Гистологические, иммуногистохимические и молекулярно-генетические маркеры рака молочной железы, их прогностическая значимость

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Гистологические, иммуногистохимические и молекулярно-генетические маркеры рака молочной железы, их прогностическая значимость

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Рак молочной железы (РМЖ) является серьезной медицинской и социальной проблемой для большинства развитых стран мира. Несмотря на значительные достижения молекулярной биологии и генетики последней четверти века в понимании биологии и клиники заболевания, а также кардинальные изменения в подходе к лечению, проблема продолжает оставаться высоко актуальной.

К настоящему моменту сообщается более чем о ста факторах прогноза, дающих представление о биологическом поведении опухоли. Для предсказания клинического течения опухолевого процесса, ответа на лечение и исхода РМЖ большое значение придается маркерам, определяемым иммуногистохимическими методами.

Одними из первых вошедших в клиническую практику клеточных маркеров были рецепторы эстрогенов (РЭ) и прогестерона (РП), роль которых в канцерогенезе гормонозависимых опухолей доказана большим количеством исследований (Семиглазов В.Ф. и соавт., 1992). Определение РЭ и РП в ткани опухоли сейчас рассматривается как обязательное условие для успешного гормонального лечения РМЖ (Allred D.C. et al., 1998; Бернштейн Л.М., 2000; Семиглазов В.Ф., 2001). Эффект гормональной терапии зависит от наличия РЭ и РП в опухоли: ее эффективность составляет около 10% при РЭ-отрицательных опухолях, примерно 50% при РЭ-положительных опухолях и около 75% при опухолях, содержащих одновременно РЭ и РП. Тем не менее, известны случаи резистентности к гормональной терапии больных с РЭ- и РП-положительными опухолями, поэтому гормональный статус опухоли оказывается не всегда достаточным показателем гормональной чувствительности РМЖ (Летягин В.П., 2004).

Важная роль в канцерогенезе РМЖ принадлежит ростовым факторам, таким как EGFR - эпидермальный фактор роста, VEGFR - сосудистый эндотелиальный фактор роста и мутационному статусу.

Ведущим фактором в механизме злокачественной трансформации клеток, в биологическом поведении уже возникших опухолей является усиление пролиферативной активности опухолевых клеток. Для выявления особенностей пролиферации клеток злокачественных опухолей человека широко используется анализ экспрессии антигена Ki-67, который экспрессируется практически во всех фазах митотического цикла и отражает величину пролиферативного пула опухоли (Пожарисский К.М., Леенман Е.Е., 2000).

Рак молочной железы характеризуется диссеминацией раковых клеток гематогенным путем уже на ранних стадиях заболевания. Поэтому помимо местного лечения (хирургическая операция и лучевая терапия), больным проводится системная химиотерапия и / или эндокринная терапия в адъювантном режиме. За последние 40 лет реальная польза от системного адъювантного лечения в плане улучшения показателей выживания без признаков заболевания и общего выживания была подтверждена многочисленными рандомизированными испытаниями (Early Breast Cancer Trialists' Collaborative Group /EBCTCG/). Однако так как рак молочной железы является гетерогенным заболеванием, вопрос о том, целесообразно ли назначать адъювантную химиотерапию всем больным или только больным с высоким риском развития системного заболевания при первом выявлении, остается открытым.

Существующие на сегодняшний день способы оценки степени риска у больных, страдающих раком молочной железы, неэффективны и недостаточны.

Значимость отдельных вышеперечисленных маркеров, выявляемых иммуногистохимическим методом, остается спорной. Требует уточнения прогностическая роль иммуногистохимических методов в оценке эффективности проводимой терапии и определении прогноза течения болезни после проведения противоопухолевого лечения. Также актуальным является разработка новых неинвазивных методик (ПЦР, ИСА), которые отвечают этим запросам.

Цель исследования

Определение диагностической и прогностической значимости комплексного изучения молекулярно-генетических и молекулярно-биологических маркеров у больных раком молочной железы.

Задачи исследования:

Определить молекулярно-генетический статус больных РМЖ по парафинированным образцам тканей и по плазме крови.

Изучить содержание и уровень экспрессии рецепторов эстрогена и прогестерона в клетках рака молочной железы и выявить клинико-морфологические особенности течения заболевания с различными гормонально-рецепторными фенотипами опухоли.

Определить концентрацию метаболитов эстрогена (2-гидрокиэстрон, 16б-гидроксиэстрон), и их соотношение.

Определить экспрессию онкобелка HER-2 и антигена Ki-67 в клетках рака молочной железы с различными гормонально-рецепторными фенотипами.

Определить сывороточный уровень EGFR и hVEGFR-165.

Оценить диагностическую и прогностическую значимость комплексного изучения молекулярно-генетических и молекулярно-биологических маркеров у больных раком молочной железы.

Новизна исследования. Проведено комплексное изучение клинико-морфологических характеристик клеток рака молочной железы: содержания и уровня экспрессии рецепторов эстрогенов, прогестерона, онкобелка HER-2, антигена Ki-67, уровня EGFR, hVEGFR-165 с применением высокочувствительного и специфичного иммуногистохимического метода и определения концентраций этих белков в сыворотке крови.

Показана корреляция и практическая значимость уровней РП и РЭ, EGFR и hVEGFR-165, HER-2/neu, определенных иммуногистохимическим и иммуносорбентным методами.

