Отримання гамма-глобуліну

Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство освіти і науки України

Національний авіаційний університет

Інститут заочного та дистанційного навчання

КОНТРОЛЬНА РОБОТА

з дисципліни “ТЕХНОЛОГІЯ ІМУНОБІОЛОГІЧНИХ ПРЕПАРАТІВ”

На тему “ОТРИМАННЯ ГАММА-ГЛОБУЛІНУ”

Виконав:

студент 4курсу ІЗДН

групи: БР-401з

напрям підготовки 6.051401

залікова книжка № 13.0208

Федорів Віктор Васильович

Київ 2017

ЗМІСТ

ВСТУП

1. ЩО ТАКЕ ГАММА-ГЛОБУЛІН

2. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТУ

3. СПОСІБ ОТРИМАННЯ ГАММО-ГЛОБУЛІНІВ ШЛЯХОМ ОЧИЩЕННЯ

4. СПОСІБ ОТРИМАННЯ ГАММО-ГЛОБУЛІНІВ ПОДРІБНЕННЯМ ПЛАЦЕНТИ

5. СПОСІБ ОТРИМАННЯ ГАММО-ГЛОБУЛІНІВ ШЛЯХОМ ОБРОБКИ БІОЛОГІЧНОЇ РІДИНИ

6. СПОСІБ ОТРИМАННЯ ГАММО-ГЛОБУЛІНІВ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ЕПІЗООТИЧНОГО ЛІМФАГОІТА КОНЕЙ

ВИСНОВОК

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

ВСТУП

Сучасна медицина використовує у своїй практиці як нові, так і вже давно відомі засоби лікування та профілактики захворювань. Впровадження обов`язкового календаря профілактичних щеплень дозволило позбутися спалахів інфекційної патології.

Багато захворювань сьогодні дозволяють проводити успішну специфічну профілактику. Найчастіше вона представлена імунізацією. Гамма-глобулін - особлива фракція білка, представлена антитілами. Сьогодні налічується три основних типи гаммаглобулінів. Структура останніх може змінюватися залежно від конкретного захворювання.

Наукові дослідження підтвердили присутність в гамма-глобулін людини противірусних та протибактерійних антитіл до різних захворювань. Такі особливості дозволяють використовувати дані фракції білка для лікування і профілактики інфекційної патології.

Сьогодні відомі особливі препарати на основі гамма-глобуліну. Дані препарати проходять постійний контроль на апірогенна, стерильність і нешкідливість. Вони є активними у відношенні кору, коклюшу, черевного тифу та поліомієліту, застосовуються для попередження і лікування останніх.

Гамма-глобулін використовується як засіб для специфічної імунопрофілактики. Створюючи пасивний імунітет на певний, обмежений термін, засіб застосовується для екстреної профілактики, так як швидкість настання і розвитку ефекту (стійкість до антитіл вірусів і бактерій) максимальна.

Гамма-глобулін підвищений в тому випадку, коли на організм людини здійснюється атака інфекційних агентів. Найбільш активно дане білкове з`єднання використовується для профілактики у детей.Пріменяют подібні з`єднання для профілактики у тих, хто мав контакт з хворим даної інфекцією. Тривалість збереження пасивного імунітету в середньому становить від трьох до чотирьох тижнів.

Антистафілококовий гамма-глобулін використовується для профілактики стафілококової інфекції. Тривалість розвивається при цьому імунітету становить два-три тижні. Крім того, глобуліни використовуються для профілактики аденовірусних інфекцій в організованих дитячих колективах (ясла, садки, школи), особливо в період епідемічних підйомів захворюваності.

Використовується специфічна профілактика і при епідемічному гепатиті, коли гамма-глобулін вводиться дітям в яслах, садках і школах. Дозування препарату становить 1 мл. Жовтяничний період у такому разі скорочується вдвічі, швидше відновлюється функція печінки, що зменшує можливість розвитку ускладнень.

Контактували з хворими на поліомієліт дітям вводиться гамма-глобулін з розрахунку 0,3 мілілітра на кожен кілограм маси тіла дитини.

При контакті дитини з хворим на скарлатину одноразово вводять три-шість мілілітрів відповідного глобуліну. Дана імунопрофілактика зменшує ризик розвитку захворювання.

Завдяки властивості глобулінів стимулювати імунну систему, подібні ліки застосовуються для лікування ослаблених хворих з хронічними захворюваннями. Введення цих лікарських засобів виправдане й у разі тривалого призначення антибактеріальних препаратів, оскільки останні значно знижують активність захисних властивостей організму.

Вводиться медикамент внутрішньом`язово в плече або верхньо-зовнішній квадрант сідничної області.

Таким чином, гамма-глобулін сьогодні застосовується не тільки як засіб для пасивної імунопрофілактики, але і як ефективний засіб лікування інфекційної патології. Використання препаратів на основі гамма-глобулінів зарекомендувало себе як дієвий засіб відновлення імунної системи людини.

