Трансплантация аутологичных клеток костного мозга для лечения длительно незаживающих язв желудка

Для выявления связи между иммунопатологическими нарушениями в СОЖ у больных с ДНЯЖ с иммунопатологическими нарушениями в ДНЯЖ в эксперименте было изучено наличие цитотоксического эффекта у лимфоцитов в зоне язвенного дефекта экспериментальных животных.

Электронно-микроскопические исследования подтвердили наличие цитотоксического действия различных популяций лимфоцитов на фибробласты собственной пластинки слизистой оболочки желудка у крыс с ДНЯЖ, особенно в области края язвы.

Результаты проведенных экспериментов подтверждают, что при моделировании аутоиммунных ДНЯЖ также как и в клинике [Логинов А.С и др., 1990; 1992], активируется цитотоксическое действие Т-лимфоцитов СОЖ, которое проявляется разрушением фибробластов собственной пластинки. Этот факт подтверждает аутоиммунный механизм повреждения слизистой оболочки желудка при моделировании ДНЯЖ в эксперименте.

Дополнительным доказательством аутоиммунной природы ДНЯЖ, полученной в эксперименте, может служить выявление и других признаков аутоиммунного заболевания, перечень которых был постулирован Rose N.R., Bona C. (1993). Нами была доказана возможность переноса ДНЯЖ активированными лимфоцитами от больного животного; возникновение цитокинового дисбаланса, манифестирующего развитие гуморальных и клеточных иммунных реакций (раздел 2.5), а также возможность индукции ДНЯЖ сенсибилизацией антигеном СОЖ аллогенного животного.

Таким образом, нами были получены доказательства аутоиммунной природы ДНЯЖ не только в клинике, но и в эксперименте, которые свидетельствуют о развитии общего типового иммунопатологического процесса при формировании язвы желудка и, следовательно, о пригодности созданной нами в эксперименте модели ДНЯЖ для подбора и исследования новых терапевтических воздействий, пригодных для лечения ДНЯЖ у человека в клинике.

3. Влияние трансплантации культивированных клеток костного мозга на заживление длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка

3.1 Влияние ММСК и МНК аутологичного КМ на динамику заживления язв и морфологическое состояние слизистой оболочки желудка

Исследование влияния трансплантации клеток КМ на регенерацию аутоиммунных ДНЯЖ проводилось нами в 3-х сериях опытов. В таблице 6 представлен планиметрический контроль динамики заживления язвенного дефекта у крыс без и после трансплантации культивированных аутологичных ММСК или МНК КМ.

Таблица 6. Динамика уменьшения площади язвенного дефекта в зависимости от типа трансплантируемых клеток у животных

*-p<0,05 по отношению к контролю.

В исследуемых 3-х группах выявлялись существенные различия не только планиметрического, но и макроскопического состояния язвенных дефектов. В контрольной группе к 10 суткам наблюдения макроскопическое состояние язв соответствовало исходному. Язвы оставались таких же размеров с выраженным отеком, были покрыты фибринозно-некротическим налетом с признаками хронического воспаления и мелкими эрозиями вокруг язвы. В группе с трансплантацией ММСК КМ через 10 суток отмечается не только уменьшение площади язвенного дефекта, но и его глубины, а также очищение дна язвы от некротических масс и уменьшение воспаления вокруг язвы. В группе с трансплантацией МНК КМ на 10 сутки отмечается уменьшение площади язвенного дефекта, вокруг язвенного дефекта сохраняются отек, бледная окраска слизистой оболочки. Глубина язвы по сравнению с контрольной группой становилась меньше.

На 20 сутки у животных контрольной группы размеры язвы несколько уменьшились, но дно язв оставалось покрытым некротическим налетом, признаки хронического воспаления становились менее выраженными. После трансплантации ММСК КМ макроскопически выявлялось значительное уменьшение размеров язвенного дефекта и его глубины. Слизистая оболочка приобретала равномерно розовую окраску. В группе с трансплантацией МНК отмечалось значительное уменьшение, как размеров язвенного дефекта, так и их глубины. Вокруг язвы сохранялся отек и точечные эрозии.

На 30-е сутки у животных контрольной группы язвенные дефекты сохранялись, тогда, как в группе с трансплантацией ММСК КМ макроскопически язвенные дефекты не выявлялись. Слизистая оболочка желудка была равномерно эпителизирована и имела розовую окраску. В группе с трансплантацией МНК макроскопически в большинстве случаев язвенные дефекты не выявлялись, но на месте язвы сохранялись мелкие эрозии, вокруг которых имелись незначительные признаки воспаления: умеренный отек, гиперемия и точечные кровоизлияния в слизистой оболочке.

В полном соответствии с макроскопическими различиями язвенных дефектов в 3 исследуемых группах животных находятся результаты их гистологического исследования на разных сроках наблюдения. Установлено, что в контрольной группе животных на 10 сутки в дне язвы выявляется широкий лейкоцитарно-некротический слой. В подлежащем слое определяется грануляционная ткань с повышенным количеством тонкостенных кровеносных сосудов и преобладанием фибробластов. В более глубоких отделах грануляционной ткани выявляются коллагеновые волокна, с их частично упорядоченным ходом и небольшим количеством сосудов. В подлежащем к зоне некроза и более глубоких слоях грануляционной ткани отмечается выраженная диффузная воспалительная инфильтрация с преобладанием нейтрофилов.

При гистологическом исследовании язвы желудка на 10 сутки в группе животных с трансплантацией ММСК КМ лейкоцитарно - некротический слой был более тонким. Подлежащий слой был представлен созревающей грануляционной тканью с большим количеством сосудов и умеренно выраженной диффузной лейкоцитарной инфильтрацией преимущественно из гистиоцитов, лимфоцитов и нейтрофилов. В зоне краев язвенного дефекта определялись кистозно-расширенные железы с пролиферирующим эпителием.

