Структура и экспрессия MMTV-родственного провируса у больных раком молочной железы

Следует подчеркнуть наличие экспрессирующихся провирусных последовательностей у всех 3-х изученных пациенток с злокачественными ЛО МЖ на фоне беременности и доброкачественной ЛО после медицинского аборта. У одной из этих MMTV-позитивных пациенток наступление беременности стимулировало быстрый рост неоплазий в обеих МЖ и увеличение опухоли в 3 раза, при сроке беременности 20 нед. У другой пациентки беременность сопровождалась четвертым рецидивом ЛО.

2.3.6 MMTV-гомологичные последовательности у больных РМЖ и неходжкинскими Т-клеточными лимфомами

Одной из причин этого заболевания может служить вирус Эпштейна-Барр, ДНК которого была обнаружена в опухолевой ткани больных. С помощью ПЦР, ОТ ПЦР и электронной микроскопии в сыворотках крови пациентов, страдающих лимфомой в сочетании с РМЖ были выявлены частицы эндогенных ретровирусов семейства HERV-K (HML-2), (Contreras-Galindo et al., 2008). Показано, что у мышей некоторых инбредных линий MMTV может вызывать, помимо РМЖ, В- и Т-клеточные лимфомы ( Dudely et al, 2005, Bhandra et al, 2005). Для лимфомагенного варианта MMTV характерно наличие Т-специфического энхансера и утрата репрессии транскрипции за счёт делеции или супрессии области негативного репрессора (NRE). При инъекции мышам с иммунодефицитом экстрактов тканей РМЖ человека в ряде случаев наблюдалась индукция Т-клеточных лимфом с фенотипом TcR/+CD4/8 (Wakasugi et al, 1995). С помощью ПЦР и секвенирования соответствующих ПЦР продуктов в Т-клеточной лимфоме у пациентки с РМЖ и лимфомой ранее были обнаружены последовательности, на 99% гомологичные гену env MMTV штамма BR6 и на 100% - гену env MMTV штамма C3H. Затем последовательности, гомологичные env MMTV и Sag-кодирующей ORF 3'- LTR MMTV, были обнаружены еще у 6 из 12 больных РМЖ и Т-клеточными лимфомами (Etkind et al., 2004). Если у мышей лимфомагенный вариант MMTV несет делецию в ORF LTR и транскрибируется укороченная иРНК Sag, то у исследованных пациенток такой делеции выявлено не было. Клонирование и секвенирование этих последовательностей показало различие клонированных ПЦР-продуктов, полученных от разных пациенток. Это говорит в пользу множественной инфекции разными штаммами MMTV.

Для уточнения имеющихся в литературе немногочисленых данных мы проанализировали образцы ДНК, полученные от 8 пациенток с РМЖ и Т-клеточной лимфомой (табл.1). Лимфомы были диагностированы у этих пациенток одновременно или вскоре после обнаружения РМЖ, одна из больных в момент диагноза была в первом триместре беременности. Исследовали ткань РМЖ, ДНК из ЛПК и гиперплазированные лимфоузлы (ГЛУ). Для сравнения исследовали опухолевую ткань, полученную от 5 пациенток с неходжкинскими лимфомами, наблюдавшихся в РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН.

С помощью специфичной ПЦР с праймерами к gp52- кодирующей области гена env MMTV и к Sag-кодирующему участку 3'LTR MMTV последовательности, относящиеся к hMTV, были выявлены у 4 из 8 пациенток. Секвенирование ПЦР-продуктов на матрице ДНК из лимфомной ткани выявило делецию 15-ти нуклеотидов в области 3' LTR и однонуклеотидные замены в области env MMTV, что может привести к преждевременной терминации транскрипции .

Рис 10. Результаты ПЦР-анализа ДНК из ГЛУ (1) и ЛПК (2), показаны различные по длине ПЦР-продукты из-за делеции 15 п.н. Sag-кодирующего участка 3'LTR, электрофорез в ПААГе.

Таким образом, мы подтвердили данные о наличии MMTV-гомологичных последовательностей не только в ткани РМЖ, но в ЛПК и ГЛУ больных, страдающих РМЖ и Т-клеточной лимфомой. В то же время, ПЦР-анализ не выявил этих последовательностей в образцах ГЛУ, полученных от пяти пациенток с неходжкинскими лимфомами, но без других онкопатологий, включая РМЖ.

У одной из позитивных больных РМЖ лимфома была обнаружена в ранние сроки беременности. При изучении ассоциации hMTV с РМЖ и лимфомами у человека предполагается сходство механизмов MMTV-индуцированного канцерогенеза РМЖ и лимфом. Скорее всего, эти опухоли развиваются одновременно или с небольшим интервалом времени. Отметим, что гемобластозы, включая лимфомы, могут развиваться и в результате геномной нестабильности клеток вследствие лучевой терапии РМЖ.

