Идентификация и внутривидовое типирование возбудителей сапа и мелиоидоза

Таким образом, проведенные исследования позволили подобрать адекватный набор штаммов близкородственных буркхольдерий, который был использован нами при оценке специфичности сконструированных амплификационных тест-систем, предназначенных для обнаружения B.mallei и B.pseudomallei.

4. Разработка молекулярно-генетических способов детекции патогенных буркхольдерий

Приоритет разработки амплификационной тест-системы для идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза принадлежит A.E.Lew и P.M.Desmarchelier (1994), сконструировавших специфичные олигонуклеотидные праймеры на основе гена, кодирующего синтез 23S рРНК. В последующих работах использовали ген, детерминирующий 16S рРНК (Dharakul T. et al., 1996; Brook M.D.,1997; Woo P.C. et al., 2003) и спейсерную область между этими генами (Kunakorn M., 1995). Для повышения специфичности ПЦР рекомендовали двухстадийную ПЦР (Kunakorn M. et al., 2000; Hagen R.M. et al., 2002), рестрикцию ампликонов (Sprague L.D. et al., 2002), а также различные видоспецифические последовательности (Sermswan R.W. et al., 2000; Баннов В.А., Калачёв И.Я., 2003; Smith-Vaughan H.C., Gal D., Lawrie P.M. et al., 2003; Neubauer H. et al., 2007) и SNP-маркеры (Bauernfeind A. et al., 1998; U'Ren J.M. et al., 2005; Wattiau P. et al., 2007). Однако, до сих пор нет единого мнения, коммерческих тест-систем, а также регламентирующих документов, определяющих обязательные ДНК-мишени и необходимые праймеры для идентификации патогенных буркхольдерий. В то же время, накоплен большой опыт, свидетельствующий о том, что применение какой либо одной пары праймеров при исследовании объектов внешней среды и проб клинического материала не обеспечивает достаточной эффективности анализа (Kunakorn M. et al., 2000; Sprague L.D. et al., 2002).

По этой причине для конструирования амплификационных тест-систем с целью генодиагностики сапа и мелиоидоза нами проведен анализ представленных нуклеотидных последовательностей патогенных буркхольдерий в различных генетических базах данных и выбрано семь пар праймеров на основе фрагментов гена 23S рРНК, две пары олигонуклеотидных затравок, фланкирующих участки флагеллярного гена (fliC)), и одна пара праймеров, являющихся участком гена orf13 системы III-типа секреции (TTS1).

Семь пар праймеров были общими для B.mallei и B.pseudomallei,одна пара олигонуклеотидных затравок гомологична последовательностям триады буркхольдерий - B.mallei, B.pseudomallei, B.thailandensis и две пары - B.mallei. Дополнительно в работе использована одна пары праймеров для обнаружения B.mallei, фланкирующих участок гена 23S рРНК, обозначенная М23-2/CVMP23-1 (Bauernfeind A. et al., 1998), и одна пара олигонуклеотидных затравок Bps16S-U33/Bps16S-OL731 (Dharakul T. et al., 1999), являющихся фрагментом гена 16S рРНК (табл.1).

Таблица 1 Характеристика используемых олигонуклеотидных праймеров

Для каждой пары праймеров подобраны оптимальные буферные растворы, концентрации дезоксинуклеозидтрифосфатов, ионов Mg2+ и Taq-полимеразы, а также режимы ПЦР. При оптимизации параметров реакции амплификации с ДНК исследуемых буркхольдерий синтезировались чёткие единичные специфические ампликоны (рис.2). Эти результаты соответствовали расчетным данным, которые были получены с помощью компьютерного анализа и свидетельствовали о потенциальной пригодности выбранных нами праймеров для конструирования амплификационных тест-систем с целью идентификации B.pseudomallei и B.mallei.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21

Рис. 2. Электрофореграмма продуктов реакции амплификации фрагментов генов 23S рРНК, fliC и orf13 B. pseudomallei, B. thailandensis и B. mallei.

1,21. Маркер молекулярных масс (леддер 100 -1000 п.н.)

2. ДНК B. pseudomallei 107, праймеры burts1/burta2 (242 п.н.)

3. ДНК B. mallei 10230, праймеры burts1/burta2 (242 п.н.)

4. ДНК B. thailandensis КМ 161, праймеры burts1/burta2 (242 п.н.)

5. ДНК B. pseudomallei 107, праймеры b23s7/b23a8 (266 п.н.)

6. ДНК B. mallei 10230, праймеры b23s7/b23a8 (266 п.н.)

7. ДНК B. mallei 10230, праймеры burk1s/burk2as (351 п.н.)

8. ДНК B. pseudomallei 107, праймеры bfl1s/bfl2a (376 п.н.)

9. ДНК B. mallei 10230, праймеры bfl1s/bfl2a (376 п.н.)

10. ДНК B. mallei 10230, праймеры burk3s/burk2as (399 п.н.)

11. ДНК B. pseudomallei 107, праймеры burk3s/burk4as (615 п.н.)

12. ДНК B. mallei 10230, праймеры burk3s/burk4as (615 п.н.)

13. ДНК B. pseudomallei 107, праймеры b23s7/burk 4as (611 п.н.)

14. ДНК B. mallei 10230, праймеры b23s7/burk 4as (611 п.н.)

15. ДНК B. pseudomallei 107, праймеры b23s5/b23a6 (666 п.н.)

16. ДНК B. mallei 10230, праймеры b23-s5/b23a6 (666 п.н.)

17. ДНК B. pseudomallei 107, праймеры burk1s/burk4as (567 п.н.)

18. ДНК B. mallei 10230, праймеры burk1s/burk4as (567 п.н.)

19. ДНК B. pseudomallei 107, праймеры BTTS-s1/BTTS-as3 (162 п.н.)