Определена важная роль EGFR и hVEGFR-165 в канцерогенезе РМЖ. Впервые показано, что снижение уровня экспрессии рецепторов прогестерона, повышение уровня EGFR и hVEGFR-165, HER-2/neu и высокого уровня индекса пролиферации Ki-67 в клетках рака молочной железы является важным предсказательным фактором низкой эффективности противоопухолевой гормональной терапии и может рассматриваться как показатель неблагоприятного прогноза клинического течения рака молочной железы.

Практическая значимость исследования. Предложена программа комплексного лабораторного иммуногистохимического, иммуносорбентного и молекулярно-генетического исследования клеток рака молочной железы, включающая определение содержания и уровня экспрессии рецепторов стероидных гормонов, онкобелка HER-2 и антигена Ki-67, определения уровня EGFR, hVEGFR-165 и молекулярно-генетического статуса больных РМЖ для формирования прогноза клинического течения рака молочной железы и отбора групп пациентов для проведения адекватной гормональной и химиотерапии. Выделены группы пациентов с опухолевыми фенотипами, обладающими неблагоприятными прогностическими и предсказательными характеристиками.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

1. С увеличением возраста больных экспрессия рецепторов половых гормонов увеличивается, экспрессия HER-2/neu - уменьшается.

2. Индекс пролиферативной активности Ki-67 выше при низкой степени дифференцировки опухоли, при отсутствии РЭ, РП в опухолевых клетках, при гиперэкспрессии HER-2/neu.

3. При любом гистологическом варианте опухоли имеется гиперэстрогенемический синдром и дискордантность соотношения 2-ОНЕ/16б-ОНЕ.

4. Выраженность гиперэстрогенемии и эстрогенового дисбаланса сильнее при низкой степени дифференцировки опухоли, при отсутствии РЭ, РП на поверхности опухолевых клеток, при гиперэкспрессии HER-2/neu.

5. Чем выше степень дифференцировки опухоли и сильнее экспрессия рецепторов эстрогена и прогестерона, тем ниже выраженность молекулярно-генетических изменений, выявляемых по парафинированным образцам опухолевой ткани и по плазме крови.

6. Выраженность молекулярно-генетических изменений, выявляемых по парафинированным образцам опухолевой ткани и по плазме крови, изменяется при проведении специального лечения, и может служить критерием оценки эффективности проводимой терапии и маркером излеченности больных РМЖ.

7. С уменьшением степени дифференцировки опухоли, с увеличением ее пролиферативного потенциала уровень экспрессии рецепторов ростовых факторов (EGFR, hVEGFR-165) увеличивается.

Апробация работы. Основные положения диссертационного исследования доложены и обсуждены: Международном симпозиуме «Молекулярные механизмы регуляции функции клетки» (Тюмень, 2005); Всероссийской конференции «Новые отечественные противоопухолевые препараты» (Москва, 2005); Международном Форуме по проблемам науки, техники и образования (Москва, 2005); IX Международной конференции «Высокие технологии восстановительной медицины: профессиональное долголетие и качество жизни» (Сочи, 2006); IX съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов и паразитологов» (Москва, 2007); Международной гистологической конференции «Морфогенезы в эволюции, индивидуальном развитии и эксперименте» (Тюмень, 2008); Всероссийской конференции «Актуальные аспекты паразитарных заболеваний в современный период» (Тюмень, 2008); на съезде онкологов Армении с международным участием «Молекулярная онкология» (Ереван, 2008); на Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» (Москва, 2008); на IV Международной конференции по иммунотерапии (Москва, 2008); III съезде Российского общества патологоанатомов «Актуальные вопросы патологической анатомии» (Самара, 2009); на научно-практической конференции онкологов Поволжья «Молекулярные аспекты рака молочной железы» (Казань, 2009); на научно-практической конференции онкологов Тюменской области «Гиперпластические процессы в органах женской репродуктивной системы» (Тюмень, 2009); на Всероссийской научно-практической конференции «Биотерапия злокачественных новообразований» (Москва, РОНЦ, 2009); совместном заседании обществ анатомов, гистологов, эмбриологов и онкологов Тюменской области (Тюмень, 2010); на научно-практической конференции с международным участием «Наноонкология - 2010» (Москва, 2010).

Внедрение результатов исследования. Результаты исследования внедрены в работу патологоанатомического отделения Тюменского областного онкологического диспансера и в учебный процесс на кафедрах онкологии с курсом лучевой диагностики и лучевого лечения, патологической анатомии и гистологии Тюменской государственной медицинской академии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 68 работ, из них 7 статей в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объём и структура работы. Диссертация изложена на 199 страницах, включает введение, обзор литературы, материалов и методов, шести глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводы, практических рекомендаций и библиографический список использованной литературы. Работа иллюстрирована 36 рисунками и содержит 31 таблицу. В библиографическом списке приведено 264 источников (100 отечественных и 164 зарубежных авторов).

Содержание работы

рак молочный железа эстроген

Материал и методы исследования. При выполнении настоящего исследования в обследуемую группу были включены 200 пациенток маммологического отделения Тюменского областного онкологического диспансера, которым был впервые установлен диагноз РМЖ и проведено адъювантное лечение. Всем пациентам проводилось комплексное обследование: осмотр врача-онколога, выполнение рентгенографического и ультразвукового исследования молочных желез. Для выяснения характера новообразования молочной железы выполнялось цитологическое исследование (тонкоигольная аспирационная биопсия) и гистологическое исследование (трепан-биопсия или операционный материал).

