Морфологическая и молекулярно-биологическая характеристика мужских гамет при патоспермии и идиопатическом бесплодии

4.2. Детекция X, Y и 1 хромосом методом FISH в сперматозоидах пациентов с выявленным герпетическим инфицированием

Изучен материал от 17 пациентов, в сперматозоидах которых выявлены белки вируса простого герпеса и/или инфекционная активность вируса. Исследование проводили с использованием ДНК-проб, специфичных для хромосом 1, X и Y. Выбор ДНК-зондов определялся тем, что при мейотическом делении у человека чаще всего наблюдается нерасхождение хромосом X и Y (Martin R., 2003), в тоже время имеются сообщения о том, при герпетическом инфицировании клеток повреждения затрагивают хромосому 1 (Peat D., Stanley M., 1986).

Показано, что частота полиплоидии по хромосомам 1, Х и Y у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами составляет 0,2±0,1%, анеуплоидии по хромосомам 1, Х и Y - 0,09±0,06, 0,06±0,04, 0,05±0,03% соответственно, частота анеуплоидии ХY - 0,1±0,11%. Определяли также долю общего количества численных хромосомных аномалий в каждом образце. В целом у пациентов с герпесвирусным инфицированием сперматозоидов в данной группе частоту всех изученных дисомий выявили в 0,48±0,09% ядер клеток.

По данным Chevret E. и соавт. (1994), полученным с помощью двухцветового метода FISH, частота X- и Y-несущих сперматозоидов составляет 49,3% и 49,22% соответственно (соотношение - 1:1), частота XY несущих сперматозоидов достигает 0,42. Используя метод FISH, Van Hummelen P. et al. (1996) продемонстрировали, что нерасхождение хромосом в сперматозоидах здоровых доноров эякулята достигает 1-2%. Показано, что анеуплоидии аутосом встречаются в зрелых половых клетках в пределах 0,05-0,28% (Pellestor F. et al., 1996). Результаты, полученные в данной работе, согласуются с вышеперечисленными данными. Таким образом, частота выявленных нарушений при герпетическом инфицировании сперматозоидов не выше той, которая была обнаружена у здоровых половозрелых мужчин с нормозооспермией (Chevret E. et al., 1994; Pellestor F. et al., 1996; Van Hummelen P. et al. 1996; Shi Q., Martin R., 2000; Martin R., 2003).

4.3. Исследование количественного состава незрелых половых клеток в эякуляте пациентов, в сперматозоидах которых выявлено герпетическое инфицирование

Изучение состояния сперматогенеза проводилось на суховоздушных препаратах ядер половых клеток из суспензии эякулята после окрашивания красителем по Романовскому-Гимза. Подсчитывали ядра клеток на разных стадиях их развития, определяя долю (в процентах) клеток в каждой стадии от общего числа подсчитанных незрелых половых клеток (Курило Л.Ф. и соавт., 1993; 1995; 1997; Курило Л.Ф., 2007).

Было проведено исследование эякулята 24 пациентов, у которых в сперматозоидах выявлены белки вируса простого герпеса. Контрольная группа состояла из 23 мужчин, проходивших обследование в качестве доноров спермы (Курило Л.Ф. и соавт., 1995).

Результаты количественного анализа состава незрелых половых клеток эякулята пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами представлены на рис. 5.

Было установлено статистически значимое (р<0,001) увеличение содержания общей фракции незрелых половых клеток у 24 пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами по сравнению с их содержанием в эякуляте 23 доноров спермы. Индекс незрелых половых клеток в этих группах составлял у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами - медиана 5,75% (минимум=0,00%, интерквартильный размах от 1,85 до 15,20%, максимум=18%), а у доноров - медиана 2,10% (минимум=0,50%, интерквартильный размах от 1,8 до 2,9%, максимум=3,5%) от общего количества подсчитанных половых клеток соответственно. В обследуемой группе обнаружено статистически значимое (р<0,001) увеличение числа клеток, находившихся на стадиях прелептотены, лептотены и зиготены (медиана 1,65% (минимум=0,80%, интерквартильный размах от 1,45 до 2,25%, максимум=3,80%) по сравнению с таковым у доноров спермы (медиана 0,70% (минимум=0,40%, интерквартильный размах от 0,50 до 0,80%, максимум=0,90%). В то же время доли клеток, находившихся в последующих стадиях сперматогенеза, оказались статистически значимо меньшими, чем у доноров. На стадии пахитены этот показатель у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами был - медиана 0,00% (минимум=0,020%, интерквартильный размах от 0,00 до 0,14%, максимум=0,4%), против аналогичного показателя у доноров - медиана 0,40% (минимум=0,20%, интерквартильный размах от 0,40 до 0,60%, максимум=0,8%) (р<0,001). На стадии диплотены у пациентов обследуемой группы - медиана 0,20% (минимум=0,00%, интерквартильный размах от 0,05 до 0,35%, максимум=1,1%), у доноров - медиана 1,00% (минимум=00,00%, интерквартильный размах от 0,40 до 2,00%, максимум=3,00%); p<0,001. Эти отклонения нашли свое отражение в количественных показателях последующих стадий сперматогенеза: наблюдали отсутствие сперматоцитов в метафазе М I и М II, в отличие от доноров (медиана 0,04% (минимум=0%, интерквартильный размах от 0,03 до 0,05%, максимум=0,08%). Количество сперматоцитов II и сперматид (медиана 87,75% (минимум=78,00%, интерквартильный размах от 82,25 до 90,00%, максимум=100,00%)) у пациентов с вирусинфицированыыми сперматозоидами было также статистически значимо меньшим (p<0,001), чем у фертильных мужчин (медиана 92,00% (минимум=86,00%, интерквартильный размах от 90,00 до 93,00%, максимум=96,00%)). Нарушение сперматогенеза выразилось также в статистически значимом (p<0,001) повышении в эякуляте у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами концентрации неидентифицируемых клеток, которые имеют патологически измененную морфологию и представляют собой дегенерирующие половые клетки (медиана 10,10% (минимум=0%, интерквартильный размах от 7,60 до 14,80%, максимум=19,00%)). У доноров этот показатель составлял медиана 5,00% (минимум=2,00%, интерквартильный размах от 4,00 до 80%, максимум=12,00%).

