Комплексная оценка эффективности патогенетической и восстановительной терапии больных сезонным аллергическим ринитом

Размещено на http://www.allbest.ru//

Размещено на http://www.allbest.ru//

14.03.11 - Восстановительная медицина, спортивная медицина лечебная физкультура, курортология и физиотерапия

14.03.09. - клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Комплексная оценка эффективности патогенетической и восстановительной терапии больных сезонным аллергическим ринитом

Уханова Ольга Петровна

Москва - 2010

Работа выполнена в ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» и кафедре терапии ФПДО Ставропольской государственной медицинской академии

Научный консультант:

Доктор медицинских наук Цыганова Т.Н.

Доктор медицинских наук, профессор Пасечников В.Д

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Машков Олег Алексеевич

Доктор медицинских наук, профессор Калюжин Олег Витальевич

Доктор медицинских наук, профессор Корчажкина Наталья Борисовна

Ведущая организация: ФГУ «Пятигорский государственный научно-исследовательский институт курортологии Федерального медико-биологического агентства».

Защита диссертации состоится « 15 » сентября 2010 года в 12.00 час. на заседании диссертационного совета Д 208.00.102 при ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» Росздравнадзора РФ. Адрес: 129301, г.Москва, ул.Касаткина,3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГУ «Всероссийский научно-исследовательский и испытательный институт медицинской техники» Росздравнадзора РФ. Адрес: 129301, г.Москва, ул.Касаткина,3.

Автореферат разослан « 12 » августа 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

Доктор медицинских наук Цыганова Т.Н.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность темы исследования

Аллергический ринит (АР) -- серьезное хроническое аллергическое заболевание, атопического генеза, которое охватывает более пятой части населения (Гаращенко Т.И. 2009). Заболевание влияет на качество жизни, учебу и профессиональную деятельность больных (Смоленов И.В. 2003). Изучение механизмов патогенеза аллергического воспаления при сезонном аллергическом рините имеет важное фундаментальное значение. Нарушение функционирования клеточного и гуморального факторов иммунитета влияет на характер течения и прогноз заболевания. Основным пусковым механизмом при сезонном аллергическом рините является IgE-опосредованный иммунный ответ с последующим развитием хронического воспалительного процесса в органе-мишени с привлечением клеток-эффекторов (базофилов, эозинофилов, лимфоцитов). Большое количество медиаторов воспаления, продуцируемых клетками-эффекторами, способствует дезорганизации процессов их пролиферации и программированной гибели (апоптоза).

В настоящее время все большее развитие получает новое профилактическое направление - восстановительная медицина, имеющая целью восстановление функциональных резервов человека, сниженных в результате неблагоприятного воздействия факторов среды и деятельности или в результате болезни, путем применения преимущественно немедикаментозных методов. (Разумов А.Н., 2005; Бобровницкий И.П., 2005).

Отличительной ее особенностью является профилактическая направленность, реализуемая путем решения проблем, связанных с повышением адаптивных возможностей человека в целях восстановления и укрепления здоровья, повышения профессиональной надежности и долголетия на основе преимущественного применения природных и искусственных физических факторов, физических упражнений и факторов традиционной терапии.

В этом аспекте достаточный интерес представляет до конца не решенная задача восстановительного лечения аллергического ринита. До наших исследований механизмы положительного действия интервальной гипоксической тренировки на организм пациентов с аллергическим ринитом не были раскрыты.

Изучение характера иммунных реакций клеток-эффекторов в результате воздействия аллергена, патогенетической терапии и интервальной гипоксической тренировки, явилось основой данного исследования. Одновременно мы можем клинически оценить все достоинства патогенетической и восстановительной терапии сезонного аллергического ринита.

Цель исследования.

Провести комплексную клинико-диагностическую оценку эффективности патогенетической и восстановительной терапии больных сезонным аллергическим ринитом.

Задачи исследования: аллергический ринит иммунный апоптоз

Оценить иммунный статус больных в период обострения сезонного аллергического ринита.

Разработать и оценить новый метод лечения моноклональными антителами к IgE больных тяжелым сезонным аллергическим ринитом.

Выявить и сравнить влияние проводимых методов лечения на уровень экспрессии маркеров апоптоза лимфоцитами периферической крови и назального секрета больных сезонным аллергическим ринитом.

Выявить и сравнить влияние проводимых методов лечения на активацию базофилов периферической крови и назального секрета больных сезонным аллергическим ринитом.

Внедрить методику интервальной гипоксической тренировки как восстановительную терапию сезонного аллергического ринита.

Выявить и сравнить влияние флутиказона пропионата, сублингвальной аллергеспецифической иммунотерапии, интервальной гипоксической тренировки и моноклональных антител к IgE на иммунный статус больных сезонным аллергическим ринитом.

Оценить качество жизни больных сезонным аллергическим ринитом до и после проведения патогенетической и восстановительной терапии.

Научная новизна работы.

Впервые показана зависимость активности базофилов периферической крови больных сезонным аллергическим ринитом от тяжести клинических проявлений и характера проводимой терапии заболевания, а так же динамика функциональной активности базофилов и лимфоцитов периферической крови больных на фоне лечения современными препаратами.

Впервые для лечения больных с тяжелой формой сезонного аллергического ринита, были использованы моноклональные антитела против IgE.

Получены новые сведения, отражающие молекулярные механизмы активации клеток-эффекторов (лимфоцитов и базофилов) периферической крови и слизистой полости носа у больных сезонным аллергическим ринитом в процессе сублингвальной аллергеспецифической иммунотерапии, лечения моноклональными антителами к IgE и флутиказона пропионатом интраназально.

Разработана и внедрена восстановительная терапия сезонного аллергического ринита у взрослых методом интервальной гипоксической тренировки.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Показана диагностическая ценность определения активации базофилов периферической крови у больных сезонным аллергическим ринитом в период обострения заболевания и на фоне различных методов лечения, позволяющая оценить тяжесть заболевания и эффективность проводимой терапии.

Предварительное иммунологическое обследование больных сезонным аллергическим ринитом определяет выбор проводимой терапии в соответствии с тяжестью заболевания.