Средний возраст пациентов на момент постановки диагноза составил 55±7,6 лет. У подавляющего большинства (у 130 из 200) пациентов, отмечался инвазивный протоковый РМЖ, что составило 65,0% (табл. 1). Вторым по частоте встречаемости РМЖ явился инвазивный дольковый РМЖ (у 50 из 200 пациентов, что составило 25,0%). Слизистый РМЖ отмечался у 7 (3,5%) пациентов. В 2 (1,0%) случаях был диагностирован тубулярный РМЖ; в 2 (1,0%) случаях - медуллярный; в двух случаях (1,0%) - папиллярный. Другие формы РМЖ составили 3,5% (встретились у 7 из 200 пациентов). Соотношение различных гистологических форм РМЖ соответствует аналогичным данным ВОЗ (WHO, 2003). Практически с одинаковой частотой РМЖ обнаруживался в правой (48,9%) и левой (51,1%) молочных железах.

Приготовление парафиновых блоков, срезов, окрашивание препаратов гематоксилином-эозином по стандартной методике и последующая верификация диагноза проводились специалистами патолого-анатомической лаборатории Тюменского областного онкологического диспансера.

Таблица 1. Частота встречаемости гистологических форм рака молочной железы

Форма РМЖ	n	%
Инвазивный протоковый	130	65,0
Инвазивный дольковый	50	25
Слизистый	7	3,5
Тубулярный	2	1,0
Медуллярный	2	1,0
Папиллярный	2	1,0
Другие формы РМЖ	7	3,5

Иммуногистохимическое определение экспрессии РЭ, РП, Ki-67 и HER-2 в ткани опухоли

Иммуногистохимическое определение РЭ, РП, онкобелка HER-2, антигена Ki-67 проводилось в лаборатории морфологических исследований патологоанатомического отделения Тюменского ООД. Иммуногистохимическое выявление экспрессии рецепторов половых гормонов и c-erbB-2 проводили в срезах фиксированной в формалине и залитой в парафин ткани согласно стандартной методике. Использовали моноклональные антитела к антигену Ki-67 (клон RTU - Ki-67-ММ1, производство фирмы Novocastra), антитела к белку рецептора эстрогена (клон 1D5, производство фирмы DAKO), к белку рецептора прогестерона (клон PgR636, производство фирмы DAKO) и набор DAKO HerceptTest для детекции c-erbB-2/HER-2.

Подсчет результатов иммуногистохимического анализа проводился с использованием следующих критериев:

- для рецепторов половых гормонов определяли опухолевые клетки со слабо, умеренно и интенсивно окрашенными ядрами. Выраженность экспрессии оценивали в баллах от 0 до 300 по шкале H-счёта, используя следующую формулу:

H = 3ЧА + 2ЧВ + 1ЧС,

где, А - доля сильноокрашенных ядер (в процентах), В-доля умеренно окрашенных ядер, С - доля слабоокрашенных ядер опухолевых клеток.

- для анализа гиперэкспрессии HER-2 использовались критерии разработанные компанией DAKO: 0 баллов - окрашивание отсутствует или окраска менее 10% опухолевых клеток; 1+ балл - неполное окрашивание клеточной мембраны, окрашено более 10% опухолевых клеток; 2+ балла - полное окрашивание мембраны, слабое или умеренно выраженное окрашивание более 10% опухолевых клеток; 3+ балла - полное сильное окрашивание мембраны опухолевых клеток.

- для анализа пролиферативной активности подсчитывали среднее количество K-67-положительных клеток в ткани опухоли.

Определение EGFR и hVEGFR-165 в сыворотке крови

Иммуносорбентное определение EGFR, hVEGFR-165 проводилось на основании «сэндвич» метода твердофазного иммуноферментного анализа с использованием иммуноферментных наборов BioSource International, Inc. Human EFG ELISA и BioSource International, Inc. Human VEFG ELISA.

Определение метаболитов эстрогена в сыворотке крови и моче больных РМЖ

Определение концентраций метаболитов эстрогена в моче проводилось иммуносорбентным анализом при помощи иммуноферментного набора ESTRAMET 2/16 ELISA. Набор основан на конкурентном методе твердофазного иммуноферментного анализа. 20НЕ1 и 160НЕ1 в моче обнаруживаются в форме 2-глюкуронида и 3,16 - глюкуронидов, соответственно, и требуют удаления сахаров перед тестированием, для распознавания моноклональными антителами. Для высвобождения эстрогенов от глюкуроновой кислоты и от сульфата используют смесь ферментов Р-глюкуронидазы и арилсульфатазы, выделенных из улитки Helix рomatia (смесь «Глюсулаза»). В ходе анализа при подготовке образцов, аликвоту мочи разводят в соотношении 1 / 20 буфером, содержащим ферменты, и инкубируют до полного расщепления. Затем смесь ферментов нейтрализуется, и полученный раствор используется непосредственно для анализа. Антиген Ki-67 определяли иммуногистохимическим методом с использованием специальных тест-систем фирмы Daco.

Определение мутационного статуса онкогенов

Полимеразная цепная реакция проводилась с использованием специфических праймеров фирм Синтол и Литех, ДНК выделялось из парафиновых образцов опухоли и плазмы крови хлороформно-фенольной методикой. Секвенирование нуклеотидных последовательностей проводили на генетическом анализаторе Applied Biosystems 3130xl. Определялись следующие онкогены: B-raf (15 экзон), C-kit (11 экзон) 560 кодон, APC (16 экзон) 1309 кодон, K-ras (1 экзон) 12 кодон+13 кодон+17 кодон, p53 (5 экзон) 175 кодон, p53 (6 экзон), p53 (7 экзон) 248 кодон, p53 (8 экзон) 273 кодон, E-cadherin, р16 (табл. 2). На рис. 1-11 приведены примеры секвенограмм.