При подсчете неразошедшихся сперматид показано, что средние значения этого параметра для доноров спермы (медиана 23,30% (минимум=9,00%, интерквартильный размах от 18,00 до 28,00%, максимум=36,00%) и для обследуемых лиц (медиана - 22,25% (минимум=0%, интерквартильный размах от 17,30 до 28,25%, максимум=34,00%)) не различались статистически значимо (p=0,744). У пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами возрастает количество неидентифицированных половых клеток, что свидетельствует об интенсивных дегенеративных процессах среди незрелых половых клеток.

Таким образом, при исследовании незрелых половых клеток выявлен выраженный цитопатический эффект вирусного инфицирования сперматозоидов. Изменение количественного состава незрелых половых клеток свидетельствует о том, что действие вируса простого герпеса на сперматогенез осуществляется на уровне клеток сперматогенного эпителия.

Рис. 5. Сравнение индекса незрелых половых клеток (НПК) и показателей состава НПК по стадиям сперматогенеза в эякуляте пациентов с герпесвирусным инфицированием сперматозоидов и доноров: а - индекс НПК (доля НПК в общем количестве половых клеток, %); б-ж - доля НПК каждой стадии от общего числа подсчитанных НПК): сперматоциты I на стадиях: б прелептотены-зиготены, в пахитены, г диплотены; д - сперматоциты на стадиях МI, МII, е сперматоциты II и сперматиды; ж неидентифицируемые (дегенерирующие) половые клетки; з - доля неразошедшихся сперматоцитов II и сперматид от общего количества сперматоцитов II и сперматид, %. По оси ординат (рис. б-ж) количество НПК исследуемых стадий, %. (1) пациенты с герпесвирусным инфицированием сперматозоидов, n=24%, (2) доноры, n=23.

Эти данные согласуются с результатами, полученными при экспериментальном герпетическом орхите (Грибенча С.В. и соавт., 2007). Авторы показали, что при инфицировании семенников экспериментальных животных размножение вируса простого герпеса происходит в клетках сперматогенного эпителия. Вопрос о путях проникновения вируса в семенники нуждается в дальнейшем изучении.

Изменение количественного состава незрелых половых клеток у пациентов с герпетическим инфицированием сперматозоидов, продемонстрированное в данной работе, свидетельствует о том, что на стадии сперматогенеза происходит селекция поврежденных при инфицировании клеток. В то же время в настоящей работе показано, что не все инфицированные клетки подвергаются селекции, так как с помощью гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса обнаружена во фракции подвижных сперматозоидов нормальной морфологии.

5. Количественная оценка ультраструктурных нарушений строения сперматозоидов при герпетическом инфицировании

Количественный анализ проводили у 22 пациентов с нарушением фертильности с отрицательными результатами выявления герпетического инфицирования сперматозоидов (1-ая группа) и у 21 пациента с выявленным герпетическим инфицированием сперматозоидов (выявлены белки вируса простого герпеса и/или инфекционная активность вируса). У 8 из них в сперматозоидах не обнаружены вирусные капсиды (2-ая группа), у 13 в сперматозоидах обнаружены внутриклеточные вирусные капсиды (3-я группа).

У пациентов 1-ой группы общее количество сперматозоидов в эякуляте у 21 из 22 были не ниже нормативных показателей, согласно инструкции ВОЗ (WHO, 1992, 2000). Содержание подвижных сперматозоидов не соответствовало нормативным у 1 пациента, но было не ниже 22%. Содержание морфологически нормальных сперматозоидов - не ниже 20%.

Во второй и третьей группах у жен пациентов в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности. Спермиологическое обследование пациентов этих групп показало, что у 20 из 21 пациентов общее содержание сперматозоидов было не ниже нормативных показателей. Содержание подвижных сперматозоидов не соответствовало нормативным у 5 пациентов, но было не ниже 20%. Содержание морфологически нормальных сперматозоидов ниже 20% у 1 пациента. Таким образом, в обследуемых группах пациентов не было лиц с выраженными аномалиями спермиологического обследования.

При ультраструктурном анализе статистически значимые различия выявлены между 1 и 3 группами. Содержание сперматозоидов с нормальным строением акросомы и с нормальным строением митохондрий статистически значимо выше в группе пациентов с герпетическим инфицированием сперматозоидов и наличием капсидов в цитоплазматической капле по сравнению с группой пациентов с идиопатическим бесплодием. Результаты количественного ультраструктурного анализа содержания (в процентах) головок сперматозоидов с гранулярным хроматином в образцах от пациентов оказались следующими: в группе пациентов с идиопатическим нарушением фертильности (1-я группа) - медиана 37% (минимум=9%, интерквартильный размах от 20 до 55%, максимум=75%); с выявленным герпетическим инфицированием сперматозоидов, у которых не обнаруживали вирусных капсидов (2-ая группа) - медиана 27% (минимум=15%, интерквартильный размах от 19 до 53%, максимум=68%); у пациентов с выявленным герпетическим инфицированием, у которых обнаружены внутригаметные вирусные капсиды (3-я группа) - медиана 27% (минимум=10%, интерквартильный размах от 20 до 50%, максимум=85%).

Содержание головок с гранулярным хроматином в 1-ой группе не отличалось статистически значимо от этого показателя в группе пациентов с выявленным герпетическим инфицированием сперматозоидов, у которых в цитоплазме не обнаруживали вирусных капсидов (p=0,629). Во 2-ой группе отличие по содержанию головок сперматозоидов с гранулярным хроматином по сравнению с 3-ей группой не было значимым (p=0,674). Различие по содержанию головок с незрелым хроматином у пациентов 1-ой группы и 3-ей группы также не было статистически значимым (p=0,916).

Проводили анализ различий частоты встречаемости повышенного содержания головок с гранулярным хроматином в образцах эякулята вышеперечисленных групп пациентов. В 1-ой группе пациентов повышенное содержание головок сперматозоидов с гранулярным хроматином наблюдали у 13 (59%) из 22 обследованных, во 2-й группе 2 - у 3 (37%) из 8, в 3-ей группе - у 6 (46%) из 13 пациентов. При сравнении групп по частоте изучаемого признака различия между первой и второй, между второй и третьей группами, а также между первой и третьей группами не были статистически значимыми (p=0,295, p=0,690 и p=0,461, соответственно).

