Молекулярно-генетические особенности структуры генов патогенности возбудителей коклюша и дифтерии; совершенствование лабораторной диагностики этих инфекций

После амплификации и электрофореза с парой праймеров DIP03531F - DIP03541R выявлены ПЦР - продукты в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis и отсутствие данных ПЦР - продуктов в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis (рис. 7А). После амплификации со второй парой праймеров (DIP0353 2F - DIP0353 2R) получили ПЦР - продукты в образцах, содержащих ДНК, как штаммов C. diphtheriae биовара gravis, так и штаммов C. diphtheriae биовара mitis (рис. 7Б).

Рисунок 6 Схема расположения праймеров, фланкирующих фрагменты генов DIP0354, DIP0357 (amy ген) и DIP0358 C. diphtheriae

Рисунок 7 Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров DIP03531F - DIP03541R к последовательности фрагмента локуса DIP0353 - DIP0354 (А) и продукты ПЦР с использованием праймеров DIP03532F - DIP03532R к последовательности фрагмента гена DIP0353 (Б) C. Diphtheriae

Примечание: дорожки 1 - маркер молекулярных весов; 2, 4 - ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3, 5, 6 - ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis

Для определения конца делеции также сконструировали две пары праймеров (рис. 6): первая пара фланкировала область DIP0357 - DIP0358 размером 307 п.н., охватывающую фрагмент гена DIP0357 (аmy ген) и фрагмент гена DIP0358, кодирующего синтез ацил-CoA-синтазы. После амплификации с этой парой праймеров (рис. 8А) выявлены ПЦР - продукты в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis и отсутствие ПЦР - продуктов в образцах, содержащих ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis. Другая пара праймеров фланкировала фрагмент гена DIP0358 размером в 210 п.н. После амплификации с этой парой праймеров (рис. 8Б) получили ПЦР - продукты в образцах, содержащих ДНК, как штаммов C. diphtheriae биовара gravis, так и штаммов C. diphtheriae биовара mitis.

Рисунок 8 Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров DIP0357F -DIP0358R к последовательности фрагмента локуса DIP0357 - DIP0358 (А) и продукты ПЦР с использованием праймеров DIP03582F - DIP0358yR к последовательности фрагмента гена DIP0358 (Б) C. diphtheriae

Примечание: дорожки 1 - маркер молекулярных весов; 2, 4 - ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3, 5, 6 - ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что в геноме штаммов C. diphtheriae биовара mitis отсутствуют локусы DIP0354 - DIP0357 (amy ген) и, следовательно, эти штаммы не обладают амилазной активностью.

Способностью штаммов C. diphtheriae биовара gravis продуцировать амилазу и использовать дополнительные источники энергии (углеводы) можно объяснить различия и во времени генерации (in vitro) штаммов биоваров gravis и mitis. У штаммов биовара gravis оно составляет 60 минут, в то время как у штаммов биовара mitis - 180 минут. Быстрорастущие штаммы, формирующие колонии большего размера на питательной среде и на слизистых человека, имеют возможность более быстрого захвата железа из инфицированных тканей, что приводит к более ранней и высокой продукции дифтерийного токсина. При изучении уровня токсинообразования (УТ) штаммов C. diphtheriae двух биоваров нами показано, что у штаммов биовара gravis УТ в два раза превышал УТ штаммов биовара mitis (Борисова О.Ю., 1999; Комбарова С.Ю. и др., 2004; Мазурова И.К., 1993; Мазурова И.К. и др., 1999). Поэтому, взаимосвязь между тяжестью клинического течения дифтерии и выделением возбудителя биовара gravis можно объяснить высоким уровнем продукции дифтерийного токсина и быстрой колонизацией слизистой ротоглотки штаммами этого биовара. Так, совместные многолетние клинико-микробиологические исследования, проводимые сотрудниками лаборатории ФРЛДДИ совместно с Т.В. Платоновой показали, что в 90-е годы, в период эпидемического подъема заболеваемости дифтерией, формировалась генетически однородная высокотоксигенная популяция C. diphtheriae. При этом от больных выделяли штаммы биовара gravis и наблюдали утяжеление клинической картины дифтерии у непривитых детей, по сравнению с 80-ми годами ХХ века, когда у больных выделяли штаммы C. diphtheriae биовара mitis. Такое наблюдение подкрепляется и данными литературы, показавшими более тяжелую клиническую картину дифтерии при выделении штаммов C. diphtheriae биовара gravis (Нисевич Н.И., 1947; Хрущева В.А., 1964; Корженкова М.П., 2002, 2006).

Способность штаммов C. diphtheriae биовара gravis продуцировать амилазу создает преимущества перед штаммами биовара mitis в скорости роста и, что, наряду с другими особенностями структуры биовара gravis, определяет более широкое и длительное распространение этого биовара. Показано, что период распространения штаммов C. diphtheriae биовара mitis (в 80-ые годы прошлого столетия) составил 7 - 8 лет, в то время как штаммы биовара gravis доминировали и циркулировали многие десятилетия - в 40 - 70-е годы и в течение последних 18 лет (Борисова О.Ю., 1999; Комбарова С.Ю., 2004, 2007; Мазурова И.К., 1993, 1997, 1999).

Таким образом, исследование показало, что только штаммы C. diphtheriae биовара gravis несут генетическую детерминанту - amy ген, определяющую дополнительный фактор патогенности - фермент амилазу, дающий микроорганизму лучшие возможности колонизировать слизистые оболочки ротоглотки и, вследствие этого, более широко и длительно циркулировать среди населения, в то время как штаммы C. diphtheriae биовара mitis, в том числе и производственный вакцинный штамм C. diphtheriae PW8, имеют делецию фрагмента генома, включающего гены DIP0354 - DIP0357.