Таблица 2. Последовательность олигонуклеотидов

№	Название	Последовательность 5'-3'	Длина	Мол. масса	ОЕ	Количество пмоль	мкг
1	K-rАs121/А	АTgACTgAAТАТАААCTTgТggТА	24	7477	3,5	12240	91,5
2	K-rАs121/Ь	СААgАТТТАССТСТАТТgТТ	20	6119	3,5	16400	100,4
3	Ех 11 forward	СТА TTТ ТТС ССТ ТТС ТСС СС	20	5958	3,5	20010	119,2
4	Ех 11 reverse	ТАС ССА ААА Agg TgA САТ gg	20	6221	3,5	14650	91,1
5	APC1309F	gCA gAT ТСТ gCT ААТ АСС CTg САА	24	7359	3,5	13360	98,3
6	APC1309R	САСТgCTggAАСТTCgСТСАСА	22	6717	3,5	15260	102,5
7	BRAF1F	ТСА Т ААТgСTTgСТСТgАТАggА	23	7116	3,5	13740	97,8
8	BRAF1R	ggCCAAAAA TTТ АА TCAgTggA	22	6854	3,5	13190	90,4
9	р53-5-Аех	ТAgCTCgCTAgTgggTTgCAg	21	6555	2,4	10630	69,7
10	р53-5-Вех	gggCAACCAgCCCTgTCg	18	5548	3,5	18710	103,8
11	р53-6-Аех	TTGCCCAGGGTCCCCAGGCCTCTGATTC	28	8555	3,5	12730	108,9
12	р53-6-Вех	ACTGCTCACCCGGAGGGCCACTGACAAC	28	8591	3,5	11710	100,6
13	р53-7-Аех	ggCCTCA TCTTgggCCTgTg	20	6178	2,2	11110	68,6
14	р53-7-Вех	CCAgTgTgCAgggTggCAAg	20	6285	3,5	15560	97,8
15	р53-8-Аех	GССТСТТGСТТСТСТТТТССТАТССТGАG	29	8790	3,5	12830	112,8
16	р53-8-Вех	TCTGAGGCATAACTGCACCCTTGGTC	26	7984	3,5	12890	102,9

Рис. 1. Фрагмент секвеннограммы нормальной последовательности 5-го экзона гена р53 (обратный праймер)

Рис. 2. Фрагмент секвеннограммы 5-го экзона гена р53 (обратный праймер) содержащий замену в 157 кодоне (GTG-TTG) приводящую к замене аминокислоты валин на лейцин



Рис. 3. Фрагмент секвеннограммы нормальной последовательности 6-го экзона гена р53 (прямой праймер)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 4 Фрагмент секвеннограммы 6-го экзона гена р53 (прямой праймер) содержащий замену в 215 кодоне (AGT-CGT) приводящую к замене аминокислоты серин на аргинин

Рис. 5. Фрагмент секвеннограммы нормальной последовательности 7-го экзона гена р53 (прямой праймер)



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6. Фрагмент секвеннограммы 7-го экзона гена р53 (прямой праймер) содержащий инсерцию TGG, после 257 кодона, приводящую к вставке аминокислоты триптофан на 258 позицию

Рис. 7. Фрагмент секвеннограммы нормальной последовательности 8-го экзона гена р53 (обратный праймер)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 8. Фрагмент секвеннограммы 8-го экзона гена р53 (обратный праймер) содержащий замену в 283 кодоне (CGC-TGC) приводящую к замене аминокислоты аргинин на цистеин



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 9. Секвенограмма гипервариабельного участка 1-го экзона гена K-ras. (обратный праймер). А - норма. Б - секвенограмма гипервариабельного участка 1-го экзона гена K-ras. (обратный праймер). Замена в 13 кодоне (GGC-GAC), приводящая к замене аминокислоты глицин на аспарагиновую кислоту

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

А Б

Рис. 10. Секвенограмма гипервариабельного участка 15-го экзона гена B-raf (прямой праймер). А - норма. Б - секвенограмма гипервариабельного участка 15-го экзона гена B-raf (прямой праймер). Замена в 600 кодоне (GTG-GAG), приводящая к замене аминокислоты валин на глутаминовую кислоту



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

А Б

Рис. 11. Секвенограмма гипервариабельного участка 16-го экзона гена APС (обратный праймер). А - норма. Б - секвенограмма гипервариабельного участка 16-го экзона гена APС (обратный праймер). Замена в 1309 кодоне (GAA-CAA) приводящая к замене аминокислоты глутаминовая кислота на глутамин

Статистический анализ. Статистический анализ полученных данных включал использование средних значений в группах (M±m), параметрических и непараметрических критериев достоверности различий p (критерий хи-квадрат, точный метод Фишера, критерий Манна-Уитни), показателя корреляции r. В ряде случаев для сравнения нескольких показателей использовался регрессионный анализ. При проведении статистического исследования использованы лицензионные программы Microsoft Excel 2002 пакета Microsoft Office XP и STATISTICA 6,0. Различия считались значимыми при р<0,05, что соответствует 95%-ной вероятности безошибочного прогноза.

Результаты исследования и их обсуждение

Клинико-морфологические особенности исследованных случаев РМЖ

На сегодняшний день известно большое количество клинических и морфологических прогностических признаков для РМЖ. К ним относят: возраст пациентов, размеры опухолевого узла, наличие метастазов и количество пораженных лимфатических узлов, степень злокачественности опухоли. Проведено исследование клинико-морфологических особенностей рака молочной железы.