У фертильных мужчин при ультраструктурном исследовании наблюдают не менее 40% головок сперматозоидов с акросомами типичного строения. Проводили анализ содержания сперматозоидов с головками, имеющими акросомы типичного строения, в образцах эякулята пациентов с идиопатическим нарушением фертильности (1-ая группа), пациентов с выявленным герпетическим инфицированием сперматозоидов, у которых в цитоплазме не обнаруживали вирусных капсидов (2-ая группа) и пациентов с выявленным герпетическим инфицированием, у которых обнаружены внутригаметные вирусные капсиды (3-я группа).

Результаты количественного ультраструктурного анализа содержания (в процентах) головок сперматозоидов, имеющими типичное строение акросомы, в образцах от пациентов были следующими: в 1-ой группе - медиана 48% (минимум=10%, интерквартильный размах от 38 до 65%, максимум=87%); во 2-й группе - медиана 65% (минимум=25%, интерквартильный размах от 34 до 79%, максимум=90%); в 3-й группе - медиана 66% (минимум=30%, интерквартильный размах от 62 до 72%, максимум=92%).

Содержание головок сперматозоидов, имеющих типичное строение акросомы, не отличалась статистически значимо у пациентов 1-ой и 2-ой групп (p=0,320). В эякуляте пациентов 3-й группы содержание головок с типичным строением акросомы было статистически значимо ниже, чем в 1-ой группе (уровень значимости - p=0,032). Различие по содержанию головок сперматозоидов с типичным строением акросомы в эякуляте пациентов 2-ой и 3-ей групп не было значимым (p=0,804).

Проводили анализ различий частоты встречаемости сниженного содержания головок с типичным строением акросомы в образцах эякулята вышеперечисленных групп пациентов. В 1-ой группе пациентов у 7 (32%) из 22 обследованных наблюдали снижение содержания головок сперматозоидов, имеющих акросому типичного строения, во 2-ой группе - у 3 (38%) из 8 пациентов, в 3-ей группе выявили 2 (15%) из 13 пациентов с такой патологией. При сравнении групп по частоте изучаемого признака статистически значимого различия между первой и второй группами, между первой и третьей группами, а также между второй и третьей группами не были статистически значимыми (p=0,761, p=0,274 и p=0,244, соответственно).

В группе пациентов с идиопатическим нарушением фертильности отмечено статистически значимое снижение содержания сперматозоидов с нормальным строением митохондрий по сравнению (p=0,013) с группой пациентов с выявленным герпетическим инфицированием, у которых обнаружены внутригаметные вирусные капсиды. При проведении анализа частоты встречаемости сниженного содержания сперматозоидов с нормальным строением митохондрий между этими группами также выявлены статистически значимые различия (p=0,028).

Таким образом, установлено, что при идиопатическом бесплодии нарушена структура акросомы и митохондрий сперматозоидов. Аномалии этих структур, не выявляемые на светооптическом уровне исследования, могут быть причиной нарушения фертильности, то есть отсутствия зачатия.

В группе пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами эти факторы не оказывают влияния на фертильность: зачатие может происходить, однако вирусное инфицирование сперматозоидов оказывает отрицательное воздействие на течение беременности.

6. Изучение сперматогенеза у пациентов, у жен которых в анамнезе было спонтанное прерывание беременности

6.1. Выявление вируса простого герпеса

Проводили обследование 36 пациентов, у жен которых в анамнезе был по крайней мере 1 случай спонтанного прерывания беременности невыясненной этиологии. В дальнейшем эта группа будет именоваться основной группой. В этой группе методом иммунофлюоресценции исследованы сперматозоиды в 31 образце эякулята. Белки вируса простого герпеса обнаружены в 23 (74%), образцах, в 8 образцах вирусные белки не обнаружены.

Определение инфекционной активности вируса простого герпеса с помощью быстрого культурального метода проводили в 29 образцах эякулята, в 20 из них (69%) выявлена инфекционная активность вируса. Фракционирование эякулята проводили в 8 из 20 инфицированных образцов. В 3 образцах из 8 инфекционная активность вируса выявлена в цельном эякуляте, спермоплазме и в общей клеточной фракции, в 5 из 8 образцов инфекционная активность вируса обнаружена только в общей клеточной фракции эякулята. Всего вирус простого герпеса выявлен (хотя бы одним из применяемых методов) в 29 образцах из 36 (81%).

В качестве группы сравнения были использованы данные о 222 пациентах, обратившихся в клинико-лабораторный центр «Пастер» или в Медико-генетический научный центр РАМН для профилактического обследования (91 человек), после перенесенных воспалительных заболеваний урогенитального тракта (87 человек) и инфертильные пациенты (44 человека). Пациенты группы сравнения были обследованы за тот же период времени, что и группа пациентов, у жен которых в анамнезе было спонтанное прерывание беременности. В группе пациентов, обратившихся для профилактического обследования, вирус простого герпеса хотя бы одним из методов выявлен в 47 образцах из 91 (52%). В группе из 87 пациентов, обратившихся для обследования после перенесенных воспалительных заболеваний урогенитального тракта различной этиологии, вирус простого герпеса выявили у 44 человек из 87 (51%). В группе пациентов, обратившихся для обследования по поводу первичного бесплодия, вирус простого герпеса выявлен в 26 образцах из 44 (59%).

Ультраструктурное исследование проводили в 25 образцах эякулята пациентов, у жен которых в анамнезе было спонтанное прерывание беременности. Вирус простого герпеса хотя бы одним методом выявлен у 19 (76%) из них. Вирусные капсиды были выявлены в сперматозоидах 13 из 19 образцов эякулята мужчин этой группы (68%). В 6 образцах из 25, в которых вирус простого герпеса не выявлен вирусологическими методами, капсиды вируса простого герпеса не обнаружены. В группе сравнения проводили исследование 24 образцов эякулята пациентов с нарушениями фертильности или пациентов, обратившихся по поводу профилактического обследования. У 14 пациентов этой группы вирус простого герпеса выявлен хотя бы одним методом. При электронно-микроскопическом изучении вирусные капсиды не обнаружены (рис. 6).

Рис. 6. Частота выявления вируса простого герпеса: методами иммунофлюоресценции и быстрым культуральным методом (I); методом трансмиссионной электронной микроскопии (II) в группах пациентов.

Таким образом, частота выявления вируса простого герпеса хотя бы одним из методов в группе пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности (81%), была статистически значимо выше, чем в группе пациентов, проходивших профилактическое обследование (52%, p=0,005) и в группе пациентов, обратившихся для обследования после перенесенных воспалительных заболеваний (51%, p=0,004). Различия между основной группой и группой пациентов, обратившихся для обследования по поводу первичного бесплодия (59%), не были статистически значимы (p>0,05). В целом частота выявления вируса простого герпеса в группе пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности, была статистически значимо выше (p=0,003), чем в группе сравнения из 222 пациентов.