Разработка ускоренных методов, основанных на амплификационных технологиях, для наблюдения и выявления возбудителя коклюша

Новые знания о структуре генетических детерминант, кодирующих основные факторы патогенности, их мутационных изменениях, особенностях циркулирующих штаммов B. pertussis позволили подобрать специфические «мишени» и разработать на их основе новые молекулярно-генетические методы наблюдения и диагностики за возбудителями коклюша и дифтерии.

Современный мониторинг и лабораторная диагностика инфекционных заболеваний, базирующиеся на молекулярно-генетических методах исследования, выявляют специфические генетические «мишени» и с большей достоверностью, по сравнению с фенотипической диагностикой, идентифицируют возбудителей инфекций, а также значительно сокращают сроки исследования.

Молекулярно-генетический метод, основанный на полиморфизме длин рестрикционных фрагментов, для ускоренного выявления штаммов B. pertussis, циркулирующих на современном этапе

Нами разработан новый молекулярно-генетический метод мониторинга штаммов B. pertussis, основанный на изучении полиморфизма длин рестрикционных фрагментов амплифицированных продуктов (ПЦР-ПДРФ). Метод базируется на выявлении специфических генетических «мишеней», дифференцирующих штаммы с новыми особенностями структуры ptxА гена, кодирующего основной фактор патогенности возбудителя коклюша - коклюшный токсин. Метод позволяет после проведения рестрикции амплифицированного определенного фрагмента ДНК специфической рестриктазой и последующего электрофореза, получить характерный рестрикционный профиль, являющийся генетическим «маркером», тесно связанным с генотипом микроорганизма. Учитывая выявленные особенности структуры различных аллелей ptxА гена (рис. 9), выбран фрагмент ДНК этого гена и подобраны две рестриктазы (EheI и BfuI), с помощью которых получен специфический рестрикционный профиль ДНК (рис. 10).

Наличие мутации в положении 684 ptxA1 аллеля (рис. 9), создающей сайт рестрикции для фермента-рестриктазы EheI, определило выбор специфической «мишени» для дифференциации штаммов B. pertussis, имеющих новый «невакцинный» ptxА1 аллель гена от штаммов, несущих старые «вакцинные» аллели (рис. 10А). Наличие мутации в положении 586, создающей сайт рестрикции для рестриктазы BfuI, определило выбор другой специфической «мишени», с помощью которой можно дифференцировать штаммы B. pertussis с уникальным ptxА5 аллелем гена от штаммов с другими аллелями (рис. 10Б).

* 196 204 586 684 696

ptxA2 GTG CTC GAC CAT CTG -//- GAG TAT T CC AAC GCT -//- CGC ATG GCG CCG GTG ATA GGC

ptxA4 GTG CTC GAА CAT CTG -//- GAG TAT T CC AAC GCT -//- CGC ATG GCG CCG GTG GTG GGC

ptxA5 GTG CTC GAА CAT CTG -//- GAG TAT С CC AAC GC T -//- CGC ATG GCG CCG GTG ATG GGC

ptxA1 GTG CTC GAC CAT CTG -//- GAG TAT T CC AAC GCT -//- CGC ATA GCG CCG GTG ATA GGC

11

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 9 Сайты рестрикции для ферментов-рестриктаз EheI и BfuI.

Примечание: показаны четыре аллели ptxА гена; положения нуклеотидов относительно стартового кодона AJ245366.

Рисунок 10 Профили рестрикции штаммов B. pertussis, полученные после обработки ампликонов рестриктазой EheI ( А) и BfuI (Б)

Примечание

А: Дорожки: 1 - маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix; 2, 3 - рестрикционный профиль тип 1 (EheI); 4, 5, 6, 7 - рестрикционный профиль тип 2 (EheI)

Б: Дорожки: 1 - маркер молекулярных весов DNA Ladder Mix; 4 - рестрикционный профиль тип I (BfuI); 2, 3, 5 - рестрикционный профиль тип II (BfuI)

Для подтверждения возможностей использования нового метода для мониторинга штаммов возбудителя коклюша, изучен 121 штамм B. pertussis и показана полная корреляция между результатами рестрикционного анализа и секвенирования.

Разработанный нами новый метод типирования штаммов B. pertussis может явиться инструментом в системе мониторинга коклюшной инфекции, позволяющим проводить наблюдение за циркулирующей популяцией штаммов B. pertussis, выявлять штаммы с измененной структурой ptxА гена и следить за их распространением. На новый молекулярно-генетический способ типирования штаммов B. pertussis, имеющих различную структуру гена коклюшного токсина, получен патент на изобретение № 2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г.

Прямой ускоренный молекулярно-генетический метод лабораторной диагностики коклюшной инфекции

Лабораторная диагностика коклюша в России до сих пор основана на микробиологических методах исследования, которые являются недостаточно чувствительными и эффективными. Серологические методы диагностики используются для ретроспективного анализа, так как эффективны только на 4-ой неделе заболевания. Все используемые в настоящее время амплификационные технологии не обладают высокой специфичностью, чувствительностью и дают ложноположительные результаты из-за большой гомологии геномов представителей рода Bordetella.

Нами впервые разработан прямой, ускоренный и эффективный метод лабораторной диагностики коклюша - LAMP-вариант, основанный на современной изотермальной амплификационной технологии. Первым этапом разработки нового метода было воспроизведение LAMP-технологии. Использование этой технологии представляло серьезные затруднения вследствие отсутствия реагентов, используемых в LAMP, трудности их приобретения, а также их высокой стоимости. Поэтому были проведены предварительные эксперименты по оптимизации параметров амплификации - подобраны реагенты, отработаны концентрации и условия постановки реакции. Разработанный протокол исследования изучен на большой панели микроорганизмов (рис. 11). Обнаружено, что для всех образцов, содержащих ДНК штаммов B. pertussis, характерными были светящиеся специфические Ladder-подобные профили. Во всех остальных образцах, содержащих ДНК штаммов других микроорганизмов, регистрировали отрицательный результат.