20. ДНК B. mallei 10230, праймеры BTTS-s1/BTTS-as3 (162 п.н.)

При анализе чистых культур наибольшая чувствительность реакции амплификации отмечена с праймерами Burk3s/Burk4as, b23s7/b23a8 и bfl1s/bflas2 (1х102 м.к./мл), а наименьшая с олигонуклеотидными затравками М23-2/CVMP23-1 (1х105 м.к./мл). Чувствительность праймеров Bps16S-U33 /Bps16S-OL731 и b23s7/Burk4as составила 1х104м.к./мл, а остальных исследуемых олигонуклеотидных праймеров - 1х103м.к./мл.

Для повышения чувствительности реакции амплификации нами апробирована 2-х раундовая («гнездовая») ПЦР. В первом раунде использовали праймеры burk3s/burk4as. Во втором раунде реакции для обнаружения возбудителей сапа и мелиоидоза применяли праймеры b23s7/b23a8, фланкирующие фрагмент размером 266 п.н., находящийся внутри участка гена 23S РНК, синтезируемого с помощью праймеров burk3s/burk4as. В результате исследований с помощью «гнездовой» ПЦР на чистых культурах патогенных буркхольдерий удалось повысить чувствительность реакции до 101 м.к./мл.

Однако, при оценке специфичности сконструированных нами праймеров лишь три олигонуклеотидные затравки bfl1s/bfl2a, BTTS-s1/BTTS-as3 и b23s7/b23a8 обеспечивали специфическую детекцию возбудителей сапа и мелиоидоза. С олигонуклеотидными затравками burts1/burta2 положительный результат реакции амплификации зарегистрирован с ДНК триады буркхольдерий - B.mallei, B.pseudomallei и B.thailandensis. При анализе гетерологичных микроорганизмов, в том числе бактерий комплекса B.cepacia и мелиоидозоподобных почвенных микроорганизмов (Ленкоранских штаммов) специфических фрагментов амплификации не выявлено.

На основе этих четырех пар олигонуклеотидных затравок нами сконструированы четыре монолокусные амплификационные тест-системы с детекцией продуктов амплификации методом электрофореза. От всех других пар праймеров нам пришлось отказаться. В отдельных случаях это было обусловлено их относительно низкой чувствительностью, отсутствием специфических ампликонов при анализе ДНК некоторых штаммов B.pseudomallei, а также ввиду наличия ложноположительных результатов при исследовании гетерологичного микроорганизма - B.cepacia, хотя все разработанные праймеры показали свою пригодность при компьютерном анализе. При секвенировании фрагментов, включающих места посадки праймеров, нами выявлено несколько нуклеотидных замен в штаммах B.cepacia 8235 и 3181, которые послужили основой для формирования ложных результатов ПЦР.

При определении специфичности праймеров burk1s/burk2as и burk3s/burk2as нам не удалось дифференцировать с их помощью возбудители сапа и мелиоидоза. Этот вариант реакции обладал только группоспецифической активностью, детектируя все штаммы возбудителя сапа и часть штаммов возбудителя мелиоидоза.

Полученные результаты свидетельствовали о том, что результаты компьютерного анализа и исследования «in silico» целесообразно рассматривать как весомые, но ориентировочные данные, и для пригодности выбранных праймеров всегда необходимы исследования с широким набором как гомологичных, так и гетерологичных видов микроорганизмов.

Для оценки диагностической ценности тест-систем для выявления патогенных буркхолдерий нами проведены комиссионные испытания трех пар праймеров - bfl1s/bfl2a, BTTS-s1/BTTS-as3 и b23s7/b23a8. Материалом для исследования служили 30 проб взвесей чистых культур возбудителей сапа и мелиоидоза - Burkholderia mallei (5 штаммов), Burkholderia pseudomallei (5 штаммов) с различной концентрацией клеток, также как и 22 пробы гетерологичных микроорганизмов - B. thailandensis (5 штаммов), B. сepacia (9 штаммов), Brucella abortus, Brucella melitensis, Brucella suis, Brucella ovis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Vibrio cholerae, Bacillus anthracis (по одному штамму), 60 проб объектов внешней среды (вода, смывы), искусственно инфицированных Burkholderia mallei и Burkholderia pseudomallei и 46 проб, искусственно инфицированных гетерологичными видами микроорганизмов.

С данными тремя парами праймеров результаты исследований оказались идентичными. Из 30 исследованных проб чистых культур B.mallei и B.pseudomallei в дозах от 1х102 до 1х104 м.к./мл, положительные реакции выявлены в 26 пробах (86,6 %), в том числе при концентрациях не ниже 103 м.к./мл - в 100 % проб. Из 60 исследованных проб объектов внешней среды (вода, смывы), инфицированных B.mallei и B.pseudomallei в дозах от 1х102 до 1х104 м.к./мл, положительные реакции выявлены в 52 пробах (86,6 %), в том числе при концентрациях не ниже 103 м.к./мл - в 100 % проб. При исследовании 23 проб чистых культур гетерологичных микроорганизмов и 46 проб объектов внешней среды (вода, смывы), зараженных гетерологичными микроорганизмами в дозах 1х107м.к./мл, неспецифических (ложноположительных) реакций не выявлено.

Таким образом, три олигонуклеотидные затравки bfl1s/bfl2a, BTTS-s1/BTTS-as3 и b23s7/b23a8 обеспечивают детекцию трех различных генетических мишеней при идентификации возбудителей сапа и мелиоидоза. Разработанные на их основе амплификационные тест-системы позволяют выявлять 100 % штаммов B.mallei и B.pseudomallei как в пробах чистых культур, так и пробах объектов внешней среды с пороговой чувствительностью 103 м.к./мл.