Сублингвальная аллергенспецифическая иммунотерапия обладает наиболее выраженным супрессивным действием на иммунный статус больных, сенсибилизированных к пыльце полыни проживающих в Ставропольском крае.

Использование моноклональных антител к IgE, может быть рекомендовано для лечения больных с тяжелым сезонным аллергическим ринитом.

Проведение интервальной гипоксической тренировки восстанавливает иммунный статус больных сезонным аллергическим ринитом.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту.

У больных сезонным аллергическим ринитом в зависимости от стадии заболевания установлены особенности иммунного статуса, требующие адекватной фармакотерапии.

Определены лабораторные показатели нормальных значений апоптоза лимфоцитов периферической крови и слизистой полости носа у здоровых добровольцев.

Традиционное патогенетическое лечение сезонного аллергического ринита в комплексе с интервальной гипоксической тренировкой нормализует большинство измененных иммунных и оксидантных показателей.

Активация базофилов и апоптоз лимфоцитов находятся в прямой зависимости от концентрации введенного аллергена, что является прогностическим в оценке тяжести заболевания и эффективности проводимых методов лечения.

Введение моноклональных антител к IgE оказывает системный супрессивный эффект на субпопуляционный состав лимфоцитов периферической крови больных сезонным аллергическим ринитом тяжелого течения, в отличие от интраназальной и аллергенспецифической иммунотерапии.

Патогенетическая терапия и интервальная гипоксическая тренировка значительно улучшают качество жизни больных сезонным аллергическим ринитом.

Внедрение результатов исследования.

Результаты исследований внедрены в работу иммунологической лаборатории и кабинетов аллергологии-иммунологии ГУЗ «Ставропольского краевого клинического центра специализированных видов медицинской помощи», ФГУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт», кафедру ФПДО клинической фармакологии, бактериологии, аллергологии и иммунологии Ставропольской государственной медицинской академии, МУЗ ЦРБ Ипатовского, Шпаковского районов Ставропольского края, Калининского района Тверской области, иммунологической лаборатории ООО «ДНК Спектр» в г.Ставрополе, иммунологической лаборатории и консультативно-диагностический приём аллерголога-иммунолога АНМО «Ставропольского краевого клинико-консультативного диагностического центра».

Данные используются в лекциях и практических занятиях с интернами, ординаторами, врачами общей практики, терапевтами и педиатрами, врачами аллергологами-иммунологами, клиническими фармакологами и врачами лаборантами на ФПДО СГМА.

Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, в том числе: 10 статей в научных изданиях, рекомендованных ВАК РФ для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 245 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, главы “Материалы и методы исследования”, 6 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 46 таблицами, 43 рисунками. Список использованной литературы включает 345 источника, из них 97 отечественных и 253 зарубежных авторов.

Апробация работы.

Результаты работы доложены на международных конференциях «Европейского респираторного общества» в 03.09.2006г. (г.Мюнхен), в 07.10.2008г. (г.Берлин) - гранты, III Научно-практической конференции ЮФО «Актуальные проблемы клинической иммунологии, аллергологии» 24.10.2005г. (г.Пятигорск), на региональных конференциях «XII неделя медицины Ставрополья» 22.09.2009г. (г.Ставрополь), и «Современные методы лечения аллергических заболеваний на Северном Кавказе» (г.Ставрополь) 27.02.2010 год, а также «Первой конференции аллергологов-иммунологов Северо-Кавказского Федерального округа» (г.Пятигорск) 07.05.2010г.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования.

1. Общая характеристика лиц, включенных в исследование

Общее количество лиц, включенных в исследование, составило 946 человек. В контрольную группу включено 20 здоровых добровольцев.

Обследование пациентов проводилось в 2 этапа:

На первом этапе было обследовано 946 человек. Им проводилось стандартное общеклиническое обследование: расспрос, осмотр, физикальные методы исследования, общий анализ крови и мочи, цитологическое исследование назального секрета, анализ кала на яйца гельминтов, серологическое исследование на ВИЧ-инфицирование и реакцию Вассермана.

Критериями включения в исследование были:

возраст от 18 до 50 лет

клинические проявления поллиноза в период цветения сорных трав

наличие положительных кожных тестов с пыльцевыми аллергенами

отсутствие ранее проводимых курсов аллергенспецифической терапии

легкая/среднетяжелая и тяжелая степень САР

стаж заболевания не менее 3-х лет

Критериями исключения были: пациенты, страдающие инфекционными и гиперпластическими заболеваниями носа и придаточных пазух, получающие какую-либо терапию в течение последних двух месяцев.

Специфическое аллергологическое обследование 946 человек, включало выявление причиннозначимого аллергена с помощью прик-теста (укола) набором небактериальных аллергенов (7.500+2.500 PNU/мл). Использовались аллергены производства НПО «МИКРОГЕН» (г.Ставрополь), НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова (г.Москва) со стандартным набором пыльцевых, бытовых, эпидермальных и грибковых аллергенов.

126 больных с клинико-анамнестическими данными сезонного аллергического ринита (46 мужчин и 80 женщин), сенсибилизированных только к пыльце полыни горькой с очень резкоположительной реакцией были включены во второй этап исследования.

При наличии клинико-лабораторных признаков в сочетании с аллергологическими и иммунологическими показателями, свидетельствовавшими о наличии у пациента САР, пациента включали в специальную программу настоящего исследования.

Биологический материал: кровь и назальный секрет были собраны у пациентов после их добровольного согласия, в условиях рекомендуемых СЭС. Забор крови производили с помощью вакутейнеров содержащих ЭДТА в качестве антикоагулянта. Соблюдали все правила асептики и антисептики. Назальный секрет получали методом вымывания изотоническим раствором (20 мл) в стерильный лоток с помощью стерильного шприца. Биоматериал поступал в лабораторию в течение двух часов после забора и специальном контейнере при температуре не выше 18 - 25є С.