С помощью корреляционного анализа по Спирмену была выявлена обратная взаимосвязь между степенью злокачественности РМЖ и возрастом пациентов. Коэффициент корреляции по Спирмену между показателями «средний возраст пациентов» и «степень злокачественности» составил г = -0,89 (р<0,05).

Пациенты с опухолями с различной степенью злокачественности статистически достоверно отличались друг от друга по показателям: «множественности (> 1) метастатического поражения лимфатических узлов» (р = 0,01). Чем выше степень злокачественности РМЖ, тем чаще поражались метастазами 2 и более лимфатические узлы (p = 0,01).

У пациентов обследуемой группы встречались опухоли различных размеров. Минимальный размер выявленной опухоли составил 0,4 см, максимальный - 13 см. В ряде случаев при поражении всей молочной железы или воспалительной форме РМЖ определить размер опухоли не представлялось возможным.

С помощью коррелляционного анализа по Спирмену было обнаружено, что размер опухоли прямо пропорционально кореллировал с возрастом пациентов (коэффициент корреляции по Спирмену r = 0,4). У пациентов пожилого возраста достоверно чаще (р <0,05) встречались опухоли крупных размеров.

Прямой зависимости между количеством пораженных метастазами лимфатических узлов и размерами опухоли не выявлено (коэффициент корреляции по Спирмену r = 0,16;). Не установлено взаимосвязи между количеством пораженных метастазами лимфатических узлов и возрастом обследуемых пациентов.

Гиперэкспрессия HER-2 в ткани опухоли больных РМЖ

При оценке экспрессии HER-2/neu установлена прямая зависимость с возрастом больных. Экспрессия выражена сильнее в группе больных до 49 лет и до 59 лет, в дальнейшем с возрастом она снижается (таб. 3). Частота гиперэкспрессии HER-2 составила 56,5% в группе больных до 49 лет и 23,9% в группе больных более 55 лет. Эти показатели оказались статистически достоверными (р=0,05).

Таблица 3. Зависимость гиперэкспрессии онкобелка HER-2 при РМЖ от возраста пациентов

Возраст пациентов	HER-2
	0 баллов	1+ баллов	2+ баллов	3+ баллов
	n	%	n	%	n	%	n	%
< 49 лет	14	26	16	32	19	38	20	43
50-55 лет	10	18,5	10	20	24	48	16	35
> 55 лет	30	55,5	24	48	7	14	10	22
Всего	54	100	50	100	50	100	46	100

При изучении связи гормонального статуса опухолевой ткани с экспрессией HER-2/neu выявлено, что у больных с рецептор-положительными опухолями гиперэкспрессия HER-2/neu ниже, чем при отсутствии рецепторов половых гормонов (таб. 4). В группе больных с РЭ+РП+ опухолях частота гиперэкспрессии HER2 составила 22,8%, тогда как в группе РЭ-РП - 67,1%.

Таблица 4. Экспрессия рецепторов половых гормонов и гиперэкспрессия онкобелка HER-2 при РМЖ

Рецепторный фенотип опухоли	Гиперэкспрессия HER-2
	0 баллов	1+баллов	2+баллов	3+баллов
	n	%	n	%	n	%	n	%
РЭ+РП +	30	55,5	31	62	9	18	9	19,5
РЭ + РП-	9	16,5	5	10	7	14	7	15
РЭ-РП +	-	-	2	4	5	10	4	8,5
РЭ-РП-	15	28	12	24	29	58	26	57
Всего:	54	100	50	100	50	100	46	100

Пролиферативная активность опухолевых клеток

Пролиферативная активность опухолевых клеток снижается с увеличением возраста больных. При изучении связи индекса Ki-67 с экспрессией HER-2/neu установлена прямая корреляция между экспрессией двух маркеров (табл. 5).

Таблица 5. Среднее значение уровня экспрессии антигена Ki-67 в клетках рака молочной железы с различными HER-2-фенотипами

	Экспрессия HER-2
	0 баллов	1+ баллов	2+баллов	3+ баллов
Среднее значение индекса Ki-67 (%)	33*	29*	49*	56*
Всего	n = 54	n = 50	n =50	n =46

Примечание: * - статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни)

У пациентов с опухолевыми фенотипами HER-2 (2+) и (3+) уровень экспрессии Ki-67 в РМЖ был статистически достоверно выше в сравнении с пациентами, опухоли которых не экспрессировали онкобелок HER-2 (фенотипы HER-2 (0) и (1+)).

Следующим этапом было сравнительное исследование индекса Ki-67 в опухолях с различным РЭ и РП фенотипами (табл. 6). Уровень пролиферативной активности (индекс Ki-67) клеток РМЖ с фенотипом РЭ-РП - был статистически достоверно выше, чем в РМЖ с фенотипом РЭ+РП+ (р<0,01; тест Манна-Уитни). Аналогичные отличия были выявлены между группами пациентов с опухолевыми фенотипами РЭ-РП+ и РЭ+РП+ (р<0,05; тест Манна-Уитни). Эти результаты позволяют в целом характеризовать РЭ - РП - и РЭ-РП+ опухоли, как имеющие неблагоприятный прогноз заболевания. Средние значения уровней экспрессии антигена Ki-67 в группах пациентов с опухолевыми фенотипами РЭ+РП+ и РЭ+РП-; РЭ-РП+ и РЭ-РП - не различались между собой (р > 0,05; тест Манна-Уитни).

