Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Патогенетические факторы бесплодия в браке как критерии прогноза эффективности вспомогательных репродуктивных технологий

14.00.16 - патологическая физиология

14.00.01 - акушерство и гинекология

Айзикович Б.И.

Омск - 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО Новосибирский государственный университет и ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН

Научный консультант: доктор медицинских наук, академик РАМН,

профессор Козлов Владимир Александрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Долгих Владимир Терентьевич

Омская государственная медицинская академия

доктор медицинских наук, профессор Антонов Александр Рудольфович

Новосибирский государственный медицинский университет

доктор медицинских наук, профессор Назаренко Татьяна Алексеевна,

ФГУ Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им.В.И.Кулакова

Ведущая организация: ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава ( г.Томск)

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема бесплодия супружеских пар приобретает сегодня не только медицинское, но и огромное социально-демографическое и экономическое значение (Заславская В.С., 2001; Подзолкова Н.М., 2003; Кулаков В.И., 2006). По данным ВОЗ около 100 млн. супружеских пар бесплодны и их число с каждым годом увеличивается. Частота бесплодных браков среди супругов репродуктивного возраста колеблется от 12 до 30,0% (Овсянникова Т.В., 1998; Филиппов О.С., 1999; Tempelton A.А., 1999). Причиной бесплодного брака в 40-50% случаях является патология репродуктивной системы у одного из супругов, реже - в 25-30,0% у обоих (Селезнева И.Ю., 1999; Фролова О.Г., 2004). Поэтому значимость проблемы инфертильности определяется необходимостью решения вопросов, связанных с совершенствованием методов диагностики, повышением эффективности лечения и профилактики бесплодия.

Современная диагностическая и лечебная помощь при бесплодии основывается на основополагающих достижениях в области репродукции, к которым относятся расшифровка механизмов гормональной регуляции репродуктивного процесса (Сидорова И.С., 2004; Серов В.Н., 2005), ультрасонографическое сканирование (Хачкурузов С.Г., 1999; Смирнова А.А., 2003), эндоскопическая хирургия (Гаспаров А.С., 2001), а так же экстракорпоральное оплодотворение (ЭКО ) и перенос эмбриона (Кулаков В.И., 1999; Edwards R.G., 1995). В результате этого открылись новые перспективы при изучении механизмов оплодотворения и имплантации. Тем не менее, в 8-10% случаев установить причину бесплодия не представляется возможным (Курило Л.Ф., 2000; Савельева, Г.М., 2004), что связано с огромным числом разнообразных факторов, влияющих на репродуктивный процесс (Кулаков В.И., 2006). Так обстоит дело, с заболеваниями, передающимися половым путем, при которых инфекционный агент определяется у обоих половых партнеров. Подобные проблемы значительно быстрее могут быть решены в программах вспомогательной репродукции (ВРТ), когда оценке подвергаются именно те гаметы, которые в данный момент участвуют в процессе оплодотворения и есть возможность оценить состоятельность ранних этапов дробления зиготы и отсеять неполноценные гаметы и порочные эмбрионы. Однако и в этом случае эффективность оценки результатов определяется разрешающей способностью методов оценки качества гамет, включаемых в программу оплодотворения, точно так же, как и состояния образующейся зиготы (Светлаков А.В. и др., 2002; Тишкевич О.Л. и др., 2004).

Известно, что функционирование репродуктивной системы как у мужчин, так и женщин осуществляется при тесном взаимодействии с иммунной и эндокринной системами (Древаль А.В., 2001). Но при этом роль иммунной регуляции ряда этапов репродуктивного процесса (сперматогенеза, фолликулогенеза, овуляции, имплантации) у человека остаются еще мало изученной. На сегодняшний день наиболее исследованными являются иммунологические аспекты, связанные физиологическим протеканием беременности и включающие изучение механизмов иммунологической перестройки, направленной на подавление реактивности иммунной системы матери по отношению к аллоантигенам плода. Вместе с вопросы участия иммунной системы в регуляции ранних этапов репродуктивного процесса - фолликулогенеза, овуляции, доимплантационных этапов развития эмбриона и его имплантации требуют своего дальнейшего изучения (Buculmez O., Arici A., 2000; Szekeres-Bartho J., 2002). Учитывая тесную взаимосвязь иммунной и репродуктивной системы, становится очевидным, что наличие исходных иммунных дисфункций, а также развитие их в процессе стимуляции гиперовуляции может быть серьезной причиной низкого качества ооцитов, дефекта оплодотворения яйцеклетки, нарушения развития и имплантации эмбриона, и, в конечном итоге, невынашивания беременности (Speroff L. et al., 1999). Поэтому большой интерес представляет исследование показателей системного и локального иммунитета, а также овариальной функции в группах женщин, оппозитных по уровню фертильности, качеству эмбрионов, имплантации и клинической беременности. Исследования такого рода имеют большое теоретическое и практическое значение, поскольку позволяют осмыслить новые аспекты иммуноэндокринной регуляции ранних этапов репродуктивного процесса и патогенеза бесплодия, а, также разработать прогностические критерии эффективности использования вспомогательных репродуктивных технологий.