5. Использование ПЦР для выявления патогенных буркхольдерий при экспериментальной инфекции

При создании амплификационных тест-систем первичный анализ параметров их качества проводится на чистых культурах как гомологичных, так и гетерологичных видов микроорганизмов, а также контаминированных возбудителями пробах из объектов внешней среды. Однако эти результаты не дают возможности объективно оценивать диагностическую эффективность ПЦР при инфекционном процессе, вызванном изучаемыми патогенами.

В связи с этим, сконструированные нами тест-системы прошли апробацию в качестве диагностических средств при моделировании инфекционного процесса, вызванного заражением лабораторных животных как патогенными буркхольдериями, так и B.thailandensis.

При сравнительном анализе эффективности ПЦР и культурального метода выявлено, что реакция амплификации при остром мелиоидозе и сапе оказалась результативнее бактериологического метода. Достоверность различий в диагностической эффективности ПЦР и бактериологического метода (p < 0,01) подтверждено статистическим анализом полученных результатов. Выявление возбудителей с использованием ПЦР оказалось эффективным уже в первые сутки после подкожного заражения вирулентным штаммом B. mallei 10230 и B.pseudomallei 100 (в инкубационном периоде), тогда как с помощью бактериологического метода патогенные буркхольдерии выделяли лишь с 3-их сут заболеваний (рис. 3).

Рис. 3. Выявление возбудителей сапа и мелиоидоза с острой формой инфекции бактериологическим методом и ПЦР.

Примечание: А - мелиоидоз, Б - сап; по оси ординат - % положительных результатов.

В первые сутки наблюдения в реакции амплификации B.pseudomallei обнаруживали в 20 % образцов крови, 40 % образцов лимфатических узлов, в 20 % проб печени и селезёнки и в 10 % образцов легочной ткани, а B.mallei - в паховых лимфатических узлах (20 %), образцах печени (20 %) и в 20 % образцов крови. На 3 сутки исследования B.pseudomallei обнаруживали во всех исследуемых тканях в 100% случаев, а B.mallei - в лимфатических узлах (60%), в образцах печени (80%), селезёнки (60%), лёгких (80%). В крови зараженных животных ДНК возбудителя сапа на 3 сутки регистрировали при анализе 60 % проб, а возбудителя мелиоидоза - в 100 % случаев.

Схожие данные получены R.L.Ulrich с соавторами (2006), которым также удалось обнаружить B. mallei методом ПЦР в легких, селезенке и печени через 24 ч после аэрозольного заражения мышей линии BALB/c.

Известно, что мелиоидоз и сап могут протекать в различных формах с возможностью перехода из латентного и хронического в острое состояние и обратно. Бактериологический и биологический методы эффективны для диагностики острого сапа и мелиоидоза, но выделить возбудители при хроническом течении чаще всего не удается (Цветков Н.Е., Черняк В.З., 1947; Беляков В.Д., 1990). Выяснение особенностей персистенции патогенных буркхольдерий нами проведено в условиях хронизации процесса при экспериментальном заражении лабораторных животных. Хроническую форму мелиоидозной инфекции моделировали на морских свинках с помощью аэрогенного заражения низковирулентным штаммом B.pseudomallei 56770 - 99/10 (LD50 составляла 5х105 м.к.) (Алексеев В.В. c соавт., 2000). Для моделирования сапной инфекции с длительным течением использовали ауксотрофный мутант B.mallei Ц-4 1360 со сниженной вирулентностью (LD50 при подкожном заражении для золотистых хомячков составляла 1х107 м.к.) (Шиповская Н.П. с соавт., 1983).

При использовании бактериологического метода на 3 сут после аэрогенного заражения культуру B.pseudomallei выделяли только из лёгких. Во всех остальных исследованных тканях мелиоидозный микроб обнаруживали с 20 сут вплоть до окончания срока наблюдения (38 сут). С помощью ПЦР на 3 сут после заражения, в отличие от бактериологического метода, B.pseudomallei обнаруживали в образцах лёгких, печени и селезёнки. При исследовании образцов крови, печени, селезёнки и лёгких культуральным методом положительные результаты были получены в 18% проб, а при применении ПЦР - в 33 % случаев.

При сравнительной оценке эффективности бактериологического метода и ПЦР при хронической форме сапа также установлено статистически достоверное различие в диагностической эффективности этих двух методов (p<0,001). С помощью культурального метода сапной микроб обнаруживали лишь в 1 из 200 исследованных проб (0,5 %), в то время как в реакции амплификации ДНК возбудителя сапа детектировали в 75 пробах (37,5%)

Используемые праймеры показали свою пригодность и высокую эффективность при диагностике различных форм инфекций, что явилось основанием для включения ПЦР в схему лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза. генетический сап штамм мелиоидоз

При изучении персистенции B.thailandensis в организме зараженных лабораторных животных метод ПЦР, так же как и при подострых формах сапа и мелиоидоза, оказался более эффективным для обнаружения B.thailandensis. От морских свинок, зараженных B.thailandensis аэрогенно, в реакции амплификации с использованием праймеров burts1/burta2 положительные результаты получены в 53 из 75 (70,6%) случаях. С помощью бактериологического метода культура B.thailandensis выделена в 9 из 75 (12%) пробах.

При секвенировании ампликонов, полученных при исследовании объектов внешней среды и проб экспериментального клинического материала, нами выявлена 100 % гомология с ДНК лишь возбудителей сапа и мелиоидоза. Однако для исключения возможных ложноположительных реакций и повышения специфичности идентификационных тестов необходимо использовать две ДНК мишени - участки 16S рРНК, 23S рРНК и orf13 или fliC. Сочетание реакции амплификации и последующего секвенирования фрагментов этих генов является алгоритмом ускоренной идентификации B.mallei и B. pseudomallei и их дифференциации от близкородственных видов без проведения этапа культивирования микроорганизмов. Учитывая, что проведение идентификации на основе культурально-морфологических и биохимических признаков занимает 2-3 дня, а общее время исследований с помощью молекулярно-генетических методов составляет порядка 9 часов, данный алгоритм вполне оправдан. Аналогичные рекомендации по использованию нескольких ДНК-мишеней (16S рРНК с дополнительным секвенированием гена 23S рРНК или спейсерной области 16S-23S рРНК) предложены и другими авторами для быстрой идентификации возбудителей особо опасных инфекций (Ruppitsch W. et al., 2007).