Различия в структуре MMTV-гомологичных последовательностей, обнаруженных в ткани РМЖ и Т-клеточных лимфом, указывают на возможность дивергенции латентного провируса, реплицирующегося в ЛПК или на множественную инфекцию человека разными штаммами MMTV (hMTV).

Рис 11. Сравнение ПЦР-фрагментов, гомологичных gp52-кодирующей области гена envMMTV (А) и области 3'LTR MMTV (Б), амплифицированных на ДНК из ГЛУ больной РМЖ в сочетании с лимфомами (нижняя строка) с каноническими последовательностями MMTV (геном мышей линии GR, верхняя строка); области делеций и/или нуклеотидных замен выделены жирным шрифтом. Гомология между сравниваемыми последовательностями составляет 94%.

2.3.7 Семейный случай РМЖ с острым миелоидным лейкозом

Мы исследовали ДНК из архивных образцов РМЖ, полученные в результате радикальной мастэктомии у пациентки в возрасте 37-ми лет из онкологически неотягощенной семьи (РОНЦ), а также ДНК из костного мозга, полученного от ее сына 11-ти лет, страдающего ОМЛ и наблюдавшегося в Отд.гематологии РДЦКБ, г.Москва. В контрольной группе было 6 мальчиков в возрасте от 2-х до 13-ти лет и 4 девочки в возрасте от 7-ми до 15-ти лет с первичным диагнозом ОМЛ, наблюдавшихся в отделении детской гематологии НИИ детской онкологии РОНЦ. По результатам цитогенетического анализа, пациенты с ОМЛ отнесены к группе носителей транслокации t(8;21), (данные Е.В.Флейшман и О.И.Соковой, НИИ канцерогенеза РОНЦ).

Амплификация ДНК, выделенной из заключенной в парафин опухолевой ткани пациентки с РМЖ, выявила ПЦР-продукт, гомологичный gp52-кодирующей области гена envMMTV. Гомология выявленного продукта была подтверждена с помощью Саузерн-блотинга. Прямое секвенирование ПЦР-продукта также обнаруживает 96-98% гомологии с геном envMMTV. ПЦР-анализ 11-ти пациентов с ОМЛ выявил 4 MMTV-позитивных образца ДНК из костного мозга (3 мальчика 9,11 и 13 лет и 1 девочка 15 лет), включая пациента, мать кторого страдала РМЖ. Все 6 пациентов с ОЛЛ оказались MMTV-негативными. Секвенирование env MMTV и 3'LTR MMTV-гомологичных продуктов выявило 93-94% гомологии с экзогенным MMTV (линии С3Н и HeJ). MMTV-гомологичные последовательности были впервые выявлены нами у 4-х из 11-ти детей с диагнозом ОМЛ, наблюдавшихся в НИИ детской онкологии РОНЦ. Полученные результаты свидетельствуют о вовлеченности MMTV -родственного ретровируса не только в лимфомагенез, но, возможно, и другие гемобластозы, включая ювенильный ОМЛ (Lushnikova, Smirnova, 2006). По-видимому, главную роль в диссеминации MMTV у таких больных играет инфекция дендритных и/или полипотентных гемопоэтических стволовых клеток миелоидной линии с последующей амплификацией провируса в активно пролиферирующих клетках костного мозга. С другой стороны, у нескольких больных ОЛЛ детей выявить MMTV-гомологичные последовательности нам не удалось (Lushnikova et al., 2006). Это указывает, что инфекция ретровирусом клеток-предшественников В- и Т-лимфоцитов, дающих начало лимфобластам, маловероятна или происходит с меньшей частотой, чем инфекция клеток миелоидной линии. Известно, что инфекция полноразмерным клонированным в плазмиде провирусом MMTV (JYC-MMTV) четырехнедельных беременных самок мышей линии CВА/CaJ, не несущих эндогенных копий MMTV , приводит к появлению инфекционных вирионов в молоке самок, появившихся от скрещивания между собой указанных инфицированных самок. Причем экспрессирующийся экзогенный JYC-MMTV был обнаружен не только в ткани молочной железы, но также в селезенке и костном мозге самок из потомства инфицированных животных. Ретровирус для клонирования был выделен у китайских мышей дикого типа с высокой частотой РМЖ, а его репликация поддерживалась в эпителиальных клетках крысы линии RBA (Xu et al. 2000). Обнаружение MMTV-гомологичных последовательностей в клетках костного мозга у сына MMTV-позитивной пациентки, болевшей РМЖ, подтверждает возможность вертикальной передачи провируса от матери к детям и роль лимфоидных клеток в его диссеминации.