Цель исследования: выявить иммунологические и эндокринные особенности нарушения фертильной функции у мужчин и женщин, состоящих длительное время в бесплодном браке, и провести анализ значимости изменений иммунного и цитокинового статуса как критериев эффективности программы вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО).

Задачи исследования:

1. Исследовать особенности гормонального статуса и состояния микробиоценоза урогенитального тракта у мужчин и женщин из бесплодных супружеских пар, включенных в программу вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО).

2. Провести спермиологическое исследование с оценкой количества сперматозоидов, их двигательной способности и морфологических особенностей у мужчин, состоящих длительное время в бесплодном браке.

3. Изучить содержание цитокинов в спермальной плазме при нормоспермии и патоспермии у мужчин, состоявших длительное время в бесплодном браке и провести сравнительную оценку изменения характера цитокинового баланса в зависимости от степени лейкоцитоспермии.

4. Выявить закономерности взаимоотношений между морфологическими, функциональными характеристиками сперматозоидов и цитокинами спермальной плазмы у мужчин, состоявших длительное время в бесплодном браке.

5. Изучить особенности иммунного статуса женщин на этапах овариального цикла при его физиологическом течении и в условиях проведения контролируемой гиперстимуляции по программе вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО).

6. Провести анализ содержания цитокинов в фолликулярной жидкости на пике стимулированной суперовуляции и на этой основе оценить роль цитокинов в процессе созревания ооцитов.

7. Провести сравнительный анализ параметров иммунного и цитокинового статуса женщин в зависимости от эффективности вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО) и проанализировать информативность и прогностическую значимость показателей иммунитета и овариальной функции в оценке эффективности лечения бесплодия с помощью вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО).

Научная новизна. Показано, что важным патогенетическим звеном нарушения фертильной функции у мужчин и женщин, состоявших длительное время в бесплодном браке, является нарушение иммунных цитокин-опосредованных и клеточно-опосредованных механизмов регуляции репродуктивного процесса.

Впервые обнаружено, что нарушение локальной продукции цитокинов у мужчин из супружеских пар с бесплодием может негативно сказываться на подвижности и морфологии сперматозоидов и, как следствие, приводить к снижению их фертилизационного потенциала в условиях латентного воспалительного процесса в мужском репродуктивном тракте и эндокринной дисрегуляции сперматогенеза. Установлено, что при патоспермии в семенной плазме мужчин наблюдается повышенный уровень Th1/провоспалительных цитокинов (IFN-г, TNF-б, IL-1в, IL-12) в сочетании с ростом хемокинов (IL-8, MCP-1, MIP-1в) и дефицитом IL-7.

Впервые показано, что в патогенезе бесплодия имеет значение системный эндокринно-иммунный дисбаланс.

Впервые установлено, что на пике стимулированной суперовуляции происходит изменение баланса регуляторных факторов в сторону доминирования медиаторов с иммуносупрессорной, противовоспалительной и проапоптогенной активностью. Сдвиг баланса регистрируется как на системном (в крови), так и на местном (в фолликулярной жидкости) уровне и сочетается с увеличением доли циркулирующих регуляторных CD4+CD25+ Т-лимфоцитов, что свидетельствуют о супрессорной реорганизации цитокин-опосредованных и клеточно-опосредованных иммунорегуляторных механизмов фолликулогенеза.

Впервые дана характеристика цитокинового профиля микроокружения фолликула у женщин с бесплодием при проведении контролируемой суперстимуляции яичников по программе вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО). Установлено, что усиление противовоспалительного и иммуносупрессорного потенциала фолликулярных факторов ассоциируется со снижением уровня IL-8 и IFN-г, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, G-CSF цитокинов.

Впервые показано, что у женщин с бесплодием в условиях фолликулярного многокомпонентного дефицита Th1/провоспалительных, Th2/противоспалительных цитокинов, ростовых факторов и хемокинов нарушаются как количественные, так и качественные характеристики ооцитов, и как следствие - эффективность оплодотворения в культуре in vitro при проведении вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО). Баланс и уровень цитокинов в микроокружении фолликула не только определяет количество и качество созревающих ооцитов, но также имеют большое значение для имплантации оплодотворенных яйцеклеток.

Теоретическая и практическая значимость. В результате выполнения работы получены новые данные, позволяющие расширить существующие научные представления о роли иммунного и цитокинового статуса в регуляции фертильной функции мужчин и женщин, а также раскрыть иммуннопатологические механизмы формирования бесплодного брака.

Комплексное исследование цитокинового спектра семенной и фолликулярной жидкости могут позволить выявить минимальные, «неочевидные» нарушения, которые в изолированном виде не являются определяющими для развития мужского или женского бесплодия, но становятся патогенетически значимыми, когда одновременно присутствуют у супругов, состоящих в бесплодном браке.