Данный метод с разработанным нами составом реакционной смеси был воспроизводим, что подтверждено серией повторяющихся экспериментов. Во всех сериях опытов отмечали постоянство профилей LAMP-ампликонов штаммов B. pertussis.

Вместе с тем, такой вариант применим только при изучении «чистой» культуры возбудителя коклюша. Поэтому, перед нами стояла цель разработки прямого метода ускоренной лабораторной диагностики коклюша для выявления возбудителя непосредственно из клинического материала (с тампонов от больных коклюшем).

Рисунок 11 Профили LAMP-ампликонов штаммов B. pertussis, B. parapertussis, B. bronchiseptica, С. glutamicum, C. ulcerans, C. pseudodiphtheriticum, C. diphtheriae и S. Aureus

Примечание: дорожки 1, 2, 5, 10, 12 - ДНК штаммов B. pertussis (50 штаммов); 3, 4 - ДНК штаммов B. parapertussis (20 штаммов); 6, 7 - ДНК штаммов B. bronchiseptica (8 штаммов); 8 -ДНК штамма С. glutamicum (2 штамма); 11 - ДНК штамма C. ulcerans (10 штаммов); 14 - ДНК штамма C. pseudodiphtheriticum (8 штаммов); 15, 16 - ДНК штаммов C. diphtheriae (20 штаммов); 9, 13 - ДНК штаммов S. aureus (2 штамма)

Чувствительность амплификационных технологий высока только при работе с «чистыми» культурами микроорганизмов и автоматически не распространяется на чувствительность метода при работе с клиническим материалом, где на эффективность метода влияет методика подготовки клинического образца, способ выделения ДНК, освобождение от ингибиторов фермента амплификации, а также низкая концентрация первичной матрицы в малом объеме клинического образца. Разработка прямого молекулярно-генетического метода включала несколько этапов экспериментальных исследований: предварительную обработку клинического образца (смыв клинического материала с тампона от больного и его первичная обработка), подготовку клинического образца (разрушение клеточной стенки возбудителя коклюша в клиническом образце различными детергентами), выделение ДНК из клинического материала (изучены методы выделения ДНК с использованием сорбентов, детергентов, магнитных частиц, а также метода кипячения).

В результате большого числа предварительных экспериментов показано, что прямой ускоренный метод лабораторной диагностики коклюша LAMP-вариант обладает высокой специфичностью в 100% случаев, высокой чувствительностью - выявляет 10³ м.кл. возбудителя и позволяет идентифицировать возбудителя заболевания в течение 9 -10 часов от начала исследования непосредственно в клиническом материале от больного без этапа выделения «чистой» культуры.

Клинические испытания прямого ускоренного молекулярно-генетического метода LAMP-варианта

Применение LAMP-варианта для ускоренного выявления B. pertussis в клиническом материале больных коклюшем. Обследовано 86 больных, из них 53 больных с клиническим диагнозом «коклюш» разной степени тяжести (у 9,4% больных коклюш протекал в легкой форме, у 66,0% - в среднетяжелой форме и у 24,6% - в тяжелой форме), обследованных на различные сроки от начала заболевания (7,5% больных обследованы на 1^ой неделе заболевания; 30,2% - на 2^ой; 41,5% - на 3^ьей; 15,1% - на 4^ой и 5,7% - на 5^ой неделях заболевания) и 33 больных с другими заболеваниями верхних дыхательных путей. Основную группу больных коклюшем (67,9%) составили дети в возрасте до 1 года, обследованных на 2^ой - 3^ьей неделях заболевания.

Клинический материал от 86 больных коклюшем и из контрольной группы изучали одновременно в разработанном молекулярно-генетическом методе - LAMP-варианте и в классическом бактериологическом методе. Проведенные клинические испытания прямого метода LAMP-варианта, показали его высокую специфичность и высокую диагностическую эффективность, по сравнению с бактериологическим методом (рис. 12). Из 53 больных с диагнозом «коклюш», у 35 больных (в 66,0% случаях) клинический диагноз подтвержден только в LAMP-варианте; у 10 больных (в 18,9% случаях) диагноз подтвержден в LAMP-варианте и в бактериологическом методе; у 2 больных (в 3,8% случаях) диагноз подтвержден только в бактериологическом методе и у 6 больных (в 11,3% случаях) клинический диагноз не был подтвержден ни в одном из используемых методов. При сопоставлении эффективности LAMP-варианта и бактериологического метода показано, что из 53 больных коклюшем, у 45 больных клинический диагноз «коклюш» был подтвержден в LAMP-варианте, т.е. процент совпадений клинического диагноза и результатов разработанного метода составил 84,9% ± 4,9% (р < 0,001). В то время как бактериологическое подтверждение клинического диагноза «коклюш» было лишь в 12 случаях, что составило 22,7% ± 5,7% (р < 0,001).

Рисунок 12 Диагностическая эффективность LAMP-варианта при сравнении с бактериологическим методом при обследовании 53 больных с клиническим диагнозом «коклюш»

Рисунок 13 Сравнение эффективности LAMP-варианта и бактериологического метода в зависимости от формы заболевания коклюшем

Высокая диагностическая эффективность LAMP-варианта показана при обследовании больных с различными клиническими формами заболевания (рис. 13) - не только при среднетяжелых (в 91,4% случаев) и тяжелых формах (в 61,5% случаев), но и при легких формах заболевания (в 100% случаев). В тоже время бактериологическим методом возбудитель коклюша выявлен в небольшом проценте случаев только при среднетяжелых (в 22,8% случаях) и тяжелых формах заболевания (в 30,7% случаях).

