Научно-организационные основы эпидемиологического надзора за природно-очаговыми и особо опасными вирусными инфекциями в Восточной Сибири

В эндемичных районах Центральной и Западной Африки лихорадка Ласса является причиной значительной заболеваемости - до 200-300 тыс. случаев в год. Важной особенностью геморрагических лихорадок является их контагиозность, что создает реальную опасность заноса инфекции из очага на неэндемичные территории и может привести к возникновению заболеваний.

Природные очаги желтой лихорадки (ЖЛ) в Южной Америке и на Африканском континенте и в настоящее время продолжают оставаться активными и периодически создают предпосылки для возникновения эндемичных вспышек этого заболевания. В 2006 г. случаи ЖЛ официально зарегистрированы в шести странах Африки, где лабораторно подтверждено 25 случаев (летальность 28 %), в четырех странах Южной Америки (86 случаев, летальность 59 %). Лихорадка Долины Рифт недавно вызвала большие эпидемические вспышки в конце 2006 - начале 2007 гг. в Кении (684 случая заболеваний людей, летальность составила 23 %), Сомали (114 случаев, летальность - 45 %), Республике Танзания (290 случаев, летальность - 40 %).

В связи с ростом эпидемиологического потенциала многих особо опасных вирусных болезней и факторов, способствующих их эпидемическому распространению, появлению новых угроз (ТОРС, высокопатогенный грипп птиц, свиной грипп), задачи санитарной охраны территории субъектов Восточной Сибири существенно расширяются.

На основе анализа условий для формирования вторичных очагов ООВИ в случае их завоза на территорию Восточной Сибири установлено, что для контагиозных геморрагических лихорадок возможность формирования вторичных очагов в случае интродукции возбудителей на территорию Восточной Сибири очень мала, что обусловлено, прежде всего, климатическими условиями и отсутствием соответствующих видов носителей.

В случае заноса в Восточную Сибирь природно-очаговых инфекций с трансмиссивным механизмом передачи больной человек опасности для окружающих не представляет, хотя возможно лабораторное заражение персонала лабораторий при работе с инфицированным материалом. Завоз на неэндемичные территории региона инфицированных переносчиков может привести к возникновению спорадических случаев заболеваний. Условия для укоренения и образования вторичных очагов в случае интродукции возбудителей ЖЛ, лихорадок денге и долины Рифт в популяции кровососущих насекомых и возможных носителей в Восточной Сибири отсутствуют.

Наличие в России природных очагов Крымской геморрагической лихорадки и ЛЗН представляет целесообразность проведения по этим инфекциям мониторинговых исследований в Восточной Сибири с целью предотвращения интродукции возбудителей и предупреждения формирования новых природных очагов, контроля видового состава кровососущих насекомых и возможного появления на территории новых видов. В случае заноса ЛЗН имеются предпосылки активизации существующих малоизученных природных очагов с низкой эпидемической активностью или образование новых вторичных очагов.

Серологический мониторинг природных очагов арбовирусных инфекций.

Серологический мониторинг природных очагов арбовирусных инфекций (клещевой энцефалит, Инко, Гета и Батаи). Трудности осуществления эпидемиологического надзора за арбовирусными инфекциями в Восточной Сибири, связанные с выявлением случаев заболеваний, обусловили применение комплексного подхода к серологическому мониторингу, основанному на одновременном скрининге широкого спектра арбовирусов. На его основе получены сведения об иммунной прослойке к арбовирусам у людей и сельскохозяйственных животных на различных административных территориях Восточной Сибири, различающихся по ландшафтно-климатическим условиям, что позволяет выделить их в зоны разного уровня риска (рис. 2 А и Б.); дана оценка напряженности гуморального иммунитета к арбовирусам у крупного рогатого скота (КРС) в разных природных очагах; изучена динамика естественной иммунизации у КРС, выпасавшегося в очагах арбовирусных инфекций.

При изучении популяционного иммунитета к арбовирусам у населения Иркутской области, Республик Саха, Бурятия и УОБАО повсеместно выявлена иммунная прослойка к вирусам КЭ, Инко, Гета и Батаи. Ее величина варьировала в разных административных субъектах, территориях и отдельных населенных пунктах и зависела от ландшафтно-климатических условий и численности кровососущих членистоногих.

Показано наличие сочетанных природных очагов вирусов КЭ, Инко, Гета и Батаи почти на всех обследованных территориях. Величина иммунной прослойки населения к вирусу КЭ в административных субъектах находилась в пределах 21,5 % (Республика Бурятия) - 29,5 % (Иркутская область). Наибольший уровень наблюдали в Тункинском районе Республики Бурятия - 47,3 ± 2,9 %. Установлена территориальная неоднородность проявления активности арбовирусов. Наиболее широко распространен вирус Инко, его активность выше на северных территориях региона. Более высокие показатели характерны для плоскогорных участков в пределах подзон средней и южной тайги (Казачинско-Ленский и Усть-Илимский районы Иркутской области, пригородные зоны гг. Красноярск и Иркутск, Междуречье Алдана и Лены) с достаточно высокой численностью комаров родов Aedes и Сulex. В каждом из административных субъектов можно выделить участки территорий, отличающихся по показателям иммунной прослойки. Наибольшая частота вируснейтрализующих антител у населения выявлена к вирусу Инко (самый высокий уровень иммунной прослойки у населения Алданского улуса: в разные годы он составлял 30,5 ± 4,0-50,3 ± 3,0 % %), а наименьшая - к Гета (1,1 ± 0,7 % в Накынском улусе) и Батаи (0,7 ± 0,5 %) в Тункинском районе Республики Бурятия). На некоторых участках иммунная прослойка не установлена: к вирусу Батаи - в Накынском улусе, Заларинском, Эхирит-Булагатском и Заларинском районах Иркутской области; к вирусу Гета - в Баяндаевском районе. У КРС из Кяхтинского района (Республика Бурятия) не обнаружены антитела к вирусу Батаи. Эпидпотенциал природных очагов вирусов Батаи и Гета в таежном и таежно-степном ландшафтах исследованных районов Восточной Сибири значительно ниже. В тоже время процент серопозитивных особей КРС к вирусам Гета и Батаи выше на юге Иркутской области. Впервые обнаружены вируснейтрализующие антитела к вирусу КЭ у КРС в Усть-Кутском районе Иркутской области. Результаты серологического обследования населения и сельскохозяйственных животных в районах с различными ландшафтными и природно-климатическими условиями несколько различались, но в большинстве случаев коррелировали с численностью и особенностями состава переносчиков, что согласуется с экологическими предпосылками существования природных очагов арбовирусных инфекций.