Комплексная оценка параметров иммунного и цитокинового статуса у женщин с бесплодием, обследованных на пике стимулированной суперовуляции, может использоваться в качестве ранних прогностических маркеров эффективности программы вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО).

Разработана методологическая основа для выделения диагностического комплекса признаков, прогнозирующего вероятность неэффективного цикла программы вспомогательных репродуктивных технологий (ЭКО), что может послужить дополнительной основой для изменения тактики лечения бесплодия.

Внедрение результатов исследования. Результаты исследований внедрены в практику работы отделения экстракорпорального оплодотворения Медицинского Центра «Авиценна», г. Новосибирск, а также в учебный процесс Новосибирского государственного медицинского университета Росздрава.

Положения, выносимые на защиту:

1. Наиболее типичными особенностями патогенеза бесплодных пар являются наличие системного эндокринно-иммунного дисбаланса, а также нарушение микробиоциноза урогенитального тракта

2. В патогенезе нарушения сперматогенеза у мужчин из супружеских пар с бесплодием ведущая роль принадлежит изменению цитокинового баланса, что проявляется в увеличении содержания Th1/провоспалительных, цитокинов, хемокинов и снижением уровня Th2/противоспалительных цитокинов в семенной плазме

3. В овуляторный период менструального цикла на пике контролируемой суперовуляции по программе экстракорпорально оплодотворения у женщин с бесплодием происходит сдвиг баланса регуляторных факторов на системном и местном уровнях, что проявляется усилением иммуносупрессорной и противовоспалительной активности крови и фолликулярной жидкости и фолликулярной жидкости.

4. Цитокины, продуцируемые в микроокружении фолликула, принимают активное участие в регуляции процесса созревания ооцитов, определяя не только количественные и качественные характеристики созревающих ооцитов, но также эффективность последующей имплантации оплодотворенных яйцеклеток и развитие беременности у женщин с бесплодием в цикле экстракорпорально оплодотворения.

5. Параметры иммунного и цитокинового статуса, а также показатели овариальной функции женщин, обследованных на этапе стимулированной суперовуляции, могут являться прогностическими критериями результативности экстракорпорального оплодотворения

Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на 6-й отчетной сессии Института Клинической иммунологии СО РАМН (Новосибирск, 2003); Всероссийском научном симпозиуме с международным участием «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет» (Новосибирск, 2005); Российской научно-практической конференции «Новые технологии в репродуктивной медицине» (Новосибирск, 2007); XVII международной конференции РАРЧ «Репродуктивные технологии сегодня и завтра» (Казань, 2007); Симпозиуме «Некоторые аспекты сексуальной дисфункции. Репродуктивная функция больного туберкулезом» (Новосибирск, 2007); Международной научно-практической конференции «Иммунологические аспекты репродукции человека» (Новосибирск, 2008); VII Межрегиональной научно-практической конференции урологов Сибири «Современные вопросы урологии, оперативной нефрологии, андрологии и репродуктивной медицины» (Новосибирск, 2008); Объединенном иммунологическом Форуме (Санкт-Петербург, 2008), Международном конгрессе «Репродуктивное здоровье Урала и Сибири» (Екатеринбург, 2008).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 23 печатные работы, из которых 9 статей в научных журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов диссертационных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на ____ страницах печатного текста и состоит из введения, обзора литературы, глав «Материалы и методы исследования», «Результаты собственных исследований», «Обсуждение собственных результатов», выводов, практических рекомендаций и списка цитируемой литературы. Список литературы включает 506 источников, из них 139 отечественных и 367 иностранных. Диссертация иллюстрирована 46 таблицами и 9 рисунками.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В настоящей работе представлены данные обследования 250 мужчин и женщин в возрасте от 24 до 46 лет (35,1 4,3), состоящих в бесплодном браке. Продолжительность бесплодия в браке варьировала от 2 до 16 лет (6,5 2,1 лет). В этиопатогенетической структуре бесплодия женский фактор обнаруживался в 30% случаев, мужской - в 10% случаев, тогда как у большинства супружеских пар (60%) диагностировались комбинации сочетанных нарушений репродуктивной функции.

До начала цикла ВРТ (ЭКО) проводилось развернутое обследование партнеров: сбор соматического, акушерско-гинекологического и андрологического анамнеза, УЗИ- исследование, клинико-лабораторные и биохимические исследования.

В случае выявления какой-либо сопутствующей патологии, в первую очередь урогенитальной инфекции, назначалась соответствующая терапия, которая проводилась в объеме, необходимом для достижения санирующего эффекта.

Все исследования выполнялись в соответствии с Хельсинской декларацией Всемирной ассоциации «Этические принципы научных и медицинских исследований с участием человека» с поправками 2000 года и «Правилами клинической практики в Российской Федерации», утвержденными Приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 г., № 266. Все обследованные лица давали информированное согласие на участии в исследовании.