1. ЩО ТАКЕ ГАММА-ГЛОБУЛІН

гамма глобулін лікування лімфагоіт

Гамма-глобулін -- це білок плазми крові, що ідентифікується за характерною швидкості руху в електричному полі. Гамма-глобулін відносять до імуноглобулінів і застосовують для захисту організму людини від цілого ряду інфекційних захворювань.

Що з себе представляє гамма-глобулін

Гамма-глобулін -- представник фракції сироваткових білків імуноглобулінів крові, які містять антитіла. Існує 3 основних типи гамма-глобулінів. На їх поверхні присутні різні противірусні та протибактеріальні антитіла проти вірусів поліомієліту, кору, черевнотифозні і коклюшна агглютинины, а також антитоксини -- дифтерійний або стафілококовий. Цим і визначається профілактичну та лікувальну дію гамма-глобуліну.

Готують препарати гамма-глобуліну з донорської або плацентарної крові здорових людей. Форма випуску -- 10% розчин. В якості розчинника використовують 0,85% розчин хлориду натрію. Перед застосуванням препарат перевіряють на нешкідливість, стерильність і апирогенность, яка являє собою відсутність здатності підвищувати температуру тіла після введення.

Гамма-глобулін -- ефективний засіб імунізації, що приводить до створення тимчасового пасивного імунітету проти ряду інфекційних захворювань.

Застосування гамма-глобуліну

Гамма-глобулін найчастіше використовується для лікування і профілактики інфекційних захворювань у дітей. Профілактика кіру полягає в одноразовому введенні 3 мл препарату здоровим дітям від 3 міс. до 4 років, всім хворим, а також ослабленим особам, які контактували з хворими на кір. Формується пасивний імунітет і зберігається протягом місяця.

Профілактика коклюшу і паракоклюша полягає у введенні гама-глобуліну здоровим дітям, які мали контакт з хворими. Для лікування захворювання вводять по 3 мл препарат три рази через кожні 2 дні. Його застосування в катаральному періоді знижує частоту і тяжкість нападів кашлю.

Гамма-глобулін використовуються для масової імунізації і профілактики ряду інфекцій в дитячих колективах. Так, при спалаху аденовірусної інфекції в дитячому садку дітей прищеплюють з розрахунку 0,3 мл препарату на 1 кг ваги дитини. Подібний захід знижує ризик зараження здорових дітей, а хворим забезпечує більш легкий перебіг хвороби.

Для лікування і профілактики епідемічного гепатиту або хвороби Боткіна всім дітям від ясельного до молодшого шкільного віку планово вводять гамма-глобулін у дозі 1 мл Це забезпечує захист від захворювання гепатитом в протягом півроку. Використовують гамма-глобулін для лікування тяжкої форми гепатиту, що сприяє скороченню жовтяничного періоду, відновлення функції печінки та зменшення вірогідності ускладнень.

Гамма-глобулін надає стимулюючу дію, тому його застосування виправдане для лікування дітей з хронічними запальними захворюваннями поряд з антибіотиками.

2. ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТУ

Специфічний протигрипозний гамма-глобулін із сироватки крові імунізованих донорів. Протигрипозний донорський гамма-глобулін являє собою прозору або злегка опалесцирующую рідина, що отримується з сироватки венозної крові донорів, багаторазово імунізованих живий грипозною вакциною типів А2 і Ст. В процесі зберіганняпрепарату можлива поява незначних, легко розбиваються опадів, що не є протипоказанням до введення гамма-глобуліну.

Гамма-глобулін протіволептоспірозний. Протіволептоспірозний полівалентний гамма-глобулін виготовляють з гіперімунної противолептоспирозной полівалентною волової сироватки. Препарат являє собою прозору, безбарвну або блідо-рожеву рідину, що містить антитіла до серологічних типів лептоспір grippotyphosa, pomona, icterohaemorrhagiae, tarassovi, canicola. В якості стабілізатора використовують 2 - 4% гликокол.

Гамма-глобулін людський. Гамма-глобулін людський містить переважно імуноглобуліни (IgG) з широким спектром антибактеріальних і противірусних антитіл, що формуються в результаті перенесених інфекційних захворювань або профілактичних щеплень. Препарат биодоступен кровообігу донора протягом 2-3 від моменту введення.

Гамма-глобулін людський містить антитіла IgG, аналогічні таким у нормальних індивідуумів. Як правило, препарат виробляють з плазми, одержуваної з не менш 1000 донорських доз і характеризується зрізом підкласів імуноглобулінів G, що відображає склад природної плазми людини. Препарат, будучи введеним внутрішньом'язово у відповідній дозі, стимулює імунну систему організму. Період пасивного імунітету зберігається протягом прибл. 3-4 тижнів.