Иммунологические методы исследования на втором этапе включали:

1. Определение сывороточных титров общего IgЕ, циркулирующих иммунных комплексов, активации комплимента методом ИФА твердофазного иммуноферментного анализа с использованием наборов «Микроген» (Ставрополь).

2. Изучение спектра лимфоцитов в периферической крови у исследуемых лиц в период обострения САР и после лечения проводили методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител CD3, CD4, CD8, CD16, CD25, HLA-DR, Fas, Fas-L, аннексин-V, Bcl-2 и CRTH2+CD203c+CD3Ї производства «Caltag Laborarories» (США) на аппарате «BECMAN COULTER CYTOMICS FC500».

3. Определение сывороточных иммуноглобулинов А, М и G проводили методом простой радиальной иммунодиффузии по Манчини.

4. Определение фагоцитароной активности лейкоцитов проводили микроскопическим методом НСТ-теста (восстановление нитросинего тетразолия супероксидным анионом).

5. Оценка активации базофилов in vitro проводили определением сульфидолейкотриена LTDC4 и его метаболитов LTD4 и LTE4, методом твердофазового ИФА, с помощью наборов Cellular Antigen Stimulation Test ELISA производства «Bulmann» (Германия).

В Ставрополе период цветения полыни горькой начинается с середины июля и продолжается до 15 - 20 ноября. В сезон 2002 - 2009 гг. средняя, достоверно не значимая концентрация пыльцы полыни в кубическом метре атмосферного воздуха составляла 250±30 зерен (очень высокая). Аэрополлинологический мониторинг проводился с помощью волюметрического пыльцеуловителя «Буркарда», установленного на крыше ГУЗ «Ставропольского краевого клинического центра специализированных видов медицинской помощи» (высота 18 метров над уровнем Земли). Помимо пыльцы полыни горькой (Artemisia absinthium) в воздухе были выявлены и другие таксоны: крапива (Urtica spp.), амброзия (Ambrosia artemisiifolia), маревые (Chenopodiaceous).

В зависимости от используемого метода лечения 126 больных САР были распределены на три группы.

Использованные препараты и схемы назначения больным САР

Патогенетическая терапия	n=126
	Флутиказона пропионат n=50	Сублингвальная АСИТ n=60	Омализумаб n=16
	Легкое течение	Средне-тяжелое течение	Тяжелое течение	Легкое течение	Средне-тяжелоетечение	Тяжелое течение	Тяжелое течение
	n=7	n=23	n=20	n=20	n=21	n=19	n=16
ИГТ	n=126

Пациентам с легкой и среднетяжелой формой АР флутиказона пропионат вводили один раз в день, утром, по 50 мкг в каждый носовой ход; у пациентов с тяжелой формой АР доза препарата повышалась до 100 мкг. Продолжительность лечения составляла 120 дней.

Моноклональными антителами к IgE было пролечено 16 больных с тяжелой степенью САР. В зависимости от исходной концентрации IgE (МЕ/мл) и массы тела пациента (кг) рекомендуемая доза препарата составляет от 75,0 до 375,0 мг 1 раз в 2 или 4 недели. В таблице 2 представлены дозы препарата, вводимые пациентам согласно инструкции (табл.1). Оценка иммунологических изменений в периферической крови и назальном секрете больных АР осуществлялась до начала и через 12 и 16 недель после завершения терапии.

Таблица 1

Расчет дозы моноклональных антител к IgE с учетом массы пациента и уровня сывороточного IgE.

Количество пациентов	IgE общий,МЕ/мл	Вес пациента,кг	Доза препарата мг
9 больных	173+101,5	50,4+24,1	150 мг/1 раз в 4 нед.
4 больных	205+21,5	75,3+10,1	300 мг/1 раз в 4 нед.
3 больных	355,2+245,6	73,2+26,6	300 мг/2 раза в 4 недели

Сублингвальную АСИТ проводили согласно инструкции с учетом показаний и противопоказаний. Общее количество азотных единиц составило 130,930 PNU. За 2 недели до цветения полыни, лечение отменяли. Оценка иммунологических изменений в периферической крови и назальном секрете больных САР осуществлялась через 5 месяцев от начала терапии.

Методика проведения нормобарической интервальной гипоксической тренировки.

В качестве восстановительной терапии проводили сеанс интервальной нормобарической гипоксической тренировки на гипоксикаторе «Hipoxia Medical» (ЦыгановаТ.Н.2004)

ИГТ (интервальная гипоксическая тренировка) применялась после проведения гипоксического теста. Пациент вдыхает (5 минут) гипоксическую смесь с 11-16% кислорода через маску. Затем пациент снимает маску и дышит обычным воздухом (5 минут) с 20,9% О2. Оптимальная длительность и для гипоксического воздействия, и для нормоксических интервалов - 5 минут, количество серий в сеансе - 4-5. Для больных в стадии сезонной ремиссии САР количество процедур было 15. Для всех обследуемых лиц разного возраста режимы ИГТ подбираются по показателям гипоксического теста и учетом противопоказаний.

Гипоксический тест проводился дважды: до и после курса ИГТ. В течeние 10 минут больные вдыхали гипoксическую смесь с 11% О2. Показатели пульсоксиметра позволяют непрерывно получать изменения частоты сердечных сокращений и насыщения артериальной крови кислородом в динамике теста. Артериальное давление измеряется до начала и на 6 минуте гипоксического теста. До и непосредственно после ИГТ брались пробы крови из пальца для определения содержания в ней гемоглобина.

Оценка качества жизни больных САР.

За основу оценки качества жизни больных САР использовали мини- вопросник Rhinitis Quality of Life Questionnaire (RQLQ) (Yuksel H. et al. 2008; Juniper E.F. 1999). Анкетирование пациентов проводилось на приеме у врача аллерголога-иммунолога до и после проводимой терапии.

Статистическая обработка полученных результатов.