Лечебные мероприятия проводились в соответствии с нормативными документами, утвержденными Министерством здравоохранения РФ (приказ Министерства здравоохранения и медицинской промышленности Российской Федерации от 28.12.1993 № 301 «О применении метода искусственной инсеминации женщин спермой донора по медицинским показаниям и метода экстракорпорального оплодотворения и переноса эмбриона в полость матки для лечения женского бесплодия»; приказ Минздрава РФ от 26.02.2003 «О применении вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в терапии женского и мужского бесплодия».

Контрольная группа (n=76) была составлена из практически здоровых мужчин и женщин аналогичного возраста, состоящих длительное время в браке и имеющих здоровых детей.

Для анализа содержания гормонов (тестостерона, лютинизирующего гормона (ЛГ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), пролактина и эстрадиола) в сыворотке крови использовался метод иммуноферментного анализа. Применялись тест-системы ИФА «Bio-Rad Lipocheck». Регистрацию результатов проводили на спектрофотометре Multiskan (MCC-340).

Оценка состояния микробиоценоза урогенитального тракта осуществлялась по результатам культурального исследования микрофлоры и ПЦР-диагностики.

Спермиологическое исследование проводилось в соответствии с рекомендациями ВОЗ (1999).

Иммунологическое исследование включало: культивирование лимфоцитов в планшетах для иммунологических исследований со стимуляцией КонА; определение субпопуляций клеток на лазерном клеточном сортере-анализаторе FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием программы CellQuest (Becton Dickinson, США) в соответствии с методикой Becton Dickinson, в модификации Кожевникова (2005); оценку содержания апоптотических клеток (лимфоцитов, моноцитов и нейтрофилов) с помощью метода проточной цитофлуориметрии по окрашиванию пропидиумом иодидом (Ayala A. et al., 1996); оценку содержания в фолликулярной жидкости и семенной плазме цитокинов (IL-1в, TNF-б, IFN-г, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, МСР-1, MIP-1в) методом проточной флюориметрии на 2-х лучевом лазерном автоматизированном анализаторе Bio-Plex Protein Assay System (Bio-Rad, США) с использованием тест-систем 17-Plex.

Иммунологические исследования, осуществлялось совместно с сотрудниками лаборатории клеточной иммунотерапии ГУ НИИ клинической иммунологии СО РАМН, г. Новосибирск (руководитель лаборатории доктор медицинских наук, профессор Черных Е.Р.).

Математическая обработка полученных результатов проводилась методами описательной, параметрической и непараметрической статистики (Гланц С., 1999) на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 5.0». Таблицы и рисунки содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и стандартных ошибок средних (m), медианных значений. Сравнение вариационых рядов осуществлялось с помощью непараметрического U критерия Вилкоксона-Манна-Уитни. Достоверность различия частоты встречаемости признака определяли, используя точный метод Фишера или кси-квадрата (ч2). Достоверными считались результаты при уровне значимости р < 0,05. Корреляционный анализ проводился методом ранговой корреляции Спирмана.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В зависимости от поставленных задач исследования выполнялась в несколько этапов. На первом этапе проводилось изучение клинико-лабораторных параметров у супружеских пар, включенных в программу лечения бесплодия с помощью ВРТ (ЭКО).

При оценке функционального состояния репродуктивной системы у мужчин было обнаружено, что только у 30% обследованных показатели числа, морфологии и подвижности сперматозоидов соответствовали установленным нормативным значениям (ВОЗ, 1999), тогда как в 70% случаев обнаруживались различные нарушения сперматогенеза (Табл. 1).

Таблица 1

Показатели спермограммы у пациентов с нормо- и патоспермией (M±m)

Показатели	Нормоспермия	Патоспермия
Объем, мл	4,5 ± 0,2	4,1 ± 0,3
Концентрация сперматозоидов, млн/мл	128 ± 19	88 ± 9,5
Подвижность сперматозоидов, %	нормокинетические	55 ± 3,0	37 ± 2,0 **
	гипо / дискенетические	21 ± 4,0	17 ± 1,5
	акинетические	23 ± 3,0	45 ± 2,0**
Морфологически полноценные формы, %	15,2 ± 0,7	10,9 ± 0,7*
Дегенеративные формы, %	патология головки	65 ± 2,5	63,5 ± 1,9
	патология шейки	9,6 ± 1,4	13,3 ± 1,5
	патология хвостика	9,7 ± 1,2	11,5 ± 1,0
Количество сперматозоидов, прошедших через градиент плотности, %	57 ± 7,8	35 ± 6,0 *

Примечание: * - p<0,05 и ** -p < 0,01 по сравнению с контролем

Так, анализ подвижности сперматозоидов обнаружил значимое снижение нормокинетических и увеличение акинетических форм половых клеток в эякуляте у мужчин с патоспермией по сравнению с аналогичными параметрами в группе мужчин с нормоспермией. Кроме этого у них было снижение количества морфологически нормальных клеток эякулята и количества сперматозоидов прошедших через градиент плотности.