На 10-е сутки в группе животных с трансплантацией МНК КМ по сравнению с контрольной группой отмечалась более ранняя смена деструктивно-воспалительной фазы раневого процесса на пролиферативно-регенераторную фазу. Это выражалось более быстрым отторжением некротических масс, что свидетельствовало о начале репаративного процесса. В грануляционной ткани наблюдалось большое количество сосудов и умеренно выраженная диффузная воспалительная инфильтрация сегментоядерными нейтрофилами, лимфоцитами с примесью гистиоцитов. В зоне краев язвенного дефекта определялись кистозно-расширенные железы с пролиферирующим эпителием.

На 20 сутки у животных контрольной группы размеры язвы несколько уменьшились, но при гистологическом исследовании выраженных различий по сравнению с предыдущим сроком не отмечалось. В то же время, в группе с трансплантацией ММСК КМ при гистологическом исследовании была выявлена частичная эпителизация краев язвенного дефекта. В дне язвы выявлялся тонкий лейкоцитарно-некротический слой. По сравнению с предыдущим сроком отмечалось разрастание грануляционной ткани и увеличение количества кровеносных сосудов; ход коллагеновых волокон в грануляционной ткани был более упорядоченным, воспалительная инфильтрация была слабо выраженной за счет клеток преимущественно лимфоидно-гистиоцитарного ряда.

Гистологическая картина ДНЯЖ, леченных МНК, на 20 сутки характеризовалась начальными признаками эпителизации. Отмечалось наползание уплощенного эпителия с краев на периферию дна язвенного дефекта, представленную грануляционной тканью. В центре дна сохранялся тонкий слой фибриноида. По сравнению с предыдущим сроком в грануляционной ткани отмечалось увеличение количества кровеносных сосудов, ход коллагеновых волокон был более упорядоченным, воспалительная инфильтрация была слабо выраженная, преимущественно лимфоидно-гистиоцитарная.

Доказательством того, что более высокий и качественный темп регенерации аутоиммунных язв связан с сохранением жизнеспособности и функциональной активности клеток КМ, после трансплантации в периульцерозную зону, являются результаты двух вариантов доказательств исследования: результаты гистохимического выявления в этой зоне ММСК с предварительно введенной в них метки-генетической конструкции - LacZ E.coli, вывляемой по сине - зеленому окрашиванию продуктов реакции X-GaL с в-галактозидазой, введенной в структуру гена LacZ E.coli и результаты выявления ММСК по их флуоресценции, поскольку они были получены от трансгенных мышей B. 10 GFP, которые содержат ген зеленого флуоресцирующего белка.

На 30-е сутки у животных контрольной группы язвенные дефекты все еще сохранялись. Дно язвы было покрыто тонким некротическим слоем и диффузно инфильтрировано лейкоцитами. В подлежащем слое созревающая грануляционная ткань имела частично упорядоченный ход коллагеновых волокон и умеренно выраженную воспалительную инфильтрацию гистиоцитами, лимфоцитами и нейтрофилами. В краях язвы выявлялись кистозно-расширенные железы, выстланные пролиферирующим эпителием. В группе с трансплантацией ММСК КМ микроскопически отмечалась эпителизация язвенного дефекта. В слизистой оболочке язвенных дефектов не было выявлено, обнаружены лишь зоны, где определялись железистые полости, выстланные пролиферирующим эпителием. В подлежащей строме слизистой оболочки определяется фиброзная ткань с упорядоченным ходом коллагеновых волокон и слабо выраженной воспалительной лимфоидно - гистиоцитарной инфильтрацией.

В группе животных с трансплантацией МНК КМ к 30-м суткам макроскопически язва не выявлялась, на ее месте отмечались рубцовые тяжи, конвергирующие к центру. Микроскопически отмечалась эпителизация язвенного дефекта. В слизистой оболочке определялись кистозно-расширенные псевдопилорические железы. В подлежащей ткани выявлялась фиброзная ткань с упорядоченным ходом коллагеновых волокон и слабо выраженной воспалительной лимфоидно-гистиоцитарной инфильтрацией.

Позитивную динамику в зоне язвенного дефекта к 30 суткам мы также связываем с присутствием и функционированием в этой зоне трансплантированных клеток, что было подтверждено гистохимически (по сине - зеленому окрашиванию введенных в ММСК генетической метки LacZ E.coli и по флуоресценции ММСК от трансгенных мышей B. 10 GFP. Это дает нам основание считать, что сохраняя свою жизнедеятельность в области язвы, ММСК длительно обеспечивали продукцию биорегуляторных пептидов, которые способствовали восстановлению местного и системного гомеостаза и создавали адекватные условия для более быстрой регенерации ДНЯЖ. Регенераторный процесс в ДНЯЖ без применения клеточной терапии так же имел место, но темп его был значительно замедлен. Достоверно более высокий темп заживления ДНЯЖ при использовании ММСК позволяет считать трансплантацию ММСК наиболее эффективным методом клеточной терапии ДНЯЖ.

3.2 Влияние ММСК КМ на активность апоптоза эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка в динамике лечения

Одним из механизмов ускорения темпа регенерации язв под влиянием ММСК является восстановление регуляции активности процессов апоптоза в слизистой оболочке желудка. Об этом свидетельствует снижение индекса апоптоза (ИА) (уровень экспрессии каспазы-9) в трех компартментах слизистой оболочки желудка в динамике лечения (табл. 7).