Статистическая обработка полученных данных проводилась на компьютере PENTIUM IV с использованием программ «Primer Biostatistics 4.03. for Windows» и «Microsoft Excel 97 for Windows». Сравнение количественных показателей проводили с помощью критерия Манна-Уитни и Стьюдента (t). Критерием статистической достоверности получаемых выводов считали общепринятую в медицине величину р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Показатели иммунного статуса больных в период обострения САР. Согласно полученным данным иммунологического исследования субпопуляционный состав иммунокомпетентных клеток периферической крови при обострении САР не прeтерпевает значительных изменений (рис.2).

Рис.2. Субпопуляционный состав лимфоцитов при обострении САР.

Так в периферической крови больных САР снижается относительное количество CD3, CD4, CD16 и СD25-лимфоцитов, и абсолютное количество CD25-лимфоциотов, причем степень этого снижения не зависит от степени тяжести заболевания. Однако, полученные результаты достоверно ниже контрольных значений.

У больных САР в стадию обострения отмечается увеличение в периферической крови уровня общего IgЕ, которое пропорционально степени тяжести заболевания (рис.3.).

Рис.3. Уровень сывороточного общего IgE при обострении САР.

В период обострения САР наблюдалось достоверное снижение общего сывороточного IgA при среднетяжелом и тяжелом течении, однако, показатели находились в пределах нормальных значений (рис.4.).

Рис.4. Уровень сывороточных иммуноглобулинов при обострении САР.

*-р<0,05.

Исследование маркеров апоптоза лимфоцитов периферической крови в период обострения САР, выявляет, что в группе здоровых людей доля аннексин V-позитивных лимфоцитов крови составила в среднем 1,70,4 %, а CD95 и CD95L позитивных 2,6±1,2% и 1,4±1,1% соответственно (табл.2.). В период обострения АР, мы наблюдали активацию лимфоцитов периферической крови больных повышенным синтезом раннего маркера апоптоза клеток аннексина-V до 4,2±0,9% при легком течении, 6,5±1,1% при среднетяжелом течении и до 23,0±1,5% при САР тяжелого течения (р<0,01, p<0,001).

Таблица 2

Относительное количество лимфоцитов периферической крови больных САР в стадию обострения, несущих апоптотические и антиапоптотические рецепторы (M±m).

	Контроль (n=20)	АР легкого течения (n=20)	АР среднетяжелого течения (n=20)	АР тяжелого течения (n=20)	Достоверность отличий (р)
Группа	1	2	3	4
Аннексин V %	1,7±0,4	4,2±0,9	6,5±1,1	23,0±1,5	Р1-2=0,015 Р1-3=0,001 Р1-4=0,001 Р2-3=0,114 Р2-4=0,001 Р3-4=0,001
CD95 %	2,6±1,2	1,8±0,6	1,6±0,1	1,9±0,2	Р1-2=0,555 Р1-3=0,411 Р1-4=0,568 Р2-3=0,744 Р2-4=0,875 Р3-4=0,188
CD95L %	1,4±1,1	0,8±0,3	1,1±0,1	1,0±0,4	Р1-2=0,602 Р1-3=0,787 Р1-4=0,734 Р2-3=0,349 Р2-4=0,691 Р3-4=0,810
Bcl-2 %	77,8±2,6	89,2±5,0	94,0±6,7	96,0±3,8	Р1-2=0,050 Р1-3=0,030 Р1-4=0,001 Р2-3=0,569 Р2-4=0,286 Р3-4=0,797

Достоверной разницы динамики экспрессии CD95 и CD95L на лимфоцитах в зависимости от степени тяжести САР не выявлено (р=0,3-0,8). Однако, чем более выражены клинические симптомы САР, тем выше экспрессия Bcl-2 89,2+5,0%, 94,0+6,7%, и 96,0+3,8 % (р<0,05) соответственно в крови, при контрольном значении экспрессии Bcl-2 77,8+5,6 %.

Таким образом, высокая экспрессия Bcl-2 обеспечивает выживаемость лимфоцитов периферической крови.

При анализе экспрессии маркеров апоптоза клетками назального секрета (табл.3) у больных САР в стадию обострения было установлено, что у больных САР легкого течения показатели относительного и абсолютного содержания аннексинV-позитивных лимфоцитов назального секрета достоверно не отличались от контрольной группы 3,7±0,4% и 3,6±0,4% (р=0,86).

Таблица 3

Относительное количество лимфоцитов назального секрета больных САР в стадию обострения, несущих апоптотические и антиапоптотические рецепторы (M±m)

	Контроль (n=20)	АР легкое течение (n=20)	АР среднетяжелого течения (n=20)	АР тяжелого течения (n=20)	Достоверность отличий (р)
Группа	1	2	3	4
Аннексин V %	3,7±0,4	3,6±0,4	6,5±1,0	23,0±1,5	Р1-2=0,861 Р1-3=0,016 Р1-4=0,001 Р2-3=0,010 Р2-4=0,001 Р3-4=0,001
CD95 %	7,7±1,7	5,9±1,5	14,8±2,8	69,0±11,2	Р1-2=0,432 Р1-3=0,037 Р1-4=0,001 Р2-3=0,008 Р2-4=0,001 Р3-4=0,001
CD95L %	8,1±2,3	6,3±1,9	17,9±3,8	70,5±13,9	Р1-2=0,550 Р1-3=0,033 Р1-4=0,001 Р2-3=0,010 Р2-4=0,001 Р3-4=0,001
Bcl-2 %	56,6±12,4	42,0±19,4	57,4±14,8	90,1±4,3	Р1-2=0,530 Р1-3=0,967 Р1-4=0,015 Р2-3=0,532 Р2-4=0,020 Р3-4=0,040

В то же время, при САР среднего и тяжелого течения экспрессия аннексинаV на лимфоцитах назального секрета достоверно возрастала до 6,5±1,0% и 23,0±1,5% соответственно по сравнению с контролем 3,7±0,4% (р<0,001). Однако, мы наблюдали более низкий уровень BcL-2 56,6±12,4% на мембране интраназальных лимфоцитов, чем в периферической крови. С увеличением тяжести клинических симптомов происходит увеличение экспрессии антиапоптотических маркеров в интраназальных лимфоцитах до 89,2±19,4%, 94±14,8% и 96,1±4,3% соответственно тяжести АР (р<0,01; р<0,02; р<0,04) по сравнению с контролем (табл.3). Одновременно, достоверного повышения или снижения экспрессии CD95 и CD95L на мембране лимфоцитов органа-мишени не наблюдалось (р=0,5).