6.2. Результаты спермиологического обследования

В группе пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности, нормативные или слабо отклоняющиеся от нормативных (при дальнейшем изложении - нормальные) показатели спермограммы выявлены в 24 из 29 образцов (83%) эякулята с вирусинфицированными сперматозоидами (рис. 7). При отсутствии инфицирования нормальные показатели спермограммы обнаружены в 5 из 7 образцов (71%).

При обследовании пациентов групп сравнения получены следующие результаты. У пациентов, проходивших профилактическое обследование, нормальными параметры спермограммы были в 36 из 47 (77%) инфицированных вирусом простого герпеса образцов и в 35 из 44 (80%) неинфицированных. У пациентов, проходящих обследование после лечения воспалительных заболеваний, соответственно в 27 из 44 (61%) инфицированных образцов и в 23 из 43 (53%) неинфицированных. При первичном бесплодии - нормозооспермию выявляли в 13 из 26 (50%) инфицированных и 9 из 18 (50%) неинфицированных образцов (рис. 7).

Рис. 7. Показатели спермиологического обследования, соответствующие нормативным, в группе пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности (I), в группе пациентов, проходивших профилактическое обследование (II), после терапии воспалительных заболеваний (III) и по поводу первичного бесплодия (IV).

При выявлении герпетического инфицирования сперматозоидов у пациентов, в анамнезе жен которых имелось спонтанное прерывание беременности, и пациентов, проходивших профилактическое обследование, параметры спермограммы статистически значимо чаще соответствовали нормативным, чем у пациентов с первичным бесплодием (p=0,022 и p=0,040 соответственно). При отсутствии инфицирования нормозооспермию статистически значимо чаще наблюдали в группе пациентов, обратившихся для профилактического обследования по сравнению с группами пациентов после лечения воспалительных заболеваний (p=0,019) или при первичном бесплодии (p=0,044). Различия между группой пациентов, в анамнезе жен которых имелось спонтанное прерывание беременности, и группой сравнения в целом по частоте выявления нормальных параметров спермограммы не были статистически значимыми (p>0,05), как в случаях выявления инфицирования сперматозоидов, так и при отрицательных результатах вирусологического обследования. Таким образом, в присутствии вируса простого герпеса значимых изменений в параметрах спермограммы обнаружено не было.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Основными показателями, отражающими оплодотворяющую способность спермы, считаются концентрация сперматозоидов (их общее количество), подвижность и содержание сперматозоидов нормальной (типичной) морфологии (Centola G., Eberly S., 1999; Брагина Е.Е., Абдумаликов Р.А., 2002). Хотя у фертильных мужчин эти показатели в общем выше, однако, в группе фертильных и бесплодных мужчин они могут значительно перекрываться, позволяя предполагать наличие неких других факторов, влияющих на фертильность (Evenson D. et al., 1999; 2000; Sakkas D., Tomlinson M., 2000). Основываясь на показателях спермиологического обследования, нельзя дать достоверный прогноз фертильности, учитывающий не только возможность зачатия, но и исход наступившей беременности (Zini A., Libman J., 2006). В последние годы появились сведения о том, что на исход беременности могут влиять факторы, не выявляющиеся при традиционном спермиологическом обследовании. Для определения различных параметров взаимодействия сперматозоидов с яйцеклеткой разработан и рекомендуется инструкцией ВОЗ ряд функциональных тестов, таких как: акросомная реакция; тест связывания сперматозоидов с блестящей зоной ооцита (HZA - hemizona assay) (Oehninger S. et al., 1989); тест проникновения сперматозоидов сквозь блестящую зону ооцита (Lanzendorf S. et al., 1994); тест проникновения сперматозоидов в ооцит, лишенный оболочки (Aitken R. et al., 1991); определение деконденсации хроматина ядра сперматозоида методом окраски анилиновым синим (Hoffman N., Hilscher B., 1991). Наряду с вышеупомянутыми тестами для установления природы патоспермии и для оценки функционального состояния сперматозоидов может быть применен метод ультраструктурного анализа.

Метод количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов может применяться для выявления ультраструктурных нарушений морфологии сперматозоидов у пациентов с патоспермией, для оценки функционального состояния сперматозоидов у пациентов с идиопатическим бесплодием и у пациентов, в анамнезе жен которых имеется спонтанное прерывание беременности. Применение электронно-микроскопического исследования сперматозоидов позволяет выяснить механизмы фертилизационной неэффективности сперматозоидов, идентифицировать генетически обусловленные и приобретенные формы патоспермии.

В первом случае, сперматозоиды с каким-либо характерным нарушением строения составляют большую (либо тотальную) часть клеток эякулята данного пациента. Эти нарушения могут быть названы системными, или синдромными, так как ультраструктурные особенности сперматозоидов не меняются со временем, не поддаются терапевтической коррекции, и аналогичны нарушениям морфологии сперматозоидов других пациентов с аналогичными нарушениями фертильности. В этом случае нарушения морфологии сперматозоидов носят семейный характер и имеют доказанное (или предположительное) генетическое происхождение. Специфическая «синдромная» патология выявляется редко, согласно данным литературы - в 0,2 до 2% случаев нарушения фертильности (Chemes H., 2000). Для клинической практики, особенно при использовании репродуктивных технологий, важно, что специфическая «синдромная» патоспермия не корректируется терапевтически, и несет риск наследования аномалий в потомстве.

В настоящей работе был выявлен тип синдромной патоспермии, не описанный ранее и связанный с аномалией строения центриолей сперматозоидов. Совокупность симптомов при данной патологии выражается в следующем: идиопатическое бесплодие при нормозооспермии у пациентов, тотальное нарушение строения центриолей сперматозоидов - разделение микротрубочек в центриолярных триплетах; тотальная остановка развития полученных с помощью интрацитоплазматической инъекции сперматозоидов эмбрионов на 2-3 сутки после оплодотворения.

Значительно более многочисленная группа - это пациенты с так называемыми неспецифическими аномалиями. У каждого пациента в этом случае обнаруживали гетерогенные комбинации различных изменений, индивидуальных для каждого пациента. Неспецифические дефекты сперматозоидов представляют собой гетерогенную группу аномалий со случайным распределением (Chemes H., 2000; Chemes H., Rawe V., 2003). Часто множественные аномалии головки и жгутиков представлены одновременно, их проявления могут варьировать по времени у одного и того же пациента.