6. Совершенствование молекулярно-генетических методов внутривидового типирования возбудителей сапа и мелиоидоза

Проблемы, связанные с недостатками фенотипических методов дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий стимулировали развитие методов типирования, основанных на исследовании структуры их ДНК.

Для молекулярного типирования штаммов возбудителя мелиоидоза, выделенных из окружающей среды, от человека и животных были использованы такие методы как полиморфизм длины рестрикционных фрагментов (Yap E.H. et al., 1995), риботипирование (Desmarchelier P.M. et al., 1993; Sexton M.M., 1993; Trakulsomboon S. et al., 1997; Inglis T.J., et al., 2002; Grif K. et al., 2003 340, 353) и гель-электрофорез в пульсирующем электрическом поле (Vadivelu J. et al., 1997; Koonpaew S. et al., 2000; Cheng A.C. et al., 2005), а также RAPD (Haase A. et al., 1995) и МЛСТ (Godoy D. et al., 2003). Дифференциацию штаммов возбудителя сапа проводили с помощью пульс-электрофореза (Chantratita N. et al., 2006), ДНК-зондирования (Monastyrskaya G. et al., 2004; Fushan A. et al., 2005) и риботипирования (Harvey S.P., Minter J.M., 2005). Однако, публикаций, касающихся ускоренного определения штаммовой гетерогенности патогенных буркхольдерий крайне мало. По крайней мере, поиск генетических маркеров для быстрого генотипирования штаммов B.mallei продолжается вплоть до настоящего времени.

Учитывая то, что в нашей коллекции отсутствовали штаммы возбудителей сапа и мелиоидоза, выделенные в период каких-либо вспышек заболеваний, в своей работе мы провели сравнительный анализ различных генотипических методов дифференциации коллекционных штаммов B.mallei и B.pseudomallei с целью установления степени сходства изучаемых культур и разработки оптимального алгоритма внутривидового типирования патогенных буркхольдерий. Из методов внутривидовой генетической дифференциации были использованы плазмидный анализ, монолокусное и мультилокусное-сиквенс типирование, схема типирования на основе вариабельных ампликонов, Rep-типирование, VNTR анализ и амплификация с различными произвольными праймерами.

Все исследуемые методы оказались эффективными для дифференциации штаммов B.pseudomallei, но не для B.mallei, что связано с различной структурной и функциональной организацией геномов этих патогенов (Holden M.T. et al., 2004; Nierman W.C. et al., 2004).

В результате проведенного плазмидного анализа нами оптимизирован метод скрининга плазмидных репликонов и выделено 4 типа штаммов В.pseudomallei, отличающихся по наличию плазмидных репликонов pPM1, рСМ2, рСМ3 и pCM4. В I группу отнесены штаммы, содержащие плазмиду рРМ1, II группу составляют штаммы с плазмидой рСМ2, в III группу входят штаммы рСМ3 и IV группу объединены штаммы с плазмидой pCM4. Плазмиды сохранялись в плазмидсодержащих штаммах в условиях длительного культивирования на питательных средах и пассажах на лабораторных животных, что свидетельствовало об их стабильном наследовании (Замараев В.С., 2004). На основе собственных и литературных данных (Jigen J., Li L., 1992; Radua S. et al., 2000) плазмидный анализ рекомендован в качестве генотипического метода дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от возбудителя сапа, в штаммах которого не обнаружены внехромосомные факторы наследственности не выявлены. Обнаруженные плазмиды могут выступать в качестве дополнительного критерия генотипической дифференциации штаммов и являться эпидемиологическим маркером в случае возникновении инфекционного процесса, вызванного плазмидсодержащим штаммом B.pseudomallei.

При компьютерном анализе и секвенирования участков генов 16S рРНК, 23S рРНК и fliC нам необходимо было решить две задачи. С одной стороны, определить консервативные локусы среди различных видов буркхольдерий и гетерологичных микроорганизмов, на основе которых мы конструировали амплификационные тест-системы, а с другой - оценить вариабельность этих генов внутри видов B.mallei и B.pseudomallei. В случае выявления нуклеотидных замен в изучаемых генах, провести типирование патогенных буркхольдерий. Однако количество таких различий оказалось недостаточным для эффективного разделения штаммов патогенных буркхольдерий ввиду выраженной гомологии геномов возбудителей. В результате кластерного анализа 30-ти штаммов возбудителя мелиоидоза и 16-ти штаммов возбудителя сапа нам удалось сформировать 3 группы штаммов B. pseudomallei и две группы B. mallei на основе фрагмента гена 16S рРНК. При сравнении нуклеотидных последовательностей целого гена 16S рРНК B. pseudomallei и B.mallei сформировано 9 и 4 группы штаммов, соответственно. На основе нуклеотидных последовательностей этого гена проведено выделение буркхольдерий в самостоятельный род бактерий (Yabuuchi E. et al., 1992) и B.thaillandensis в отдельный вид (Brett P.J. et al., 1998), а также дифференциация возбудителя мелиоидоза от возбудителя сапа (Gee J.E. et al., 2003), что также было подтверждено при выполнении настоящей работы.