Изучение напряженности гуморального иммунитета к арбовирусам у КРС показали его неоднородность на разных участках (табл. 4) Наиболее высокие титры антител к вирусу Инко отмечены в Якутии в Междуречье Алдана и Лены - СГТ составил 5,83 ± 0,31. Достаточно высокий уровень СГТ отмечен и в пригородных зонах гг. Красноярск и Иркутск, причем СГТ выше к вирусу Батаи. Здесь же выявлены наиболее высокие титры антител, в отдельных случаях достигавшие 1:1280-1:2560.

Таблица 4. Напряженность популяционного иммунитета в реакции нейтрализации в (log₂) к арбовирусам у КРС с разных территорий Восточной Сибири

Примечание: СГТ - средний геометрический титр.

Наше предположение о том, что результаты обследования телят могут быть применены при изучении эпидемической активности очага в конкретный сезон, не подтвердилось. Изучение динамики естественной иммунизации у КРС, выпасавшегося в очаге арбовирусных инфекций, показало, что особенностью естественной иммунизации коров при контакте с вирусами КЭ, Инко, Гета и Батаи является непродолжительность сохранения вируснейтрализующих антител, уровень которых на протяжении осенне-зимних месяцев заметно уменьшается и может полностью утратиться.

С точки зрения эпидемиологического надзора за КЭ данные серологического обследования населения эндемичных территорий позволяют судить об активности природного очага и могут быть использованы при планировании профилактических мероприятий.

Серологическая разведка циркуляции возбудителей геморрагической лихорадки с почечным синдромом и лихорадки Западного Нила. Несмотря на наличие природных очагов хантавирусов, а, возможно, и вируса Западного Нила, их распространение на территории Восточной Сибири практически не изучено. С 1995 по 2008 гг. нами обследовано 1546 мелких млекопитающих более 20 видов, относящихся к трем отрядам, 6 семействам и 13 родам, отловленных на территориях Красноярского и Забайкальского краев, Республик Саха (Якутия), Бурятия, УОБАО и Иркутской области, расположенных в следующих ландшафтных зонах: таежной, смешанных и широколиственных лесов, лесостепной и степной. Анализ результатов обследования мелких млекопитающих в ИФА показал, что на территории Восточной Сибири антиген хантавирусов обнаружен у восьми видов мелких млекопитающих: красной и красно-серой полевок (Республика Саха), узкочерепной полевки, полевки-экономки, азиатской лесной мыши, мыши полевой и серой крысы (Иркутская область), узкочерепной полевки и мыши домовой (Забайкальский край). В Иркутской области в пробах легких мелких млекопитающих, отловленных в 2006 г. в верховьях реки Умга (Заларинский район), антиген хантавирусов выявлен в среднем в 11,2 ± 3,3 % проб. Наибольший показатель зараженности наблюдали среди полевок-экономок - 16,6 ± 7,5 %. Довольно высокая частота зараженности выявлена и у узкочерепных полевок - 11,36 ± 4,7 %. В двух пробах от узкочерепных полевок в ОТ-ПЦР обнаружена РНК хантавирусов. В Забайкальском крае антиген хантавирусов выявлен в Забайкальском районе в легких двух видов грызунов - мыши домовой и узкочерепной полевки, РНК хантавирусов выявлена в одной пробе от джунгарского хомячка.

Изучение иммунитета к вирусу ГЛПС у населения региона (выборочно у населения Республики Саха (Якутия) и Бурятия (Кяхтинский район) показало отсутствие серопозитивных лиц. Серологическое обследование 108 жителей двенадцати деревень Заларинского района (Иркутская область) выявило трех (2,7 %) сероположительных на ГЛПС с титрами 1:32. Анализ проб сывороток крови, поступивших от 16 больных с подозрением на ГЛПС из лечебных учреждений гг. Иркутск, Ангарск, Усть-Илимск, Чита и Улан-Удэ, показал наличие антител к вирусу ГЛПС в титрах 1:128 у больного, прибывшего из Саратовской области и 1:1024 у проживающего в Забайкальском крае.

Результаты серологического обследования населения, проживающего на территории Восточной Сибири, свидетельствуют о циркуляции в регионе возбудителя лихорадки Западного Нила. Антитела обнаружены в среднем у 3 % населения, причем, у пациентов неврологических стационаров достоверно чаще - у 12-18 %. Впервые обнаружены антитела к вирусу ЗН у населения в Алданском улусе (Республика Саха), Эхирит-Булагатском районе УОБАО, Заларинском районе Иркутской области, Прибайкальском, Баргузинском и Кяхтинском районах Республики Бурятия.

Для установления возможной роли вируса ЗН в инфекционной патологии населения в период активности кровососущих членистоногих в 2005-2007 гг. проведены сероэпидемиологические исследования среди больных, в том числе и амбулаторных, обратившихся за медицинской помощью с жалобами на высокую температуру, упорные головные боли и другие проявления, включая менингиты и энцефалиты. При исследовании в 2005 г. в опытную группу включены 65 больных, поступивших в апреле-июне для стационарного лечения в Иркутскую областную клиническую инфекционную больницу (ОКИБ) с подозрением на КЭ и другие нейроинфекции. Контрольную группу составили 78 пациентов поликлиник, обратившихся за медицинской помощью по поводу заболеваний, не связанных с поражением нервной системы. Частота положительных находок в ИФА к вирусу ЗН в опытной группе составила 12,3 ± 4,3 %, а в контрольной - 2,6 ± 1,8 % (р<0,05). Антитела к вирусу ЗН во всех случаях (кроме одного из поликлиники) обнаружены в сыворотках крови, не содержащих вируснейтрализующие антитела к вирусу КЭ. В одном случае выявлена сероконверсия к вирусу ЗН во второй сыворотке у больного с окончательным диагнозом ОРВИ.