В настоящей работе особое внимание было уделено так называемому идиопатическому бесплодию. Основная группа обследованных пациентов - это лица без явно выраженных нарушений спермиологического обследования (за исключением небольшой группы пациентов, где проводили дифференциальную диагностику генетически обусловленной аномалии и нарушений, вызванных экзогенными причинами при астенозооспермии и тератозооспермии). Нарушение фертильности при идиопатическом бесплодии может выражаться как в отсутствии зачатия в срок не менее года, так и в аномальном течении беременности у жены пациента после зачатия.

Показано, что при бесплодии у 81% пациентов выявляли повышенное содержание сперматозоидов с аномальной акросомой. В группе пациентов, проходивших профилактическое обследование, повышенное содержание сперматозоидов с аномальной акросомой не выявлено. Напротив, у 58% пациентов, в анамнезе жен которых имелось спонтанное прерывание беременности, наблюдали повышенное содержание сперматозоидов с нарушением конденсации хроматина. Эта аномалия обнаружена у 37% пациентов с первичным бесплодием, и не выявлялась в группе пациентов, проходивших профилактическое обследование.

Другим фактором, влияющим на фертильность мужчин, является наличие вирусного инфицирования сперматозоидов. Так как данные о вирусном инфицировании сперматозоидов не являются в настоящее время общепризнанными, в настоящей работе были поставлены следующие вопросы: 1) какова форма существования вируса простого герпеса в сперматозоидах, 2) может ли наблюдаться продуктивная вирусная инфекция в сперматозоидах и 3) главный вопрос - могут ли быть инфицированы вирусом герпеса морфологически нормальные сперматозоиды, обладающие так называемой прогрессивной подвижностью и участвующие в оплодотворении?

Работы по выявлению вируса простого герпеса и других вирусов группы герпеса в эякуляте были начаты более 30 лет назад, в связи с интенсивным развитием методов репродуктивных технологий. (Брагина Е.Е. и соавт. 1996; Deture F. et al., 1978; Kulscar G. et. al., 1991; Czata S. и Kulsar G., 1991; Kotronias D., Kapranos N., 1998; Еl Borai et al.,1997; Kapranos et al., 2003). С другой стороны, имелись сведения о выделении вируса простого герпеса из материала спонтанно абортированных плодов человека и животных (Sifakis S. et al., 1998; Rappersberger K., 1999; Mukaiya R. et al., 2000; Spano L. et al., 2002; Moore D. et al., 2003), причем инфицирование эмбриона при спонтанных абортах может быть значимо выше частоты инфицирования матери (Барановская Е.И. и соавт., 2004).

Обычно при аномалиях беременности, связанных с генитальным герпесом, так же, как и при герпетическом инфицировании новорожденных, проводят обследование беременных женщин (Масюкова С.А., ГладькоВ.В., 2002; Bujko M. et al., 1984; Whitley R., 1994). Значительно меньше внимания уделяется роли мужского фактора (Wald A. et al., 2002). О роли мужского фактора в аномальном течении беременности при герпетическом инфицировании опубликованы единичные работы (Csata S., Kulcsar G., 1991; Kulcsar G. et al., 1991). Очень мало сведений о влиянии герпетической инфекции на репродуктивную систему мужчин.

Для решения вопроса о форме существования вируса простого герпеса в сперматозоидах в настоящей работе использовали комплекс методов: 1) реакцию иммунофлюоресценции для анализа белков различных стадий жизненного цикла вируса простого герпеса в сперматозоидах; 2) метод определения ДНК-ДНК гибридизации in situ - для выявления и локализации геномной ДНК вируса простого герпеса; 3) быстрый культуральный метод - для определения инфекционной активности вируса; 4) метод электронной микроскопии - с целью морфологического выявления внутригаметного инфицирования.

Для исследование влияния вируса простого герпеса на сперматогенез использовали следующие методы: 1) традиционное спермиологическое обследование; 2) молекулярно-генетические методы: степень анеуплоидизации сперматозоидов оценивали с помощью хромосомоспецифичных зондов к специфическим последовательностям ДНК хромосом 1, X и Y; 3) количественный анализ незрелых половых клеток эякулята для определения степени блокирования мейоза у пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами; 4) количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов при герпетической инфекции.

Для исследования формы существования вируса простого герпеса в сперматозоидах было проведено выявление б (сверхраннего), в (раннего) и г (позднего) белков разных стадий жизненного цикла вируса, и выявление инфекционной активности вируса в образцах общей клеточной фракции спермы 101 пациентов, не имеющих симптомов генитального герпеса. При выявлении в сперматозоидах белков всех стадий жизненного цикла вируса инфекционную активность вируса простого герпеса в клеточной фракции эякулята обнаруживали статистически значимо чаще, чем в тех случаях, когда белки всех стадий цикла не выявляли.

В выделенной фракции подвижных сперматозоидов различных образцов были обнаружены как белки полного жизненного цикла вируса, так и белки одной или двух стадий жизненного цикла, а также выявлена инфекционная активность вируса.

Таким образом, при выявлении вируса простого герпеса в общей клеточной фракции сперматозоидов была обнаружена связь между наличием вирусных белков и выявлением инфекционной активности вирусов - в образцах эякулята с полной экспрессией белков вируса простого герпеса (сверхранних, ранних и поздних) инфекционную активность вируса выявляли чаще, чем в образцах с неполной экспрессией белков в сперматозоидах. Аналогичные факты были получены и другими исследователями, которые объясняли это явление наличием в семени ингибиторов роста клеточных культур (Deture F. et al., 1978; Sherman J., Morgan P., 1989).

Результаты настоящего исследования дают основание утверждать, что в сперматозоидах общей клеточной фракции и во фракции подвижных сперматозоидах может осуществляться как полный, так и неполный жизненный цикл вируса простого герпеса.

Проведение гибридизации in situ с зондами к ДНК вируса простого герпеса показало, что вирусная ДНК может присутствовать, как при полной экспрессии вирусных белков (б, в и г), так и при неполной их экспрессии. ДНК вируса простого герпеса может быть обнаружена как при наличии, так и при отсутствии инфекционной активности вируса. Следовательно, при неполном жизненном цикле вируса простого герпеса в сперматозоидах ДНК вируса сохраняется.