При сравнении секвенированных последовательностей фрагментов 23S рРНК B. mallei и B. pseudomallei не обнаружено ни внутривидовых, ни межвидовых отличий, за исключением двух штаммов возбудителя мелиоидоза, выделенных в отдельную кластерную группу. Лишь при сравнении целого гена выявлены три нуклеотидные замены, на основе которых возможна дифференциация между собой этих двух видов микроорганизмов (Bauernfeind A. et al., 1998). Различий в нуклеотидных последовательностях fliC генов было еще меньше. При формировании 4 кластерных групп, образованных обоими видами буркхольдерий, штаммы возбудителя сапа вошли в одну группу с B.pseudomallei.

Малое количество вариабельных последовательностей внутри выбранных генов патогенных буркхольдерий свидетельствовало о низкой эффективности этих ДНК-мишеней для генотипирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза, а также определяло необходимость использования дополнительных методов дифференциации. Одним из таких методов является метод мультилокусного секвенс-типирования, впервые предложенный D. Godoy с соавторами (Godoy D. et al., 2003) для генотипирования возбудителя мелиоидоза. Разрешающая способность МЛСТ нами оценена при анализе двух коллекционных штаммов B. mallei 10230 и V-120 и трех штаммов B. pseudomallei 100, С-141 и 107. Классификацию аллельного профиля изучаемых штаммов B.pseudomallei и B.mallei проводили путем сравнения полученных нами сиквенсов с известной базой данных МЛСТ (http://www.bpseudomallei.mlst.net) на странице Burkholderia. Распределение аллелей исследуемых штаммов B. mallei и B.pseudomallei представлено в таблице 2.

Таблица 2 Характеристика исследуемых штаммов патогенных буркхольдерий по сиквенс-типу

Как следует из представленной таблицы, штаммы возбудителя мелиоидоза имели различные СТ (сиквенс-типы), что позволяло их дифференцировать друг от друга, в отличие от штаммов B. mallei, которые имели одинаковый 40 СT.

Использование этой технологии и алгоритма BURST (Based Upon Related Sequence Types) (Feil J.E. et al., 2004) позволило установить, что авирулентный штамм B.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, который получен нами от A. Bremmelgaard и числящийся в ее коллекции как атипичный штамм возбудителя мелиоидоза (Bremmelgaard A., 1975), принадлежит, наряду с анализируемыми B. pseudomallei 100 и B. pseudomallei С-141 к клональным комплексам штаммов Юго-Восточной Азии (рис. 4).

Рис. 4. Диаграмма различных СТ штаммов B.pseudomallei, выделенных в Юго-Восточной Азии (Алгоритм BURST). Стрелками отмечены СТ штаммов из коллекции ВолгоградНИПЧИ.

Полученные нами результаты и литературные данные свидетельствуют, с одной стороны, о значительно большей генетической однородности B. mallei (Godoy D. et al., 2003), а с другой, что метод МЛСТ недостаточно эффективен для внутривидового типирования возбудителя сапа и может быть использован лишь для дифференциации штаммов B. pseudomallei.

Оценка схемы типирования на основе амплификации вариабельных ампликонов (Variable Amplicon Typing Scheme), предложенной K. Duansonk с соавторами (2006), нами проведена на 18 штаммах возбудителя мелиоидоза и 4 штаммах возбудителя сапа из коллекции ВолгоградНИПЧИ.

В ходе эксперимента при анализе вариабельных продуктов амплификации (VAT), в зависимости от используемых праймеров и анализируемых штаммов, зарегистрировано от 3 до 9 фрагментов ДНК размерами от 132 до 788 п.н. Исследуемые 18 штаммов возбудителя мелиоидоза по наличию вариабельных ампликонов разделены на 13 VAT типов (рис.5). Большинство вариабельных локусов, выявленных с помощью субтрактивной гибридизации и на основе которых проводится типирование штаммов возбудителя мелиоидоза (Duangsonk K. et al., 2006), отсутствуют в геномах секвенированных штаммов B.mallei, поэтому нам не удалось разделить штаммы возбудителя сапа на различные генетические группы.

Рис. 5. Кластерный анализ VAT профилей штаммов возбудителя мелиоидоза.

Генетическая гетерогенность B.mallei была оценена нами методами рестрикционного анализа в формате пульс-электрофореза, VNTR-анализа и амплификации с произвольными праймерами, результаты которых позволили провести эффективную внутривидовую дифференциацию штаммов возбудителя сапа.

С помощью ПЭФ все исследуемые 14 штаммов возбудителя сапа разделены на 13 кластерных групп (90 % сходства). На уровне 92 % сходства каждый штамм B.mallei формировал уникальную кластерную группу (рис. 6).

Рис. 6. Электрофореграмма Xba I рестрикционных фрагментов ДНК и дендрограмма сходства штаммов B. mallei. ПЭФ в 1% агарозном геле с окраской ДНК этидиумом бромидом.

Амплификация с произвольными праймерами (метод RAPD) является одним из наиболее простых способов дифференциации штаммов. Данный метод использован для многих микроорганизмов, в том числе B.pseudomallei (Haase A. et al., 1995; Leelayuwat C. et al., 2000). Для генотипирования штаммов B.mallei этот методический прием не применяли.

Практически во всех цитируемых работах отмечено, что метод амплификации с произвольными праймерами требует не только строгой стандартизации подготовки культур, но и условий проведения ПЦР и электрофореза. Для получения высокоинформативных и воспроизводимых ДНК-профилей нами первоначально оптимизированы параметры реакции амплификации - отработаны температурные режимы ПЦР, определены необходимые концентрации праймеров, исследуемой ДНК, Taq-полимеразы, а также режимы электрофоретического разделения фрагментов амплификации.