В 2006 г. обследовано на наличие антител к вирусу ЗН еще 94 пациента ОКИБ с подозрением на КЭ, и положительный результат получен у 17 из них (18,0 ± 4,0 %). В контрольной группе (пациенты Центра профилактики клещевых инфекций, n = 112), антитела к вирусу ЗН обнаружены в 3,2 ± 1,7 %, что достоверно меньше, чем в группе пациентов инфекционной больницы (р<0,05).

В 2007 г. обследовано 92 пациента ОКИБ, поступивших в августе-сентябре. Сероположительными к вирусу ЗН оказались 14 (15,2 ± 3,7 %). В контрольной группе, состоящей из 95 жителей Заларинского района Иркутской области (сыворотки крови собраны в сентябре) антитела к вирусу ЗН обнаружены в трех пробах (3,1 ± 1,8 %), что также достоверно ниже, чем в группе пациентов ОКИБ (р<0,05).

Таким образом, у пациентов инфекционного стационара с неврологической симптоматикой антитела к ВЗН обнаруживались в 4-5 раз чаще, в сравнении с амбулаторными пациентами. Результаты наших исследований позволяют высказать предположение о существовании в Восточной Сибири природных очагов ЛЗН и этиологической роли вируса ЗН в патологии населения.

Изучение свойств популяции вируса клещевого энцефалита в региональных природных очагах.

Свойства штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированых из иксодовых клещей (на примере Приангарья, 1995-1998 гг.). Одним из критериев, позволяющим выявить гетерогенность вирусной популяции, является способность вируса к репродукции в тех биологических системах, в которых он не размножался при первичной изоляции. Осуществляли это путем смены систем культивирования. Из ИФА-положительных клещей и ИФА-отрицательных пулов клещей были изолированы штаммы вируса КЭ, отнесенные в соответствии с применяемыми системами изоляции в семь групп. При выделении все изоляты (63) прошли два-три пассажа на культуре клеток или НБМ. Анализ результатов смены систем культивирования показал, что изоляты, выделенные от клещей и пулов клещей только в культуре клеток при температуре 37 °С, не адаптировались к культуре клеток при 28 °С на протяжении трех пассажей, т.е. все они имеют селективное преимущество при размножении в клеточной культуре. Отрицательный результат получен и при переводе штаммов с 28 на 37 °С (табл. 5).

Таблица 5. Результаты перевода изолятов в системы, отличные от систем первичной изоляции

Примечание: КК - культура клеток; НБМ - новорожденные белые мыши.

При смене системы культивирования с культуры клеток на НБМ положительный результат получен у 16 из 37 (43,2 %) ИФА-положительных и у семи из 24 (29,1 %) ИФА-отрицательных изолятов. Причем, при смене систем культивирования с культуры клеток на НБМ больше положительных результатов получено для штаммов, изолированных при 37 °С, чем при 28 °С.

За 1995-1998 гг. изучения очагов клещевого энцефалита в Иркутском, Ольхонском, Слюдянском и Эхирит-Булагатском районах Иркутской области нами выделено 130 штаммов от иксодовых клещей: /. persulcatus (123), D. silvarum (2) и D. nuttalli (5). У 25 штаммов изучена вирулентность вируса для беспородных белых мышей при внутримозговом и подкожном способах введения материала. При внутримозговом заражении показатели вирулентности варьировали в пределах 5,09-10,0 lg ЛД _50/мл и подкожном - 3,60-9,16 lg ЛД _50/мл (титр 3,60 lg ЛД _50/мл выявлен только у одного штамм при внутримозговом заражении, титр 5,09 lg ЛД _50/мл - у одного штамма при подкожном заражении). Индекс инвазивности (ИИ) - в пределах 0,13-3,0 При экстраневральном введении высокая вирулентность (выше 8,0 lg ЛД _50/мл) выявлена у 10 штаммов. ИИ у них находился в пределах 0,15-1,5 lg ЛД _50/мл - Средние величины титров при церебральном заражении составили 8,12 ± 0,23, при периферическом - 7,34 ± 0,28 lg ЛД _50/мл. Средний показатель ИИ = 0,77 ± 0,15. Таким образом, большинство (92 %) изученных штаммов высоковирулентны как при внутримозговом, так и подкожном введении вируса (ИИ <2,0), один штамм оказался умеренно вирулентным (ИИ = 3,06). Штаммы обладали выраженной гетерогенной гемагглютинирующей активностью, вызывая агглютинацию гусиных эритроцитов в условиях оптимума рН 6,2 при 4 °С в пределах 1:20-1:640.

Свойства штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных от людей, умерших от клещевого энцефалита (на примере Забайкальского края, 1995-2003 гг.). Для изучения этиологической структуры очаговых форм КЭ, заканчивающихся летальным исходом, в Забайкальском крае впервые с применением молекулярно-биологических методов изучена представительная группа штаммов вируса КЭ, выделенных от 13 умерших людей с энцефаломиелитической, менингоэнцефаломиелитической, менингополиомиелитической формами КЭ. Штаммы изолированы на НБМ, зараженных пробами из разных отделов головного (11), спинного (1) мозга и трупной крови (1). Результаты изучения вирулентности для беспородных белых мышей массой 6-8 г показали, что большинство штаммов высоковирулентны как при внутримозговом, так и подкожном введении вируса (ИИ<2,0) и только один штамм (653) - умеренновирулентный (ИИ = 3,0). Различия в способности преодолевать гематоэнцефалитичесий барьер у изученных штаммов разных подтипов вируса КЭ не установлены. Штаммы независимо от подтиповой принадлежности агглютинировали эритроциты гуся в зоне рН 5,8-6,2. Титры гемагглютинина колебались от 1:40 до 1:1280. Преобладали штаммы со средними титрами. Исключение составил штамм 102 (дальневосточный подтип), у которого отсутствовали гемагглютинирующие свойства. Это один из немногочисленных антигенно-дефектных изолятов вируса КЭ, с которыми связывают развитие серонегативных форм инфекции (Погодина В.В. и др., 1992). Все изученные штаммы проявляли цитопатическое действие на культуре клеток СПЭВ, но в то же время различались по срокам деструкции монослоя и степени его выраженности.

Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса клещевого энцефалита. Нами охарактеризована структура вирусной популяции в Приангарье по результатам ретроспективного генотипирования 47 изолятов вируса КЭ, выделенных в 1995-2005 гг. из клещей, собранных на территории Иркутского (46) и Ольхонского (1 изолят) районов Приангарья и 1 штамма, выделенного из пробы головного мозга от больной К., умершей от КЭ (Иркутская область). Генотипирование штаммов методом ПЦР в режиме реального времени с гибридизационно-флюоресцентной детекцией с генотипоспецифическими зондами показало абсолютное преобладание сибирского подтипа: из 47 изолятов 41 (87,2 %) принадлежит к сибирскому, два (4,2 %) - к дальневосточному подтипам и четыре (8,5 %) содержат смесь вирусов двух генотипов в различной концентрации - микст-штаммы (табл. 6).

Таблица 6. Результаты генотипирования штаммов вируса клещевого энцефалита, изолированных из иксодовых клещей, собранных на территории Приангарья в 1995-2005 гг.

Полученные сведения являются новыми доказательствами ранее описанного (Верхозина М.М. и др., 2007) преимущественного распространения в Приангарье сибирского подтипа вируса КЭ.

В Забайкальском крае от больных, умерших от очаговых форм КЭ, изолировано 13 штаммов вируса. Генотипированием установлено наличие среди них штаммов вируса КЭ дальневосточного (8 штаммов) и сибирского (4 штамма) подтипов. Один штамм (штамм 29) охарактеризован как микст - содержал участки генома дальневосточного и сибирского подтипов. В результате впервые проведенного комплексного изучения биологических, в том числе и молекулярно-генетических свойств штаммов вируса КЭ, выделенных от умерших больных показано, что в Забайкальском крае заболевания КЭ обусловлены двумя самостоятельными подтипами вируса - дальневосточным и сибирским. Оба подтипа вызывают развитие очаговых форм болезни с летальным исходом. Очаговые формы связаны и с микст-штаммами вируса КЭ.

Таким образом, на основе генотипирования 61 штамма охарактеризована структура популяции вируса КЭ, циркулирующего в Приангарье и Забайкалье в 1995-2005 гг. Структура популяции сформирована на основе сибирского и дальневосточного генотипов с абсолютным доминированием сибирского генотипа (87 %) в Приангарье (Иркутский район) и напротив, доминированием в Забайкалье дальневосточного генотипа (61,5 %). Показано, что в очаге совместной циркуляции разных подтипов появляются микст-штаммы вируса КЭ, в которых сочетаются генетические признаки сибирского и дальневосточного подтипов; впервые в природном очаге в Приангарье изолированы четыре таких штамма, а в Забайкалье - один.

Совершенствование лабораторной диагностики природно-очаговых и особо опасных вирусных инфекций.

Вирусологический мониторинг природного очага вируса клещевого энцефалита на основе комплексного применения методов первичной изоляции вируса из иксодовых клещей. Для повышения эффективности эпидемиологического надзора нами разработан алгоритм вирусологического мониторинга природных очагов КЭ, основанный на комплексном использовании биологической изоляции (лабораторные животные, культура клеток), серологических (ИФА, МФА) и молекулярно-генетических методов с целью выявления наиболее широкого спектра циркулирующих в природном очаге вариантов вируса и оценки их эпидемиологической значимости. Такой подход отличается от применяемых другими исследователями, во-первых, исследованием как положительных, так и отрицательных в ИФА клещей, во-вторых, заражением клеточной культуры одновременно при двух температурных режимах (рис. 3.).

Из 3057 исследованных в ИФА клещей положительный результат получен в 165 пробах, что составило 5,4 ± 0,4 %. Из них в соответствии с применяемыми методами получено семь групп изолятов (табл. 7). Параллельно на НБМ и в КК удалось выделить 22,0 %, в КК - 50,0 % и на НБМ - 27,9 % изолятов. При заражении КК получено в 1,8 раз больше изолятов, чем на НБМ, причем на КК при 37 ^оС их выделено несколько больше, чем при 28 ^оС. Получен только один изолят одновременно на НБМ и в КК при двух температурных режимах. Следует отметить, что не из всех антигенсодержащих клещей удалось выделить вирус КЭ. Из 165 положительных в ИФА суспензий методами биологической пробы в различных системах изоляции выделено только 68 патогенных агентов (41,2 ± 3,8 %).

Рис. 3. Схема изоляции и типирования вируса клещевого энцефалита из клещей Ixodes persulcatus на основе комплексного применения методов первичной изоляции

Примечание: * - отрицательные в ИФА суспензии клещей объединены по 5-10 в пулы; НБМ - новорожденные белые мыши; КК - культура клеток.

Таблица 7. Общее количество патогенных агентов (изолятов), выделенных в различных системах первичной изоляции из положительных и отрицательных в иммуноферментном анализе клещей Ixodes persulcatus

Из 2892 отрицательных в ИФА суспензий приготовлено 382 пула. Из них на НБМ и КК в двух температурных режимах выделен один, параллельно на НБМ и КК при температуре культивирования 37 ^оС - 4, на НБМ и КК при 28 ^оС - 3, методом заражения НБМ - 26 изолятов. Параллельно в двух температурных режимах выделен один, при 37 ^оС - 12, при 28 ^оС - 15 изолятов. Таким образом, параллельно на НБМ и в КК выделено 12,9 % изолятов, на НБМ - 41,9 % и в КК - 45,2 % изолятов. Особо следует отметить, что из отрицательных в ИФА проб удалось выделить 16,2 % изолятов. Таким образом, из 547 исследованных проб (включая 165 положительных проб и 382 отрицательных в ИФА пулов) выделено 130 изолятов, в том числе: в биопробе на НБМ - 45, на КК - 62, на КК и НБМ - 23 изолята. Результаты исследований свидетельствуют о том, что широко применяемый при скрининговых исследованиях клещей как в природных очагах КЭ, так и в центрах профилактики клещевых инфекций метод ИФА не позволяет корректно оценивать их вирусофорность и показывают необходимость включения в экспресс-диагностику КЭ в центрах профилактики клещевых инфекций дополнительных методов.