3. ВИДІЛЕННЯ ГАММА-ГЛОБУЛІНУ МЕТОДОМ ОЧИЩЕННЯ

Широке практичне застосування в даний час має метод очищення, зводиться до виділення гамма-глобулінової фракції імунних сироваток. Найбільш детально цей метод вивчений стосовно до отримання так званого «корового» гамма-глобуліну з людської крові.

В останні роки інтенсивно вивчаються методи виділення гамма-глобуліну з гіперімунних сироваток проти кліщового енцефаліту, сказу, лептоспірозу, сибірки. Обнадійливі результати отримані при виділенні гамма-глобуліну з деяких антитоксичних сироваток.

Принцип методу зводиться до фракціонування сироваток спиртоводными осадителями при різних значеннях рН і при температурі нижче нуля. Метою

фракціонування є відділення імунного гама-глобуліну від альбуміну, альфа - і бета-глобулінів. Очищення проходить в три стадії.

1 стадія.

Умови: концентрація спирту 25%, Т °До 5°С, рН 6,8-7,2

В осад випадає гамма-глобулиновая фракція; крім того, він містить значні домішки, головним чином, бета-глобуліну. Розчин, що містить альбуміни, а також частина альфа - і бета-глобулінів після відділення осаду шляхом фільтрації або центрифугування викидають. Осад розчиняють у сольовому розчині (0,01 М - NаС1), після чого здійснюється друга стадія очищення.

2 стадія.

Умови: концентрація спирту 13-17%, Т °До -3...-6°С, рН 5,1.

В осад випадає бета-глобулін, ліпоїдні речовини і невелика кількість альфа - і гамма-глобулінів. Після відділення осаду розчин, що містить очищений гамма-глобулін, піддається подальшій обробці.

3 стадія.

Умови: концентрація спирту 25-26%, Т °С 5...6,5°С, рН 7,0-7,2, NаС1 0,05-0,07 мл

В осад випадає гамма-глобулін.

Для кращого очищення гамма-глобуліну допускається переосадження білкових опадів, отриманих на 1-й і 3-й стадіях очищення. Повторним витягом гамма-глобуліну з баластних білків після 2-го осадження досягається підвищення виходу.

Кінцевий вихід гамма-глобуліну становить 8-10% від загального білка сироватки. Для видалення спирту та отримання у сухому вигляді осад піддається сублимационному висушування.

Сухий гамма-глобулін до розчинення може зберігатися у вакуум-ексикаторі над хлористим кальцієм або іншим поглиначем вологи не довше одного місяця.

Подальшій обробці може піддаватися і сирий осад, максимально звільнений від спирту шляхом суперцентрифугирования і відстоювання протягом 12-18 годин при температурі -5 °С.

При виготовленні рідкого гамма-глобуліну осад розчиняється у фізіологічному розчині або дистильованій воді (якщо розчиняється сухий осад, у якому міститься NаС1) так, щоб довести кількість білка до 10-10,5%. Зміст NаС1 в

розчині повинно бути доведено до 0,85%. В якості консерванту до препарату додається мертиолят у кінцевій концентрації 1:15000.

У 10%-му розчині гамма-глобуліну встановлюється рН 7,0-7,5 і з допомогою рефрактометра точно перевіряється кількість білка. Після цього розчин піддається стерилізуючої фільтрації при температурі 2-8 °С.

Розливання в ампули проводиться після перевірки стерильності. Готовий препарат має бути прозорим або злегка опалесцирующим і містити 10 % білка. Кожна серія контролюється методом електрофорезу. Випуск препарату допускається в тому випадку, якщо гамма-глобулиновая фракція становить 97 % від кількості загального білку.

Вміст спирту в готовому препараті в тих випадках, якщо піддавався обробці сирий осад, не повинно перевищувати 4,5 %. Кожна серія профільтрованого гамма-глобуліну піддається контролю на стерильність і нешкідливість. Відмінність від контролю нешкідливості сироваток полягає в кількості введеного препарату (свинці вводиться 1 доза гамма-глобуліну) і тривалості терміну спостереження (за мишами спостерігають 4 дні). Придатним визнається препарат, що не викликає загальних і місцевих реакцій протягом періоду спостереження.

Препарати гамма-глобуліну повинні зберігатися при температурі 4-10 °С. Термін придатності їх півтора року; після закінчення цього строку, якщо препарат не змінив своїх фізичних властивостей, що він може застосовуватися протягом ще одного місяця.

4. СПОСІБ ОТРИМАННЯ ГАММО-ГЛОБУЛІНІВ ПОДРІБНЕННЯМ ПЛАЦЕНТИ

Відомий спосіб отримання гамма-глобуліну, що включає подрібнення плаценти, її электроплазмолиз шляхом пропускання через звужується зазор між парними електродами після попереднього заморожування повітрям або без нього, відділення рідкої фази від твердої і виділення цільового продукту з рідкої фази.