Детекцию фрагментов, как и в случае ПЭФ, осуществляли в автоматическом режиме программы RFLPscan 3.12 из пакета программ Gene Profiler 4.03 (CSP Inc., USA). Кластерный анализ и графическое отображение матриц коэффициентов сходства проводили при помощи программы TreeCon for Windows v.1.3b. Группирование штаммов и построение дендрограмм проводили при помощи невзвешенного парно-группового метода UPGMA (Sneath P.H., Sokal R.R., 1973).

Из 19 проанализированных нами произвольных олигонуклеотидных затравок, для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий экспериментально подобран набор праймеров, показавших наибольшую эффективность (табл. 3). Каждые из олигонуклеотидов или их комбинаций давали возможность обнаружить специфические микролокусы в геномах штаммов, которым свойственна различная степень нуклеотидной изменчивости на внутривидовом уровне.

Таблица 3 Набор произвольных праймеров для дифференциации штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза методом RAPD

При анализе электрофоретических профилей ДНК 14 штаммов возбудителя сапа выявлены схожие RAPD-паттерны, которые, независимо от используемых праймеров, имели коэффициент подобия более 75 %, что доказывало высокую степень однородности изучаемых штаммов B.mallei. Анализ электрофоретических RAPD - паттернов штаммов B.pseudomallei и B.thailandensis показал их более высокую полиморфность по сравнению со штаммами возбудителя сапа. Данная закономерность вполне объяснима с позиций формирования адаптационной и генетической изменчивости у этой триады буркхольдерий. Кроме того, размер геномов B. pseudomallei и B.thailandensis превышает размер генома B. mallei, что также может влиять на количество RAPD-фрагментов на электрофореграммах.

Нами выявлено, что практически любой из праймеров пригоден для видовой дифференциации патогенных буркхольдерий. Однако в зависимости от праймеров формировалось различное количество и состав кластерных групп. Образованные кластерные группы отражали гетерогенность популяций патогенных буркхольдерий, при которой каждый штамм имел свой характерный RAPD-тип. Анализ штаммов, проведенный внутри каждого кластера в отдельности, показал, что при использовании разных праймеров формируются независимые группы.

Для проведения внутривидового типирования штаммов возбудителя сапа наиболее эффективны оказались праймеры Jeffreys, PR 6, PR 7 и RA, в то время как для для возбудителя мелиоидоза - олигонуклеотидные затравки PR 7, PR 16, PR 13, RA и Rep. При суммировании результатов RAPD-типирования и формировании единой матрицы сходства с использованием всего набора исследуемых праймеров каждый штамм B.mallei и B.pseudomallei формировал уникальную кластерную группу, соответственно количеству исследуемых штаммов, отражая гетерогенность популяций возбудителей сапа и мелиоидоза (рис.7).

Рис. 7. Дендрограмма сходства штаммов патогенных буркхольдерий с использованием набора произвольных праймеров

Детальный анализ геномов различных микроорганизмов, в том числе B. pseudomallei и B. mallei позволил обнаружить многочисленные повторяющиеся последовательности. Одними из них являются вариабельные тандемные повторы, лежащие в основе VNTR-анализа (Keim P. et al., 2000; Farlow J. et al., 2001; Сучков И. Ю. с соавт., 2004; Цыганкова О. И. с соавт., 2006). У патогенных буркхольдерий впервые тандемный повтор размером 10 п.н., обнаружен при анализе штамма B.pseudomallei ATCC 23343 (Liu Y. et al., 2002).

В настоящем разделе работы была рассмотрена возможность использования VNTR-анализа для генотипирования коллекционных штаммов патогенных буркхольдерий. Амплификацию VNTR-локусов возбудителей сапа и мелиоидоза проводили с помощью праймеров SR1/SR5 (Liu Y. et al., 2002).

В результате амплификации во всех исследуемых штаммах возбудителей сапа и мелиоидоза синтезировались фрагменты ДНК размером от 422 до 692 п.н. (рис. 8).

Рис. 8. Электрофореграммы продуктов амплификации штаммов патогенных буркхольдерий с праймерами SR1/SR5.

На основе различий в размерах полученных ампликонов при анализе 6 штаммов В.pseudomallei и 11 штаммов В. mallei нами идентифицировано 11 аллелей (VNTR-типов). Шесть штаммов B.pseudomallei разделены на 5 аллелей. Среди 11-ти штаммов B.mallei идентифицировано 8 аллелей с различным числом тандемных повторов. Причем, два аллеля были общими для B.mallei и B.pseudomallei.

Стабильность тандемных повторов для каждого штамма и отсутствие изменений нуклеотидных последовательностей в этом генетическом локусе после пассажей на животных, как отмечено в работе Y. Liu с соавторами (2002), свидетельствует о возможности использования данного генетического маркера в VNTR анализе B.mallei и B.pseudomallei. При этом, амплификационная тест-система с праймерами SR1/SR2 пригодна для простого, быстрого и высокоспецифичного ПЦР-типирования штаммов патогенных буркхольдерий.

Обобщая полученные результаты необходимо отметить, что в основу алгоритма генодиагностики и генотипирования патогенных буркхольдерий нами был заложен принцип дифференцированного подхода к выбору наиболее информативного метода или сочетаний молекулярно-генетических методов. Это позволило разработать единую схему идентификации и типирования B.mallei и B.pseudomallei (рис.9).

Рис. 9. Схема генетической идентификации и типирования B.mallei и B.pseudomallei.

В данной схеме ПЦР-скрининг предполагает использование амплификационных тест-систем со специфическими праймерами bfl1s/bfl2a, BTTS-s1/BTTS-as3 и b23s7/b23a8 для детекции B.mallei и B.pseudomallei. Алгоритм генодиагностики и генотипирования патогенных буркхольдерий, включает на этапе идентификации культур реакцию амплификации и секвенирование ампликонов. Для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза пригодны все используемые в работе генетические методы. Однако для ускоренного генотипирования B.pseudomallei целесообразно использовать различные варианты ПЦР-типирования (VAT, RAPD, Rep-ПЦР, VNTR). К этому следует добавить, что для дифференциации штаммов B.mallei эффективны ПЭФ, VNTR и RAPD, но быстрое генетическое типирование штаммов возбудителя сапа обеспечивают метод анализа тандемных повторов и амплификация с произвольными праймерами.