Таким образом, комплексное использование нескольких методов изоляции оказалось более результативным и позволило выделить из клещей больший спектр штаммов вируса комплекса КЭ с различными биологическими свойствами. Очевидно, что такие исследования могут проводить только научные учреждения.

Совершенствование методов лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Марбург и Эбола. Изучена динамика антителообразования у морских свинок, иммунизированных культуральным вирусом (Марбург, Эбола) в дозе 10⁴ БОЕ на животное. Через 1,5 месяца проводили реиммунизацию тем же материалом с полным адъювантом Фрейнда. Титры специфических антител в сыворотках крови определяли в НМФА и клеточном ИФА. Установлено, что через 16 дней после иммунизации антитела выявляются в высоких титрах: СГТ составил 7,00 ± 0,68 (НМФА) и 12,78 ± 0,58 (клеточный ИФА). После реиммунизации наблюдали статистически достоверное (р<0,05) увеличение титра специфических антител, которое превышало показатели после первой иммунизации. Высокие титры антител поддерживались или несколько увеличивались (33 % животных) на протяжении еще 16 дней (срок наблюдения), СГТ в НМФА и клеточном ИФА составил 7,50 ± 0,22 и 13,50 ± 0,26 соответственно.

Через две недели после иммунизации титр специфических антител к вирусу Эбола у животных составлял в НМФА 1:128-1:1024, в клеточном ИФА - 1:1280-1: 51200. Высокий титр антител сохранялся до 34 дня, затем наблюдали его постепенное снижение. Реиммунизация приводила к увеличению иммунного ответа. Максимум антителообразования наблюдали также, как и при иммунизации вирусом Марбург - через 2 недели.

Для получения специфических сывороток нами испытаны восемь схем иммунизации животных, отличающихся по срокам, способам и дозе введения материала, а также использованием адъюванта Фрейнда. Для вируса Марбург наилучшие результаты получены при трех схемах. Антисыворотки, полученные при этих схемах иммунизации, имели СГТ 8,02 ± 0,26; 8,27 ± 0,27 и 8,15 ± 0,32 соответственно. Для вируса Эбола наилучший результат получен при схеме № 4 - у 12 из 14 морских свинок выявлен в НМФА титр антител 1:1024 (СГТ равен 9,86 ± 0,10).

Проведена работа по оптимизации метода приготовления слайд-антигенов высокого качества: подобрана множественность заражения клеток и определены оптимальные сроки инкубации инфицированных культур. При множественности заражения 0,01 БОЕ/кл. и инкубации в течение 3 суток (для вируса Эбола) и 4 суток (Марбург) на слайд-антигенах выявляли специфические антигены в виде гранул разнообразных форм и размеров, локализующихся в цитоплазме. Изучена динамика экспрессии антигенов вирусов Марбург и Эбола при заражении клеток Vero с множественностью 10 БОЕ/кл. Показана возможность выявления в зараженных клеточных культурах вирусных антигенов при различных сроках инкубации, начиная сразу после адсорбции материала на клеточном монослое. Полученные данные указывают, что на различных этапах инфекции морфология вирусспецифических антигенов, выявляемых в НМФА, может существенно различаться. Эти сведения необходимо учитывать при проведении лабораторной диагностики лихорадок Марбург и Эбола, чтобы избежать ошибочных заключений.

Разработан метод клеточного иммуноферментного анализа, который применили для выявления в сыворотках крови морских свинок антител к вирусам Марбург (n = 48) и Эбола (n = 42). Во всех сыворотках выявлены антитела одновременно в клеточном ИФА и НМФА. При анализе результатов использования двух методов титрования антисывороток к вирусам Марбург и Эбола наблюдалась корреляция: коэффициент корреляции для сывороток к вирусу Марбург составил 0,45, к Эбола - 0,78. Титры антител в клеточном ИФА были выше, чем в НМФА в среднем в 50 раз. Метод клеточного ИФА, обладая высокой чувствительностью, специфичностью и простотой исполнения, позволяет проводить массовый скрининг сывороток. Наиболее существенным достоинством метода является то, что для его постановки не требуется очищенный вирусный антиген. Это актуально при изучении особо опасных вирусов, так как очистка вирусных антигенов должна проводиться в условиях максимальной биологической защиты, требующей дополнительных затрат.

Нами разработан вариант реакции нейтрализации в культуре клеток BGM с применением минимальной тест-дозы вируса, который позволил впервые выявить нейтрализующие вирус Эбола (штамм Заир) антитела в сыворотках иммунизированных морских свинок. В варианте РН с постоянной дозой вируса и сыворотки установили, что термоинактивированные иммунные сыворотки двух морских свинок в разведении 1:10 обеспечивают 100 % редукцию бляшек вируса Эбола. При исследовании 12 образцов сывороток иммунизированных животных выявлены сыворотки как с относительно высоким (1:180), так и с низким (1:20) титром вируснейтрализующих антител. Обращает на себя внимание тот факт, что ряд иммунных сывороток (в НМФА) не имеет нейтрализующих антител (титр менее 1:20). Существенного влияния схем иммунизации животных на титры вируснейтрализующих антител не отмечено. Эффект неспецифической нейтрализации обнаружили только в нормальных сыворотках морских свинок при 5-10 % их концентрации. Таким образом, разработанный нами вариант РН с применением минимальной тест-дозы вируса позволил впервые выявить нейтрализующие вирус Эбола (штамм Заир) антитела в сыворотках иммунизированных морских свинок.