Высокая эффективность LAMP-варианта показана также при обследовании больных коклюшем в различные сроки от начала заболевания (рис. 14) - от 72,7% на 3^ьей неделе, 87,5% на 4^ой неделе заболевания до 100% на 1^ой, 2^ой и 5^ой неделях заболевания. Бактериологическим методом удалось выявить возбудителя коклюша лишь в небольшом проценте случаев и то, только на 3^ьей и на 4^ой неделях заболевания.

С целью определения специфичности разработанного метода взята контрольная группа больных - 33 человека с диагнозами «ОРВИ», «лакунарная ангина», «респираторный микоплазмоз» и др. Исследование клинических образцов, полученных от этих больных, в разработанном LAMP-варианте показало, что у всех 33 больных, т.е. в 100% случаев, были отрицательные результаты, также как и при бактериологическом обследовании.

Рисунок 14 Сравнение эффективности разработанного метода ускоренной диагностики коклюша и бактериологического метода в зависимости от сроков обследования больных коклюшем

Таким образом, использование LAMP-варианта расширило возможности эффективного обследования больных, как с различной тяжестью клинического течения болезни, так и в различные сроки от начала заболевания (с ранних сроков и вплоть до 31 дня болезни, т.е. даже в период обратного развития заболевания), а также при обследовании детей до 1 года, детей с коклюшем, осложненным другими заболеваниями и в очагах инфекции, в первую очередь, в детских специализированных учреждениях. Разработанный метод применим для быстрого подтверждения или опровержения клинического диагноза «коклюш», в то время как бактериологический метод обладает низкой диагностической эффективностью (10,0%) и длительностью выдачи ответа (5 - 7 дней).

Приведем несколько примеров эффективного использования нового прямого ускоренного молекулярно-генетического метода - LAMP-варианта при обследовании больных с подозрением на коклюш.

Ребенок А. (11 мес.) госпитализирован в ИКБ № 1 с предварительным диагнозом «коклюш» из Дома ребенка № 2 СЗАО г. Москвы. При обследовании группы контактных лиц (10 детей и 10 взрослых) бактериологическим методом и разработанным ускоренным методом - LAMP-вариантом в течение суток был выявлен ребенок Г. (11 мес.) с положительным результатом в LAMP-варианте, что позволило быстро удалить его из очага коклюша и госпитализировать также в инфекционное отделение с диагнозом «коклюш». Однако, бактериологическое подтверждение этого случая было получено только через 6 дней. Следовательно, применение LAMP-варианта позволило провести быстрое обследование очага коклюшной инфекции, выявить заболевшего ребенка и своевременно изолировать его от остальных детей грудничкового возраста, тем самым предотвратив распространение инфекции.

Ребенок М. (4 мес.) с серьезной патологией сердечно-сосудистой системы переведен из специализированного стационара в ИКБ №1 с подозрением на коклюш при отрицательных результатах бактериологического обследования. Применение разработанного LAMP-варианта позволило быстро подтвердить диагноз «коклюш».

Ребенок Г. (4 мес.) из асоциальной семьи госпитализирован в ИКБ № 1 с диагнозом «респираторный микоплазмоз, острый бронхиолит, ателектаз сегмента левого легкого». Симптомы заболевания коклюшем у него были замаскированы выраженным микоплазмозом. Разработанный LAMP-вариант позволил подтвердить диагноз «коклюш», в то время как бактериологическое обследование дало отрицательные результаты. Впоследствии, серологическое обследование показало убедительное нарастание динамики титров антител в РА с 1:20 до 1:320, т.е. в четыре раза, на четвертой неделе от начала заболевания, что ретроспективно также подтвердило диагноз «коклюш» у ребенка.

Апробация LAMP-варианта для ускоренного выявления B. pertussis в клиническом материале больных, обследованных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, проведена на 447 клинических образцах от лиц, обследованных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания. Среди них, 81 (18,1%) образец был положительным в LAMP-варианте, в то время как в бактериологическом методе положительными были только 19 образцов. Из 81 положительного LAMP-образца, бактериологически подтвержденными оказались только 23,4% образцов. Таким образом, выявлена высокая эффективность применения LAMP-варианта для диагностики больных с подозрением на коклюш и коклюшеподобные заболевания, которая в 4,3 раза превышала результативность бактериологического обследования, а также в 5 - 7 раз сокращала срок выдачи окончательного ответа.

На новый метод LAMP-вариант получено положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г. по заявке № 2007147797/13 (052390).

Выбор фрагмента нуклеотидной последовательности в amy гене в качестве «мишени» для определения принадлежности C. diphtheriae к биовару с помощью ПЦР

Система бактериологической диагностики дифтерии, разработанная в России несколькими поколениями исследователей и практических микробиологов и используемая в настоящее время, направлена на то, чтобы в максимально короткий срок (4 - 5 дней) с помощью минимального набора тестов выявить в исследуемом материале (в мазках из ротоглотки и носа, или других мест локализации) возбудителя дифтерии - токсигенные С. diphtheriae.

Определение принадлежности штаммов С. diphtheriae к биовару проводится классическим бактериологическим методом - биохимической реакцией разложения крахмала на среде Грисса. Однако результаты проведения биохимической идентификации С. diphtheriae зависят от большого числа факторов, таких как качество питательных сред и реагентов, условий их приготовления, определения рН среды, а также квалификации персонала и др. Поэтому, выявление генетической детерминанты амилазной активности (фрагмента amy гена) в геноме возбудителя дифтерии с помощью ПЦР является более точным и достоверным методом определения принадлежности к биовару, по сравнению с биохимической идентификацией.