ВЫВОДЫ

1. Оценена сравнительная эффективность молекулярно-биологических методов идентификации и внутривидовой дифференциации штаммов B. mallei и B. pseudomallei. Предложена схема лабораторной диагностики сапа и мелиоидоза с включением ПЦР как на этапе идентификации чистых культур, так и анализа проб клинического материала и объектов внешней среды. Сформирована единая система генодиагностики и генотипирования патогенных буркхольдерий.

2. На основе нуклеотидных последовательностей генов, детерминирующих 23S рРНК, флагеллярного гена fliC и orf гена III типа секреции, определены олигонуклеотидные праймеры, подобраны оптимальные условия, определены параметры проведения ПЦР и сконструированы амплификационные тест-системы для идентификации патогенных буркхольдерий, позволяющие выявлять возбудителей сапа и мелиоидоза в концентрациях 1х102 -1х103 м.к./мл.

3. Показано, что использование олигонуклеотидных праймеров burts1/burta2, сконструированных на основе флагеллярного гена fliC, позволяет идентифицировать три вида буркхольдерий B.pseudomallei, B.mallei и B.thailandensis при анализе чистых культур и обнаруживать B.thailandensis в пробах экспериментального клинического материала при моделировании инфекционного процесса.

4. Для повышения специфичности идентификационных тестов необходимо использовать ПЦР с диагностическими праймерами, сконструированными на различные ДНК-мишени. Показано, что сочетание реакции амплификации и секвенирование ДНК мишеней - участков 16S рРНК и 23S рРНК, orf13 или fliC является алгоритмом быстрой идентификации B. mallei и B. pseudomallei и их дифференциации от близкородственных видов микроорганизмов.

5. Установлено, что эффективными фенотипическими методами дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза являются фаготипирование и анализ белкового спектров, в то время как проведение внутривидового типирования штаммов B.mallei возможно на основе различий в спектре суммарных клеточных белков. Тесты, основанные на выявлении вариабельных биохимических признаков и различий в чувствительности к антибиотикам выступают лишь в качестве дополнительных критериев внутривидовой дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий.

6. На основе плазмидного анализа выявлено 4 группы штаммов В.pseudomallei, отличающихся по составу и размеру плазмидных репликонов. Показано, что обнаруженные плазмиды могут выступать в качестве дополнительного критерия генотипической дифференциации штаммов и являться эпидемиологическим маркером в случае возникновении инфекционного процесса, вызванного плазмидсодержащим штаммом B.pseudomallei.

7. Показана высокая эффективность метода мультилокусного сиквенс-типирования для дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, позволившего установить, что анализируемые штаммы B.pseudomallei 100, С-141, а также B.pseudomallei 107 с неизвестным источником выделения, относятся к Юго-Восточной группе. Все исследуемые штаммы B. mallei формируют единый 40 сиквенс-тип, входящий в клональный комплекс штаммов B. pseudomallei.

8. Отработаны условия проведения рестрикционного анализа ДНК штаммов возбудителя сапа, оценена их генетическая гетерогенность и показана высокая эффективность метода пульс-электрофореза для внутривидового генетического типирования штаммов B.mallei. На основе полиморфизма длин рестрикционных фрагментов 14 штаммов возбудителя сапа с помошью кластерного анализа разделены на 13 генетических групп.

9. Показана высокая эффективность RAPD-типирования для дифференциации штаммов патогенных буркхольдерий. Предложен набор олигонуклеотидных затравок, обозначенных Jeffreys, PR 6, PR 7 и RA для проведения внутривидового типирования штаммов возбудителя сапа и праймеров PR 7, PR 16, PR 13, и RA - для возбудителя мелиоидоза.

10. Выявлена эффективность схемы типирования, основанной на анализе вариабельных ампликонов, для ускоренной генетической дифференциации штаммов возбудителя мелиоидоза, в отличие от штаммов B.mallei, в геномах которых вариабельные ампликоны не выявлены. С помощью ПЦР-типирования 18 штаммов возбудителя мелиоидоза разделены на 13 генетических группп (VAT типов).

11. Установлена пригодность праймеров, фланкирующих тандемные повторы в гене, детерминирующем эстеразу патогенных буркхольдерий, для простого, быстрого и высокоспецифичного ПЦР-типирования штаммов возбудителей сапа и мелиоидоза. С помощью VNTR анализа среди 11 штаммов B.mallei идентифицировано 8 аллелей с различным числом тандемных повторов, в то время как шесть штаммов B.pseudomallei разделены на 5 аллелей.

12. Показано, что алгоритм быстрой дифференциации штаммов B.pseudomallei включает методы ПЦР-типирования, основанные на анализе вариабельных ампликонов и количества тандемных повторов, амплификации ДНК с произвольными праймерами и Rep-ПЦР, в то время как быстрое генетическое типирование штаммов B.mallei обеспечивают VNTR-анализ и амплификация с произвольными праймерами.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Генетика возбудителя мелиоидоза / Меринова Л.К., Гришкина Т.А., Тарасова Т.Д., Антонов В.А. // Мелиоидоз (под ред. акад. Н.Г.Тихонова).- 1995.- Волгоград.- С. 26-47.

2. Антонов В.А., Замараев В.С., Захарова И.Б. Плазмиды возбудителя мелиоидоза // Экологоэпидемический надзор за природно-очаговыми инфекциями в Северном Прикаспии: Тез. науч. конф., посвящ. 95-летию Астраханской ПЧС, Астрахань, 1996.- С.107.