В настоящей работе впервые выявлено наличие ДНК вируса простого герпеса в подвижных сперматозоидах нормальной морфологии. До настоящего времени в литературе имелось лишь одно сообщение о выявлении ДНК вируса простого герпеса в общей клеточной фракции сперматозоидов (Kapranos N. et al., 1998). Полученные данные крайне важны для современной репродуктологии.

Следует подчеркнуть, что полученные результаты, касающиеся выявления ДНК ВПГ в подвижных сперматозоидах, имеющих нормальную морфологию, позволяют высказать предположение о том, что имеется возможность участия инфицированных клеток в оплодотворении.

При ультраструктурном исследовании образцов эякулята с вирусинфицированными сперматозоидами показано, что капсиды вируса простого герпеса могут быть обнаружены в цитоплазме сперматозоидов нормальной морфологии. Выявляли только капсиды с электронно-прозрачной сердцевиной, то есть не содержащие ДНК. На основании морфологического сравнения с опубликованными микрофотографиями (Newcomb W. et al., 1999; Алиева С.А. и соавт., 2006) был сделан вывод, что в сперматозоидах вирус простого герпеса обнаруживается в виде прокапсидов. Капсиды вируса простого герпеса были обнаружены также в нуклеоплазме ядер, в перинуклеарном пространстве ядер сперматозоидов и в районе пор ядерной оболочки. Эти данные позволяют считать, что капсиды формируются в ядрах сперматозоидов.

Можно предположить, что отсутствие инкапсуляции ДНК может быть вызвано каким-либо фактором, присутствующим в сперматозоидах и мешающим синтезу белков, участвующих в инкапсуляции. Так, известен ингибитор репликации вируса простого герпеса, который in vitro мешает контакту между pre-VP22a (UL26.5) (каркасным белком) и порталом (зоной, через которую осуществляется инкапсуляция вирусной ДНК внутрь капсида). В присутствии этого ингибитора (WAY-150138) в инфицированной клетке или в реакционной смеси, формируются морфологически нормальные капсиды, в которых блокирована инкапсуляция ДНК и, соответственно, сборка вируса. (Newcomb W., Brown J., 2002; Newcomb W. et al., 2005).

С другой стороны, возможно, имеет место изменение самих вирусов, например, белка портала, белков, участвующих в интеграции портала в растущий капсид, или белков, участвующих в расщеплении транзитных каркасных белков вируса простого герпеса (Beard P., Baines J., 2004; Beard P. et al., 2004; Singer G. et al., 2005).

Показано, что капсиды выявляются не во всех образцах - при ультраструктурном анализе сперматозоидов у пациентов различных групп внутригаметные капсиды выявлены у большей части пациентов, в анамнезе жен которых отмечено спонтанное прерывание беременности. Капсиды обнаружены в 68% образцов эякулята пациентов этой группы, в которых вирусологическими методами выявлен вирус простого герпеса. При исследовании образцов эякулята пациентов, у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности, но вирус простого герпеса не обнаружен вирусологическими методами, капсиды вируса простого герпеса не были выявлены. Проводили также ультраструктурное исследование 14 образцов эякулята пациентов, у которых выявлены белки и/или инфекционная активность вируса простого герпеса, но в анамнезе жен отсутствовало прерывание беременности. Ни в одном из этих образцов не удалось обнаружить вирусные капсиды.

Другим аспектом проблемы герпетического инфицирования сперматозоидов является выяснение влияния инфицирования на фертильность мужчин.

При исследовании кариотипа с помощью гибридизации с хромосомоспецифичными ДНК-зондами, было показано, что степень анеуплоидии хромосом 1, X и Y в ядрах сперматозоидов эякулята пациентов с герпетическим инфицированием половых клеток не выше таковой у фертильных мужчин (Shi Q., Martin R., 2000). Эти данные свидетельствуют о том, что инфицирование по крайней мере, части сперматозоидов может происходить без выраженных генетических и морфологических повреждений (Shi Q., Martin R., 2000).

Количественный анализ состава незрелых половых клеток показал, что в эякуляте 24 пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами происходит статистически значимое, по сравнению с данными группы сравнения (доноры спермы), увеличение количества сперматоцитов на предпахитенных стадиях профазы I мейоза. Эти стадии характеризуются синтезом ДНК (в прелептотене) и материала для построения специфической структуры мейотических хромосом - синаптонемного комплекса (в лептотене), его формированием и конъюгацией гомологичных родительских хромосом в зиготене.

Изменение количественного состава незрелых половых клеток у пациентов с герпетическим инфицированием сперматозоидов, продемонстрированное в данной работе, свидетельствует о том, что на стадии сперматогенеза происходит селекция поврежденных при инфицировании клеток. В то же время не все инфицированные клетки подвергаются селекции, так как с помощью гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса обнаружена в подвижной фракции сперматозоидов нормальной морфологии.

Таким образом, можно считать доказанным существование внутриклеточного инфицирования сперматозоидов мужчин, не имеющих симптомов генитального герпеса, которые не обращаются по поводу генитального герпеса к клиницистам и не получают лечения. Это явление может иметь как эпидемиологическое значение (горизонтальная передача вируса простого герпеса при бессимтомном носительстве), так и играть роль в развитии аномалий беременности при вертикальной передаче вируса.

ВЫВОДЫ

1. Метод количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов может быть использован для установления характера патоспермии и для оценки функционального состояния сперматозоидов. Применение электронно-микроскопического исследования позволяет выяснить механизмы фертилизационной неэффективности сперматозоидов, дифференцировать генетически обусловленные и приобретенные формы патоспермии.

2. Описан новый тип синдромной патоспермии. Совокупность симптомов при данной патологии выражается в следующем: идиопатическое бесплодие при нормозооспермии у пациентов, тотальное нарушение строения центриолей сперматозоидов - разделение микротрубочек в центриолярных триплетах; тотальная остановка развития полученных с помощью ИКСИ эмбрионов на 2-3 сутки после оплодотворения.

3. Использование метода количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов позволило выделить две принципиально различные группы пациентов с астенозооспермией, различающихся по характеру нарушения ультраструктурных нарушений морфологии аксонемы жгутиков сперматозоидов: а) группа пациентов с тотальной аномалией морфологии аксонемы (пациенты с синдромом первичной цилиарной дискинезии), б) пациенты, у которых выявлены множественные, но не тотальные аномалии микротрубочек аксонемы, что может являться следствием действия экзогенных факторов.