Спосіб одержання полягає в тому, що планцету подрібнюють, в процесі перемішування просочують скрапленим газом при температурі вище 0 oc і тиску вище атмосферного, скидають тиск до атмосферного, піддаютьэлектроплазмолизу шляхом пропускання через звужується зазор між парними електродами, на які накладають протифазні ультразвукові коливання, спрямовані вздовж осі, що проходить від центрів електродів і найбільш вузькому зазору між ними, а потім відокремлюють рідку фазу від твердої і виділяють цільовий продукт з рідкої фази. Спосіб забезпечує підвищення виходу гамма-глобуліну.

Недоліком цього способу є низький вихід цільового продукту внаслідок неповного руйнування клітинної структури плаценти і часткового руйнування цільового продукту в процесі электроплазмолиза при утворенні шунтуючих перемичок між повітряними включеннями в сировині.

Спосіб реалізується наступним чином.

Плаценту подрібнюють, наприклад, на вовчку після чого просочують скрапленим газом, переважно вибраного з ряду, що включає інертні гази, азот, закис азоту, двоокис вуглецю, граничні і неграничні вуглеводні, що містять до чотирьох атомів вуглецю в молекулі, і їх суміші. Ці гази практично не взаємодіють з білками і не викликають хімічних змін у них. Просочення здійснюють при температурі вище 0 oc для виключення заморожування плаценти і тиску вище атмосферного, яке забезпечує рідкий фазовий стан газу або газової суміші при температурі просочення. В умовах перемішування просочення подрібненої плаценти скрапленим газом відбувається за 10 - 15 хв. Потім скидають тиск до атмосферного. Це призводить до миттєвого закипання впитанного плацентою скрапленого газу з вибуховим збільшенням внутрішньоклітинного тиску. В результаті відбувається розрив до 90% клітинних оболонок плаценти, уцілілих в процесі механічного подрібнення на вовчку, що значно (майже в 2 рази) перевищує кількість клітинних оболонок, що руйнуються при обробці подрібненої плаценти заморожуванням з подальшою дефростацией, як це передбачено способом-прототипом. Оброблену таким чином плаценту піддають электроплазмолизу. Для цього її пропускають через звужується зазор між парними електродами, колеблемыми в протифазі з улектрозвуковой частотою в напрямку осі, що проходить від центрів електродів до найбільш вузькогоділянки зазору між ними. У процесі проходження через вузький зазор між електродами відбувається ущільнення подрібненої маси плаценти, витискання з неї найбільш великих газових бульбашок.

Дрібні бульбашки при відсутності коливань електродів, як це передбачено способом-прототипом, залишаються в масі плаценти і утворюють порожнини з високим електричним опором, перемички сировини між якими є шунтирующими, тобто проводять електричний струм високої потужності. В результаті відбувається локальний перегрів плаценти в місцях утворення шунтуючих перемичок, що супроводжується термодеструкцией білкових речовин, у тому числі глобулярных.

При накладенні на електроди ультразвукових механічних коливань відбувається коагуляція дрібних газових бульбашок і їх видалення з маси сировини. В результаті вся подрібнена плацента піддається однаковому впливу електричного струму в процесі плазмолізу, а хімічний склад білків залишається незмінним. Крім того, ультразвукове вплив, так само як і електричне руйнує вцілілі клітинні оболонки в подрібненої плаценті, тому після электроплазмолиза в полі ультразвукових механічних коливань плацента не має взагалі уцілілих клітинних оболонок, у той час як при реалізації способу-прототипу при найкращих результатах залишається не менше 8% клітин з поруйнованими оболонками.

Після электроплазмолиза плаценту направляють на відділення рідкої фази від твердої, наприклад центрифугуванням і подальшим пресуванням шламу. Вихід рідкої фази на стадії її відділення в порівнянні зі способом-прототипом в кращому варіанті його здійснення збільшено на 6%, концентрація білка вище на 1 - 3%. З рідкої фази цільовий продукт виділяють відомими прийомами, наприклад спиртовим осадженням. Вихід гамма-глобуліну в порівнянні зі способом-прототипом в його найкращому варіанті збільшено на 8,5% [4].

5. СПОСІБ ОТРИМАННЯ ГАММО-ГЛОБУЛІНІВ ШЛЯХОМ ОБРОБКИ БІОЛОГІЧНОЇ РІДИНИ

Спосіб отримання гамма-глобуліну шляхом обробки біологічної рідини хлороформом з наступною очисткою, відрізняється тим, що, з метою підвищення ступеня очищення цільового продукту із збереженням ступеня специфічної активності, в біологічну рідину перед обробкою хлороформом додають полиэтиленимин в кінцевій концентрації 0, 5-1, 5, далі обробку проводять поліакрилової кислоти до кінцевої концентрації 0, 2-0, 6, причому кінцева концентрація хлороформу становить 5-10.