Таким образом, анализируя полученные данные, можно сделать заключение о том, что лимфоциты назального секрета больных САР готовы вступить в апоптоз опосредованный не только аннексиномV, но и CD95/CD95L. При этом, чем выше активность заболевания, тем больше проапоптатических маркеров экспрессируется на лимфоцитах назального отделяемого. В то же время при САР переход в состояние апоптоза лимфоцитов назального содержимого не происходит вследствие высокой экспрессии Bcl-2 рецептора, который обеспечивает выживаемость лимфоцитов, обладая антиапоптогенным действием. С нашей точки зрения механизм, блокирующий апоптоз клеток-эффекторов, активно участвующих в реализации аллергической реакции в органе-мишени лежит в основе тяжелых форм САР.

Оценка активности базофилов периферической крови больных САР, в период обострения, до лечения, включала в себя определение CD203c - активированных базофилов, а также базальную и стимулированную аллергеном полыни продукцию сульфидолейкотриена LTC4 и его метаболитов in vitro. Согласно полученным данным уровень экспрессии CD203c маркера на базофилах периферической крови составлял 0,6±0,1%, спонтанная и стимулированная аллергеном продукция LTC4 in vitro у здоровых людей достоверно не отличались между собой и составляли 75,0±63,0 и 181,0±18,0 пг/мл, соответственно (р=0,114) (табл.4).

Таблица 4

Активность базофилов периферической крови у больных с САР в период обострения (Mm)

	Контроль (n=20)	АР легкого течения (n=20)	АР среднетяжелого течения (n=20)	АР тяжелого течения (n=20)	Достоверность отличий (р)
Группа	1	2	3	4
CD203с %	0,6+0,1	9,2+0,2	12,2+0,3	94,3+0,4	Р1-2=0,001 Р1-3=0,001 Р1-4=0,001 Р2-3=0,001 Р2-4=0,001 Р3-4=0,001
LTC4 базальный пг/мл	75,0+63,0	380,0+112,0	769,0+185,0	1558,0+231,0	Р1-2=0,023 Р1-3=0,001 Р1-4=0,001 Р2-3=0,050 Р2-4=0,001 Р3-4=0,001
LTC4 стимулированный пг/мл	181,0+18,0	476,0+114,0	1421,0+203,0	2728,0+91,0	Р1-2=0,015 Р1-3=0,582 Р1-4=0,001 Р2-3=0,001 Р2-4=0,001 Р3-4=0,001

В период обострения САР наблюдается достоверное повышение экспрессии CD 203c до 9,2±0,2% при САР легкого течения, 12,2±0,3% САР средней степени тяжести и 94,3±0,4% при САР тяжелого течения по сравнению с группой контроля (р<0,001). Пропорционально повышается уровень сульфидлейкотриенов до 380,0±112,0 пг/мл при легком, 769,0±185,0 пг/мл среднетяжелом и 1558,0±231,0 пг/мл тяжелом САР (р<0,02). Таким образом, в период обострения САР наблюдается повышенная активация базофилов периферической крови и синтез медиаторов аллергического воспаления - лейкотриенов.

Показатели иммунного статуса больных на фоне терапии флутиказона пропионатом. В процессе терапии флутиказона пропионатом, было выявлено снижение уровня общего IgE, однако, он оставался высоким по сравнению с контрольной группой (табл.5).

Таблица 5

Динамика содержания сывороточного IgE периферической крови больных САР на фоне лечения флутиказоном пропионатом, (M±m)

	АР легкого течения (n=7)	АР среднетяжелого течения (n=23)	АР тяжелого течения (n=20)
	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения
IgE, МЕ/мл	121,015,8	89,09,6	355,057,3	98,215,6	455,085,9	117,114,5
Достоверность отличий между группами (р)	0,109	0,001	0,001

Выявлено, что флутиказона пропионат не влияет на экспрессию аннексина V, Fas и Fas-L на лимфоцитах периферической крови и назального секрета больных САР, однако подавляет Bcl-2 (табл.6-7).

Таблица 6

Экспрессия маркеров апоптоза лимфоцитов периферической крови больных САР на фоне лечения флутиказона пропионатом, (M±m)

Маркеры апоптоза	АР легкое течение (n=7)	АР среднетяжелое течение (n=23)	АР тяжелое течение (n=20)
	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения
Аннексин V, %	4,2+0,9	1,8+0,8	6,5±1,1	4,3+0,3	23,0±1,5	9,6+1,3
Достоверность отличий (р)	0,069	0,060	0,001
CD 95,%	1,8+0,6	1,5+1,0	1,6+0,1	0,9+0,4	1,9±0,2	0,9+0,6
Достоверность отличий (р)	0,801	0,097	0,122
CD95L,%	0,8±0,3	0,4+0,2	1,1±0,1	0,8+0,5	1,0±0,4	0,5+0,3
Достоверность отличий (р)	0,289	0,559	0,324
Bcl-2,%	89,2±5,0	63,0+2,0	94,0±6,7	77,6+3,0	96,0±3,8	87,0+3,3
Достоверность отличий (р)	0,001	0,031	0,082

Содержание аннексин V-позитивных лимфоцитов периферической крови на фоне лечения флутиказона пропионатом при АР легкого и среднетяжелого течения достоверно не отличается (р<0,06). Однако, при АР тяжелого течения экспрессия аннексина V достовено снижается с 23,0±1,5% до 9,6+1,3% (р<0,001). Также выявлено, что интраназальное использование флутиказона пропионата не оказывает влияние на экспрессию маркеров Fas и Fas-L (табл.7).