Проведенная оценка фертилизационного потенциала сперматозоидов по числу оплодотворенных in vitro ооцитов показала, что в экстракорпоральном режиме все исследуемые образцы спермы мужчин, включенных в программу ВРТ (ЭКО) были способны к оплодотворению. Тем не менее, у мужчин с патоспермией фертилизационная активность сперматозоидов была достоверно ниже, т.к. индекс оплодотворения составил 60% против 87%.

Среди широкого спектра патогенетических причин нарушения структурной целостности и функциональной активности половых гамет ведущее значение отводится гормональным и инфекционным факторам.

При обобщении результатов оценки гормонального статуса (Табл. 2) было выяснено, что уровень гипофизарных гормонов (ЛГ, ФСГ) у мужчин групп контроля и ВРТ не различался, и находился в пределах нормы. Но в тоже время, у пациентов группы ВРТ отмечено достоверное (p < 0,05) повышение уровня пролактина в крови (299 ± 15,5 мМЕ/л) относительно пациентов контрольной группы (219 ± 12,7 мМЕ/л). При этом высокая величина уровня гормона выявлена у 4,5% пациентов с нормоспермией и у 16% пациентов с патоспермией группы ВРТ.

Таблица 2

Концентрация гормонов в сыворотке крови у практически здоровых мужчин (контроль) и пациентов программы ВРТ (M± m).

Показатели	Контроль	Пациенты
ЛГ, МЕ/л	5,2 ± 0,47	6,1 ± 1,1
ФСГ, МЕ/л	3,7 ± 0,85	4,5 ± 0,96
Пролактин, мМЕ/л	219 ± 12,7	299 ± 15,5*
Тестостерон, нмоль/л	18,8 ± 0,55	14,9 ± 0,75*
Эстрадиол, пмоль/л	23,1 ± 1,19	37,2 ± 0,74*

Примечание: * - p<0,05 и ** -p < 0,01 по сравнению с контролем

Известно, что уровень пролактина четко коррелирует с состоянием гипоталамуса и аденогипофиза (Гладкова А.И., 1998). Учитывая отсутствие признаков патологии гипоталамуса и аденогипофиза у пациентов можно предположить, что повышение концентрации пролактина является возможным проявлением хронического стресса, и его относительно высокий уровень может отражать снижение содержания тестостерона в крови обследуемых лиц.

Действительно, при оценке концентрации тестостерона в крови было обнаружено его уменьшение у мужчин из группы ВРТ по сравнению с лицами из группы контроля (соответственно 14,9 ± 0,75 нмоль/л и 18,8 ± 0,55 нмоль/л, p < 0,05). Причем среди пациентов с патоспермией имеется значительная доля лиц с низкой продукцией тестостерона (61,5%) и с отклонениями в продукции гонадотропинов (39,5%). Однако, отсутствие клинических признаков гипогонадизма у пациентов программы ВРТ, указывает на то, что андрогенная недостаточность у них, по всей вероятности, носит относительный характер на фоне, как правило, сохраненной гонадотропной функции.

При микробиологическом анализе видового состава микрофлоры картина нормоценоза уретры наблюдалась только у 34,4% пациентов, а секрета предстательной железы - лишь у 50,9%, тогда как в группе здоровых лиц эти показатели составили 77,8% и 88,9% соответственно. Данные бактериологического исследования согласуются с результатами клинического обследования пациентов - у 41,5% мужчин с нормоспермией и у 54,5% с патоспермией имеются хронические воспалительные заболевания мочеполовой системы.

Таким образом, анализ состояния репродуктивной системы у мужчин, включенных в программу ВРТ, продемонстрировал отсутствие физиологической нормы в их репродуктивном статусе.

Аналогичные исследования у женщин также выявили целый ряд отклонений (Табл. 2). Так, уровни пролактина в крови у пациенток с бесплодием в фолликулиновую и лютеиновую фазу цикла был достоверно выше по сравнению с параметрами фертильных женщин, хотя и находились в пределах нормы (до 500 МЕ/л). У 32,8% женщин, включенных в программу ВРТ, отмечаются эндокринные нарушения преимущественно в виде гиперпролактинемии.

Анализ гормональной функции яичников показал, что имеются определенные различия в функциональном состоянии репродуктивной системы пациенток и практически здоровых женщин, которые выражаются в достоверном (p < 0,05) снижении концентрации эстрадиола в 1,5 раза в периовуляторный период ( 475,0 ±7,6 пмоль/л и 710,2 ±10,5 пмоль/л) и в уменьшении продукции прогестерона в лютеиновую фазу цикла (11,9 ± 0,8 нмоль/л и 35,1 ± 1,2 нмоль/л).