Схема лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Эбола и Марбург. В связи с отсутствием нормативно-методических документов, регламентирующих лабораторно-диагностические исследования на эти возбудители, нами на основе собственных наработок составлено "Методическое пособие по лабораторной диагностике возбудителей геморрагических лихорадок Эбола и Марбург". Схематично лабораторная диагностика геморрагических лихорадок Эбола и Марбург включает в себя комплекс исследований по выделению и идентификации вируса, а также по выявлению вирусспецифических антигенов и антител, которые можно реализовать в условиях максимальной биологической защиты. Данная схема апробирована в лабораторных условиях, а также применена при анализе материала в 1992 г. от больной М. из г. Корсакова с диагнозом "геморрагическая лихорадка Марбург?".

Совершенствование эпидемиологического надзора за природно-очаговыми и особо опасными вирусными инфекциями.

На основе анализа эпидемиологических данных, данных литературы, результатов вирусологического и серологического мониторинга нами обоснован дифференцированный подход и намечены пути совершенствования эпидемиологического надзора за природно-очаговыми и ООВИ с учетом распределения их в группы разного уровня эпидемиологической значимости для региона и требующих различных подходов при организации эпидемиологического надзора в Восточной Сибири (рис. 4.): I. С регистрируемой заболеваемостью - КЭ и бешенство; II. Широко распространенные в регионе арбовирусные инфекции: Инко, Батаи, зайца-беляка, Тягиня, Гета; III. Малоизученные, роль которых в патологии населения Восточной Сибири требует уточнения - лихорадка Западного Нила, ГЛПС; IV. Экзотические особо опасные вирусные инфекции I-II групп патогенности, на которые распространяются правила санитарной охраны территории.

I. Результаты наших исследований позволяют наметить пути оптимизации эпидемиологического надзора за КЭ (рис. 5.) в соответствии с функциональными блоками эпидемиологического надзора (Черкасский Б.Л., 2001).

1. Функциональная структура контроля управляющих решений: организация центров экспресс-диагностики и профилактики клещевых инфекций в наиболее неблагополучных районах субъектов региона; выделение зон наибольшего риска заражения населения с разработкой для каждой оптимальных специфических и неспецифических мер профилактики.

2. Статистический мониторинг: налаживание обмена на территориальном и региональном уровнях оперативной информацией между заинтересованными учреждениями, ведомствами по заболеваемости КЭ, результатам эпизоотологического мониторинга очагов.

Рис. 4. Распределение природно-очаговых и особо опасных вирусных инфекций по группам в соответствии с уровнем их эпидемиологической значимости для территории Восточной Сибири

3. Вирусологический мониторинг: комплексный подход к изоляции вируса из клещей в природном очаге, основанный на одновременном использовании систем индикации (ИФА), изоляции (белые мыши, культура клеток при 28 и 37^оС) с последующим применением (выборочно) молекулярно-генетических методов (ОТ-ПЦР, генотипирование). Может быть применен только научно-исследовательскими учреждениями.

Рис. 5. Схема оптимизации эпидемиологического мониторинга в системе эпидемиологического надзора за клещевым энцефалитом

4. Паразитологический мониторинг: изучение вирусофорности клещей по возможности во всех эндемичных районах субъектов региона с учетом мозаичности распределения клещей на территории очага. Осуществляют Центры гигиены и эпидемиологии в субъектах, научные учреждения, Читинская и Тувинская ПЧС.

5. Серологический мониторинг: анализ иммунологической структуры населения; изучение иммунной прослойки у КРС на участках территорий с разными рисками заражения КЭ. Может выполняться научными учреждениями.

6. Молекулярно-генетический мониторинг: применение в системе эпидемиологического надзора молекулярно-генетических методов позволяет уточнить роль разных подтипов вируса, а также политиповых штаммов в формировании региональных особенностей инфекционной патологии. Возможен при участии научных учреждений, в том числе центральных.

II. Основные пути оптимизации эпидемиологического надзора за арбовирусными инфекциями, связанными с комарами: своевременное выявление и расследование случаев и вспышек сезонных лихорадок с менингитами и энцефалитами, дифференциация их от заболеваний, вызванных вирусами комплекса клещевого энцефалита и других инфекций; активизация исследований на основе научно обоснованной региональной программы эколого-эпидемиологического мониторинга арбовирусов для получения данных о современном состоянии природных очагов арбовирусных инфекций на территории Восточной Сибири - уточнения ареала, изучения экологии возбудителей в разных ландшафтных зонах региона. Обследование КРС как "индикатора" активности природного очага арбовирусов.

III. На территории Восточной Сибири заболеваемость лихорадкой Западного Нила и ГЛПС не регистрируется, поэтому эпидемиологический надзор со стороны службы Роспотребнадзора полностью отсутствует. Необходимо разработать программу эпидемиологической разведки, экологического, эпизоотологического мониторинга, а также обследования больных в летне-осенний период с остро лихорадочными заболеваниями без поражения и с поражением ЦНС в виде серозного менингита или менингоэнцефалита. В выполнении такой программы должны быть задействованы ФГУЗ "Центр гигиены и эпидемиологии" в субъекте, научные учреждения.

Пути улучшения эпиднадзора за ГЛПС в условиях Восточной Сибири мы видим в организации эпидемиологической разведки - выявлении и характеристике местных очагов хантавирусных инфекций, а также выявлении и тщательном обследовании больных с подозрением на ГЛПС. Прежде всего, следует дифференцировать местные и завозные случаи.

IV. Основная цель эпиднадзора за экзотическими особо опасными вирусными болезнями заключается в предотвращении случаев заноса на территорию региона и их дальнейшего распространения. Особую опасность для населения представляют геморрагические лихорадки Эбола, Марбург, Ласса, человеческий грипп, вызванный новым подтипом. Не исключена возможность их завоза на территорию нашего региона, особенно через международные аэропорты в гг. Иркутск, Красноярск, Улан-Удэ.

