Сиалидазная активность и морфологические изменения опухолевых клеток нейрального и мышечного происхождения

Рис. 15. Нейральная клеточная линия NB-1: I - контроль без обработки дб-цАМФ; II - контроль c обработкой дб-цАМФ; III - трансфекция вектором, не содержащем ген САПМ; без обработки дб-цАМФ; IV - трансфекция вектором, не содержащем ген САПМ; обработка дб-цАМФ; V - трансфекция вектором, содержащем ген САПМ; без обработки дб-цАМФ; VI - трансфекция вектором, содержащем ген САПМ; обработка дб-цАМФ. Активность ацетилхолинэстеразы выражена в процентах от контроля. По оси ординат - %. *p<0.001, **p<0.05 (см. пояснение в тексте).

дб-цАМФ также регистрировалась высокая активность АЭ достоверно отличавшаяся от активности АЭ как в клетках, подвергнутых только трансфекции вектором с САПМ (V), так и в клетках и подвергнутых трансфекции вектором с САМП, и обработанных дб-цАМФ (VI).

Результаты проведённого исследования указывают, что высокая активность САПМ приводит к выраженной активности такого функционального маркера дифференцировки нейральных клеток как ацетилхолинэстераза. Более значимое повышение в активности АЭ в клетках без повышенной экспрессии САПМ, но обработанных дб-цАМФ, можно объяснить активацией нескольких цАМФ-сопряжённых молекулярных факторов, которые усиливают действие друг друга.

Активность лизосомальной сиалидазы в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека.

В связи с полученными результатами при исследовании активности сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной,

Таблица 6 Активность лизосомальной сиалидазы в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека

*См. материалы и методы. Средние представлены результатом трёх экспериментов.

представляло несомненный интерес изучить активность лизосомальной сиалидазы (ЛС) в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека при различных экспериментальных условиях, включая обработку клеток синтетическим аналогом циклического аденозинмонофосфата. Результаты, представленные в табл. 6, показывают, что в нейрональных клетках NB-1 выявляется спонтанная активность лизосомальной сиалидазы, которая в контрольной клеточной культуре составляет 0.884±0.139 ед./мг белка. В клетках, подвергшихся трансфекции, активность ЛС варьировала и была зарегистрирована на уровне 0.935±0.421 ед./мг белка для клеток после трансфекции “пустым” вектором с последующей обработкой д-цАМФ и максимальной для клеток, модифицированных вектором с САПМ и обработанных дб-цАМФ, в которых ЛС активность составила 1.640±0.491 ед./мг белка. Вместе с тем следует отметить, что при анализе средних показателей активности ЛС в исследованных клеточных культурах достоверных различий не было зарегистрировано.

Анализ молекулярно-генетических маркеров экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клеточной линии NB-1 нейробластомы человека.

Верификация продукта транскрипции гена сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной в клетках NB-1 нейробластомы человека.

Исследование количества матричной РНК, экспрессируемого геном САПК, было проведено в клеточных культурах при условиях согласно стандартному протоколу (см. материалы и методы). При этом исследование количества матричной РНК в культурах, подвергшихся трансфекции вектором, содержащим ген САПМ, не проводилось. Количество мРНК (рис. 16), измеренное в контрольной клеточной культуре, подвергшейся обработке дб-цАМФ, превысило контрольное значение (клетки, не подвергавшиеся трансфекции и обработке дб-цАМФ) более чем в 4 раза (p<0.001). Измерение количества мРНК в клеточной культуре, подвергшейся трансфекции “пустым” вектором, выявило тенденцию в повышении уровня мРНК гена САПМ, однако, различия по сравнению с контролем оказались недостоверны, что позволяет говорить об отсутствии неспецифической индукции “пустым” вектором в повышении транскрипционной активности гена, кодирующего мРНК для САПМ.

Иммуноцитохимическая верификация клеток NB-1, положительных по экспрессии сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной.

Рис. 16. Количество матричной РНК (% от контроля), выявленной в нейральных клетках NB-1 нейробластомы человека, культивировавшихся при разных экспериментальных условиях (среда без ЭТС): I - контроль; II - контрольные клетки, обработанные дб-цАМФ; III - клетки, подвергшиеся трансфекции вектором, не содержащим ген САПМ; IV - клетки, подвергшиеся трансфекции, вектором, не содержащим ген САПМ. Обработаны дб-цАМФ. По оси ординат - %. *p<0.001 (см. пояснение в тексте).