Чистота препаратів антитіл, одержуваних при використанні цього методу, залежить від того, наскільки велика частина гамма-глобулінів припадає на частку виділених антитіл, а також від ступеня попереднього видалення баластних речовин, головним чином ліпопротеїнів.

Відомий спосіб отримання гамма-глобуліну шляхом його фракціонування за методикою Кона спиртовим осадженням на холоді.

Використання спиртового методу Кона отримання гамма-глобуліну обмежена трудомісткістю, тривалістю процедури, необхідністю великої кількості холодильного обладнання. До того ж препарати, отримані з молока і молозива, містять крім гамма-глобуліну альбумін, альфа - і бета-глобуліни і молочні цукру.

Відомий також спосіб отримання гамма-глобуліну, що включає очищення сироватки від баластних білків шляхом її обробки охолодженим хлороформом в їх ізоелектричної точці при рН 5, 0 - 5, 6 з наступним концентруванням препарату відомим чином, наприклад, шляхом обробки З % рідини сульфатом амонію 40 - 50 %-ного насичення, сульфатом натрію у 18 %-ної кінцевої концентрації в розчині або полиэтиленглнколем. Проте відомі способи не забезпечують високої міри очищення цільового продукту із збереженням необхідного ступеня специфічної активності. Тривалий та складний технологічний процес включає відкриті стадії і стадії, які надають денатуруючі впливу на сироваткові білки, що є однією з причин зниження активності сироваток на 20 - 30 %.

Мета винаходу - підвищення ступеня очищення гамма-глобуліну із збереженням 45 високої специфічної активності.

Зазначена мета досягається тим, що згідно способу отримання гамма-глобуліну шляхом обробки біологічної рідини хлороформом з наступною очищенням, біологічну рідину перед обробкою хлороформом додають полиэтиленимин в кінцевій концентрації 0, 5 -1,5, далі обробку проводять поліакрилової кислоти до кінцевої концентрації 0, 2 - 0, 6, причому кінцева концентрація хлороформу становить 5 - 10%.

Враховуючи складний склад таких біологічних рідин, як сироватка крові, молоко, молозиво, жовч, феномен селективного виділення гамма-глобуліну обробкою полиэтиленимином, хлороформом та поліакрилової кислоти можна пояснити наступним чином: з допомогою поліетиленіміну видаляються з біологічної рідини альбумін і основна частина мелкомолекулярных білків (преальбумин, трансферин, постальбумини ін ), полиэтиленимин флоккулирует в цьому випадку білки з малою сумарним зарядом; хлороформ денатурує крупномолекулярные структурні компоненти, але з малим сумарним зарядом, в тому числі ліпопротеїни, глюкопротеины і в подальшому переводить їх в нерозчинне стан; при обробці поліакрилової кислоти осідають альфа-2-макроглобулины і бета-глобуліни, а також утворилися на вищевказаних етапах агрегати денатурованого білка і залишки поліетиленіміну.

Селективне виділення гамма-глобуліну можливо тільки вищевказаної почергової обробкою. Зміна черговості обробки не дає такого ефекту, так як присутність в біологічній рідині мелкомолекулярных білків знижує ефективність видалення великомолекулярних компонентів - ліпопротеїнів, глюкопротеинови ін. Після цієї обробки в біологічній рідині, в основному, знаходяться крупномолекулярные білки, з яких надалі з допомогою поліакрилової кислоти вдається отримати гамма-глобулін.

Приклад 1. До 100 мл сироватки крові великої рогатої худоби додають рівну кількість дистильованої води, а потім по краплях додають 10 мл 10 %-ного водного розчину поліетиленіміну, створивши таким чином його 0, 5 %-ву кінцеву концентрацію в суміші. Суміш перемішують до утворення флоккул протягом 5 - 10 хв Після утворення флоккул в рідину додають 10 мл хлороформу, що становить 50 % його кінцевої концентрації в розчині, і її енергійно гемогенизируют протягом 5 - 10 хв. Після центрифугування протягом 20 хв при 3000 об. хв надосадову рідину додають 1 мл 40 %-ноїполіакрилової кислоти, що становить 0, 2 % її кінцевої концентрації в розчині. Потім проводять центрифугування при 3000 об. мінімум 20 хв. Для подальшого застосування використовують надосадову рідину. При необхідності отримання препарату з більш високою питомою серологічної активності гамма-глобулін концентрують відомим чином, наприклад, шляхом обробки рідини сульфатом амонію 40 - 50 %-ного насичення, сульфатом натрію в 80 %-ної кінцевої концентрації в розчині або поліетиленгліколем в 8 - 10 %-ної кінцевої концентрації. Отриманий осад ресуспендують у заданому обсязі і використовують для подальших досліджень.