Проведена оценка территории Восточной Сибири (на примере Красноярского, Забайкальского краев, Республик Хакасия, Тыва, Бурятия, Иркутской области) в отношении риска возможного завоза особо опасных вирусных болезней и эпидемиологического значения видов транспортного сообщения с эндемичными по ООВИ странами. Санитарно-карантинный досмотр пассажиров и грузов организован в пунктах пропуска (санитарно карантинные пункты и отделения) через Государственную границу в аэропортах гг. Красноярск, Абакан, Иркутск, Братск, Улан-Удэ и Чита; на железнодорожных станциях Наушки Восточно-Сибирской железной дороги и Забайкальск Забайкальской железной дороги. На международных автомобильных пунктах пропуска в населенных пунктах Кяхта, Монды (Республика Бурятия), Забайкальск, Старый Цурухайтуй, Соловьевск, Верхний Ульхун, Олочи и Покровка (Забайкальский край), на автомобильных пунктах пропуска "Хандагайты", "Цаган-Тологой", "Шара-Суур" (Республика Тыва).

Для уточнения роли разных видов транспорта в Восточной Сибири проведен анализ международных пассажирских перевозок с учетом актуальных с точки зрения санитарной охраны территории от заноса вирусных инфекционных болезней. По имеющимся данным на территорию Иркутской области ежегодно воздушным транспортом прибывают около 70 тыс. человек, включая пассажиров и членов экипажей. Пассажиры прибывали в разные годы из 23-32 стран Европы, 4-6 - Америки, 1-6 - Африки, 15-21 - Азии, Австралии с Океанией и Новой Зеландии. Ежегодно доля перевозимых пассажиров из эндемичных по лихорадке денге, желтой лихорадке и контагиозным вирусным геморрагическим лихорадкам (КВГЛ) стран составляет соответственно 2,15; 0,015 и 0,002 % в структуре прибывших. В период с 2003 по 2007 гг. отмечается трехкратное нарастание объема пассажирских перевозок. Преобладают перевозки пассажиров из стран Европы и Азии. Среднемноголетнее число прибывших пассажиров из стран Европы за период с 2002-2006 гг. составило 56231, а из стран Азии - 19627. На территорию региона из европейских стран возможен завоз ЛЗН, ГЛПС, Крымской геморрагической лихорадки и других болезней. Прибытие авиапассажиров из стран Азии (Япония, Китайская Народная Республика, Вьетнам, Индия, Индонезия, Малайзия, Сингапур, Таиланд, Австралия, Пакистан) связано с возможностью заноса различных болезней, вызываемых особо опасными арбовирусами семейств Flaviviridae (японский энцефалит, лихорадка/геморрагическая лихорадка денге, киасанурская лесная болезнь), Bunyaviridae (ГЛПС, Крымская геморрагическая лихорадка), Paramyxoviridae (Хендра и Нипа), Orthomyxoviridae (грипп птиц H5N1), Picornaviridae (ТОРС). Togaviridae (Чикунгунья). В международном аэропорту "Красноярск" санитарно-карантинным отделением ежегодно досматривается в среднем 1100 воздушных судов на международных линиях. Международными рейсами прибывает в пределах 100 тыс. человек.

Санитарный контроль международных пассажирских железнодорожных перевозок осуществляется в пунктах пропуска через Государственную границу РФ на пограничных железнодорожных станциях Забайкальск (Забайкальский край) и Наушки (Республика Бурятия). Общее количество прибывших на ст. Наушки пассажиров из КНР, Монголии, в том числе и российских граждан, ежегодно составляет 42864-45021 человек. На станции Забайкальск основные перевозки связаны с передвижением грузов, ежегодный объем составляет 470 тыс. контейнеров.

Автомобильные перевозки. Рассматривая потенциальную возможность заноса особо опасных инфекционных болезней разными видами транспорта, следует отметить, что число пассажиров, ежегодно прибывающих на территорию Восточной Сибири через международные автомобильные пункты пропуска (МАПП) из КНР и Монголии, превышает количество авиапассажиров, прибывающих из Европы, Азии, Африки, Америки и Австралии в аэропорты гг. Красноярск, Иркутск, Братск, Абакан, Чита и Улан-Удэ. Так, через шесть МАПП, расположенных в Забайкальском крае на Государственной границе с КНР и Монголией, ежегодно передвигается более 1,5 млн. человек и 300 тысяч транспортных средств. Географическое расположение Забайкальского края и Республики Бурятия определяет особую важность организации мероприятий по санитарной охране. Территория Забайкальского края на протяжении полутора тысяч километров граничит с КНР и Монголией. В сопредельных странах практически ежегодно регистрируются заболевания чумой, холерой, но мы не располагаем сведениями по заболеваемости ООВИ. Известно о существовании природных очагов ГЛПС, бешенства и некоторых других инфекций. В 2003 г. в Китае зарегистрирована эпидемическая вспышка неизвестного ранее заболевания - ТОРС, регистрируются заболевания людей гриппом птиц. При ухудшении эпидемиологической ситуации по этим болезням существует вероятность их завоза на территорию Забайкалья.

Нами проведено эпидемиологическое ранжирование территории Восточной Сибири по степени риска завоза и распространения ООВИ. В качестве основных критериев эпидемиологических рисков для ранжирования территории были выбраны следующие: 1. Наличие международного аэропорта; 2. Наличие железнодорожного сообщения с зарубежными странами; 3. Наличие МАПП; 4. Наличие приграничной территории; 5. Наличие пассажиропотока из эндемичных по ООВИ стран; 6. Численность населения. Для оценки риска применили метод Е.Б. Куренкова (2006) в нашей модификации. Величину риска завоза ООВИ определяли по результирующей сумме баллов всех критериев. Использовали три градации балльной системы: высокий уровень (более 30 баллов), средний (20-30 баллов), низкий (меньше 20 баллов). Максимальная величина риска завоза - 40 баллов. Результаты ранжирования территории Восточной Сибири по степени риска завоза и распространения ООВИ представлены на рис. 6. Ранжирование территории (Красноярский, Забайкальский края, Республики Хакасия, Тыва, Бурятия и Иркутская область) показало, что наибольшему риску завоза ООВИ подвержены Забайкальский край и Республика Бурятия, имеющие общую границу с КНР и Монголией. На территорию Забайкальского края и Республики Бурятия наиболее вероятен занос ТОРС, бешенства, а также гриппа птиц Н 5N1 автомобильным и железнодорожным транспортом в пунктах пропуска на границе с КНР. Примерно одинаковый риск имеют Красноярский край и Иркутская область, так как на их территорию прибывают авиапассажиры из-за рубежа, в том числе и из эндемичных по ООВИ стран. Возможен завоз геморрагических лихорадок и других опасных инфекций. В Республике Тыва риск связан с завозом природно-очаговых вирусных инфекций из Монголии (в основном бешенства). В Республику Хакасия возможен завоз воздушным транспортом неэндемичных для региона инфекций пассажирами, прибывающими из европейской части страны.