2.3.8 MMTV-гомологичные последовательности у пациентки с РМЖ и другими неоплазиями

Анализ геномной ДНК, выделенной из ЛПК и опухолевой ткани больных РМЖ, а также доноров и пациентов с онкопатологиями другой локализации показывает, что носителями MMTV-гомологичных последовательностей (hMTV) являются далеко не все из исследованных образцов. Отсутствие hMTV в нормальной ткани без неопластических изменений, а также у целого ряда пациентов с неоплазиями четко свидетельтвует об экзогенности этого ретровируса. При исследовании одной из пациенток, страдающей РМЖ в сочетании с раком толстой кишки (РТК) нам удалось проследить пути циркуляции hMTV в организме человека и получить доказательства его экзогенного происхождения. При плановом обследовании пациенток из наследственно отягощенных семей, наблюдавшихся в НИИ клинической онкологии РОНЦ, в ДНК из ЛПК у пациентки К. были выявлены последовательности , на 93-97% гомологичные 3'LTR и гену env MMTV. В возрасте 48 лет этой пациентке был поставлен диагноз рак толстой кишки и хирургически удалена массивная опухоль, а также часть тонкого и толстый кишечник. Гистологически материал был описан и верифицирован в отд. патоморфологии РОНЦ. За три года до этой операции пациентка перенесла одностороннюю мастэктомию по поводу РМЖ. Среди родственников больной у бабушки по материнской линии был диагностирован РМЖ, у деда - рак мочевого пузыря, а у отца - рак легких . Мы исследовали кратковременные культуры клеток, полученных при соскобеэпителия хирургически удаленного кишечника и срезы фиксированной нормальной и опухолевой ткани кишечника этой больной, заключенной в парафин. Контролем служили хирургически удаленные ткани стенки кишечника одной больной полипозом кишечника и двух пациенток с раком толстого кишечника, ближашие родственники которые не болели РМЖ. Нужные микрофрагменты ткани: инфильтрированные лимфоцитами узелки и не инфильтрированные ими участки опухоли выделяли со среза путем микродиссекции. В образцах геномной ДНК, выделенной из ЛПК данной пациентки с помощью ПЦР с последующей гибридизацией по Саузерну были выявлены последовательности, гомологичные геному MMTV (hMTV). Для того, чтобы убедиться в экзогенности этих последовательностей, мы проанализировали с помощью ПЦР образцы ДНК из различных участков тканей кишечника. В ДНК, выделенной из фрагментов стенки кишечника, содержится также лимфоцитарная ДНК из Пейеровых бляшек - морфологически обособленных лимфатических узелков в стенке тонкого и верхнего отдела толстого кишечника. Если MMTV-гомологичные последовательности действительно экзогенного происхождения, т.е. попадают в организм человека извне, то наиболее вероятна передача ретровируса человеку путем инфицирования лимфоидных клеток. Эти клетки по-видимому, играют основную роль в передаче ретровирусного агента вертикально, включая внутриутробную инфекцию пролиферирующих клеток эпителия (Лушникова и др.2009). Механизмы преодоления иммунологического барьера не вполне ясны, однако известны факты передачи инфекции потомству при заражении экспрессирующимся экзогенным MMTV беременных самок мышей (Xu et al., 2000). Возможность инфекции мышиным MMTV эмбриональных клеток эпителия с последующей их трансформацией была продемонстрирована нами на модельных культурах эпителиальных клеток ПКЭПЧ и линии НЕК 293-Т in vitro, однако возможность внутриутробной инфекции in vivo пока не доказана.

2.3.9 MMTV-гомологичные последовательности в отдаленных метастазах у пациенток с РМЖ

Как было показано в наших работах, MMTV-родственный провирус использует для своей циркуляции в организме человека лимфоидные клетки. Кроме того, анализ клинических особенностей hMTV-позитивных опухолей МЖ говорит о более высокой частоте метастазов по сравнению с hMTV-негативными неоплазиями. Так например, частота отдаленных метастазов у hMTV-позитивных пациенток с РМЖАБ по сравнению с hMTV-негативными была достоверно выше. У одной из таких hMTV-позитивных пациенток в возрасте 37-ми лет с односторонним спорадическим РМЖ 4-й степени и отдаленными метастазами в головной мозг, легкие и скелетные кости были проанализированы образцы ДНК, выделенной из архивных образцов метастатических узлов в теменной области головного мозга, полученные при паталогоанатомическом вскрытии. Пациентка наблюдалась в МОНИКИ им. Вишневского, и прожила после хирургической операции 2,5 года, химиотерапии и лучевой терапии не проводилось. Параллельно был проанализирован образец ДНК, выделенной из заключенной в парафин ткани РМЖ, опухоль была получена после хирургической операции - резекции части пораженной МЖ. Контролем служили 5 образцов замороженной ткани головного мозга здоровых лиц, погибших в ДТП, полученные из Института скорой помощи, Москва. При ПЦР на образцах ДНК из ткани РМЖ и печени в качестве контроля использовали 2 образца хирургически удаленной гепатокарциномы, полученные в Отд.патоморфологии РОНЦ. Анализ образцов ДНК из метастазов у первой пациентки и анализ образцов ДНК из ткани РМЖ и печени у второй позволил выявить MMTV-гомологичные последовательности как в опухолевой ткани, так и в метастазах. Секвенирование ПЦР-продуктов, соответствующих gp52-кодирующей области гена env MMTV и Sag- кодирующей области 3'LTR не выявило значительных различий между соответствующими последовательностями в провирусной ДНК разной локализации у двух исследованных пациенток. Это указывает на общность происхождения MMTV-гомологичных последовательностей в опухоли МЖ и отдаленных метастазах в разные органы.