Таблица 7. Динамика изменения индекса апоптоза эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка у животных с ДНЯЖ без и при трансплантации ММСК (М±м)

*p<0,05 по сравнению с контролем при том же сроке.

Было установлено, что во всех компартментах слизистой оболочки желудка в контрольной группе на 10 сутки отмечалась выраженная экспрессия маркера апоптоза в цитоплазме эпителиоцитов и соответственно высокий уровень ИА (табл. 7), тогда как в группе с трансплантацией ММСК, экспрессия маркера апоптоза была менее выражена и ИА имел тенденцию к снижению.

При оценке экспрессии маркера апоптоза в отдельных компартментах обеих групп нами были выявлены достоверные различия (табл. 7). Достоверное снижение ИА на 10 сутки после трансплантации ММСК КМ нами отмечено в эпителиоцитах перешеечной зоны слизистой оболочки желудка, в отличие от группы контроля, где ИА в этой зоне по-прежнему оставался высоким. Особенно отчетливое и достоверное снижение интенсивности экспрессии маркера апоптоза и, соответственно ИА (табл. 7) эпителиоцитов слизистой оболочки желудка в трех компартментах наблюдалось на 20 и 30 сутки после трансплантации ММСК КМ, что, по-видимому, свидетельствовало о нормализации клеточного обновления в отсутствие воспалительной инфильтрации при активизации процессов дифференцировки на завершающей стадии регенераторного процесса. В контрольной группе животных, на 20 и 30 сутки исследования интенсивность экспрессии маркера апоптоза и соответственно ИА (табл. 7) эпителиоцитов снижались медленнее и оставались повышенными. Это указывало на сохранение хронического воспаления в слизистой оболочке желудка животных контрольной группы и вялое течение регенераторного процесса.

Позитивная динамика регенераторного процесса и снижение активности апоптоза в слизистой оболочке желудка у животных с трансплантацией ММСК КМ мы связываем с тем, что трансплантированные ММСК КМ создают условия для регуляции апоптоза эпителиоцитов и лимфоцитов, снижают аутоиммунное воспаление, меняют профиль цитокинов, а также участвуют в регуляции дифференцировки отдельных клонов Т-клеток, создавая оптимальные условия для процессов дифференцировки и пролиферации клеток и регенерации ДНЯЖ.

3.3 Влияние ММСК КМ на систему «простагландины - циклические нуклеотиды» в регуляции процессов регенерации и цитопротекции в слизистой оболочке желудка

Ускорению темпа регенерации язв способствовало ускорение темпа межклеточных взаимодействий о чем, хотя и косвенно, свидетельствует накопление в слизистой оболочке желудка вторичных мессенджеров межклеточных взаимодействий (цАМФ, цГМФ). Если исходить из того, что увеличение цАМФ в значительной степени отражает интенсификацию процессов пролиферации, а цГМФ - процессов дифференцировки, то на основании полученных нами данных мы заключили, что под влиянием трансплантации ММСК КМ к 10 и 20 суткам резко активизируются процессы пролиферации (рис. 3), тогда как процессы дифференцировки - активизируются только к 30 суткам, свидетельствуя о наступлении завершающей стадии регенераторного процесса. В контрольной группе животных уровни цАМФ и цГМФ на 30 сутки наблюдения оставались достоверно сниженными по сравнению с основной группой, что указывало на вялое течение регенераторного процесса в слизистой оболочке желудка.

Исследование содержания ПГЕ2 в СОЖ до лечения позволило установить его значительное снижение (134±11,7нг/г) по сравнению с интактными животными и этот факт косвенно свидетельствовал об уменьшении секреции бикарбонатов и слизи, и соответственно об уменьшении защитных возможностей слизистого секрета. На 30 сутки, после трансплантации ММСК КМ наблюдалось достоверное повышение ПГЕ2 (320±18,5нг/г) по сравнению с контролем (176±12,3нг/г) и исходными данными (146±9,7нг/г).

Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки костного мозга, длительно функционируя в зоне язвенного дефекта, становятся продуцентами не только дефицитных тканеспецифических пептидов, но и биологически активных веществ, которые при совместном воздействии на организм восстанавливают регуляцию межклеточного взаимодействия (цАМФ/цГМФ) и создают условия для ускоренного и качественного заживления ДНЯЖ.

Рис. 3. Динамика изменения содержания цАМФ и цГМФ в слизистой оболочке желудка крыс с моделью аутоиммунной язвы желудка после трансплантации ММСК КМ и введения физиологического раствора в зону язвенного дефекта. Обозначения: темные столбики - цАМФ, столбики со штриховкой - цГМФ Ч - p<0,05 по сравнению со значениями аналогичного показателя в исходе.

4. Влияние ММСК и МНК КМ на коррекцию иммунного дисбаланса при ДНЯЖ

4.1 Морфофункциональное состояние тимуса при аутоиммунных ДНЯЖ и трансплантации ММСК и МНК КМ

Динамическое морфометрическое исследование тимуса в группе без применения клеточной терапии (контроль) и в группе с трансплантацией ММСК КМ позволило установить, что на 10-е сутки терапии в группе контроля (введение физиологического раствора), преобладает мозговой слой (табл. 8).

Объемная доля коркового слоя была снижена и составила 32,3%. Этот слой был «плотно заселен» лимфоцитами. Субкортикальный слой был представлен 5-10 рядами лимфобластов. Границы между корковым и мозговым слоями были четкими. В мозговом слое соотношение лимфоцитов и эпителиальных элементов составляло 4:1; 5:1. Тимические тельца (Гассаля) были 1-3 фаз развития по О.В.Зайратьянцу (1992) и представлены скоплениями из 5-7 эпителиальных клеток. В то же время, в группе животных с трансплантацией ММСК КМ на 10 сутки терапии уже преобладал корковый слой (табл.8), который так же как в контрольной группе был «плотно заселен» лимфоцитами. Границы между корковым и мозговым слоями были четкие. В мозговом слое также преобладали лимфоидные элементы. Тельца Гассаля представлены скоплениями из 3-7 эпителиальных клеток. В субкортикальном слое определялись 12-14 рядов лимфобластов.