На основании выявленных особенностей структуры генетической детерминанты, определяющей амилазную активность, нами разработан новый основанный на ПЦР способ, позволяющий дифференцировать штаммы C. diphtheriae по принадлежности к биоварам.

На консервативную область аmy гена сконструированы праймеры, фланкирующие фрагмент гена, после амплификации с которыми положительными считались образцы, содержащие специфический светящийся фрагмент и данные штаммы регистрировались как C. diphtheriae биовар gravis (рис. 15).

Рисунок 15 Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров AmyF1 - AmyR1 к последовательности фрагмента amy гена C. diphtheriae

Примечание: дорожки 1 - маркер молекулярных весов; 2, 4, 7, 9, 10, 11 - ДНК штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3, 5, 6, 8, 12, 13 - ДНК штаммов C. diphtheriae биовара mitis

Специфичность, чувствительность и воспроизводимость метода подтверждена при изучении 99 штаммов C. diphtheriae (48 штаммов биовара gravis и 51 штамм биовара mitis), выделенных от больных и бактерионосителей в 80 - 90-е годы прошлого столетия, а также на современном этапе эпидпроцесса дифтерийной инфекции. Сравнительные исследования фенотипических свойств штаммов C. diphtheriae в классическом бактериологическом методе и ПЦР показали 100% корреляцию результатов. Вместе с тем, разработанный способ позволял дифференцировать штаммы C. diphtheriae биовара gravis от штаммов биовара mitis в более короткие сроки (на 1 сутки меньше). Данный метод явился одним из этапов разработки метода ускоренной лабораторной диагностики дифтерии. На разработку способа дифференцирования штаммов C. diphtheriae биовара gravis от штаммов mitis получено положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г. по заявке № 2007140879/13 (044745).

Для оценки возможностей использования разработанных «мишеней» в amy гене в качестве диагностического критерия определения принадлежности к биовару в ускоренной лабораторной диагностике дифтерии предпринята попытка применения мультиплексной амплификационной технологии для выявления возбудителя дифтерии в клиническом материале больных, позволяющей одновременно в одной пробирке определять фрагменты amy гена, ответственного за амилазную активность, и tox гена, кодирующего токсинообразование.

Рис. 16 Фотография фрагмента 1,5% агарозного геля, содержащего электрофоретически разогнанные продукты ПЦР с использованием праймеров DTF - DTR и AmyF1 - AmyR1 к последовательностям фрагментов tox и amy генов C. Diphtheriae

Примечание: дорожки 1, 8 - маркер молекулярных весов; 2, 5 - ДНК токсигенных штаммов C. diphtheriae биовара gravis; 3 - ДНК нетоксигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis; 4 -ДНК нетоксигенного штамма C. diphtheriae биовара mitis; 6 - ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae биовара mitis; 7 - отрицательный контроль

Метод апробирован на 147 штаммах C. diphtheriae, как токсигенных (100 штаммов), так и нетоксигенных (47 штаммов), двух биоваров - gravis (76 штаммов) и mitis (71 штаммов). У токсигенных штаммов C. diphtheriae биовара gravis регистрировали специфический профиль, состоящий из двух фрагментов ДНК с молекулярной массой 634 п.н. и 289 п.н., у токсигенных штаммов C. diphtheriae биовара mitis - фрагмент с молекулярной массой 634 п.н. При отсутствии этих фрагментов в исследуемом образце ДНК, продукты амплификации не регистрировали (рис. 16).

Апробирование метода подтвердило специфичность «мишеней» в amy гене для определения биовара gravis и показало возможности использования мультиплексной ПЦР-технологии для диагностических целей.

Нами предпринята попытка выделения возбудителя дифтерии по наличию фрагментов tox и amy генов непосредственно в клиническом материале от больных дифтерией. Обследовано 9 больных в возрасте от 28 лет до 60 лет, госпитализированных в ИКБ № 1 (г. Москва). Патологический материал собирали двумя тампонами из ротоглотки и носа для дальнейшего изучения в бактериологическом методе и мультиплексной ПЦР.

Рис. 17 Профили ПЦР-ампликонов образцов клинического материала, полученного от больного (С., 44 года) с подозрением на дифтерию

Примечание: дорожки 1, 8 - маркер молекулярных весов; 2 - ДНК из клинического образца от больного дифтерией (С, 44 года (нос); 3 - ДНК из клинического образца от больного дифтерией (С., 44 года (зев); 5 - положительный контроль - ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis; 6 - положительный контроль - ДНК токсигенного штамма C. diphtheriae биовара mitis; 4, 7 - отрицательные контроли

На рис. 17 представлены результаты обследования больного (С., 44 лет) с подозрением на дифтерию в мультиплексной ПЦР. Положительной считалась проба, имеющая характерный вид профиля, состоящего из двух специфических светящихся фрагментов определенной молекулярной массы. В образцах, содержащих ДНК из клинического образца из носа и ротоглотки больного, регистрировали положительные результаты, что свидетельствовало о наличие в материале от больного токсигенного штамма C. diphtheriae биовара gravis и подтверждало клинический диагноз «дифтерия ротоглотки и носа».