Таблица 3

Концентрация гормонов в сыворотке крови у практически здоровых женщин (контроль) и пациенток программы ВРТ (ЭКО) в различные фазы менструального цикла (M ± m).

Гормоны	Фаза менструального цикла
	Фолликулярная	Периовуляторный период	Лютеиновая
	Контроль	Пациентки	Контроль	Пациентки	Контроль	Пациентки
ЛГ, МЕ/л	5,8 ± 1,1	6,6 ± 1,5	25,9 ± 2,5	18,5 ± 3,0	5,5 ± 1,0	4,9 ± 1,0
ФСГ, МЕ/л	4,6 ± 0,9	4,4 ± 0,9	7,7 ± 1,3	6,5 ± 1,3	3,1 ± 0,5	2,4 ± 0,4
Пролактин, мМЕ/л	240 ± 7,0	420 ± 4,5*	300,3 ± 7,4	425,5 ± 3,6*	275,1 ± 6,4	465 ± 5,5*
Эстрадиол, пмоль/л	270,5 ± 4,5	260 ± 5,5	710,2 ±10,5	475 ±7,6*	520,1 ±5,6	485,5 ± 8,4
Прогестерон, нмоль/л	1,7 ± 0,7	1,1 ± 0,3	2,85 ± 0,6	3,2 ± 0,55	35,1 ± 1,2	11,9 ± 0,8*

Примечание: * - p<0,05 и ** -p < 0,01 по сравнению с контролем

Все это является указанием на меньшую стероидогенную активность яичников у пациенток ЭКО. Но следует отметить, что ритм секреции прогестерона в течение менструального цикла у обследованных пациенток сходен с таковым у фертильных женщин, что указывает на полноценную функцию желтого тела. Вместе с тем можно думать, что более низкая концентрация прогестерона у женщин с бесплодием отражает, видимо, нарушение того оптимального баланса стероидных гормонов, который обеспечивает готовность репродуктивной системы к реализации генеративной функции.

При оценке результатов бактериологического исследования из С-канала у женщин группы ВРТ условно-патогенные микроорганизмы (Escherichia coli, Staphylococcus, Streptococcus, Candida albicans и т.д.) обнаружены в 87,3% случаев. При анализе частоты встречаемости ИППП, отмечено, что они выявлены у 3,5% женщин, включенных в программу ВРТ.

Таким образом, предварительные клинико-лабораторные исследования в супружеских парах свидетельствуют о более глубоком, чем это принято считать, нарушении репродуктивной функции и мужчин, и женщин, включенных в программу ВРТ. При этом основными патогенетическими звеньями нарушения репродуктивной функции у представителей супружеских пар являются нарушения нейроэндокринной регуляции и микробиоценоза мочеполовой системы.

Однако в последнее время ведущая роль в патогенезе как мужского, так и женского бесплодия отводится нарушениям, возникающим в организме со стороны иммунной системы. Иммунорегуляция процессов гаметогенеза, оплодотворения и беременности играет важную роль при репродукции человека.

Поэтому следующий этап работы был посвящен изучению состояния системы иммунитета у мужчин и женщин, состоящих длительное время в бесплодном браке (Табл. 4). Так, сравнительный анализ цитокинового профиля СП у пациентов с нормоспермией и патоспермией показал, что снижение качества эякулята (подвижности, морфологии сперматозоидов) ассоциируется с умеренным, но статистически достоверным увеличением концентрации Th1/провоспалительных цитокинов (IFN-г, TNF-б, IL-1в, IL-12). Отмечается также отчетливая тенденция повышения уровня хемокинов (IL-8, MCP-1), которая в отношении MIP-1в была наиболее выраженной. Среди ростовых факторов регистрировалось снижение концентрации IL-7 в 1,5 раз на фоне сохранного уровня GM-CSF и умеренно повышенного содержания G-CSF.

Таблица 4

Уровень цитокинов семенной плазмы у мужчин с нормо- и патоспермией (M± m)

Группы	Цитокины	Нормоспермия	Патоспермия
Th1	IFN-г	7,0 ± 1,2	13,1 ± 2,2 *
	IL-2	9,6 ± 1,1	13,0 ± 1,1
Th2	IL-4	9,0 ± 0,9	11,3 ± 0,5
	IL-5	19,5 ± 6,0	23,0 ± 7,6
	IL-6	31,0 ± 13,0	49,6 ± 19,5
	IL-10	11,2 ± 1,7	16,0 ± 2,3
	IL-13	2,2 ± 0,2	2,8 ± 0,2
Про- воспалительные	IL-1в	8,5 ± 0,9	20,8 ± 4,6 *
	TNF-б	8,6 ± 0,9	13,5 ± 1,9 *
	IL-12 (p70)	10 ± 1,1	12,7 ± 0,4*
	IL-17	1,8 ± 0,1	2,2 ± 0,3
Факторы роста	IL-7	487,0 ± 55,0	336,0 ± 52,0*
	G-CSF	164,0 ± 16,0	211,0 ± 13,0*
	GM-CSF	42,2 ± 2,7	49,0 ± 3,6
Хемокины	IL-8	114,0 ± 18,0	271,0 ± 16,6*
	MIP-1в	73,0 ± 18,0	339,0 ± 12,2 **
	MCP-1	271,0 ± 33,0	452,0 ± 40,0*