Таблица 7

Экспрессия маркеров апоптоза лимфоцитов назального секрета больных САР на фоне лечения флутиказона пропионатом, (M±m)

Маркеры апоптоза	АР легкое течение (n=7)	АР среднетяжелое течение (n=23)	АР тяжелое течение (n=20)
	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения
Аннексин V, %	3,6±0,4	3,5±0,3	6,5±1,0	3,2±0,2	23,0±1,5	9,5±1,3
Достоверность отличий (р)	0,845	0,002	0,001
CD 95,%	5,9±1,5	4,0±1,5	14,8±2,8	10,0±1,7	69,0±11,2	8,2±1,9
Достоверность отличий (р)	0,129	0,150	0,001
CD95L,%	6,3±1,9	4,5±2,1	17,9±3,8	7,6±1,7	70,5±13,9	7,8±2,5
Достоверность отличий (р)	0,537	0,017	0,001
Bcl-2,%	42,0±19,4	12,7±4,6	57,4±14,8	15,9±2,9	90,1±4,3	14,1±2,5
Достоверность отличий (р)	0,167	0,009	0,001

Снижение экспрессии CD203c на фоне терапии флутиказона пропионатом до 11,1±4,1% (р<0,6) при легком течении, 13,4±3,6% (р<0,7) среднетяжелом и 37,1±14,9% тяжелом течении (р<0,001) свидетельствует о подавлении активации базофилов периферической крови больных (табл.8).

Таблица 8

Динамика активации базофилов периферической крови больных САР на фоне лечения флутиказона пропионатом, (M±m)

Маркеры апоптоза	АР легкое течение (n=7)	АР среднетяжелое течение (n=23)	АР тяжелое течение (n=20)
	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения
CD203с, %	9,2±0,2	11,1±4,1	12,2±0,3	13,4±3,6	94,3±0,4	37,1±14,9
Достоверность отличий (р)	0,652	0,741	0,001
LTC4, пг/мл	380,0±112,0	340,0±124,3	769,0±185,0	701,0±223,5	1558,0±231,0	759,0±241,5
Достоверность отличий (р)	0,815	0,816	0,022

Синтез лейкотриенов достоверно также снижается только при САР тяжелого течения и составляет 759,0±241,5 пг/мл, что значительно выше контрольных значений 75,0±63,0 и 181,0±18,0 пг/мл (р<0,001).

Показатели иммунного статуса больных на фоне терапии моноклональными антителами к IgE. Системное введение моноклональных антител к IgE несколько иначе влияет на иммунный статус больных САР тяжелого течения.

Согласно полученным данным происходит снижение абсолютного количества лимфоцитов экспрессирующих CD3, CD4, CD8 и CD19 на фоне терапии моноклональными антителами к IgE через 16 недель. Снижение CD3 составило 31,8%, CD4 - 37,1% и CD19 - 43,3%, что ниже контрольных значений и показателей региональных норм. Одновременно наблюдается недостоверное снижение CD25, CD16 и достоверное повышение HLA-DR на 105% (Р=0,002) после терапии.

Снижение относительного количества лимфоцитов экспрессирующих CD3, CD4, CD8, CD25 и CD16 также достоверно ниже контрольных значений на 30%, 35,3%, 40,6%, 50% и 41,9% соответственно (рис.5).



**-р<0,01 - по сравнению с контролем.

Рис.5. Динамика субпопуляций лимфоцитов перифертческой крови больных САР, после терапии моноклональными антителами к IgE.

Повышение HLA-DR наблюдается на 49,5% (р<0,01). Однако, моноклональные антитела к IgE достоверно не меняют показатели общих сывороточных иммуноглобулинов А, М, G, ЦИК, НСТ и системы комплемента в периферической крови больных САР тяжелого течения (рис.6).

Рис.6. Недостоверная динамика показателей иммунного статуса больных САР тяжелого течения после терапии моноклональными антителами к IgE.

Одновременно наблюдается значительное повышение сывороточного IgE до 716,2±202,5 МЕ/мл на 12-й неделе лечения и 901,4±183,1 МЕ/мл на 16-й неделе лечения моноклональными антителами по сравнению с исходным уровнем 455,0±85,9 МЕ/мл (р<0,001). Вероятно, повышение уровня IgE происходит за счет циркуляции анти-IgE+IgE свободного, в виде триммеров и гексамеров (Куличенко Т.В. 2007).

Лечение тяжелых форм САР моноклональными антителами к IgE ведет к достоверному увеличению экспрессии Fas и Fas-L на 12-й неделе лечения до 27,6±5,9% и 9,7±3,8% соответственно (p<0,001). Снижение экспрессии аннексина -V с 23,0+1,5% до 3,1±0,1% на лимфоцитах периферической крови наблюдалось одновременно по сравнению с периодом обостерния САР тяжелого течения (p<0,001). При этом, в отличие от флутиказона пропионата терапия моноклональными антителами к IgE ведет к снижению экспрессии Bcl-2 рецептора на поверхности лимфоцитов периферической крови больных тяжелой степени САР в период обострения с 96,0+ 3,8% до 36,8±4,3% на 12-ю неделю лечения и 19,6±1,1% на 16-ю неделю (p<0,001) (табл.9).

Таблица 9

Апоптоз лимфоцитов периферической крови больных САР на фоне лечения моноклональными антителами к IgE, (M±m).

Маркеры апоптоза	АР тяжелое течение (n=16)	Достоверность отличий между группами (р)
	До лечения	После лечения
		12 недель	16 недель
№ группы	1	2	3
АннексинV%	23,0+ 1,5	3,9±0,1	3,1±0,1	Р1-2=0,001 Р1-3=0,001 Р2-3=0,001
CD 95,%	1,9+ 0,2	27,6±5,9	5,1±0,9	Р1-2=0,001 Р1-3=0,001 Р2-3=0,001
CD95L,%	1,0+0,4	9,7±3,8	5,1±0,2	Р1-2=0,030 Р1-3=0,001 Р2-3=0,236
Bcl-2,%	96,0+ 3,8	36,8±4,3	19,6±1,1	Р1-2=0,001 Р1-3=0,001 Р2-3=0,001

В слизистой полости носа также происходит выраженное, достоверное снижение экспрессии Bcl-2 до 19,6±1,9% на 12-й неделе терапии и до 16,4±1,2% на 16-й неделе терапии (p<0,001) (табл.10).