Приклад 2. До 100 мл молозива свиней (рН 7, 0 - 7, 6) додають 10. мл 10 %-ного водного розчину поліетиленіміну, створивши таким чином його 1 %-ную кінцеву концентрацію в розчині. Суміш перемішують 5 - 10 хв. Після утворення флоккул в рідину додають 10 мл хлороформу, що становить 10 % його кінцевої концентрації, і енергійно гемогенизируют протягом 5 - 10 хв, а потім центрифугують З5 при 3000 об. мінімум 20 хв. В надосадову рідину додають 1О мл 4 %-ної поліакрилової кислоти, що становить 0, 4. її кінцевої концентрації, і центрифугують при 3000 об. хв 20 хв. Подальше 40 концентрування за допомогою засобів, зазначених у прикладах 1 і 2, не завжди доцільно у зв'язку з високим вмістом антитіл у молозиві.

6. СПОСІБ ОТРИМАННЯ ГАММО-ГЛОБУЛІНІВ ДЛЯ ЛІКУВАННЯ ЕПІЗООТИЧНОГО ЛІМФАГОІТА КОНЕЙ

Гамма-глобулін отримують із сироватки крові великої рогатої худоби (ВРХ) у віці 1,5 - 2 роки масою 250 - 280 кг Гипериммунизации тварин збудником хвороби здійснюють у два цикли з інтервалом в 30 днів. Під час першого циклу антиген вводять тваринам одноразово протягом 3 днів у дозі по 4 мл, що включає 1 мл водної суспензії гриба (50 млн/мл), 1 мл фіз. розчину 2 мл 1%-ного розчину сапоніну. Під час другого циклу антиген вводять тваринам одноразово протягом 2 днів в дозі по 8 мл, що включає 2 мл водної суспензії гриба, 2 мл розчину і 4 мл 1%-ного розчину сапоніну. Через 5 днів після закінчення другого циклу гіперімунізації тварин піддають знекровлення. З отриманої крові відокремлюють гипериммунную сироватку, pH якої встановлюють в межах 6,9 - 7,2. В сироватку додають 50%-ний водний розчин ПЕГ до кінцевої концентрації 20% і після годинної експозиції при 10oC сироватку піддають центрифугированию при 2500 об/хв протягом 30 хв для виділення гамма-глобуліну з подальшою його лиофилизацией для забезпечення стабільності властивостей препарату при зберіганні. Перед використанням сухої гамма-глобулін розводять у 10 мл фіз. розчину. Хворим коням вводять по 10 мл гамма-глобулін дворазово через день підшкірно в область нижньої третини шиї. Спосіб забезпечує безпеку і високу активність препарату.

Винахід відноситься до ветеринарної медицини і біотехнології і стосується способу отримання гамма-глобуліну длялікування епізоотичного лимфангоита коней (ЕЛ).

ЕЛ (синоніми - африканський сап, японська шкірна виразка, псевдосап, епізоотичне запалення лімфатичних судин, бластомікоз, гістоплазмоз, пантушко) - контагіозне хронічне захворювання однокопытных тварин, що характеризується ураженням (запаленням) лімфатичних судин шкіри, лімфатичних вузлів і підшкірної клітковини, слизових оболонок з утворенням виразок і абсцесів, кератитів і пневмонії.

Збудник захворювання - дрожжевидный грибок Histoplasma farciminosus (синонім - Cryptococcus farciminosus) вперше описаний у 1873 р. італійським ученим Ривольта (Rivolta). Захворювання найбільш широко було поширене в Африці і Азії, зареєстровано також у різних європейських країнах, у тому числі в Росії під час першої та другої світових воєн, що пов'язане з контактом тварин з різних за епізоотичної ситуації країн, частими переміщеннями хворих коней, невиконанням необхідних ветеринарно-санітарних заходів.

Основним джерелом зараження є хвора тварина. Однак інфіковані грунт і предмети догляду також можуть стати причиною зараження. В організм тварини гриб проникає через пошкоджені ділянки шкірного покриву і локалізується в лімфатичних судинах, підшкірній клітковині і власне шкірі. Клінічний прояв ЕЛ характеризується появою виразок на шкірі, запаленням лімфатичних судин і утворенням вузликів. Ступінь ураження залежить від вірулентності збудника та рівня захисних сил організму. Поряд з місцевим лікуванням при слабкому ступені ураження застосовують хірургічне лікування та внутрішньовенне введення 4%-ного водного розчину формаліну і хлористої ртуті в концентрації 1:1000. Для профілактики ЕЛ проводили діагностичні та ветеринарно-санітарні заходи, спрямовані на виявлення хворих тварин, своєчасне лікування хворих тварин, ретельну дезінфекцію предметів догляду та неблагополучних приміщень.

Відомий спосіб лікування коней, хворих ЕЛ, шляхом підшкірного введення в ділянку верхньої третини шиї 100 мл крові інших коней, які страждають тією ж хворобою, і обробки уражених ділянок міднимкупоросом.