Гомология указанных последовательностей с геном env MMTV и Sag-

кодирующей областью 3'LTR провирусной ДНК штаммов НеJ и C3H

составила 96-98% и 92-95% , соответственно.

Клонирование и секвенирование провирусных последовательностей, изолированных путем ПЦР, показало от 88 до 94% гомологии с геномом MMTV (gi9626965) и 91-98% гомологии между отдельными клонами hMTV, изолированными из культур РМЖ разными авторами (Liu В. et al. 2001; Ford С. et al 2003). Эти структурные различия обусловлены различиями применяемых методов клонирования и секвенирования отобранных клонов, а также географическими особенностями распростанения различных штаммов MMTV- родственного ретровируса в человеческих популяциях (Levine P.H. et al., 2004).

2.3.10 Структурные особенности hMTV

Обнаружение провируса hMTV у пациенток, страдавших РМЖ в сочетании с другими неоплазиями, включая гемобластозы, позволяет предполагать дивергенцию MMTV-гомологичных последовательностей и, следовательно, полиморфную структуру провирусного генома, экспрессируюшегося в различных тканях. Напомним, что в организме человека представлен также широкий спектр эндогенных MMTV-гомологичных последовательностей, например суперсемейств HERV, HML и некоторых других. Все это осложняет ПЦР-анализ образцов ДНК, выделенных из ЛПК и опухолей.

В своей работе мы сосредоточились на изучении структуры функционально важных и непротяженных консервативных областей провирусного генома, имеющих минимальную гомологию с соответствующими генами наиболее близкого семейства HERV-K: от 9% до 15%. Выборочное секвенирование выявило несколько структурных вариантов gp52-кодирующей области гена еnv MMTV и Sag- кодирующей области 3'LTR в провирусном геноме. Последовательности, выявленные в опухолевой ткани, лимфатических узлах и ЛПК больных спорадическим контралатеральным двусторонним РМЖ по степени гомологии ближе к геному экзогенного MMTV, чем еnv MMTV-гомологичные последовательности, выявляемые в ткани РМЖ, лимфоузлах и ЛПК пациенток с РМЖАБ и двусторонним РМЖ, а также у пациенток с РМЖ в сочетании с неходжкинскими лимфомами. Этот вариант представляет особый интерес, поскольку содержит однонуклеотидные замены в области env MMTV, что может привести к появлению стоп-кодонов и терминации транскрипции гена на С-конце, т.е. возможна трансляция укороченного предшественника р73. К такому же результату приводит частичная делеция основного промотора Р1 в геноме рекомбинантного провируса. Однако, эта делеция не влияет на гормонозависимую транскрипцию гена еnv MMTV, а приводит к потере вирусом инфекционных свойств,