Таблица 8. Морфофункциональная характеристика тимуса крыс Wistar с ДНЯЖ при трансплантации ММСК КМ (местно) (М±м)

*p < 0,05 по сравнению с контролем

У животных контрольной группы на 20 сутки лечения продолжал преобладать мозговой слой (табл.8). Субкортикальный слой был представлен 3-7 рядами лимфобластов. Отмечалось очаговое опустошение коркового слоя. Граница между корковым и мозговым слоем была очагово-нечеткой. В мозговом слое соотношение лимфоцитов к клеткам ретикулоэпителия составляло 4:1; 5:1. Тельца Гассаля 4-5 фаз развития были представлены как скоплениями из 5-7 клеток, так и крупными тельцами, имеющими вид кистоподобных полостей. В то же время, в группе с применением ММСК КМ преобладал корковый слой (табл.8). В субкортикальном слое отмечалось 7-14 слоев лимфобластов. В мозговом слое преобладали лимфоциты. Тимические тельца были 2-4 фаз развития, встречались тельца в виде кистоподобных полостей.

На 30-е сутки у животных контрольной группы объемная доля коркового слоя составляла 39% (табл.8). Корковый слой был «плотно заселен» лимфоцитами. Субкортикальный слой представлен 8-12 рядами лимфобластов. Границы между корковым и мозговым слоем были четкие. Тельца Гассаля представлены скоплениями ретикулоэпителия (5-12 клеток). В группе животных с трансплантацией ММСК КМ на 30-е сутки преобладал корковый слой, объемная доля которого, достигала 70%. Корковый слой представлен лимфоцитами. Границы между корковым и мозговым слоем четкие. В субкортикальном слое отмечалось 8-14 рядов лимфобластов. В мозговом слое преобладали лимфоциты, тимические тельца 1-4 фаз развития, а также определялись единичные кистоподобные тельца.

При терапии МНК КМ морфофункциональное состояние тимуса претерпевало те же изменения, что и при использовании ММСК на всех сроках исследования (табл. 9), однако эти изменения были менее выражены.

Таблица 9. Морфофункциональная характеристика тимуса крыс Wistar при ДНЯЖ и трансплантации МНК КМ (местно) (М±м)

*p < 0,05 по сравнению с контролем

Таким образом, динамическое морфометрическое исследование тимуса - одного из центральных органов иммуногенеза позволило нам выявить стимуляцию Т-зон тимуса и восстановление структурных компартментов под влиянием как ММСК, так и МНК КМ. Оно проявлялось расширением коркового слоя и субкортикальной зоны, повышением количества лимфобластов, а по срокам эти изменения совпадали с активизацией регенераторных процессов в слизистой оболочке желудка и существенным сокращением сроков заживления язв.

4.2 Морфофункциональное состояние селезенки животных при длительно незаживающих аутоиммунных язвах желудка и трансплантации ММСК и МНК КМ

Морфофункциональное состояние селезенки также претерпевало соответствующие изменения. В контрольной группе на 10 сутки преобладала красная пульпа (табл. 10).

Таблица 10. Морфофункциональная характеристика селезенки крыс Wistar с ДНЯЖ при трансплантации ММСК КМ (местно) (M±m)

*p < 0,05 по сравнению с контролем

Лимфоидные фолликулы были средних размеров со светлыми центрами, представленными лимфобластами. В строме красной пульпы отмечались лимфоциты, гистиоциты, диффузно рассеянные нейтрофилы и мегакариоциты. В группе животных с трансплантацией ММСК КМ на 10-е сутки белая пульпа занимала около 40% площади среза и была представлена лимфоидными фолликулами со светлыми центрами из лимфобластов. Отмечались хорошо выраженные периартериальные муфты (ПАЛМ). В строме красной пульпы преобладали гистиоциты, лимфоциты и небольшое количество диффузно рассеянных нейтрофилов и мегакариоцитов. Отмечался выраженный диффузный гемосидероз.

У животных контрольной группы на 20 сутки после лечения по данным морфометрического исследования по-прежнему преобладала красная пульпа (табл. 10). Часть лимфоидных фолликулов имела некрупные светлые центры с лимфобластами. В строме красной пульпы отмечались преимущественно гистиоциты, диффузно рассеянные нейтрофилы и единичные в поле зрения мегакариоциты. В то же время, при морфометрическом исследовании селезенки животных, леченных ММСК КМ, на 20 сутки отмечено явное преобладание белой пульпы (табл. 10). Лимфоидные фолликулы имели светлые центры и были представлены рыхло расположенными лимфобластами. ПАЛМ были хорошо выражены. В строме красной пульпы преобладали лимфоциты, большое количество гистиоцитов и небольшое количество диффузно рассеянных нейтрофилов. В отличие от контрольной группы, в группе с трансплантацией ММСК КМ отмечалось большое количество в поле зрения мегакариоцитов.