Недоліки даного способу полягають у тому, що для лікування використовують кров хворих тварин, яка може містити збудник хвороби, що значною мірою знижує цінність пропозиції.

Рішень, аналогічних пропонованого винаходу, у доступних джерелах інформації не виявлено.

Завданням створення винаходу є розробка способу отримання гамма-глобуліну для лікування ЕЛ. Технічний результат від використання винаходу полягає в забезпеченні безпеки і високої активності препарату.

Зазначений технічний результат досягнуто створенням винаходу, охарактеризованого такою сукупністю ознак: спосіб отримання гамма-глобуліну для лікування ЕЛ з біологічної рідини; в якості біологічної рідини використовують гипериммунную сироватку крові тварин-продуцентів; в якості тварин-продуцентів використовують велику рогату худобу (ВРХ); ВРХ використовують у віці 1,2 - 2,0 років масою 250 - 280 кг; ВРХ піддають попередньої багаторазової гіперімунізації збудником хвороби в середню третину шиї у два цикли з інтервалом в 29 - 31 день; під час першого циклу ВРХ гипериммунизируют протягом 3 - 4 днів в дозі по 3 - 5 мл одноразово; під час другого циклу - протягом 2 - 3 днів у дозі 7 - 9 мл одноразово; через 4 - 6 днів після закінчення гіперімунізації ВРХ піддають знекровлення; з отриманої крові відокремлюють гипериммунную сироватку; pH гіперімунної сироватки встановлюють в межах 6,9 - 7,2; в гипериммунную сироватку додають 50%-ний водний розчин ПЕГ до кінцевої концентрації 20%; після двогодинної експозиції гипериммунную сироватку піддають центрифугированию при 2500 об/хв протягом 30 хв для виділення гамма-глобуліну; гамма-глобулін висушують лиофилизацией для забезпечення стабільності властивостей препарату.

Винахід включає наступну сукупність істотних ознак, що забезпечують одержання технічного результату, що у всіх випадках, на які витребовується обсяг правової охорони: спосіб отримання гамма-глобуліну для лікування ЕЛ з біологічної рідини; в якості біологічної рідини використовують гипериммунную сироватку кровітварин - продуцентів; в якості тварин-продуцентів використовують ВРХ; ВРХ піддають попередньої багаторазової гіперімунізації збудником хвороби у два цикли з інтервалом в 29 - 31 день; під час першого циклу ВРХ гипериммунизируют протягом 3 - 4 днів в дозі по 3 - 5 мл одноразово; під час другого циклу - протягом 2 - 3 днів у дозі по 7 - 9 мл одноразово; через 4 - 6 днів після закінчення гіперімунізації ВРХ піддають знекровлення; з отриманої крові відокремлюють гипериммунную сироватку; pH гіперімунної сироватки встановлюють в межах 6,9 - 7,2; у гипериммунную сироватку додають 50%-ний водний розчин поліетиленгліколю до кінцевої концентрації 20%; після двогодинної експозиції гипериммунную сироватку піддають центрифугированию для виділення гамма-глобуліну.

Досягнення технічного результату запропонованого способу можна пояснити наступним чином.

Використання гіперімунної сироватки крові в якості біологічної рідини і ВРХ в якості тварин-продуцентів даної сироватки забезпечують безпеку застосування гамма-глобуліну для лікування ЕЛ, так як ВРХ не піддається цьому захворюванню.

Пропонована схема гіперімунізації ВРХ дозволяє отримати високий титр антитіл у крові тварин.

Обробка гіперімунної сироватки крові ВРХ поліетиленгліколем при рн 6,9 - 7,2 з подальшим центрифугуванням дозволяє провести повне виборче виділення гамма-глобуліну високого ступеня чистоти і активності.

Отриманий гамма-глобулін містить високий титр високоочищених антитіл, що вступають у взаємодію з збудником і нейтралізують його, що перешкоджає подальшому розмноженню криптококка в організмі тварин. Застосування гамма-глобуліну, отриманого пропонованим способом хворих на епізоотичних лимфангоитом конях забезпечує їх одужання у 85 - 90% випадках через 30 - 40 днів.

Пропонований спосіб характеризується також іншими ознаками, що виражають конкретні форми його виконання: ВРХ використовують у віці 1,5 - 2 років масою 250 - 280 кг; для виділення гамма-глобуліну гипериммунную сироватку центрифугують при 2500 об/хв протягом 25 - 35 хв;

отриманий гамма-глобулін висушують лиофилизацией для забезпечення стабільності властивостей препарату при зберіганні.

При дослідженні сукупності суттєвих ознак, що характеризують пропонований спосіб, не виявлено будь-яких аналогічних відомих рішень, що стосуються способів отримання гамма-глобуліну для лікування ЕЛ.