В основном, выявленный нами полиморфизм провирусной ДНК hMTV представлен однонуклеотидными заменами, не приводящими к сдвигу рамки считывания, но влияющими на степень гомологии провирусной ДНК с мышиным провирусом. В Sag- кодирующей области 3'LTR hMTV мы выявили делеции одного или нескольких нуклеотидов, что также обусловливает полиморфизм в данной области 3'LTR и в С-концевой области белка Sag. С-концевая область суперантигена является гипервариабельной и важна для активации специфичных Т-клеток CD4+, несущих определенные V-в-цепи Т-клеточных рецепторов (TCR). Известно, что Sag MMTV презентируется на поверхности В-и Т-клеток, а также ДК в составе молекул МНС II класса, связанных с гликопротеином оболочки MMTV - gp52. Поскольку разные штаммы передающегося с молоком экзогенного MMTV кодируют суперантиген с разной аминокислотной последовательностью на С-конце, при инфекции этими штаммами происходит стимуляция или делетирование разных субпопуляций Т-клеток. Взаимодействие лигандов CD40 и CD40L на поверхности В- и Т-клеток, соответственно, приводит к активации В-клеток и обеспечивает дальнейшую амплификацию и распространение MMTV в организме мышей (Okeoma et al., 2008). По-видимому, сходные механизмы Sag-зависимой активации лимфоидных клеток действуют и в человеческом организме. Косвенным доказательством этому является вариабельная структура последовательности, кодирующей С-концевой аминокислотный мотив суперантигена. Область 3'LTR MMTV - наиболее протяженная среди длинных концевых повторов известных ретровирусов. Сходный полиморфизм (возможно, следствие структурной дивергенции) Sag-кодирующей области 3'LTR был обнаружен ранее при анализе 3 штаммов MMTV у мышей одной и той же линии с высокой частотой ранних гормонозависимых опухолей МЖ (Sarkar., 2004). Полиморфизм провирусной ДНК, частичная гомология с эндогенными MMTV-родственными ретровирусами и наличие гипервариабельных участков в области 3'LTR hMTV создают трудности для ПЦР-анализа геномной ДНК из лимфоидной и опухолевой тканей и детекции MMTV-гомологичных последовательностей. Этого требуется ПЦР с менее специфичными праймерами, охватывающими область нескольких генов (gag pol env) и длинные концевые повторы, а затем - ПЦР с высокоспецифичными праймерами для выявления gp52-кодирующей области гена env MMTV и Sag- кодирующей области 3LTR, не амплифицирующейся у эндогенного Mtv. В ряде случаев для подтверждения структуры MMTV-гомологичных последовательностей требуется сравнение последовательностей клонированного и напрямую секвенированного ПЦР-продуктов. Путем ПЦР с праймерами к 5'LTR и области гена gag MMTV с последующим клонированием и секвенированием соответствующего продукта мы исследовали изменение структуры гена gag hMTV в области сайта фреймшифта в провирусной ДНК из опухолевой ткани больной РМЖАБ. С помощью вестерн-блотинга и антител против корового белка gag MMTV были обнаружены изменения экспрессии гена gag, возможно, обусловливающие неконтагиозность вирусных частиц, которые обнаруживаются в грудном молоке у некоторых больных РМЖ и здоровых женщин из группы риска (так называемый фактор молока).

По данным гибридизации in situ, в человеческих лимфоцитах имеется несколько сайтов преимущественной интеграции MMTV-гомологичных последовательностей, в частности на хромосомах 1p, 3q, 5q, 8p и 8q ( Lushnikova et al. , 2001: Лушникова и др. 2007). Однако мы не обнаружили каких-либо специфичных сайтов интеграции провируса в геном эпителиальных клеток (ПКЭПЧ, НЕК 293Т). По-видимому, в активно пролиферирующих трансформированных клетках провирус встраивается случайным образом, при этом возможно образование экстракопий провирусной ДНК. По-видимому, это способствует ускоренной репликации провируса в инфицированных эпителиальных клетках. Кроме того, случайная интеграция провируса в геном клеток повышает вероятность активации клеточных онкогенов в области +/- 25 т.п.н. от промотора MMTV(hMTV) с последующей трансформацией клеток. Cтохастическая интеграция провируса в геном стволовых клеток и клеток-предшественников, локализованных в растущей МЖ, по-видимому индуцирует целый каскад событий: от активации клеточных онкогенов (Wnt, FGF, Rspo, Notch4), индуцированной энхансерами MMTV, до нарушения экспрессии ряда клеточных генов и генетической нестабильности (Callahan, Smith, 2008). Различная картина экспрессии целого ряда регуляторных и структурных клеточных генов в MMTV-позитивных и негативных изогенных линиях РМЖ человека подтверждает это предположение (Melana et al., 2001). Диспергированное распределение сайтов интеграции провируса подтверждается также результатами компьютерного анализа сайтов интеграции hMTV, фланкированного короткими повторами длиной 6 п.н. по концам провируса, и ряда других ретровирусов в геном человека.

Рис 11. Результаты компьютерного анализа сайтов интеграции МMTV-гомологичного провируса (hMTV) в геном эпителиальных клеток человека по сравнению с другими ретровирусами (цифрами обозначены относительные расстояния, база данных BLAST 2.0).

2.3.11 Экспрессия MMTV-гомологичных последовательностей у человека

Ранее нами было показано, что обнаруживаемый в сыворотках крови больных РМЖ и некоторых здоровых женщин антиген, иммунологически родственный структурному белку оболочки gp52 транслируется с мРНК env MMTV (Лушникова др. 1998). Поверхностному гликопротеину gp52 отводится важная роль в инфекции Т- и В-клеток. Кроме того, ген env MMTV кодирует тирозинсодержащий аминокислотный мотив иммунорецепторов (ITAM), участвующих в клеточном сигналинге, а в случае их гиперактивации - в неопластической трансформации эпителиальных клеток (Ross et al., 2008 ).