На 30-е сутки у животных контрольной группы по сравнению с предыдущим сроком увеличилась площадь белой пульпы (табл. 10), занимаемой фолликулами со светлыми центрами, представленными лимфобластами и распадающимися клетками. ПАЛМ были выражены. В строме красной пульпы определялись лимфоциты, гистиоциты, единичные в поле зрения мегакариоциты, а также диффузный гемосидероз. В группе животных с трансплантацией ММСК КМ на 30-е сутки преобладала красная пульпа. Лимфоидные фолликулы были мелкие с небольшими светлыми центрами и рыхло расположенными в них лимфобластами, гистиоцитами и лимфоцитами. В строме красной пульпы преобладали лимфоциты, большое количество гистиоцитов и небольшое количество диффузно рассеянных нейтрофилов.

Морфофункциональная картина селезенки под влиянием МНК КМ претерпевала те же изменения, что и под влиянием ММСК КМ на всех исследуемых сроках. Однако, возникающие изменения были менее выраженными (табл. 11).

Таблица 11. Морфофункциональная характеристика селезенки крыс Wistar при ДНЯЖ и трансплантации МНК КМ (местно) (M±m)

*p < 0,05 по сравнению с контролем

Таким образом, динамические морфометрические исследования селезенки позволили выявить восстановление структурных компартментов под влиянием ММСК и МНК КМ. Это восстановление сопровождалось увеличением объемной доли лимфоидных фолликулов и ПАЛМ, что совпадало с активизацией регенераторных процессов в слизистой оболочке желудка. При использовании клеточной терапии мы впервые отметили, что в красной пульпе селезенки значительно возрастает количество мегакариоцитов, по сравнению с контролем. В норме мегакариоциты в селезенке отсутствуют. Мы предполагаем, что наличие этого феномена (мегакариоциты в селезенке) следует рассматривать как компенсаторную реакцию организма в ответ на иммунопатологическое повреждение СОЖ и развитие иммунного дисбаланса, при котором имеет место повреждение органов иммуногенеза, в том числе костного мозга и как системы иммуногенеза, и как системы кроветворения.

4.3 Коррекция цитокинового дисбаланса при ДНЯЖ и трансплантации ММСК и МНК КМ

Подтверждением коррекции иммунного дисбаланса под влиянием ММСК КМ служит динамика изменения цитокинового баланса в сыворотке крови животных при ДНЯЖ. Нами установлено (рис.4), что под влиянием ММСК происходит постепенное снижение уровня провоспалительных цитокинов - IL1в, IFNг, TNFб к 30 суткам наблюдения, причем снижение IL1в было достоверным уже на ранних сроках (10-20 сутки) (рис. 4А). В тоже время уровень противовоспалительных цитокинов - IL-4, IL-10, TGFв наоборот повышался и значения этих показателей становились достоверно выше по сравнению с контролем на 20 и 30 сутки лечения (рис. 4Б).

Рис.4.Изменение продукции провоспалительных (А) и противовоспалительных (Б) цитокинов в сыворотке крови крыс при трансплантации ММСК КМ в зону язвенного дефекта. 1 - после трансплантации ММСК КМ; 2 - после введения физиологического раствора (контроль); x-p<0,05 по сравнению с контролем при том же сроке исследования.

Аналогичная динамика цитокинового баланса была отмечена нами при трансплантации МНК КМ. Было установлено (рис. 5), что под влиянием МНК в сыворотке крови крыс с ДНЯЖ происходит постепенное снижение уровня провоспалительных цитокинов - IL1в, IFNг, TNFб к 30 суткам наблюдения, причем снижение IL1в было достоверным уже на ранних сроках (10-20 сутки). В тоже время уровень противовоспалительного цитокина - IL-4 наоборот под влиянием МНК резко повышался и значения этого показателя были достоверно выше по сравнению с контролем на всех сроках наблюдения.

Рис. 5. Изменение продукции провоспалительных (IL1в, TNFб, IFNг) и противовоспалительнго (IL-4) цитокинов в сыворотке крови крыс с ДНЯЖ при трансплантации МНК КМ в зону язвенного дефекта. 1 - после трансплантации МНК КМ; 2 - после введения физиологического раствора (контроль); x-p<0,05 по сравнению с контролем при том же сроке

Мы полагаем, что устранение цитокинового дисбаланса в организме под влиянием ММСК и МНК КМ, связано как с локальной продукцией трансплантированными клетками противовоспалительных цитокинов, и прежде всего, TGFв, так и с усилением продукции этих цитокинов другими клетками иммунной системы, что в условиях нормализации морфофункционального состояния тимуса и селезенки восстанавливает программу адекватного функционирования всех интегративных систем организма и приводит к активизации процессов устойчивой репаративной регенерации ДНЯЖ.

5. Влияние ММСК и МНК КМ на стимуляцию неоангиогенеза и восстановление микроциркуляторного русла слизистой оболочки желудка

В результате проведенного лечения в группах с ДНЯЖ и применением клеточной терапии происходило значительное увеличение показателя микроциркуляции (ПМ) в СОЖ (табл. 12 и 13). Методом лазерной допплеровской флоуметрии было установлено, что уже на 10 сутки после применения ММСК у животных с ДНЯЖ уровень ПМ был в 2 раза выше, по сравнению с контролем (табл.12).

На 20 сутки у животных с ДНЯЖ и трансплантацией ММСК уровень ПМ становился еще выше, амплитудные характеристики микроциркуляции были также более выражены в опыте, чем в контроле, хотя и в контроле (ДНЯЖ без ММСК), ПМ возрос, но практически не отличался от показателя на сроке 10 суток лечения.

Изучение интегральной характеристики гемодинамики - индекс флаксмоции (ИФМ) у животных контрольной и основной группы подтвердило, что, начиная с 20-х суток (табл. 12) происходит не только достоверное увеличение ПМ, но и увеличение ИФМ, что указывает на улучшение состояния микроциркуляторного русла и способность к восстановлению его адекватной регуляции при воздействии имитационных нагрузок.