С помощью мультиплексной ПЦР клинический диагноз «дифтерия» удалось подтвердить у трех больных: у больного (С., 44 лет) с диагнозом «комбинированная дифтерия ротоглотки и носа»; у больной (И., 54 лет) с клиническим диагнозом «комбинированная локализованная дифтерия ротоглотки и носа»; у больной (Е., 60 лет) с клиническим диагнозом «токсическая дифтерия ротоглотки II - III степени в комбинации с дифтерией гортани». Для первых двух больных получено бактериологическое подтверждение на 4 сутки, бактериологическое обследование последней больной дало отрицательные результаты. У остальных шести больных, госпитализированных в стационар с подозрением на дифтерию, при поступлении поставлены диагнозы «лакунарная ангина» и при бактериологическом обследовании и в мультиплексной ПЦР получены отрицательные результаты. Проведенное исследование показало возможности использования «мишеней» в amy гене, выявление которых с помощью ПЦР позволяет определять принадлежность к биоварианту, с целью коплексирования в мультиплексной ПЦР для разработки ускоренного метода обследования больных с подозрением на дифтерию. В настоящее время исследования по разработке ускоренного метода лабораторной диагностики дифтерии продолжаются.

ВЫВОДЫ

1. Мониторинг штаммов B. pertussis выявил особенности распространения и различия в генетической структуре штаммов, циркулирующих в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции, и показал, что в допрививочный период (1948 - 1959 гг.) и первые десять лет (1960 - 1969 гг.) проведения массовой иммунизации детского населения АКДС-вакциной, циркулировали штаммы B. pertussis с «вакцинными» аллелями генов, кодирующих основные факторы патогенности; в начале 70-х годов в популяции штаммов B. pertussis появились штаммы с новыми «невакцинными» аллелями генов, которые с начала 80-х годов заняли доминирующее положение в популяции.

2. Выявлены особенности генетической структуры штаммов B. pertussis, выделенных на современном этапе эпидемического процесса коклюшной инфекции. В настоящее время циркулируют штаммы B. pertussis с новым «невакцинным» ptxА1 аллелем гена коклюшного токсина (в 100% случаев), новыми «невакцинными» prn2 и prn3 аллелями гена пертактина (в 76,0% и 21,9% случаев, соответственно); распространение штаммов с «невакцинными» fim2-2 и fim3В аллелями фимбриальных генов происходит медленнее и встречается в популяции современных штаммов в 53,3% и в 83,4% случаев, соответственно. Изменений в структуре tcfA гена, кодирующего фактор колонизации трахеи, не обнаружено.

3. Современные штаммы B. pertussis, несущие новые «невакцинные» аллели, и вакцинные штаммы B. pertussis, используемые для производства АКДС-вакцины и несущие старые «вакцинные» аллели генов коклюшного токсина, пертактина и фимбриальных белков, имеют существенные различия генетической структуры. У современных штаммов B. pertussis произошли существенные изменения в структуре ptxA гена, кодирующего S1 субъединицу коклюшного токсина, prn гена, кодирующего пертактин, и в фимбриальном fim3 гене, кодирующем Fim3 белок.

4. Штаммы B. pertussis, характеризующиеся новыми «невакцинными» аллелями генов патогенности, обладают высокой степенью вирулентности (в 72,7% случаев) и высоким уровнем лейкоцитозстимулирующей активности (в 100% случаев), что является неблагоприятным прогностическим признаком тяжести течения инфекционного процесса коклюшной инфекции.

5. Разработан новый метод мониторинга штаммов B. pertussis на основе ПЦР-ПДРФ, позволяющий выявлять штаммы с новым ptxА1 аллелем гена коклюшного токсина, для наблюдения за популяцией B. pertussis, циркулирующей на современном этапе развития эпидпроцесса коклюшной инфекции.

6. Показаны высокая специфичность (100%), высокая чувствительность (10³ м.кл.), высокая диагностическая эффективность (84,9% ± 4,9% (р < 0,001) нового впервые разработанного прямого ускоренного метода (LAMP-вариант), позволяющего выявлять возбудителя заболевания непосредственно из клинического материала больного в течение 9 - 10 часов. Данный метод позволяет обследовать больных как в ранние (с 3 дня), так и в поздние (в течение месяца) сроки заболевания, а также больных с различными формами клинического течения заболевания.

7. Подтверждено сохранение в циркуляции штаммов C. diphtheriae (в 66,7% случаях) с незначительными множественными единичными мутациями в tox гене, не приводящими к изменению первичной структуры белка дифтерийного токсина, что влияет на формирование генетической вариабельности вида. Мониторинг штаммов C. diphtheriae показал, что распространения штаммов C. diphtheriae с измененной структурой гена дифтерийного токсина (в положении 1252 tox гена), приводящей к изменению аминокислотного состава белка дифтерийного токсина, не произошло.

8. Получены новые знания о том, что в геноме C. diphtheriae биовара gravis имеется нуклеотидная последовательность (локус DIP0357 - amy ген), являющаяся генетической детерминантой, кодирующей амилазную активность - дополнительный фактор патогенности C. diphtheriae биовара gravis, и впервые определена нуклеотидная «мишень» в amy гене, выявляемая в ПЦР новыми сконструированными специфическими праймерами, для дифференциации штаммов C. diphtheriae двух биоваров, что имеет значение для создания диагностических препаратов.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю. Характеристика Corynebacterium diphtheriae, циркулирующих в России в период 1984 - 1998 гг. (микробиологический мониторинг в системе эпиднадзора за дифтерийной инфекцией) // Пособие для врачей. Москва. 1999. 26 Стр.

Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Костюкова Н.Н., Мазурова И.К. Риботипирование штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России // в сборнике научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского “Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)”. 2000. С. 42 - 47.

Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Соков Б.Н., Смердов Г.Н., Ушакова Н.С., Степанова Н.И., Бугаев Е.А., Мазурова И.К. Усовершенствование методики постановки полимеразной цепной реакции для выявления гена дифтерийного токсина // в сборнике научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского “Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)”. 2000. С. 47 - 52.

Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Герасимова С.В., Андрусенко Е.Э., Цепляева Э.Д., Калугина Л.П. Некоторые особенности циркуляции биоваров gravis и mitis токсигенных и нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae // в сборнике научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского “Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)”. 2000. С. 52 - 55.