Примечание: * - p<0,05 и ** -p < 0,01 по сравнению с нормоспермией

Можно предположить, что цитокиновый профиль СП при патоспермии у мужчин, состояших в бесплодном браке, характеризуется повышенным содержанием Th1/провоспалительных цитокинов в сочетании с увеличением уровня хемокинов и дефицитом ростовых факторов, что может негативно сказываться на подвижности и морфологии сперматозоидов и, как следствие, приводить к снижению их фертилизационного потенциала.

Более наглядно взаимосвязь морфологических нарушений сперматогенеза с уровнем цитокинов СП просматривалась при проведении корреляционного анализа, который показал наличие значимой (p<0,05) положительной связи между частотой встречаемости морфологически аномальных сперматозоидов с уровнем IL-1в (r= +0,55), MIP-1в (r= +0,53), G-CSF (r= +0,70) и отрицательной с содержанием IL-5 (r= -0,57), IL-10 (r= -0,82) в СП. При этом необходимо отметить, что частота встречаемости при патоспермии различных форм морфологически аномальных сперматозоидов составляет от 11,5 до 63,5% случаев. Полученные результаты можно трактовать как подтверждение значимости локальных изменений цитокинового статуса в патогенезе инфертильности мужчин, состоящих длительное время в бесплодном браке.

При рассмотрении данных, включающих анализ параметров иммунитета и биологической активности сывороточных факторов у женщин в различные периоды менструального цикла и в динамике суперстимуляции яичников по программе ЭКО, следует отметить, что сравнительная оценка показателей иммунного статуса не выявила значимых различий у здоровых доноров и женщин с бесплодием, ни по количественному составу иммунокомпетентных клеток, ни по уровню их функциональной активности.

Отсутствие заметных отклонений иммунологических параметров на системном уровне у пациенток могло быть обусловлено несколькими причинами. Во-первых, все женщины до начала ЭКО проходили тщательное медико-лабораторное обследование. В случае выявления патологии им назначалась соответствующая терапия, которое проводилось в объеме, необходимом для достижения санирующего эффекта. Кроме того, среди обследованных женщин не было пациенток, у которых основной причиной бесплодия выступал бы иммунный фактор. Вторичная форма бесплодия являлась доминирующей, и, как правило, была связана с нарушением проходимости маточных труб или наличием спаек в брюшной полости (у 76-78%). бесплодие урогенитальный репродуктивный овариальный

Поскольку пациентки обследовались в первые (2-4) дни менструального цикла, т.е. до начала индукции овуляции по программе ЭКО, можно предположить, что на базовом уровне иммунные механизмы играют минимальную патогенетическую роль в нарушении репродуктивной функции, или же они начинают проявлять себя в более критичный период овариального цикла, связанный с созреванием ооцитов, а также на этапах оплодотворения и имплантации эмбрионов.

Исследование иммунитета у женщин с бесплодием в день проведения трансвагинальной пункции ооцитов (на пике стимулированной овуляции по программе ЭКО), показали (Табл. 5), что по сравнению с исходным статусом у них регистрируется достоверное снижение интенсивности спонтанной пролиферации и относительного количества CD16⁺NK-клеток, в сочетании с увеличением доли CD20⁺В-лимфоцитов и HLA-DR^highмоноцитов

Таблица 5

Характеристика иммунитета в группах женщин-доноров ооцитов и пациенток ВРТ (ЭКО) на пике стимулированной овуляции (M±m)

Показатели	До начала ЭКО	На пике стимулированной овуляции
	Пациентки	Пациентки	Доноры-ооцитов
CD3 Т-лимфоциты (%)	69,6 1,2	72,6 1,3	70,2 4,1
CD4 Т-лимфоциты (%)	42,0 1,2	44,6 1,3	44,0 4,9
CD8 Т-лимфоциты (%)	25,9 0,9	26,0 0,9	26,0 2,9
CD4/CD8	1,71 0,09	1,78 0,07	1,71 0,16
CD20 B-клетки (%)	9,2 0,5	12,0 0,6**	12,6 1,2*
CD16 NK-клетки (%)	14,4 1,3	10,7 0,8 *	11,4 2,3*
HLA-DRhigh моноциты (%)	42,0 1,8	69,0 2,6**	70,0 5,0**
Пролиферация (имп/мин)	Спонтанная	1560 90	1280 80 *	1230 160*
	КонА-индуцированная	439303160	369502780	328805790
	ИВКонА	32,4 1,3	35,8 3,6	28,0 5,3
Апоптоз (%)	лимфоцитов	6,5 1,0	9,0 1,6	-
	моноцитов	13,1 1,4	17,5 1,9	-
	нейтрофилов	7,8 1,1	12,9 2,0 *	-