Имеющиеся в литературе данные по экспрессии hMTV основаны на иммуногистохимической окраске срезов ткани РМЖ с использованием антител против gp52, которые были получены с помощью гибридом, экспрессирующих поверхностный и трансмембранный белки - anti MMTV SU и TM. Кроме того, экспрессия анализировалась с помощью нозерн-блоттинга и иммуноблотинга с использованием вирус-специфичных поликлональных антител (Faedo et al., 2004, Indik et al., 2006). Мы попытались проанализировать экспрессию важнейшего для жизненного цикла ретровируса белка gp52 с использованием мышиных моноклональных антител против gp52 MMTV и обратимого связывания их с магнитными частицами, на которых иммобилизованы молекулы IgG (ЗАО Силекс, Москва). Было показано, что концентрация иммунологически родственного gp52 MMTV белка в опухолевой ткани РМЖ достоверно выше, чем в крови, что отражает различия в уровне экспрессии провируса (табл.2).

Таблица 2. Концентрация gp52 MMTV в сыворотке и опухолевой ткани 2 пациенток с РМЖАБ.

Заключение

MMTV-родственный провирус (hMTV) имеет уникальную структуру. Кроме известных генов gag-pro-pol-env его геном содержит не менее четырех участков, кодирующих функционально важные ретровирусные белки: УТФазу, интегразу, суперантиген Sag и РНК-транспортер (Rem). В геномной ДНК имеется один основной и несколько дополнительных промоторов. Мутации в основном помотере Р1 негативно влияют на инфекционные свойства ретровирусных частиц, однако не нарушают транскрипцию гена env MMTV и сплайсинг мРНК, кодирующей белок gp52 и аминокислотный мотив ITAM с функцией онкобелка. Это обусловливает возможную роль hMTV в индукции неоплазий даже при наличии дефектных вирионов. Вариабельность некоторых областей генома MMTV/hMTV, а также их гомология с эндогенными ретровирусами (Mtv и HERV-K) затрудняют ПЦР-анализ экзогенных MMTV-гомологичных последовательностей в геномной ДНК, выделенной из лимфоидной и опухолевой ткани пациентов с РМЖ и с другими неоплазиями. Зачастую требуются дополнительные методы детекции провирусной кДНК: блот-гибридизация, клонирование ПЦР-продуктов и их секвенирование. Была показана корреляция между наличием транскриптов гена env MMTV и экспрессией в сыворотках крови больных РМЖ антигена, иммунологически родственного gp52. Нами предложен простой метод детекции в сыворотке или в лизате гомогенизированной ткани РМЖ продукта гена env MMTV с помощью моноклональных мышиных антител против gp52 (mabP2 anti-gp52 IgG), связанных с магнитными частицами, на которых иммобилизованы молекулы IgG.

Выводы

1. Геном провируса hMTV, обнаруженного в лимфоидной ткани и в опухолях МЖ человека, содержит консервативные и вариабельные области с высокой гомологией MMTV. Выявлены структурные изменения в области генов gag, gp52-кодирующей области гена env и Sag- кодирующей области 3'LTR, которые влияют на транскрипцию провирусной ДНК и сплайсинг мРНК, а также на инфекционные свойства ретровируса.

2. Доказана роль лимфоидных клеток в циркуляции и диссеминации hMTV у человека. Показана значимость лимфоидной ткани кишечника и лимфатических узлов для депонирования провируса.

3. Специфичные для консервативных областей генома hMTV последовательности обнаруживаются не только в опухолях и лимфоидных клетках пациенток с РМЖ, но и в отдаленных метастазах в головной мозг и печень.

4. Доказана возможность инфекции MMTV первичных и стабильных культур эпителиальных клеток человека in vitro с последующей трансформацией этих клеток. Предложена модель трансформированных клеток эпителия эмбриональной почки человека.

5. Показано случайное распределение сайтов интеграции провируса hMTV в хромосомы эпителиальных клеток в отличие от более специфичных и редких - в лимфоцитах периферической крови.

6. Экспрессия hMTV наблюдается в 60-80% позитивных по ПЦР опухолей МЖ и коррелирует с высоким содержанием эстрогенов/прогестерона (РМЖАБ), а также с нестабильностью генома (наличие герминальных мутаций в генах-супрессорах BRCA1/2).

7. Анализ клинико-патологических особенностей РМЖАБ и спорадического РМЖ обнаруживает тенденции к быстрой прогрессии опухолей, а также к снижению общей и безрецидивной выживаемости в группах hMTV-позитивных пациенток.