3. Антонов В.А., Замараев В.С., Захарова И.Б. Изучение гомологии плазмид возбудителя мелиоидоза // Там же.- С.103.

4. Антонов В.А., Замараев В.С., Меринова Л.К. Мобилизация криптических плазмид Pseudomonas pseudomallei в гетерологичные виды микроорганизмов // Там же.- С.99.

5. Денисов И.И., Андрус В.Н., Антонов В.А. Адаптация псевдомонад, имеющих клиническое значение к дезинфектантам // Там же.- С.101.

6. Илюхин В.И., Антонов В.А., Гришкина Т.А. Таксономическая позиция патогенных псевдомонад // Мат. VII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 28-31 января 1997, Москва. - 1997.- С.201-202.

7. Антонов В.А., Меринова Л.К., Замараев В.С, Викторов Д.В. Анализ фенотипических свойств штаммов возбудителя сапа, несущих криптические плазмиды Pseudomonas pseudomallei // Мат. науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России, 16-18 сентября 1997, Саратов, 1997.- C.6-7.

8. Замараев В.С., Антонов В.А. Плазмиды Pseudomonas pseudomallei // Мат. науч.-практ. конф., посвящ. 100-летию образования противочумной службы России, 16-18 сентября 1997, Саратов, 1997.- C.49-50.

9. Антонов В.А., Меринова Л.К., Замараев В.С., Агеева Н.П., Викторов Д.В. Фенотипические свойства возбудителей сапа и мелиоидоза, содержащих плазмидные репликоны // Проблемы санэпид охраны территории стран СНГ: Тез. науч. практич. конф., 15-17 сентября, 1998.- Саратов, 1998.- С.174-176.

10. Антонов В.А., Замараев В.С., Илюхин В.И. Группоспецифический ДНК-зонд для идентификации патогенных псевдомонад // Биотехнология .- 1998.-N5.- С.75-84.

11. Антонов В..А., Меринова Л.К., Викторов Д.В., Замараев В.С., Захарова И.Б., Ткаченко Г.А. Влияние R-плазмид на отдельные фенотипические признаки штаммов возбудителя сапа и мелиоидоза // Диагностика, лечение и профилактика опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология.Ветеринария: Мат. юбилейной науч. конф., посвящ. 70-летию НИИ микробиологии МО РФ, 30 ноября -1 декабря 1998, Киров, 1998.- C.48-49.

12. Захарова И.Б., Замараев В.С., Антонов В.А., Ткаченко Г.А. Конструирование интегративного вектора на основе ColE1-репликона для клонирования в Burkholderia pseudomallei // Там же.- C.48-49.

13. Замараев В.С., Антонов В.А., Илюхин В.И., Захарова И.Б. Выделение и первичная характеристика плазмид Pseudomonas (Burkholderia) pseudomallei // Мол. генет. микробиол. вирусол.- 1998.- N4.- С.28-33.

14. Vicktorov D.V., Piven N.N., Zakharova I.B., Plekhanova N.G., Antonov V.A. Melioidosis vaccine: some approaches to development / First Global Conference on Vaccines and Immunisation into the next millennium.6th-9 th September 1999, Manchester, UK, 1999, р.47-48

15. Антонов В.А., Замараев В.С., Меринова Л.К., Илюхин В.И. Burkholderia mallei как хозяин плазмид возбудителя мелиоидоза // Scientific Journal.- 1999.- №7.- р.225-226.

16. Антонов В.А., Замараев В.С., Меринова Л.К., Захарова И.Б., Ткаченко Г.А, Бахтояров Г.Н., Клонирование фрагментов криптической плазмиды возбудителя мелиоидоза // Проблемы медицинской и экологической биотехнологии: Тез. докл. юбилейной науч. конф., посвящ. 25-летию ГНЦ прикладной микробиологии, 14-15 декабря 1999, Оболенск, 1999.- С.8.

17. Антонов В.А., Меринова Л.К., Викторов Д.В., Ткаченко Г.А., Бахтояров Г.Н. Влияние плазмиды RP1::Tn10 на чувствительность клеток сапного микроба к мелиоидозному бактериофагу // Там же.- С.9.

18. Захарова И.Б., Замараев В.С., Антонов В.А. Физическое картирование криптической плазмиды рРМ1 возбудителя мелиоидоза // Проблемы особо опасных инфекций.- 1999.- Вып.79.- С.159-162.

19. Ткаченко Г.А., Антонов В.А., Бахтояров Г.Н. Плазмиды возбудителя мелиоидоза // Тез. конф. молодых ученых Поволжья и Северного Кавказа, 15-17 февраля, 2000.- Нижний Новгород, 2000.- С. 81.

20. Меринова Л.К., Антонов В.А., Замараев В.С., Викторов Д.В. Мобилизация криптических плазмид возбудителя мелиоидоза в гетерологичные виды микроорганизмов // Мол. генет. микробиол. вирусол.- 2000.- N2.- С.37-40.

21. Антонов В.А., Илюхин В.И., Замараев В.С., Трушкина М.Н. Использование плазмид возбудителя мелиоидоза в качестве ДНК-зондов для идентификации близкородственных микроорганизмов // Биотехнология .- 2000.-N4.- С.8-14.

22. Антонов В.А., Замараев В.С., Захарова И.Б., Меринова Л.К., Викторов Д.В., Попов С.Ф. Изучение плазмид патогенных буркхолдерий // Природно-очаговые инфекции в Нижнем Поволжье: Сб.науч. тр. (под ред. Н.Г. Тихонова).- Волгоград: Изд-во «Принт», ВолГУ, 2000.- С.41-46.