Таблица 10

Экспрессия маркеров апоптоза лимфоцитов назального секрета больных АР на фоне лечения моноклональными антителами к IgE, (M±m)

Маркеры апоптоза	АР тяжелое течение (n=16)	Достоверность отличий между группами (р)
	До лечения	После лечения
		12 недель	16 недель
№ группы	1	2	3
Аннексин V%	23,0+1,5	3,2±0,3	3,1±0,1	Р1-2=0,001 Р1-3=0,001 Р2-3=0,754
CD 95,%	69,0+1,1	8,5±1,4	6,9±1,4	Р1-2=0,001 Р1-3=0,001 Р2-3=0,425
CD95L,%	70,5+13,9	7,1±2,4	6,8±1,8	Р1-2=0,001 Р1-3=0,001 Р2-3=0,921
Bcl-2,%	90,1+4,3	19,6±1,9	16,4±1,2	Р1-2=0,001 Р1-3=0,001 Р2-3=0,165

Однако, наблюдается повышение маркеров Fas/FasL на лимфоцитах слизистой полости носа до 6,9±1,4% и 6,8±1,8% соответственно (p<0,001) и снижение аннексин-V позитивных лимфоцитов с 23,0+1,5% до 3,1±0,1% (p<0,001).

Таким образом, терапия моноклональными антителами вызывает выраженный супрессивный эффект на экспрессию CD3, CD4, CD8, CD25 и CD16, Bcl-2 и стимулирует экспрессию HLA-DR в периферической крови больных САР (табл.11).

Таблица 11

Динамика активации базофилов периферической крови больных САР на фоне лечения моноклональными антителами к IgE, (M±m)

Маркеры апоптоза	АР тяжелое течение (n=16)	Достоверность отличий между группами (р)
	До лечения	После лечения
		12 недель	16 недель
№ группы	1	2	3
CD203с, %	94,3±0,4	25,4+1,3	15,3+1,1	Р1-2=0,001 Р1-3=0,001 Р2-3=0,001
LTC4, пг/мл	1558,0±231,0	281,0±2,2	209,1±1,9	Р1-2=0,001 Р1-3=0,001 Р2-3=0,001

Применение моноклональных антител к IgE при тяжелой степени САР, ведет к достоверному снижению их количества и продукции сульфидолейкотриена LTC4, по сравнению с исходным уровнем. При этом необходимо отметить, что степень снижения активности базофилов более выражено, чем при использовании флутиказона пропионата и определяется длительностью назначения препарата (табл.11).

Показатели иммунного статуса на фоне сублингвальной аллергенспецифической иммунотерапии пыльцой полыни. В процессе терапии слАСИТ отмечалось снижение концентрации общего IgЕ в сыворотке крови у пациентов до 53,27,1 МЕ/мл САР легкого течения, 69,811,4 МЕ/мл и 155,28,1 МЕ/мл САР среднетяжелого и тяжелого течения. Однако, уровень IgE у больных САР тяжелого течения выше нормальных значений. На фоне слАСИТ происходит достоверное увеличение экспрессии CD3 и CD4 при легкой, среднетяжелой и тяжелой степени САР в пределах возрастной нормы. Также наблюдается достоверное повышение уровня IgA, IgG и снижение ЦИК в пределах нормальных значений.

Снижение Bcl-2 наблюдается на фоне лечения аллергеном полыни до 16,1±0,1% легкого, 15,3±0,9% среднетяжелого и 14,0±1,1% тяжелого течения (p<0,001). Одновременно повышается экспрессия аннексина V, Fas и Fas-L (p<0,001) (табл.12).

Таблица 12

Экспрессия маркеров апоптоза лимфоцитов периферической крови больных САР на фоне лечения аллергеном полыни, (M±m)

Маркеры апоптоза	АР легкое течение (n=20)	АР среднетяжелое течение (n=21)	АР тяжелое течение (n=19)
	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения
Аннексин V, %	4,2+0,9	19,0±0,1	6,5±1,1	10,0±0,1	23,0±1,5	32,0±0,1
Достоверность отличий (р)	0,001	0,003	0,010
CD 95,%	1,8+0,6	6,6±1,9	1,6+0,1	3,0±1,6	1,9+0,2	2,0±2,5
Достоверность отличий (р)	0,001	0,001	0,001
CD95L,%	0,8+0,3	7,8±0,2	1,1+0,1	5,5±4,1	1,0+0,4	3,2±1,2
Достоверность отличий (р)	0,001	0,001	0,001
Bcl-2,%	89,2+5,0	16,1±0,1	94,0+6,7	15,3±0,9	96,0+3,8	14,0±1,1
Достоверность отличий (р)	0,001	0,001	0,001

слАСИТ также приводит к нормализации апоптоза опосредованного Fas/FasL-зависимым путем, в то же время, подавляя Bcl-2 зависимый антиапоптатический механизм в органе-мишени (табл.13).

Однако, слАСИТ подобные изменения вызывает в назальном секрете только при тяжелой форме АР (p<0,001), а при легкой и среднетяжелой достоверных изменений в количестве клеток, экспрессирующих про- и противоапоптотические маркеры на фоне АСИТ выявлено не было.

Таблица 13

Экспрессия маркеров апоптоза лимфоцитов назального секрета больных САР на фоне лечения аллергеном полыни, (M±m)

Маркеры апоптоза	АР легкое течение (n=20)	АР среднетяжелое течение (n=21)	АР тяжелое течение (n=19)
	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения	До лечения	После лечения
Аннексин V, %	3,6±0,4	3,4±0,2	6,5±1,0	5,5±0,2	23,0±1,5	4,3±0,2
Достоверность отличий (р)	0,657	0,333	0,001
CD 95,%	5,9±1,5	6,9±1,2	14,8±2,8	7,6±4,7	69,0±11,2	8,5±1,3
Достоверность отличий (р)	0,606	0,196	0,001
CD95L,%	6,3±1,9	6,8±1,3	17,9±3,8	8,07±5,3	70,5±13,9	7,1±0,9
Достоверность отличий (р)	0,829	0,140	0,001
Bcl-2,%	42,0±19,4	16,4±2,7	57,4±14,8	56,6±0,1	90,1±4,3	19,6±1,1
Достоверность отличий (р)	0,199	0,957	0,001

В отношении активности базофилов слАСИТ имеет некоторые особенности (табл.14).