8. Предложен способ идентификации иммунологически родственного gp52 MMTV белка в сыворотках крови и в ткани РМЖ, основанный на конъюгации этого белка с антителами, которые связаны с молекулами IgG, иммобилизованными на магнитных частицах.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1.А.А.Лушникова Корреляция между экспрессией антигена, иммунологически родственного gp52 и транскрипцией гомологичных env MMTV последовательностей ДНК в лимфоцитах периферической крови больных раком молочной железы / А.А.Лушникова, И.Н.Крюкова, Т.Ф.Маливанова и др.// Мол.генет.Микробиол. Вирусол. - 1998. - № 3. - С.33-

2.Лушникова А.А. Экспрессия env MMTV-гомологичных последовательностей в лимфоцитах периферической крови больных раком молочной железы / А.А. Лушникова, Т.Ф. Маливанова, П.Б. Махов и др. // Мол.генет.Микробиол. Вирусол. - 2001. - №2. - С.57- 62.

3. Крюкова И.Н., Лушникова А.А., Махов П.Б. Влияние 5-азацитидина на экспрессию последовательностей ДНК, гомологичных гену env вируса рака молочной железы мышей, в лимфоцитах здоровых доноров / И.Н. Крюкова А.А. Лушникова, П.Б. Махов // Мол.Генет.,Микробиол.,Вирусол. - 2002. - №2. - С.36 - 39.

4. Крюкова И.Н. О возможном участии ретровирусов в индукции рака молочной железы человека / И.Н. Крюкова, А.А. Лушникова, Т.Ф. Маливанова // Вопросы вирусологии. - 2002. - №4. - С.4 - 9.

5. Лушникова А.А. Обнаружение последовательностей, гомологичных гену env MMTV, в лимфоидной ткани кишечника больной раком молочной железы / А.А.Лушникова, И.Н. Крюкова , Д.Л. Ротин, Л.Н. Любченко // Докл.Акад.Наук. - 2004. - Т. 399. - №1. - С. 118-121.

6. Лушникова А.А. Обнаружение env MMTV-гомологичных последовательностей у беременных и кормящих женщин с опухолями молочных желез / Лушникова А.А., Крюкова И.Н., Пароконная А.А., Полевая Е.Б./ Молекулярн. Медицина. - 2006. - №1. - С. 48-52.

7. А.А.Лушникова. MMTV-гомологичные последовательности у мужчин с раком молочной железы и гинекомастией / А.А.Лушникова, И.Н.Крюкова, Е.Б.Полевая, Л.Н.Любченко // Молекулярн. Медицина - 2006.- № 4.- С. 53-56.

8. Л.Н. Любченко. Клинико-молекулярные аспекты наследственного рака молочной железы /Л.Н. Любченко, С.М. Портной, В.В. Брюзгин, Н.И. Поспехова, А.А. Лушникова и др.// Молекулярн. Медицина. - 2007. - № 1. - С. 8-15.

9. Лушникова А.А. MMTV и канцерогенез молочных желез у человека. / А.А.Лушникова // Молекулярн. Медицина. - 2007. - №4. - С.19-26.

10. Пароконная А.А. Прогноз и течение рака молочной железы на фоне беременности и лактации: вирусно-генетические особенности / А.А. Пароконная, А.А. Лушникова, Л.Н. Любченко и др. // Сибирский Онкол. Журн. - 2008. - №2 . - С. 15-20.

11. Пароконная А.А. Неэпителиальная опухоль молочной железы на фоне существующей беременности. Клинико-генетические особенности / А.А. Пароконная, М.И. Нечушкин, И.К. Воротников , А.А. Лушникова и др.// Вестник РОНЦ. - 2008. - Т.19. -№1. - С.71-75.

12.Лушникова А.А. Инфицирование клеток эмбриональных почек человека вирусом рака молочных желез мышей (MMTV) / А.А.Лушникова, И.Н.Крюкова, Л.Н.Любченко, А.А. Пароконная // Доклады Академии Наук. -2009. - Т.424. -№1. - С.130-134.

13. Крюкова И.Н. ММТV-гомологичные последовательности и их экспрессия у больных раком молочной железы в сочетании с лимфомами / И.Н. Крюкова ,А.А.Лушникова, Л.Н. Любченко, А.А. Пароконная // Молекулярн. Медицина. - 2009. - № 2.- С 8-15.

14. Л. Н. Любченко. Клинико-генетический скрининг при опухолях женской репродуктивной системы /Л. Н. Любченко, Н.И. Поспехова, А.А. Лушникова и др.//. Вопросы Онкологии . - 2008. - Т.54. - С. 17-18.

15. Любченко Л.Н., Поспехова Н.И., Пароконная А.А., Лушникова А.А.,

Чевкина Е.М. Рак молочной железы и /или яичников в составе наследственного онкологического синдрома / Л.Н. Любченко, Н.И. Поспехова, А.А.Пароконная, А.А.Лушникова, Е.М.Чевкина// Опухоли женской репродуктивной системы. - 2009. - № 1-2. - С. 59-63.