Исследование методом иммуноцитохимического анализа показало, что в клеточных линиях NB-1 нейробластомы человека, не модифицированных трансфекцией для получения клеток с повышенной экспрессии гена САПМ, представляется затруднительным локализовать антиген, даже при использовании усиления сигнала с помощью иммуноцитохимических систем визуализации. По-видимому, это связано с тем, что САПМ - это фермент, который в количественном отношении незначительно представлен в клетке и не образует скоплений в клеточной мембране. В связи с этим представляет несомненный интерес возможность локализовать САПМ: находится ли фермент предпочтительно в теле нейральной клетки или её отростках. Результаты иммуноцитохимического анализа показали, что клетки NB-1 нейробластомы человека после трансфекции вектором, содержащим ген САПМ, значимо экспрессируют фермент, который выявляется с помощью моноклональных антител. При этом флюоресцентный сигнал выявляется не только в теле нейральной клетки, но и её отростке. По-видимому, синтезируясь и созревая в аппарате Гольджи и эндоплазматическом ретикулуме фермент, в дальнейшем, поступает из тела нейральной клетки в её отросток.

ВЫВОДЫ

1. Клоны клеток перевиваемой рабдомиосаркомы РА-23 крыс с высоким метастатическим потенциалом характеризуются низкой активностью лизосомальной сиалидазы, тогда как клоны клеток с низким метастатическим потенциалом характеризуются высокой активностью лизосомальной сиалидазы, что свидетельствует о важности этого фермента для метастазирования опухолевых клеток мышечного происхождения.

2. Клоны клеток перевиваемой рабдомиосаркомы РА-23 крыс с высоким и низким метастатическим потенциалом характеризуются, соответственно, более выраженными и менее выраженными изменениями структуры ядер в форме интерфазных мостов.

3. Морфологическая дифференцировка нейральной клеточной линии NB-1 нейробластомы человека сопровождается высокой активностью сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной, что свидетельствует о супрессивном значении этого фермента для опухолей нейрального происхождения.

4. Циклический аденозинмонофосфат повышает количество матричной РНК гена сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной и её активность в нейральной клеточной линии NB-1 нейробластомы человека, что свидетельствует о зависимости этих изменений от цАМФ-сопряжённой сигнальной системы.

5. Циклический аденозинмонофосфат не вызывает повышения количества матричной РНК гена лизосомальной сиалидазы и её активности в клетках NB-1 нейробластомы человека, что указывает на отличные от цАМФ-сопряжённой сигнальной системы механизмы геномной и протеомной регуляции этого фермента в нейральных клетках.

6. В нейральных клетках NB-1 нейробластомы человека с высокой активностью сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной регистрируется достоверное повышение активности ацетилхолинэстеразы, что доказывает возможность использования сиалидазы, ассоциированной с плазматической мембраной, как функционального маркера дифференцировки опухолевых клеток нейрального происхождения.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

1. Рекомендуется использование перевиваемой рабдомиосаркомы РА-23 крыс в качестве экспериментальной модели для тестирования противоопухолевых препаратов. При этом предлагается измерять активность лизосомальной сиалидазы, как маркера снижения метастатического потенциала опухолевых клеток.

2. Предлагается регистрировать активность сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной при тестировании антибластомных средств, разрабатываемых для супрессии опухолей нейрального происхождения.

3. В экспериментах по регенерации аксонов необходимо учитывать значения активности сиалидазы ассоциированной с плазматической мембраной как прогностического маркера.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кравцов В.Ю., Прошин С.Н., Федорцева Р.Ф., Треус В.В., Никифоров А.М., Яковлев А.Ф., Каминская Е.В., Вахтин Ю.Б. Частота клеток с полумостами в клеточных популяциях in vivo // Доклады Академии Наук. - 1996. - Т.350. - N.6. - С.831-833.

2. Vakhtin Yu.B., Kaminskaya E.V., Kravtsov V.Yu., Proshin S.N., Fedorova E.V., Yakovlev A.F. Genomic stability of tumour cells of rat rhabdomyosarcoma with different levels of tumorogenicity. In: 'Molecular determinants of cancer metastasis' // 50th Annual Symposium on Fundamental Cancer Research / Houston, Texas, USA. - 1997. - P.122.