Приклад 1. Для отримання гамма-глобуліну для лікування ЕЛ використовують в якості біологічної рідини гипериммунную сироватку крові тварин-продуцентів, в якості яких використовують ВРХ у віці 1,5 - 2 років масою 250 - 280 кг Для гіперімунізації ВРХ використовують у якості антигену водну суспензію микроконидий гриба епізоотичного штаму Cryptococcus farciminosus Rivolta з концентрацією 50 млн/мл Гипериммунизации тварин збудником хвороби здійснюють підшкірно в середню третину шиї у два цикли з інтервалом в 30 днів. Під час першого циклу антиген вводять тваринам протягом 3 днів одноразово в дозі по 4 мл, що включає 1 мл водної суспензії гриба, 1 мл фізіологічного розчину і 2 мл 1%-ного розчину сапоніну. Через 30 днів проводять другий цикл гіперімунізації ВРХ. Під час другого циклу антиген вводять тваринам підшкірно в середню третину шиї протягом 2 днів одноразово в дозі по 8 мл, що включає 2 мл водної суспензії гриба, 2 мл фізіологічного розчину і 4 мл 1%-ного розчину сапоніну. Через 5 днів після завершення другого циклу гіперімунізації тварин піддають знекровлення. Від однієї голови ВРХ отримують - 12 л крові, з якої можна приготувати приблизно 250 доз гамма-глобуліну. З отриманої крові відокремлюють гипериммунную сироватку. pH сироватки знижують до 6,9 - 7,2. Потім в неї додають 50%-ний водний розчин поліетиленгліколю до кінцевої концентрації 20%. Сироватку перемішують і після годинної експозиції при 10oC її піддають центрифугированию на центрифузі Mistral 6 L при 2500 об/хв протягом 30 хв для відділення осаду, що містить гамма-глобулін. Отриманий гамма-глобулін має пастоподібну консистенцію, жовтувато-коричневого кольору. Гамма-глобулін ресуспендують у фізіологічному розчині в 1/50 початкового об'єму. Отриманий гамма-глобулін висушують

лиофилизацией для забезпечення стабільності властивостей препарату при зберіганні. Перед висушуванням у кожну ампулу поміщають 4 мл концентрату гамма-глобуліну. Активність отриманого препарату в РДП становить 1 : 64, в ІФА - 1 : 64000. Вміст білка в препараті визначають методом Лоурі і його кількість становить [pic]30 мг/мл Перед використанням сухої гамма-глобулін розводять у 10 мл фізіологічного розчину. Хворим коням вводять по 10 мл гамма-глобуліну дворазово через день підшкірно в область нижньої третини шиї.

ВИСНОВОК

Я вважаю, що в даний час виробництво гамма-глобуліну відіграє величезну роль у медицині. Так як в гамма-глобулине людини встановлено наявність різних противірусних та протибактеріальних антитіл (проти вірусів кору, поліомієліту, коклюшна, черевнотифозні агглютинины) і антитоксинов (дифтерійного, стафілококового та ін), що визначає його профілактичну і лікувальну дію.

В даний час мікробіологічна промисловість Росії та інших країн виробляє імунні сироватки та імуноглобуліни для лікування хворих різними інфекційними захворюваннями. Це передбачено відносно збудників тих хвороб, у патогенезі яких першорядне значення відіграють екзотоксини (дифтерія, ботулізм, правець та ін), а також ряду небезпечних для здоров'я людей хвороб - стафілококової інфекції, сибірки, лептоспірозу, грипу, сказу, кліщового енцефаліту.

На сьогоднішній день виділені гамма-глобуліни проти грипу, дизентерії, інфекційного гепатиту, кліщового енцефаліту, кашлюку, кору, краснухи, віспи, свинки, сибірської виразки і скарлатини.

СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ

1. Иммунные глобулины в ветеринарии / Балашенко С. Г., Урбан В. П., /Минск, 1972; /144 с.

2. Строение и биосинтез антител;/Р.С. Незлин/ Москва : Наука, 1972р. /312 с.,

3. Способ получения гамма-глобулина для лечения эпизоотического лимфангоита лошадей /Гусев А.А., Борзионов В.Д., Утешева Е.Н., Котова М.В., Старов С.К., Гусева Е.В., 1998/ 347с.

4. Использование новых физических методом обработки пищевых продуктов для получения гамма-глобулина,/Жилюк А.С. /Одесса, 1972,/ с. 5 - 22

5. Основные этапы совершенствования лабораторной диагностики ящура и ... Пути заражения и распространения /1977, / Ж. А. Шажко, В. А. Мищенко, Н.А. Улупов, В. В. Михалишин, Н. Н. Шуть ,А. Б, Смирнов иН.А. Яременко/347 с.

6. Иммунология. 2010/ Ярилин А.А., /749 с.

7. Микробиология. 2005/ Борисов Л.Б., /727 с.

8. http://www.medical-enc.ru

9. http://www.kelechek.ru

10. http://www.biomed.lublin.pl/ru

Размещено на Allbest.ru

...