На 30 сутки у животных группы с трансплантацией ММСК КМ уровень и амплитудные характеристики ПМ были выше, чем в контроле, но не выше, чем в опыте на 20 сутки применения ММСК.

Дополнительным доказательством восстановления микроциркуляции в зоне язвенного дефекта под влиянием ММСК КМ являются результаты морфометрии сосудов в динамике процесса регенерации ДНЯЖ (рис. 6).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 6. Среднее количество сосудов (в 1 поле зрения) в краевой зоне язвенного дефекта длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка в динамике лечения. *-p<0,05 по сравнению с контролем при тех же сроках.

Из рисунка 6 видно, что обкалывание язвы ММСК ведет к достоверному увеличению количества микрососудов в 1 поле зрения по сравнению с аналогичными сроками в контроле и указывает на стимуляцию процессов неоангиогенеза.

Аналогичные результаты исследования микроциркуляции и ангиогенеза были получены нами в группах с применением МНК КМ. У этих животных также происходило значительное увеличение ПМ в СОЖ периульцерозной зоны (табл. 13). На 10 сутки после применения МНК КМ уровень ПМ был в 1,5 раза выше по сравнению с контролем.

На 20 сутки у животных с трансплантацией МНК КМ уровень ПМ становился еще выше; амплитудные характеристики микроциркуляции были также более выражены в опыте, чем в контроле, хотя и в контроле (ДНЯЖ без МНК), ПМ возрос, но практически оставался на уровне 10 суток лечения.

Изучение интегральной характеристики гемодинамики (ИФМ) у животных этих групп подтвердило, что, начиная с 10-х суток (табл.13) происходит не только достоверное увеличение ПМ, но и увеличение ИФМ, что указывает на улучшение состояния микроциркуляторного русла и способность к восстановлению его адекватной регуляции при воздействии имитационных нагрузок.

На 30 сутки у животных с трансплантацией МНК КМ уровень ПМ становился очень высоким, даже несколько выше, чем в группе с трансплантацией ММСК КМ в аналогичные сроки, но амплитудные характеристики микроциркуляции были слабо выражены и были ниже, чем в контроле, а также в группе с трансплантацией ММСК КМ. Хотя в контроле ПМ возрос, уровень его приближался к значениям ПМ на 10 сутки у животных опытной группы, где трансплантировались ММСК.

Дополнительным доказательством более эффективного восстановления микроциркуляции в зоне язвенного дефекта под влиянием МНК КМ являются результаты морфометрии сосудов в динамике процесса регенерации ДНЯЖ (рис. 6).

Таким образом, проведенное исследование состояния микроциркуляторного русла слизистой оболочки желудка позволило установить связь между более высокой регенерацией язвенных дефектов с улучшением микроциркуляции у животных, которым проводилась клеточная терапия, по сравнению с контрольной группой животных (ДНЯЖ без клеток КМ). Нами также отмечен, не только высокий темп регенерации язв при клеточной трансплантации (ММСК и МНК КМ), но и отмечено более высокое качество регенерации зоны язвенного дефекта, так как при завершении эксперимента даже через 6 месяцев после моделирования ДНЯЖ в контрольной группе сохранялись язвенные дефекты размерами до 0,4-0,5 ммІ, а у животных основных групп язвенные дефекты и рубцовые изменения в слизистой оболочке желудка отсутствовали. Мы полагаем, что высокое качество регенерации язвенного дефекта при использовании клеток костного мозга обусловлено более полноценным восстановлением структуры и регуляции сосудистого русла не только в зоне язвенного дефекта, но и в прилежащих тканях.

Таблица 12. Характеристика показателей микроциркуляции у крыс в зоне длительно незаживающих язв желудка в динамике восстановительного процесса без и на фоне клеточной трансплантации (ММСК КМ) (M±m).

Примечание. Верхний ряд цифр - трансплантация ММСК КМ; нижний ряд - введение физиологического раствора (контроль).p<0,05 по сравнению с аналогичным показателем на 10 сутки исследования.

Таблица 13. Характеристика показателей микроциркуляции у крыс в зоне длительно незаживающих язв желудка в динамике восстановительного процесса без и на фоне клеточной трансплантации (МНК КМ) (M±m).

Примечание. Верхний ряд цифр - трансплантация МНК КМ; нижний ряд - введение физиологического раствора (контроль).p<0,05 по сравнению с аналогичным показателем на 10 сутки исследования.

Выводы

1. Трансплантация прекультивированных аутологичных клеток костного мозга - мононуклеарных клеток и мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток в зону язвенного дефекта является эффективным методом лечения длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка, так как ускоряет процесс восстановительной регенерации в зоне язвенного дефекта и корригирует иммунопатологические изменения в организме, ликвидируя тем самым условия для их возникновения.

2. Разработанная модель длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка у крыс является адекватной экспериментальной моделью для изучения иммунопатологических механизмов развития язвенной болезни и для оценки эффективности лечения длительно незаживающих язв методами клеточной трансплантации, так как воспроизводит основные местные иммунопатологические изменения, возникающие в зоне язвенного дефекта у больных.

3. Культивирование мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток аутологичного костного мозга также как культивирование мононуклеарных клеток является важным этапом подготовки этих клеток к трансплантации в зону язвенного дефекта, так как позволяет восстановить их пролиферативную и биорегуляторную активность от ингибирующего влияния хронического стресса, а также увеличить клеточную массу, необходимую для проведения клеточной терапии. Технология выделения ММСК является адекватной, так как выявление коллагена 1 типа в 100% этих клеток свидетельствует о мезенхимальной природе этих клеток и однородности клеточной культуры.