3. Кравцов В.Ю., Прошин С.Н., Яковлев А.Ф., Каминская Е.В., Вахтин Ю.Б. Мосты и многополюсные митозы в популяциях клеток рабдомиосаркомы РА-23 крыс // Бюл. Эксп. Биол. Мед. - 1997. - Т.123. - N.5. - С.569-572.

4. Proshin S, Kaminskaya E, Vakhtin Yu, Kravtsov V, Yakovlev A. Cells with "trailed nuclei" as markers of the breakages of the chromosome bridges // XVIII International Congress of Genetics / Beijing, China. - 1998. - P.32.

5. Kaminskaya E.V., Vakhtin Yu.B., Fedorova E.V., Kravtsov V.Yu., Proshin S.N., Yakovlev A.F. Mutagenecity and tumorigenecity in cells of lung metastases of rat rhabdomyosarcomas // 17th International Cancer Congress / Rio de Janeiro - Brazil. - 1998. - P.216.

6. Прошин С.Н., Кравцов В.Ю., Ольнев М.Г., Яковлев А.Ф., Вахтин Ю.Б. Хромосомные мосты и "хвостатые" ядра в популяциях злокачественных клеток // Генетика. - 1998. - Т.34. - №.1. - С.61-64.

7. Патент на изобретение N 2111249 от 20 мая 1998 года. Способ селекции популяций клеток in vivo. Прошин С.Н., Кравцов В.Ю., Яковлев А.Ф., Федорцева Р.Ф., Бычкова Н.В., Вахтин Ю.Б., Никифоров А.М.

8.Забежинский М.А., Коваленко А.Л., Кветной И.М., Южаков В.В., Попучиев В.В., Вахтин Ю.Б., Каминская Е.В., Прошин С.Н., Попович И.Г., Зарипова Е.А., Анисимов В.Н. Влияние циклоферона на метастазирование карциномы лёгких Льюис у мышей и рабдомиосаркомы РА-23 у крыс // Вопросы онкологии. - 1999. - Т.45. - N.6. - С.650-654.

9. Proshin S., Yamaguchi K., Wada T., Miyagi T. Modulation of neuritogenesis by ganglioside-specific sialidase in human neuroblastoma NB-1 cells // The 23rd Japanese Carbohydrate Research Meeting / Yokohama, Japan. 2002. - P.237.

10.Proshin S., Yamaguchi K., Wada T., Miyagi T. Modulation of neuritogenesis by ganglioside-specific sialidase (Neu 3) in human neuroblastoma NB-1 cells // Neurochemical Research. - 2002. - Vol.27. - N7/8. - P.841-846.

11.Прошин С.Н. Физиологические эффекты сиалидаз в формировании пластичности нервной ткани // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Том.7. - N.1. - С.1414-1418.

12.Прошин С.Н. Физиологическая роль ганглиозидов и сиалидаз при воздействии факторов ионизирующей радиации // Медико-биологические и социально-психологические проблемы безопасности в чрезвычайных ситуациях. - 2007. - N. 2. - С.28-32.

13.Proshin S.N. Sialidase activity and metastatic characteristics of tumor cell clones in vivo of rat rhabdomyosarcoma RA-23 // J. Glycobiology. - 2007. - Vol.17. - N.11. - P.1228.

14.Прошин С.Н., Каминская Е.В., Лебедев А.А., Кравцов В.Ю., Шабанов П.Д. Активность лизосомальной сиалидазы в опухолевых клетках клонов рабдомиосаркомы РА-23 / III Съезд Фармакологов России: спец. вып. (сентябрь). С.1909 // Психофармакология и биологическая наркология. - 2007. - Т.7. - Ч.2. - 2084 с.

15.Прошин С.Н., Каминская Е.В., Лебедев А.А., Шабанов П.Д. Опухолевые клетки клонов рабдомиосаркомы РА-23 с высоким и низким метастатическим потенциалом отличаются по активности лизосомальной сиалидазы // Бюл. Эксп. Биол. Мед. - 2008. - Том.145. - N.3. - С.330-333.

16.Прошин С.Н., Каминская Е.В., Лебедев А.А., Байрамов А.А., Яковлев А.Ф., Шабанов П.Д. Метастатический потенциал и сиалидазная активность клеток опухолевых клонов рабдомиосаркомы РА - 23 крыс // Мед. Акад. Жур. - 2008. - Том.2. - С.26-29.

Размещено на Allbest.ru