4. Методом количественного электронно-микроскопического сперматозоидов показано, что в эякуляте 15 из 26 (58%) пациентов, у которых показатели спермиологического обследования соответствовали нормативным, и у жен которых в анамнезе имелось спонтанное прерывание беременности, выявлено повышенное содержание сперматозоидов с нарушенной конденсацией хроматина ядер сперматозоидов. В группе пациентов с первичным бесплодием и нормативными показателями спермиологического обследования нарушение конденсации хроматина ядер сперматозоидов выявлено у 10 из 27 пациентов (37%). Различия между этими группами статистически значимы (p=0,031). В группе из 10 пациентов с нормозооспермией, проходивших профилактическое обследование, не выявлено повышенного содержания сперматозоидов с аномальной конденсацией хроматина.

5. Методом количественного электронно-микроскопического исследования сперматозоидов показано, что в эякуляте 21 из 26 (81%) инфертильных пациентов, у которых показатели спермиологического обследования соответствовали нормативным, выявлено сниженное содержание сперматозоидов с морфологически нормальной акросомой. В группе из 10 пациентов с нормозооспермией, проходивших профилактическое обследование, не выявлено повышенного содержания сперматозоидов с морфологически аномальной акросомой.

6. Во фракции подвижных сперматозоидов нормальной морфологии из образцов эякулята 19 из 34 (56%) пациентов с нарушением фертильности обнаружена инфекционная активность вируса и с помощью реакции иммунофлюоресценции с использованием моноклональных антител к сверхранним (МКА 4а), ранним (МКА 3е5) и поздним (МКА 2С) белкам вируса простого герпеса выявлены белки вируса простого герпеса. В подвижной фракции сперматозоидов мужчин, проходивших профилактическое обследование, белки вируса простого герпеса не обнаружены.

7. Впервые методом гибридизации in situ ДНК вируса простого герпеса обнаружена во фракции подвижных сперматозоидах нормальной морфологии 7 из 11 пациентов, у которых белки вируса простого герпеса были обнаружены с помощью реакции иммунофлюоресценции. Методом гибридизации in situ установлено, что вирусная ДНК может присутствовать в сперматозоидах как при полном жизненном цикле вируса простого герпеса, так и при неполном жизненном цикле, то есть при абортивной форме инфекции. Наличие вирусной ДНК в подвижных сперматозоидах нормальной морфологии позволяет сделать заключение о возможности вертикальной передачи вируса.

8. Показано, что сперматозоиды с включениями, идентифицированными как капсиды вируса простого герпеса, обнаружены у 13 из 19 пациентов, у жен которых в анамнезе имеется спонтанное прерывание беременности. Капсиды вируса простого герпеса обнаруживались в цитоплазме, кариоплазме, перинуклеарном пространстве и в районе пор ядерной оболочки сперматозоидов. У пациентов, в анамнезе жен которых имеется спонтанное прерывание беременности, но вирус простого герпеса в сперматозоидах не был выявлен с помощью реакции иммунофлюоресценции и быстрого культурального метода, а также у пациентов, у которых вирус простого герпеса в сперматозоидах выявлен вирусологическими методами, но в анамнезе жен отсутствовали указания на прерывание беременности, капсиды вируса простого герпеса в сперматозоидах не обнаружены.

9. При количественном анализе состава незрелых половых клеток показано, что в эякуляте 24 пациентов с вирусинфицированными сперматозоидами выявляется статистически значимое по сравнению с контрольной группой увеличение количества сперматоцитов на предпахитенных стадиях профазы I мейоза: прелептотены, лептотены и зиготены, а также повышение содержания неидентифицируемых незрелых половых клеток. Выраженный цитопатический эффект и изменение количественного состава незрелых половых клеток, обусловленные наличием герпетического инфицирования, свидетельствуют о том, что действие вируса простого герпеса на сперматогенез осуществляется на уровне клеток сперматогенного эпителия.

10. Методом флюоресцентной гибридизации in situ с хромосомоспецифичными ДНК-зондами показано, что степень анеуплоидии хромосом 1, X и Y в ядрах сперматозоидов эякулята 17 пациентов с герпетическим инфицированием сперматозоидов не выше таковой в группе фертильных мужчин.

11. Таким образом, можно считать доказанным существование внутриклеточного инфицирования подвижных сперматозоидов нормальной морфологии в эякуляте мужчин, не имеющих симптомов генитального герпеса, которые не обращаются по поводу генитального герпеса к клиницистам и не получают лечения. Это явление может иметь как эпидемиологическое значение (горизонтальная передача вирус простого герпеса при бессимптомном носительстве), так и играть роль в развитии аномалий беременности.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е., Юров Ю.Б., Ворсанова С.Г., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В. Использование метода хромосомных зондов (FISH) для выявления генетических аномалий половых клеток при вирусном инфицировании сперматозоидов // «Генодиагностика инфекционных заболеваний». - Материалы 4-ой Всероссийской научно-практ. конф. - М., 2002. - С. 8.

Брагина Е.Е., Абдумаликов Р.А., Бочарова Е.Н., Кущ А.А, Гребенча С.В., Курило Л.Ф. Внутриклеточное инфицирование сперматозоидов человека вирусами группы герпеса //Андрология и генитальная хирургия. - 2002, № 3. - С. 81-82.

Курило Л.Ф., Дмитриев Г.А., Щетинин В.В., Брагина Е.Е., Бушманов А.Ю., Абдумаликов Р.А., Шилейко Л.В., Бочарова Е.Н., Юрасов С.В. Электронномикроскопическое исследование сперматозоидов как функциональный тест при диагностике мужского бесплодия // Методические рекомендации. - М., 2003. - 23 с.

Курило Л.Ф., Масюкова С.А., Щетинин В.В., Брагина Е.Е., Бушманов А.Ю., Гладько В.В., Абдумаликов Р.А., Бармина Г.В., Бочарова Е.Н., Зудин А.Б., Бочарова Е.Н., Шилейко Л.В., Алиева С.Н., Юрасов С.В. Диагностика урогенитального герпеса с помощью реакции иммунофлюоресценции. Выявление сперматозоидов, инфицированных вирусом простого герпеса // Методические рекомендации. - М., 2003. - 19 с.