Таблица 6. Уровень экспрессии антигена Ki-67 в опухолях с различными РЭ/РП фенотипами

	Фенотип РМЖ
	РЭ+РП+	РЭ+РП-	РЭ-РП+	РЭ-РП-
Среднее значение антигена Ki-67 (%)	30*±14	36±13	48*±19	52*±18
Всего, n	79	28	11	82

Примечание: * - статистически достоверное отличие (р<0,01; р<0,05; тест Манна-Уитни)

Индекс Ki-67 отрицательно корреллировал с уровнем экспрессии РЭ (коэффициент корреляции по Спирмену r = - 0,47; р < 0,01) и РП (коэффициент корреляции по Спирмену r = - 0,44; р < 0,05). Таким образом, чем выше был уровень экспрессии (HScore) РЭ и РП, тем ниже отмечалась пролиферативная активность клеток РМЖ.

В процессе нашего исследования в зависимости от уровня экспрессии РЭ, РП в РМЖ пациенты были разделены на группы с отрицательной (HScore меньше 10 баллов), слабоположительной (HScore от 11 до 99 баллов) и положительной (HScore больше 100 баллов) экспрессией рецепторов стероидных гормонов. Средние значения индекса пролиферации Ki-67 в РМЖ с различным уровнем экспрессии РП представлены в табл. 7.

Таблица 7. Среднее значение индекса Ki-67 в клетках рака молочной железы с различным уровнем экспрессии рецепторов прогестерона

	РП-отрицательный	РП-слабоположительный	РП-положительный
Среднее значение индекса Ki-67 (%)	46±6	30±2*	23±4
Всего	n = 110	n = 30	n = 60

Примечание: * - статистически достоверные отличия (р<0,05; тест Манна-Уитни)

Опухоли со слабоположительной экспрессией РП отличались от опухолей с положительной и отрицательной экспрессией РП по экспрессии антигена Ki-67 (%) (р < 0,05). Уровень экспрессии антигена Ki-67 в РМЖ увеличивался обратно пропорционально уровню экспрессии РП. При положительной экспрессии РП Ki-67 составил в среднем 19-27%, при слабоположительной экспрессии РП уровень Ki-67 составил 28-32%, при отрицательной экспрессии РП уровень Ki-67 составил 42-52%.

Таким образом, стоит отметить, что РП - слабоположительные РМЖ характеризуются не только высокой экспрессией онкобелка HER-2, но и также повышенной экспрессией антигена Ki-67.

Уровень гормональных рецепторов и метаболитов эстрогена при РМЖ

Экспрессия ЭР значимо зависит от возраста больных РМЖ. Можно выделить три возрастные группы пациентов по выраженности экспрессии ЭР: минимальная экспрессия у лиц в возрасте до 49 лет, умеренно выраженная экспрессия в возрасте 50-59 лет и высокая экспрессия ЭР у больных в возрасте 60-69 лет. Содержание в опухолевых клетках ЭР увеличивается с возрастом больных.

Экспрессия ПР не отличается столь чёткими закономерностями, как содержание в опухоли ЭР. При изучении эстроген-зависимых опухолей репродуктивных органов была показана важная роль, которую играет метаболическое окисление эстрогена при гормоночувствительных заболеваниях. 16-гидроксилированные соединения являются более эффективными эстрогенами, эти значительные изменения могут иметь важное гиперэстрогенные последствия, которые могут иметь отношение к этиологии опухолей репродуктивной системы, и, в особенности, рака молочной железы. Соотношение 20НЕ1/16ПОНЕ1 может быть новым вспомогательным биомаркером определения риска развития рака молочной железы. Этот биомаркер может предоставлять аналитическую основу для разработки новых фармакологических и диетологических стратегий.

Установлена зависимость между концентрацией метаболитов эстрогена от степени дифференцировки опухоли (табл. 8), ее рецепторного фенотипа (табл. 9), пролиферативной активности (табл. 10) и экспрессии HER-2/neu (табл. 11).

Таблица 8. Уровень метаболитов эстрогена в зависимости от степени дифференцировки опухоли

Степень дифференцировки	Концентрация 2 (ОНЕ-1), среднее значение	Концентрация 16 (б ОНЕ-1), среднее значение	Соотношение 2 (ОНЕ-1)/16 (б ОНЕ-1)
Высокая степень дифференцировки	2,8	7,2	1 / 2.5
Средняя степень дифференцировки	4,6	13,5	1 / 2,9
Низкая степень дифференцировки	5,1	20,8	1 / 4

У всех больных РМЖ, независимо от степени дифференцировки опухоли, наблюдаются повышенные концентрации обоих метаболитов эстрогена и их дискордантное соотношение (преобладание «агрессивного» 16 (б ОНЕ-1) над физиологическим «хорошим» 2 (ОНЕ-1)).

При этом, чем выше степень злокачественности опухоли, чем ниже ее степень дифференцировки, тем выше концентрация метаболитов и сильнее дискордантность соотношения 2 (ОНЕ-1)/16 (б ОНЕ-1). При изучении связи гормонального фенотипа опухоли с концентрациями метаболитов эстрогена выявлено, что при гормонопозитивном статусе опухолевой ткани (РЭ+РП+) средние концентрации метаболитов ниже, чем при гормононегативном фенотипе (РЭ-РП-) (табл. 9). Дискордантность соотношения 2 (ОНЕ-1)/16 (б ОНЕ-1) также сильнее выражена при гормоноотрицательном фенотипе опухоли.

Таблица 9. Уровень метаболитов эстрогена в зависимости от гормонального фенотипа опухоли

Гормональный фенотип опухоли	Концентрация 2 (ОНЕ-1), среднее значение	Концентрация 16 (б ОНЕ-1), среднее значение	Соотношение 2 (ОНЕ-1)/ 16 (б ОНЕ-1)
РЭ+, РП+	2,7	6,8	1 / 2,5
РЭ-, РП-	4,2	19,6	1 / 4,6

Из данных табл. 9 видно, что чем выше экспрессия патологического онкобелка HER-2/neu, тем отчетливее нарушение гормонального статуса больных РМЖ, выше концентрации метаболитов эстрогена и выше преобладание 16 (б ОНЕ-1) над 2 (ОНЕ-1).