4. Прекультивированные мононуклеарные и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга ускоряют процессы регенерации ДНЯЖ за счет быстрой смены фаз язвенного процесса: сокращения сроков и выраженности деструктивно - воспалительной фазы и активизации пролиферативно - регенераторной фазы язвенного процесса. Процессы регенерации ДНЯЖ при трансплантации ММСК протекают в более быстром темпе, чем при трансплантации МНК КМ.

5. Клетки костного мозга при трансплантации в зону язвенного дефекта реализуют свою биорегуляторную активность не краткосрочно, а за счет их длительного функционирования (не менее 30 суток), что подтверждается выявлением в зоне язвенного дефекта флуоресцирующих ММСК, использованных от трансгенных доноров с геном GFP, или ММСК, предварительно меченых геном LacZ E.coli.

6. Трансплантированные ММСК и МНК КМ обеспечивают более качественную и быструю регенерацию язв желудка за счет стимуляции неоангиогенеза и восстановления микроциркуляторного русла, улучшения процессов метаболической регуляции в системе «простагландины - циклические нуклеотиды», следствием чего становится ингибирование процессов усиленного апоптоза эпителиоцитов в слизистой оболочке желудка.

7. Культивированные мононуклеарные и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга, трансплантированные в зону язвенного дефекта, устраняют цитокиновый дисбаланс: снижается уровень провоспалительных (IL1в и TNFб) и повышается уровень противовоспалительных (IL-10 и TGFв) цитокинов.

8. Культивированные мононуклеарные и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга восстанавливают морфофункциональные компартменты органов иммуногенеза у животных с длительно незаживающими аутоиммунными язвами: в тимусе отмечается расширение коркового слоя и субкортикальной зоны; в селезенке - увеличивается доля лимфоидных фолликулов и периартериальных лимфатических муфт. Появление в селезенке мегакариоцитов после проведения клеточной терапии может рассматриваться как феномен перестройки иммунной системы в ответ на активизацию ее прекультивированными клетками костного мозга.

9. Наиболее информативными показателями эффективности клеточной терапии длительно незаживающей язвы желудка и двенадцатиперстной кишки может стать фенотипический контроль активированных иммунокомпетентных клеток (цитотоксических лимфоцитов: CD8+, CD16+) и молекулярного маркера регуляторных клеток (CD4+CD25+) - FOXP3 в зоне язвенного дефекта.

10. Повышение уровня противовоспалительных цитокинов в сыворотке крови животных, коррелирующее со снижением активности апоптоза в динамике после трансплантации ММСК и МНК КМ может служить показателем качественной регенерации слизистой оболочки желудка, так как устраняются факторы прогрессирования деструктивно-язвенного процесса.

11. Прекультивированные ММСК и МНК КМ аутологичного костного мозга целесообразно использовать для трансэндоскопического лечения хронических, длительно незаживающих, трудно рубцующихся гастродуоденальных язв.

Практические рекомендации

1. При моделировании длительно незаживающей аутоиммунной язвы желудка подопытным животным (крысам) необходимо вводить подкожно 3-кратно, с интервалом в 7-10 дней антигены слизистой оболочки желудка в дозе до 1,5-2,0 мл (концентрация белка 35 мг/мл).

2. Для точного определения (с погрешностью до 0,01 ммІ) площади язвенного дефекта необходимо производить фотографирование язвенного дефекта на фоне линейки и производить расчеты с использованием компьютерной программы «Видео Тест-Мастер 5,0 («Видео Тест», СПб)».

3. С целью восстановления биорегуляторной и функциональной активности клеток аутологичного КМ (ММСК и МНК) перед трансплантацией следует их культивировать in vitro: МНК - 4-5 дней, а ММСК - 9-12 суток для устранения ингибирующего влияния стресса на эти клетки в организме.

4. При культивировании клеток площадь монослоя ММСК не должна превышать 80-85%, так как превышение этих значений может стать фактором ингибирования пролиферативной активности клеток в культуре.

5. Целесообразно исследовать возможности применения аутологичных клеток костного мозга (ММСК и МНК) для лечения длительно незаживающих и рецидивирующих язв, причем предпочтение следует отдавать ММСК, которые являются предшественниками фибробластов, дефицит которых имеет место в зоне язвенного дефекта, стимулируют региональные стволовые клетки в слизистой оболочке желудка и продуцируют биорегуляторные пептиды, корригирующие местный и общий гомеостаз.

6. Целесообразно эффективность клеточной терапии при длительно незаживающих язвах оценивать эндоскопически и в биоптатах из зоны язвенного дефекта по динамике снижения цитотоксического эффекта лимфоцитов в слизистой оболочке желудка и повышения экспрессии молекулярного маркера регуляторных клеток - FOXP3, отражающего степень нарушения иммунопатологических сдвигов в организме.

7. Клеточная терапия должна проводиться трансэндоскопически путем обкалывания зоны язвенного дефекта, что создает условия для более длительного функционирования мезенхимальных клеток в зоне язвенного дефекта, так как эти клетки попадают в условия адекватного микроокружения.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Расулов М.Ф., Потапов И.В., Аскаров М.Б. Прекультивирование клеток костного мозга как способ повышения их регуляторной активности при регенерационной терапии поврежденных органов / Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций. Под ред. Шумакова В.И и Онищенко Н.А. М: «Лавр». - 2009. -С. 77-103.

2. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Трансплантация мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток аутологичного костного мозга как новый способ коррекции продукции регуляторных пептидов в организме и ускорения восстановительных (регенерационных) процессов длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка / Биологические резервы клеток костного мозга и коррекция органных дисфункций. Под ред. Шумакова В.И и Онищенко Н.А. М: «Лавр».- 2009. -С. 204-209.