Однако проблема санитарной охраны территории региона осложняется следующими положениями: недостаточным оснащением и кадровым обеспечением лабораторной базы, отсутствием сертифицированных диагностических тест-систем на особо опасные вирусные инфекции.

Рис. 6. Ранжирование территории Восточной Сибири в баллах (от 15 до 40) по риску завоза и распространения особо опасных и природно-очаговых вирусных болезней

Важным является корректировка региональных программ по санитарной охране территории субъектов региона в связи с проводимыми Федеральной службой Роспотребнадзора мероприятиями: созданием единой трехуровневой системы мониторинга, индикации и диагностики инфекционных болезней территориального, регионального и федерального уровней; укреплением материально-технической базы лабораторий, оснащением их необходимым оборудованием для проведения мониторинга возбудителей инфекционных болезней с едиными требованиями к методам лабораторной диагностики; пересмотром нормативно-методических документов по мониторингу инфекционных болезней.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, по результатам проведенных исследований впервые научно обоснована необходимость дифференцированного подхода к эпидемиологическому надзору за природно-очаговыми и особо опасными вирусными инфекциями в соответствии с уровнем их эпидемиологической значимости для территории Восточной Сибири. Для каждого уровня определены нозологические формы вирусных инфекционных болезней, по которым проведены исследования, отраженные в данной работе и намечены пути оптимизации эпидемиологического надзора:

1. Клещевой энцефалит

· На основе анализа отчетных данных, собственных данных мониторинга природных очагов КЭ дана характеристика эпидемиологической ситуации по КЭ в Восточной Сибири, что может быть использовано при планировании противоэпидемических и профилактических мероприятий.

· Для повышения эффективности эпидемиологического надзора впервые разработана и применена комплексная система изоляции вируса КЭ из иксодовых клещей, включающая применение ИФА, новорожденных белых мышей, культуру клеток при различных температурных режимах культивирования и типирование.

· Существенно расширены представления о структуре популяций и степени вариабельности вируса КЭ в природных очагах Приангарья и Забайкалья. Изучены биологические и молекулярно-генетические свойства штаммов вируса КЭ, изолированных от людей и иксодовых клещей в региональных природных очагах. Установлено, что вирус КЭ сибирского подтипа вызывает в Забайкальском крае очаговые формы болезни с летальным исходом. Изолированы штаммы вируса КЭ, содержащие генетический материал двух подтипов - дальневосточного и сибирского.

2. Арбовирусные инфекции Инко, Гета и Батаи

· На основе данных серологического мониторинга оценен уровень иммунной прослойки у населения и сельскохозяйственных животных на территории Восточной Сибири.

· Установлена территориальная неоднородность проявления природных очагов арбовирусных инфекций. Показано, что крупный рогатый скот является индикатором интенсивности циркуляции арбовирусов с точной привязкой к местности.

3. Лихорадка Западного Нила, ГЛПС

· Эпидемиологический надзор учреждениями Роспотребнадзора за ЛЗН отсутствует. Результаты серологического обследования населения Восточной Сибири свидетельствуют о циркуляции в регионе возбудителя лихорадки Западного Нила. Антитела к ВЗН в крови пациентов с поражением нервной системы обнаруживаются достоверно с более высокой частотой, чем среди других амбулаторных пациентов и населения.

· ГЛПС. Поучены новые данные об ареале циркуляции хантавирусов и носителей на территории Восточной Сибири. Установлены доминирующие носители хантавирусов для таежной зоны в Республике Саха (Якутия), для степной зоны, чередующейся с участками соснового леса и березняка с кустарником в Иркутской области, степной зоны в Забайкальском крае.

4. Экзотические особо опасные вирусные инфекции I-II групп патогенности, на которые распространяются правила санитарной охраны территории

· Сформированы базы данных "ОСОБО ОПАСНЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ", "ПРИРОДНООЧАГОВЫЕ ВИРУСНЫЕ ИНФЕКЦИИ, ЭНДЕМИЧНЫЕ ДЛЯ РОССИИ"; на их основе проанализирована современная эпидемиологическая ситуация в мире по контагиозным вирусным геморрагическим лихорадкам и некоторым особо опасным вирусным болезням и, в соответствии с ММСП (2005 г.), оценена их актуальность с точки зрения завоза и формирования вторичных очагов на территории региона.

· Усовершенствованы методы лабораторной диагностики геморрагических лихорадок Марбург и Эбола для оптимизации санитарной охраны территории от их заноса.

· На примере Красноярского, Забайкальского краев, Республик Хакасия, Тыва, Бурятия, Иркутской области проведена оценка эпидемиологического значения видов транспортного сообщения с эндемичными по ООВИ странами и ранжирование территории в отношении риска возможного заноса особо опасных вирусных болезней.

Выводы:

1. На основе анализа эпидемиологических данных, результатов вирусологического и серологического мониторинга обоснован дифференцированный подход и намечены пути совершенствования эпидемиологического надзора за природно-очаговыми и особо опасными вирусными инфекциями с учетом распределения их в группы разного уровня эпидемиологической значимости для региона.

2. Современная эпидемиологическая ситуация в мире по контагиозным вирусным геморрагическим лихорадкам характеризуется глобализацией эпидемического процесса, обусловливающей рост заболеваемости и масштабность вспышек, сокращение интервалов между эпидемическими вспышками; рост эпидемического потенциала лихорадок Западного Нила, долины Рифт, денге, КГЛ, оспы обезьян, патогенного для человека гриппа птиц. В соответствии с ММСП (2005 г.) дана оценка их актуальности с точки зрения завоза и возможности формирования вторичных очагов на территории Восточной Сибири.