Таблица 14

Динамика уровня экспрессии маркера 203с базофилов периферической крови больных САР на фоне лечения АСИТ аллергеном полыни, (M±m).

	До начала лечения, %	На фоне АСИТ , %
		10Їі	10ЇІ	10Ї№	Цельный аллерген
№ Группы	1	2	3	4	5
АР легкое течение (n=20)	9,2+0,2	6,7+0,1	5,1+0,2	5,1+0,2	4,8+1,1
Достоверность отличий (р)	Р1-2=0,001 Р1-3=0,001 Р1-4=0,001 Р1-5=0,001	Р2-3=0,001 Р2-4=0,001 Р2-5=0,001	Р3-4=1,000 Р3-5=0,790	Р4-5=0,790
АР среднетяжелое течение (n=21)	12,2+0,3	9,4+1,4	9,2+1,1	8,6+0,9	8,9+1,1
Достоверность отличий (р)	Р1-2=0,058 Р1-3=0,050 Р1-4=0,001 Р1-5=0,006	Р2-3=0,955 Р2-4=0,675 Р2-5=0,848	Р3-4=0,676 Р3-5=0,823	Р4-5=0,834
АР тяжелое течение (n=19)	94,3+0,4	82,2+7,1	24,3+2,1	10,1+0,6	9,9+1,2
Достоверность отличий (р)	Р1-2=0,097 Р1-3=0,001 Р1-4=0,001 Р1-5=0,001	Р2-3=0,001 Р2-4=0,001 Р2-5=0,001	Р3-4=0,001 Р3-5=0,001	Р4-5=0,882

Несмотря на достоверное снижение количества активированных базофилов с фенотипом CD203с при введении небольшой дозы антигена (100 PNU), активность базофилов по данным продукции сульфидолейкотриена LTC4 резко возрастает (табл.14).

Увеличение дозы аллергена вызывает супрессивный эффект на базофилы и продукцию лейкотриенов. Таким образом, оптимальной дозой аллергена модулирующей аллергическое воспаление при проведении слАСИТ у больных с легким течением АР следует считать 1000 PNU, а при среднетяжелой и тяжелой 10000 PNU (табл.14).

Кроме этого необходимо отметить, что применение слАСИТ снижает активность базофилов в большей степени, чем флутиказона пропионат, но в меньшей степени, чем моноклональные антитела к IgE. Эффективность проводимой терапии была клинически подтверждена с помощью вопросника качества жизни больных САР. Проводимое цитологическое исследование назального секрета, отражает элиминацию клеток-эффекторов из органа-мишени, что также является подтверждением эффективности используемых в исследовании методов терапии САР.

Интервальная гипоксическая тренировка. Результаты наших исследований свидетельствуют о том, что курс ИГТ дает лучшие результаты независимо от тяжести заболевания. В результате улучшения вентиляционно-перфузионных отношений повысилось насыщение артериальной крови кислородом. Повышение содержания гемоглобина и насыщение артериальной крови кислородом привело к возрастанию содержания кислорода в артериальной крови. Эти изменения способствовали улучшению снабжения организма кислородом, увеличению скорости транспорта кислорода артериальной кровью.

Таким образом, сочетанное применение нормобарической интервальной гипоксической тренировки и патогенетической терапии имеет безусловное преимущество перед раздельным применением каждого из этих методов и может быть рекомендовано практическим врачам.

Интервальная гипоксическая тренировка (ИГТ) вызывает практически полное восстановление показателей иммунной системы до уровня контрольных значений с улучшением состояния функциональной системы дыхания и нормализацией снабжения организма кислородом (рис.7-8). В результате ИГТ увеличилось насыщение артериальной крови кислородом, достоверно показатели повышались при САР тяжелого течения от 161,4% до 189,7% (р<0,05) (рис.7). Повышенное содержания гемоглобина, кислородной емкости крови (КЕК) и насыщение артериальной крови кислородом привели к увеличению содержания О2 в артериальной крови (СаО2).

Влияние интервальной гипокситерапии на показатели кислородной емкости крови (M±m).

Рис.7. *p<0,05 - до и после ИГТ.

Влияние интервальной гипокситерапии на уровень гемоглобина в крови больных САР (M±m).

Рис. 8. *p<0,05, **р>0,05 - до и после ИГТ, *** р<0,001 - по сравнению с контролем.

Повышение насыщения артериальной крови кислородом наблюдается при любой степени тяжести САР (рис.9). Насыщение артериальной крови кислородом, также значительно и достоверно повышается (p<0,001).

Показатели газового состава крови у больных САР легкого, среднетяжелого и тяжелого течения (M±m).

Рис.9. АРТТ - аллергический ринит тяжелое течение, АРСТ - аллергический ринит средней степени тяжести, АРЛТ - аллергический ринит легкого течения, *p<0,05 - после интервальной гипокситерапии.

В результате ИГТ увеличилось насыщение артериальной крови кислородом (SaO2). Повышенное содержания гемоглобина, кислородной емкости крови (КЕК) и насыщение артериальной крови кислородом привели к увеличению содержания О2 в артериальной крови (СаО2).

Повышение насыщения артериальной крови кислородом (SaO2) наблюдается при любой степени тяжести САР (p<0,001). При САР тяжелого течения, наиболее выражено насыщение крови кислородом после ИГТ, достигая показателей здоровых людей.

После проведения ИГТ в период ремиссии САР экспрессия маркеров апоптоза лимфоцитов периферической крови и назального секрета приближается к показателям здоровых. Интересно, что экспрессия Bcl-2 лимфоцитами периферической крови, ингибированная флутиказона пропионатом и аллергеном полыни у больных САР легкого...