Таблица 10. Изучение уровня метаболитов эстрогена в зависимости от экспрессии HER-2

Степень экспрессии HER-2/neu	Концентрация 2 (ОНЕ-1), среднее значение	Концентрация 16 (б ОНЕ-1), среднее значение	Соотношение 2 (ОНЕ-1)/ 16 (б ОНЕ-1)
1+ баллов	2,3	4,9	1 / 2
2+ баллов	3,9	9,6	1 / 2,6
3+ баллов	6,1	20,8	1 / 3,4

Таблица 11. Изучение уровня метаболитов эстрогена в зависимости от значения индекса пролиферативной активности Ki-67

Значение индекса Ki-67, %	Концентрация 2 (ОНЕ-1), среднее значение	Концентрация 16 (б ОНЕ-1), среднее значение	Соотношение 2 (ОНЕ-1)/ 16 (б ОНЕ-1)
0-35	2,1	4,5	1 / 2,1
36-50	3,2	8,4	1 / 2,6
51-75	5,4	19,2	1 / 3,5
Выше 75	6,0	22,7	1/4,3

При анализе взаимосвязи активности опухолевых клеток с гормональными изменениями, выявлено, что чем выше индекс пролиферативной активности клеток, тем большие изменения происходят в эстрогеновом статусе больных РМЖ - выше средние значения метаболитов эстрогена и более выражена дискордантность их соотношения.

Мутационный статус больных с РМЖ по парафиновым образцам тканей

Следующим этапом исследования стало изучение происходящих молекулярно-генетических изменений, происходящих при РМЖ. Изучалась выраженность этих нарушений в зависимости от гистологического варианта опухоли, рецепторного статуса, пролиферативной активности.

Оказалось, что при изучении операционного и биопсийного материала большее количество мутаций наблюдается у больных с низкодифференцированными опухолями. При этом наиболее часто встречаются мутации генов р 53 в 7 экзоне, k-ras, E-кадхерин. Чем выше пролиферативная активность опухолевых клеток по индексу Ki-67, тем больше количество генетических нарушений в опухолевых клетках (табл. 12).

Таблица 12. Распределение больных с выявленными мутациями различных генов в зависимости от степени дифференцировки опухоли (n=200)

Парафиновые образцы	ДНК	ВД1 (n=24)	УД2 (n=64)	НД3 (n=112)	Кол-во мутаций
	р53	5 экзон	6	12	24	44
		6 экзон	9	14	89	76
		7 экзон	16	36	112	156
		8 экзон	8	19	44	80
	C-kit	12 кодон	0	4	24	28
	B-raf	15 кодон	4	18	20	40
	APC		4	8	16	28
	K-ras	12,13 кодоны	0	20	64	80
	E-кадхерин	гиперметилирование	10	12	44	64
	р16	гиперметилирование	0	12	32	44
	Итого		49	155	469
	Ki -67	0-35%	18	7	-
		36-50%	4	32	20
		51-70%	2	18	59
		>70%	-	7	33

Примечание: ¹ - высокодифференцированный РМЖ; ² - умереннодифференцированный РМЖ; ³ - низкодифференцированный РМЖ

Таблица 13. Молекулярно-генетический статус больных РМЖ с различным гормональным и HER2/neu фенотипами

	РЭ-, РП-, HER2/neu (3+) (n=82)	РЭ +++, РП +++, HER2/neu (-) (n=79)
р53	5 экзон	12	4
	6 экзон	36	24
	7 экзон	100	52
	8 экзон	24	16
C-kit	12 кодон	20	20
B-raf	15 кодон	24	16
APC		4	12
K-ras	12,13 кодоны	72	56
E-кадхерин	гиперметилирование	60	44
р16	гиперметилирование	16	8
Итого		368	252
Ki -67	0-35%	4	45
	36-50%	10	27
	51-70%	43	7
	>70%	25	-

Из данных таблицы видно, что наибольшее количество мутаций выявлено у больных РМЖ с низкой степенью дифференцировки опухоли (469 мутаций). При этом преобладают мутации генов р 53 в 6, 7 ех (104 случаев у больных с низкодифференцированным РМЖ) и E-кадхерин (44 случаев у больных с низкодифференцированным РМЖ). Индекс пролиферативной активности Ki-67 большее значение (>70%) имел также у больных с низкодифференцированными формами РМЖ (112 случаев). У больных с гормоно-чувствительными вариантами опухолей (РЭ+, РП+) выраженность мутационных нарушений по сравнению с гормоно-негативными фенотипами значительно слабее (табл. 13). Таким образом, мутации генов р 53, E-кадхерин, K-ras чаще выявляются при рецептор-отрицательном и HER2/neu (3+) фенотипе.

Уровень EGFR и hVEGFR-165 в сыворотке крови больных РМЖ

Средняя концентрация EGFR и hVEGFR-165 в сыворотке крови составила 20,9 fmol/ml и 147,9 pg/ml соответственно. Также установлено, что независимо от степени дифференцировки опухоли, имеет место гиперэкспрессия рецепторов факторов роста (EGFR, hVEGFR-165). Однако прослеживается прямая зависимость выраженности гиперэкспресии РЭФР от пролиферативной активности клеток и происходящими при этом молекулярно-генетическими изменениями (таб. 14). Как видно из данных таблицы, у больных с низкодифференцированными формами РМЖ уровень EGFR, hVEGFR-165 значительно превышает нормативные пороговые значения (EGFR=36,7 fmol/ml, hVEGFR-165=168,0 pg/ml).