3. Цыпин А.Б., Васильченков А.В., Горшенин Т.Л., Аскаров М.Б. Лечение язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки пептидами и цитокинами селезенки // Новые технологии в трансплантации фетальных клеток и их медиаторов: тез. Международной конференции. Казахстан, Астана,-2005.-С. 128-129.

4. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Трансплантация стволовых и прогениторных клеток аутологичного костного мозга ускоряет регенерацию длительно незаживающих язв желудка и двенадцатиперстной кишки // Новые технологии в трансплантации фетальных клеток и их медиаторов: тез. Международной конференции. Казахстан, Астана,-2005.-С. 130-131.

5. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Трансплантация стромальных клеток аутологичного костного мозга активизирует ядрышковые организаторы хромосом мРНК эпителиоцитов и ускоряет регенерацию длительно незаживающих язв желудка // Новые технологии в трансплантации фетальных клеток и их медиаторов: тез. Международной конференции. Казахстан, Астана,-2005.-С. 131-132.

6. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Стромальные клетки аутологичного костного мозга стимулируют неоангиогенез и ускоряют регенерацию длительно незаживающих язв желудка // Клеточные технологии в медицине, в травматологии и ортопедии. Тез. конф. НИИ травматологии и ортопедии им. Приорова, Москва,-2006.-С. 38-39.

7. Аскаров М.Б., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А., Трубицына И.Е. Стратегия применения SDF-1 фактора и его роль в активации и хоминге клеток в лечении хронических длительно незаживающих язв желудка // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. Прил. 1.-2007.-С. 25.

8. Аскаров М.Б., Трубицына И.Е., Онищенко Н.А. Экспериментальная язва желудка: стволовые клетки аутологичного костного мозга ускоряют процессы репаративной регенерации // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. Прил. 1.-2007.-С. 26-27.

9. Васильченков А.В., Цыпин А.Б., Аскаров М.Б. Иммунотерапия язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. Прил. 1.-2007.-С. 39-40.

10. Аскаров М.Б., Трубицына И.Е., Богатырев С.Р., Онищенко Н.А. Аутологичные стромальные клетки костного мозга корригируют факторы регуляции морфогенеза и ускоряют регенерацию длительно незаживающих язв желудка // Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении. Тез. Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции. - Москва, РГМУ. - 2007.-С. 31-32.

11. Васильченков А.В., Аскаров М.Б., Цыпин А.Б. Состояние иммунной системы при язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. Прил.1.-2008.-С. 19-20.

12. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А., Макарова О.В. Восстановление морфофункционального состояния органов иммуногенеза - важный фактор заживления длительно незаживающих язв желудка при трансплантации культивированных клеток аутологичного костного мозга // Стволовые клетки и перспектива их использования в здравоохранении. Тез. Ежегодной Всероссийской и международной научной конференции.-Москва, РГМУ. - 2008. -С. 5-6.

13. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Коррекция цитокинового дисбаланса и стимуляция регенерации длительно незаживающих язв желудка при трансплантации стромальной фракции клеток аутологичного костного мозга // Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения: мат. Всероссийской школы-конференции.- Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2008.-С. 28-29.

14. Аскаров М.Б., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга восстанавливают дизрегуляцию системы «простагландины - циклические нуклеотиды» и ускоряют регенерацию длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка // Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения: мат. Всероссийской школы-конференции.- Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2008.-С. 30-31.

15. Аскаров М.Б., Дьяконова А.П., Крашенинников М.Е., Онищенко Н.А. SDF-1 фактор и его роль в активации и хоминге клеток в лечении длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка // Аутологичные стволовые и прогениторные клетки: экспериментальные и клинические достижения: мат. Всероссийской школы-конференции.- Москва, МГУ им. М.В. Ломоносова, 2008.-С. 27.

16. Аскаров М.Б., Трубицына И.Е., Онищенко Н.А. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки аутологичного костного мозга восстанавливают дизрегуляцию системы «простагландины-циклические нуклеотиды» и ускоряют регенерацию длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка // Всероссийская конференция с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток», посвященный 25-летию Самарского банка тканей и 45-летию ЦНИЛ СамГМУ, Самара, - 2008.-С. 47-48.

17. Аскаров М.Б., Вострикова О.Ф., Воробьева Н.Н., Онищенко Н.А. Влияние аутологичных клеток костного мозга на процессы апоптоза и регенерацию длительно незаживающих язв желудка // Всероссийская конференция с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток», посвященный 25-летию Самарского банка тканей и 45-летию ЦНИЛ СамГМУ, Самара, - 2008.-С. 49-50

18. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Восстановление морфофункционального состояния органов иммуногенеза и заживление длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка при трансплантации культивированных клеток аутологичного костного мозга // Всероссийская конференция с международным участием «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток», посвященный 25-летию Самарского банка тканей и 45-летию ЦНИЛ СамГМУ, Самара, - 2008.-С. 51-52.

19. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А., Макарова О.В. Восстановление морфофункционального состояния органов иммуногенеза и заживление длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка при трансплантации культивированных клеток аутологичного костного мозга // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия.-2008.-т.3.№ 3.-С. 36-42.

20. Аскаров М.Б., Вострикова О.Ф., Воробьева Н.Н., Онищенко Н.А. Влияние аутологичных клеток костного мозга на апоптоз и регенерацию длительно незаживающих аутоиммунных язв желудка // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. -2008.-№ 11.-С. 585-590.

21. Аскаров М.Б., Онищенко Н.А. Мультипотентные мезенхимальные стромальные клет...