16. Поспехова Н.И. Двусторонний рак молочной железы в российской популяции: семейная отягощенность, молекулярно-генетические и клинические характеристики /Н.И. Поспехова, А.А.Лушникова, Л.Н.Любченко, А.В.Карпухин// Молекулярн. Медицина. - 2010. - №3. - 9с.

17. Лушникова А.А. Экспрессия VEGFR-2 в опухолевой ткани больных раком молочной железы / Лушникова А.А., Насунова И.Б., Любченко и др..// Доклады Академии Наук. - 2010. - в печати.

18. Lushnikova A. Supposed expression of MMTV-related DNA sequences in peripheral blood lymphocytes of breast cancer patients /A. Lushnikova, P.Makhov, I. Kryukova et al. // Virus Res. - 1997.- V.47.- N2. - P.106.

19. A.A.Lushnikova. Detection of the env MMTV-homologous sequences in Payer's patches and peripheral blood lymphocytes of familial breast cancer patients /A.A.Lushnikova, I.N.Kryukova, L.N.Lyubchenko// Breast Cancer and Treatment - Dec.2003 - N 12. - P. 78.

20. Lushnikova A.A. A possible role of the env MMTV-homologous sequences in breast cancer carcinogenesis / A.A. Lushnikova, I.N. Kryukova, P.B. Makhov, E.B. Polevaya // Cancer Research - 2003. - N4. - Abstr.327.

21. Lushnikova A. High frequency of the env MMTV - homologous sequences detection in breast cancer patients / A. Lushnikova, A. Parokonnaya, E.Polevaya, I. Kryukova // Clinical Cancer Research. - Dec. 2004. -Р. 234.

22. Lushnikova A. The env MMTV-homologous sequences in familial breast cancer patients and their relatives / A. Lushnikova, I. Kryukova, A. Parokonnaya et al. // Mat. of Milan Breast Cancer Conference, June 2005. - P. 26.

23. Lushnikova A. MMTV-related sequences in male breast cancer and gynecomastia patients / A. Lushnikova, A. Parokonnaya, I. Kryukova, E. Polevaya // European Journ. Of Cancer. - Oct - Nov 2005. - P. 365.

24. L. Lyubchenko. Prognostic factors for BRCA1-associated familial breast cancer from Russian population/ L. Lyubchenko, N. Pospekhova, A. Lushnikova, A.Karpukhin.// European Journ. Of Cancer . - 2005. - V. 3. - N. 2. - P. 322.

25. Kryukova I. MMTV-homologous sequences in breast cancer patients with lymphomas / I. Kryukova, A. Lushnikova , A. Parokonnaya, E. Polevaya // Mat. of the 9-th Int. Conf. on malignant lymphoma, Paris. June 2005. - P. 236.

26. Lushnikova A. MMTV-related sequences expression in the patients with the breast phyllodes tumors / A.Lushnikova, A. Parokonnaya, E.Peredereeva et al. // Breast Cancer and Treatment. - Dec. 2007. - P. 148-149.

27. Lyubchenko L. Clinical and genetics analysis of breast and ovarian cancer patients from Russian population /L. Lyubchenko, A. Lushnikova, N. Pospekhova et al. // Breast Cancer and Treatment. - Dec. 2007. - P. 123-124.

28. Parokonnaya A. Molecular genetics analysis of the breast cancer patients during pregnancy and lactation / A. Parokonnaya, A. Lushnikova, L. Lyubchenko, I. Kryukova // VII Milan Breast Cancer Conference. - 2007. - Abstr. 20323.

29. Lushnikova A.A. MMTV involves into breast cancer progression during pregnancy and lactation /.A. Lushnikova, L. N. Lyubchenko, A.A. Parokonnaya , E.G. Peredeeva // J.Virology. - Mat. оf the Third European Congress of Virology, Nurnberg, Germany, 1-5 Sep. 2007. - Abstr. # 01232.

30. L.N.Lyubchenko / BRCA1 and TP53 mutations in pregnancy-associated breast cancer in Russian patients /L.N.Lyubchenko,N.Pospekhova, A.A.Lushnikova et al. // Annals of Oncology/ - 2009 / - Suppl.- Abstr. #307.

31. A.A.Lushnikova. MMTV-homologous sequences revealed in feline breast cancer tumors /A.A.Lushnikova. , A.A.Preobrazenskaya, V.A.Pavlov, S.V.Zontov //Cancer Research, Suppl. 32 SABCS Abstract Book. - Dec. 2009 - Abst. #1486SABCS09D1.

Размещено на Allbest.ru