Таблица 14. Молекулярно-генетический статус больных РМЖ в зависимости от экспрессии ростовых факторов (EGFR, hVEGFR-165 (до лечения)

	р53 5 экзон	р53 6 экзон	р53 7 экзон	р53 8 экзон	C-kit	B-raf	APC	K-ras	E-кадхерин	р16	EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml)
Высокая степень дифференцировки	6	9	16	8	-	4	4	-	10	-	EGFR 10,8 hVEGFR-165 130,0
Средняя степень дифференцировки	12	14	36	19	4	18	8	20	12	12	EGFR 15,4 hVEGFR-165 145,7
Низкая степень дифференцировки	24	89	112	44	24	20	16	64	44	32	EGFR 36,7 hVEGFR-165 168,0

Оценка эффективности проводимой терапии и полноты излеченности больных РМЖ после проведения противоопухолевого лечения

Считая, что под воздействием специального противоопухолевого лечения, должны происходить качественные и количественные изменения мутационного статуса (выраженность должна уменьшиться или исчезнуть вовсе), мы изучили молекулярно-генетический статус больных РМЖ по плазме крови при помощи неинвазивных методов после проведения противоопухолевого лечения (табл. 15,16).

Таблица 15. Молекулярно-генетический статус больных в зависимости от экспрессии ростовых факторов (EGFR, hVEGFR-165) (после 4-х курсов ПХТ)

	р53 5 экзон	р53 6 экзон	р53 7 экзон	р53 8 экзон	C-kit	B-raf	APC	K-ras	E-кадхерин	р16	EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) hVEGFR-165 (N=0-120 pg/ml)
Высокая степень дифференцировки	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	EGFR 9,8 hVEGFR-165 = 130,0
Средняя степень дифференцировки	-	1	21	7	1	6	-	11	10	-	EGFR 12,6 hVEGFR-165 = 138,3
Низкая степень дифференцировки	-	23	56	21	1	19	-	51	26	-	EGFR 15,7 hVEGFR-165 = 147,2

Таблица 16. Молекулярно-генетический статус больных РМЖ в зависимости от экспрессии ростовых факторов (EGFR, hVEGFR-165 (после 6-и курсов ПХТ)

	р53 5 экзон	р53 6 экзон	р53 7 экзон	р53 8 экзон	C-kit	B-raf	APC	K-ras	E-кадхерин	р16	EGFR (N=0-9,5 fmol/ml) VEGFR (N=0-120 pg/ml)
Высокая степень дифференцировки	-	-	-	-	-	-	-	-	-	-	EGFR 9,8 hVEGFR-165 130,0
Средняя степень дифференцировки	-	-	16	4	-	4	-	8	8	-	EGFR 12,6 hVEGFR-165 =135,6
Низкая степень дифференцировки	-	8	44	20	-	12	-	44	24	-	EGFR 15,7 hVEGFR-165 = 130,0

Таким образом, после проведения 4-х курсов ПХТ наблюдается отсутствие мутаций у больных высокодифференцированными формами РМЖ. Т.е. этим больным дальнейшее проведение курсов противоопухолевого лечения будет необоснованным. У больных же с более низкодифференцированными опухолями мутационные изменения в клетках сохраняются, т.е. молекулярная ремиссия не достигнута, и отменять ПХТ, даже при удовлетворительной клинико-инструментальной картине, нельзя.

При анализе изменений, произошедших после проведения 6-и курсов ПХТ, наблюдается уменьшение количества мутаций в генах, а также снижение уровня EGFR, hVEGFR-165 у больных с низкодифференцированными опухолями. Таким больным рекомендовано продолжение специального лечения химиопрепаратами, с контролем через каждые 2 курса ПХТ, до достижения молекулярной ремиссии.

В связи с тем, что в настоящее время нет достоверных маркеров оценки эффективности адъювантной терапии, исследование молекулярно-генетического статуса (мутации в онкогенах, Ki-67, EGFR, VEGFR, метаболитов эстрогена - 2 (ОНЕ-1), 16б (ОНЕ-1), РЭ, РП, HER-2/neu и гистологического типа опухоли) должны рассматриваться как маркеры оценки эффективности проводимого специального лечения, а также маркерами полноты излеченности, а в необходимых случаях - маркерами коррекции проводимой терапии.

Выводы

1. Степень морфологической дифференцировки рака молочной железы корреллирует с экспрессией молекулярно-генетических маркеров.

2. Опухоли с низкой степенью дифференцировки имеют наибольшее количество мутаций (469 мутаций). При этом преобладают мутации генов р53 в 6б 7 ех кодонах и гена Е-кадхерина.

3. В опухолевых клетках больных с низкой степенью дифференцировки более высокая пролиферативная активность, определенная по экспрессии антигена Ki-67. В плазме крови этих больных повышен уровень антигенов EGFR и VEGFR.

4. После проведенного хирургического, химиолучевого лечения, наблюдается снижение количества мутаций в генах и корреляционное снижение уровня EGFR, VEGFR в плазме крови.

5. При отсутствии рецепторов эстрогена и прогестерона на поверхности опухолевых клеток наблюдается более агрессивное течение заболевания. У пациентов с такими фенотипами опухолей достоверно чаще встречаются метастазы в регионарные лимфатические узлы.

6. Низкий у...