Платонова Т.В., Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г. Биологические свойства Corynebacterium diphtheriae и их влияние на клинику дифтерии у непривитых детей в условиях различной интенсивности эпидпроцесса // в сборнике научных трудов МНИИЭМ им. Г.Н. Габричевского “Проблемы инфекционных болезней (эпидемиология и профилактика)”. 2000. С. 52 - 59.

Мазурова И.К., Платонова Т.В., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Костюкова Н.Н. Молекулярно-биологические свойства Corynebacterium diphtheriae и их влияние на клинику дифтерии у непривитых детей в периоды различной интенсивности эпидемического процесса // Материалы научно-практической конференции «Инфекционные болезни на рубеже XXI века», 24 - 26 мая, Москва. 2000. С. 75.

Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Платонова Т.В., Андрусенко Е.Э. Антибиотикорезистентность штаммов Corynebacterium diphtheriae - новая проблема инфекционной патологии // Материалы международной конференции «Антибиотики и антибиотикорезистентность на пороге XXI века», Москва. том 2.2000. С. 27 - 28.

Melnikov V.G., Zoysa A.De, Mazurova I.K., Kombarova S.J., Borisova O.J., Engler K.H., Efstratiou А. Molecular screening for the `identification' of non-toxigenic tox bearing strains of Corynebacterium diphtheriae from the Russian Federation // Proceedings of the Sixth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, 21 - 24 June, Brussels, Belgium. 2000. P. 60 - 61.

Mazurova I.K., Platonova T.V., Kombarova S.J., Melnikov V.G., Borisova O.J. Diphtheria in Russia: clinical and epidemiological features // Proceedings of the Sixth International Meeting of the European Laboratory Working Group on Diphtheria, 21 - 24 June, Brussels, Belgium. 2000. P. 33 - 34.

Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Бугаев Е.В. Ускоренные методы лабораторной диагностики и наблюдения за возбудителем дифтерийной инфекции // Методические рекомендации. Москва.2001. 12 Стр.

Kombarova S., Kim C., Melnikov V., Reeves M., Borisova O., Mazurova I., Popovic T. Rapid identification of Corynebacterium diphtheriae clonal group associated with diphtheria epidemic, Russian Federation // Journal Infectious Diseases. Vol. 7. - no. 1. 2001. Р. 133 - 136.

Комбарова С.Ю., Мазурова И.К., Мельников В.Г., Костюкова Н.Н., Волковой К.И., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Efstratiou А. Генетическая структура штаммов Corynebacterium diphtheriae, выделенных в России при разной интенсивности эпидемического процесса дифтерии // ЖМЭИ. 2001. № 3. С. 3 - 8.

Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мазурова И.К. Нетоксигенные штаммы Corynebacterium diphtheriae, несущие ген дифтерийного токсина // Пособие для врачей. Москва. 2002. 12 Стр.

Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Нарвская О.В., Костюкова Н.Н., Платонова Т.В., Волковой К.И., Прохоров В.А., Салова Н.Я., Андрусенко Е.Э., Цепляева Э.Д., Калугина Л.П., Кривопалова Н.С. Молекулярная эпидемиология дифтерии в России // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26 - 28 марта, Москва. 2002. том 1. С. 68 - 69.

Бугаев Е., Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Платонова Т.В., Шипулин Г.А., Малинина С.В., Корочкина М.Ю., Мазурова И.К.. Полимеразная цепная реакция в диагностике дифтерийной инфекции // Материалы VIII съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 26 - 28 марта, Москва. 2002. том 3. С. 236 - 237.

Mazurova I.К., Melnikov V., Kombarova S.J., Borisova O., Bugaev E.A. Laboratory diagnosis of diphtheria as part of diphtheria surveillance in Russia // Proceedings of the Seventh International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, Vienna, Austria. 2002. Р. 53.

Borisova O., Melnikov V., Kombarova S.J., Mazurova I.К. Antibiotic-resistant Corynebacterium diphtheriae strains circulating in Russia // Proceedings of the Seventh International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, Vienna, Austria. 2002. Р. 79.

Kombarova S., Melnikov V., Borisova O., Platonova T.V., Mazurova I.K. Genotype characteristics of Corynebacterium diphtheriae strains in a period of low diphtheria incidence in Russia: 1997 to 2001 // Proceedings of the Seventh International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, Vienna, Austria. 2002. Р. 68 - 69.

Melnikov V., Kombarova S., Borisova O., Mazurova I.K. Etiological value of non-toxigenic tox-bearing (NTTB) Corynebacterium diphtheriae strains // Proceedings of the Seventh International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, Vienna, Austria. 2002. Р. 80.

Мазурова И.К., Борисова О.И., Петрова М.С., Мельников В.Г. Фено - и генотипического характеристика штаммов B. pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве // Материалы международной конгресса «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней - прогресс и проблемы». 2003. С. 30.

Мельников В.Г., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Воложанцев Н.В., Веревкин В.В., Волковой К.И., Мазурова И.К. Характеристика нетоксигенных штаммов Corynebacterium diphtheriae, несущих ген дифтерийного токсина // ЖМЭИ. 2004. № 1. С. 3 - 7.

Комбарова С.Ю., Мельников В.Г., Борисова О.Ю., Мазурова И.К. Комплексная система наблюдения за циркулирующими штаммами Corynebacterium diphtheriae // Пособие для врачей. Москва. 2004. 34 Стр.

Borisova O.J., Кombarova S.J., Berens T.T., Vaizovaj А., Мazurova I.K. Phenotypic and genotypic characteristics of toxigenic C. diphtheriae isolated in the Central Federal District of Russia during 2002-2004 // Proceedings of the Eighth International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, 16 - 18 june, Denmark, Copenhagen.2004. Р. 45.