Бочарова Е.Н., Абдумаликов Р.А., Брагина Е.Е., Климова Р.Р., Адуева С.М., Меджидова М.Г., Курило Л.Ф., Кущ А.А. Обнаружение белков и капсидов вируса простого герпеса в сперматозоидах человека // Доклады академии наук. - 2003. - Т. 391, № 6. - С. 836-841.

Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е., Климова Р.Р., Адуева С.М., Меджидова М.Г., Курило Л.Ф., Кущ А.А. Выявление вируса простого герпеса в эякуляте у мужчин, не имеющих клинических симптомов урогенитального герпеса // Материалы Первого Российского конгресса дерматовенерологов (23-26 сентября 2003 г.). - С-Пб., 2003. - С. 152.

Брагина Е..Е., Бочарова Е.Н., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Юров Ю.Б., Ворсанова С.Г.Использование FISH метода в генетическом консультировании для выявления анеуплоидий хромосом при вирусном инфицировании сперматозоидов // Материалы Второго конгресса «Современные технологии в педиатрии и детской хирургии» (15-17 октября 2003 г.). - М., 2003. - С. 136.

Брагина Е..Е., Курило Л.Ф., Абдумаликов Р..А., Бочарова Е.Н., Михайлова Е.М., Гришина Е.М., Шилейко Л.В., Сорокина Т.М. Множественные дефекты ультраструктурной организации жгутика сперматозоида у пациента с абсолютной астенозооспермией // Проблемы репродукции. - 2004. - Т. 10, № 1. - С. 66-69.

Бочарова Е.Н., Климова Р.Р., Завалишина Л.Э., Петров А.Н., Брагина Е.Е., Кущ А.А. Выявление ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах человека методом гибридизации in situ // Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - ХХI век». Саратов, (28-30 сентября). - Саратов, 2004. - С. 44-45.

Брагина Е.Е., Бочарова Е.Н., Климова Р.Р., Завалишина Л.Э., Ашапкин В.В., Петров А.Н., Кущ А.А. Выявление ДНК вируса простого герпеса в сперматозоидах человека методом гибридизации in situ // Материалы I Международной конф. «Молекулярная медицина и биобезопасность» (26-28 октября 2004г.). - М., 2004. - С. 35-36.

Брагина Е.Е., Шилейко Л.Ф., Курило Л.Ф., Гусак Ю.К., Кущ А.А., Бочарова Е.Н. Количественное электронно-микроскопическое исследование сперматозоидов и его прогностическое значение при нарушениях фертильности мужчин // Материалы 3-го Российского научного форума «Мужское здоровье и долголетие» (16-18 февраля 2005г.). - М., 2005. - С. 38.

Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е., Гусак Ю.К., Зыкова М.С., Лихаев Д.Н., Зотов В.В., Терещенко А.Б., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф., Климова Р.Р., Кущ А.А. Спонтанное прерывание беременности, неудачи при использовании репродуктивных технологий и герпетическое инфицирование сперматозоидов // Андрология и генитальная хирургия. - 2006. - № 1. - С. 59-65.

Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е., Гусак Ю.К., Зыкова М.С., Лихаев Д.Н., Шилейко Л.В., Курило Л.Ф., Климова Р.Р., Кущ А.А. Спонтанное прерывание беременности, неудачи при использовании репродуктивных технологий и герпетическое инфицирование сперматозоидов // Материалы 4-го Российского научного форума «Мужское здоровье и долголетие» (15-17 февраля 2006г). - М., 2006. - С. 22.

Абдумаликов Р.А. Бочарова Е.Н. Антигерпетическая терапия субклинических форм генитального герпеса с использованием пептидных биорегуляторов // Натуротерапия и гомеопатия. - 2006. - № 2 (9). - С. 16-20.

Абдумаликов Р.А., Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е. Антигерпетическая терапия пептидными биорегуляторами у лиц с герпетическим инфицированием сперматозоидов // Натуротерапия и гомеопатия. - 2006. - № 2 (9). - С. 34-37.

Кущ А.А., Климова Р.Р., Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е., Зыкова М.С., Лихаев Д.Н., Абдулмеджидова А.Г., Курило Л.Ф., Хилькевич Л.В., Скорова Н.Е. Инфицирование сперматозоидов вирусом простого герпеса при идиопатическом бесплодии в браке // Материалы международной конференции по андрологии (24-26 мая 2006г., Дагомыс) / Андрология и генитальная хирургия. - 2006. - С. 32.

Бочарова Е.Н. Вирусное инфицирование сперматозоидов //Проблемы репродукции. - 2006. - Т. 12, № 5. - С. 75-79.

Алиева П.М., Алиева С.А., Масюкова С.А., Бочарова Е.Н., Брагина Е.Е. Выявление вирионов вируса простого герпеса в эпителии шейки матки пациенток, страдающих генитальным герпесом, в межрецидивный период //Клиническая дерматология и венерология. - 2006. - № 4. - С. 23-27.

Бочарова Е.Н., Шилейко Л.В., Брагина Е.Е., Климова Р.Р., Кущ А.А., Курило Л.Ф.Нарушение сперматогенеза человека: количественное исследование состава незрелых половых клеток при инфицировании сперматозоидов вирусом простого герпеса // Проблемы репродукции. - 2006. - Т. 12, № 6. - С. 75-80.

Бочарова Е.Н. Завалишина Л.Э., Брагина Е.Е., Климова Р.Р., Гусак Ю.К., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Петров А.Н., Франк Г.А., Кущ А.А. Выявление геномной ДНК вируса простого герпеса методом гибридизации in situ в сперматозоидах человека при нарушении фертильности // Доклады академии наук. - 2007. - Т. 412, № 3. - С.417-421.

Бочарова Е.Н., Завалишина Л.Э., Брагина Е.Е., Климова Р.Р., Гусак Ю.К., Курило Л.Ф., Шилейко Л.В., Петров А.Н., Франк Г.А., Кущ А.А. Выявление геномной ДНК вируса простого герпеса методом гибридизации in situ в сперматозоидах человека при бесплодии // Материалы 4-го Российского научного форума «Мужское здоровье и долголетие» (20-22 февраля 2007г). - М., 2007. - С. 28-29.

Bocharova E.N. Herpesvirus infection of male gametes // International scientific-practical interdisciplinary workshop “New Technology in Medicine and Experimental Biology” (26 February-08 March, 2007). - Pattaya-Bangkok, Thailand, 2007. - P. 16.