Кombarova S.J.,, Zotina R.K., Borisova O.J, Narvskaya O.V., Limeshenko E., Мazurova I.K. Circulation of toxigenic and non-toxigenic С. diphtheriae in period of decreasing morbidity of diphtheria in Russia // Proceedings of the Eighth International meeting of the European Laboratory working group on diphtheria, 16 - 18 june, Denmark, Copenhagen. 2004. Р. 43

Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Захарова Н.С., Алешкин В.А. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Bordetella pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции // Журнал молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2005. № 4. С. 21 - 25.

Kombarova S.Yu., Borisova O.Yu., Melnikov V.G., Mazurova I.K Monitoring the genes responsible for Сorynebacterium diphtheriae toxin production // Proceedings of the Ninth international meeting of the European laboratory working group on diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network (DIPNET), 15 - 17 November 2006, Voliagmeni, Greece.2006. P. 65.

Borisova O.Yu., Kombarova S.Yu., Volozhantsev N.V., Mazurova I.K. Investigation of the amylase gene structure of Сorynebacterium diphtheriae // Proceedings of the Ninth international meeting of the European laboratory working group on diphtheria, ELWGD and Diphtheria surveillance network (DIPNET), 15 - 17 November 2006, Voliagmeni, Greece -2006. P. 66.

Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Петрова М.С., Грачева Н.М., Герасимова А.Г., Алешкин В.А., Савинкова В.С., Скачкова В.Г., Захарова Н.С., Мерцалова Н.У., Шинкарев А.С., Семенов Б.Ф. Особенности генетической структуры производственных штаммов для АКДС-вакцины и циркулирующих в настоящее время штаммов возбудителей коклюша и дифтерии // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология - 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней», 21 - 22 ноября, Москва. 2006. С. 60 - 61.

Чистякова Г.Г., Борисова О.Ю., Лыткина И.Н., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Петрова М.С., Мельникова А.М., Скачкова В.Г. Особенности эпидемического процесса коклюшной инфекции в Москве на современном этапе // ЖМЭИ. 2005. № 5. С. 35 - 40.

Borisova O., Kombarova S.J., Zakharova N.S., Marjolein van Gent, Aleshkin V.A., Mazurova I.K., Mooi F. Antigenic divergence between Bordetella pertussis clinical isolates from Moscow, Russia and vaccine strains // J. Clinical and vaccine immunology. 2007.Vol. 14. № 3. Р. 234 - 238.

Шинкарев А.С, Мерцалова Н.У., Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Захарова Н.С., Озерецковская М.Н., Зайцев Е.М., Поддубиков А.В., Брицина М.В., Бажанова И.Г. Современные штаммы Bordetella pertussis: молекулярная и иммунобиологическая характеристика // ЖМЭИ. 2007. № 4. С. 20 - 25.

Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Герасимова А.Г., Пяева А.П., Скачкова В.Г., Захарова Н.С., Мерцалова Н.У., Мазурова И.К., Алешкин В.А. Полиморфизм генов, кодирующих основные факторы патогенности штаммов Bordetella pertussis // Материалы IX съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. 2007. том 1. С. 50 - 51.

Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мельников В.Г., Гадуа Н.Т., Губина Н.И., Лосева Л.В., Савинкова В.С., Скачкова В.Г., Мазурова И.К., Алешкин В.А. Особенности структуры генов, ответственных за токсинообразование Сorynebacterium diphtheriae // Материалы IX съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. 2007. том 1. С. 69 - 70.

Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Борисова О.Ю., Мельников В.Г., Алешкин В.А. Микробиологический и молекулярно-генетический мониторинг дифтерийной инфекции // Материалы IX съезда Всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. 2007. том 1. С. 78 - 79.

Мазурова И.К., Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Алешкин В.А. Динамика изменчивости основных генов патогенности штаммов Bordetella pertussis, выделенных от больных коклюшем в г. Москве (1948 - 2005 гг.) // Журнал молекулярной медицины. 2008. № 1. С. 40 - 45.

Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мазурова И.К. Молекулярно-генетический метод ускоренного выявления штаммов Bordetella pertussis, обладающих различными ptx генами // ЖМЭИ. 2008. № 5 - С. 80 - 83.

Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мерцалова Н.У., Шинкарев А.С., Захарова Н.С., Пяева А.П., Лыткина И.Н., Требунских И.П., Салова Н.Я., Савинкова В.С., Скачкова В.Г., Мазурова И.К. Молекулярно-генетический мониторинг штаммов Bordetella pertussis, выделенных в различные периоды эпидемического процесса коклюшной инфекции // Материалы четвертой международной конференции «Идеи Пастера в борьбе с инфекциями», 2 - 4 июня 2008 г., Санкт - Петербург. 2008. С. 7.

Изобретения

Борисова О.Ю., Комбарова С.Ю., Алешкин В.А., Мазурова И.К. Патент на изобретение «Способ дифференциации штаммов Bordetella pertussis» № 2299908, зарегистрированный в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 27 мая 2007 г.

Борисова О.Ю., Воложанцев Н.В., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Мазурова И.К. Заявка на изобретение «Способ дифференцирования штаммов C. diphtheriae» № 2007140879/13(044745) от 07.11.2007; получено положительное решение о выдаче патента от 13.11.2008 г.

Борисова О.Ю., Мазурова И.К., Комбарова С.Ю., Гадуа Н.Т., Петрова М.С., Попова О.П., Алешкин В.А. Заявка на изобретение «Набор и ускоренный способ лабораторной диагностики коклюша» № 2007147797/13 (52390) от 25.12.2007; получено положительное решение о выдаче патента от 16.09.2008 г.

Размещено на Allbest.ru