Примечание: * - p<0,05 и ** -p < 0,01 по сравнению с группой женщин до начала ЭКО

. Кроме того, отмечалась также тенденция к увеличению апоптоза циркулирующих клеток крови, которая в отношении свежевыделенных нейтрофилов достигала статистически значимого уровня (p< 0,05). Важно отметить при этом, что обследованные пациентки не отличались по анализируемым параметрам иммунного статуса у здоровых женщин. По-видимому, выявленные отклонения в иммунной системе в большей степени обусловлены изменениями гормонального фона вследствие использования препаратов-индукторов созревания ооцитов, и не связаны непосредственно с нарушенной репродуктивной функцией.

Другая причина выявленных иммунологических изменений у обследованных женщин может быть связана также с особенностями цитокиновой регуляции. Очевидно, что и в динамике физиологического менструального цикла, и, особенно, в условиях стимулированной суперовуляции в организме женщины могут происходить «флюктуации» цитокинового профиля в том или ином направлении, которые в свою очередь и могут обуславливать специфические изменения параметров иммунитета на системном уровне.

Для проверки высказанного предположения были проведены исследования биологической активности сывороточных факторов ориентированных на интегральную оценку суммарного эффекта цитокинов у женщин в различные периоды физиологического и стимулированного овуляторного цикла по программе ЭКО.

Исследования показателей биологической активности сыворотки крови показали (Рис. 1), что в первые дни (2-4 сутки) физиологического менструального цикла они значимо не отличались от значений контроля. В то же время в период овуляции регистрировалось появление супрессорной и противовоспалительной активности, о чем свидетельствует снижение ИСА и ИВА, соответственно в 1,6 и 1,35 раз. Аналогичная закономерность наблюдается и при проведении контролируемой овариальной стимуляции по программе ЭКО. Причем у большинства женщин из программы ЭКО значения соответствующих индексов выходили за нижнюю границу нормативных диапазонов (ИСА. в 68,6% случаев и ИВА в 74% случаев).

Рис. 1. Биологическая активность сыворотки крови в группах женщин контроля и программы ВРТ (ЭКО) в различные фазы менструального цикла и контролируемой овариальной гиперстимуляции (M±m)

Полученные данные свидетельствуют об изменении у женщин с бесплодием баланса сывороточных факторов в сторону доминирования медиаторов/цитокинов с иммуносупрессорной/противовоспалительной активностью в овуляторный период менструального цикла, особенно после проведения контролируемой суперстимуляции яичников по программе ЭКО.

Дополнительным подтверждением этого могут являться изменения субпопуляции регуляторных CD4⁺CD25⁺Т-лимфоцитов и CD14⁺ CD16⁺моноцитов в качестве потенциальных кандидатов-участников, задействованных в супрессорной перестройке иммунитета у женщин в период стимулированной суперовуляции. Результаты показывают, что в овуляторный период менструального цикла при проведении суперстимуляции яичников у женщин увеличивается доля CD4⁺CD25⁺Т-лимфоцитов по сравнению с контролем (соответственно 9,6 ± 0,8% и 5,4 ± 0,5%). Можно предположить, что эти системные изменения не случайные, поскольку они четко синхронизированы с фазой овуляторного цикла, и могут лежать в основе супрессорной реорганизации иммунорегуляторных механизмов, реализуемых как через растворимые факторы, так и на уровне межклеточной кооперации, в том числе и на местном уровне.

Выявленную взаимосвязь между биологической активностью ФЖ и содержанием в ней цитокинов иллюстрируют результаты сравнительного анализа пациенток ЭКО, оппозитных по уровню иммуносупрессорной активности ФЖ.

Таблица 6

Уровень цитокинов (пкг/мл) в ФЖ пациенток ВРТ (ЭКО), оппозитных по уровню супрессорной активности (Median)

Группы	Цитокины	Контроль	Пациентки
			ИСА > 0,6	ИСА ? 0,6
Th1	IFN-г	55	60	10 **
	IL-2	25	27,5	1,3 **
Th2	IL-4	9,6	10	4,9 *
	IL-5	2,7	2,8	1,3
	IL-6	13	22,4	11,6 *
	IL-10	10	11	10
	IL-13	24	22,5	27
Про- воспалительные	IL-1в	23	24	26
	TNF-б	10	10,5	10,5
	IL-12 (p70)	12	12	12
	IL-17	16	15,7	16,3
Факторы роста	IL-7	11	11,4	3,0 **
	G-CSF	166	155	43 **
	GM-CSF	136	137	135
Хемокины	IL-8	21	10	22
	MIP-1в	75	85,5	75
	MCP-1	1	1	1

Из представленных в табл. 6 результатов видно, что у пациенток с чрезмерно выраженной иммуносупрессорной активностью (ИСА ? 0,6) концентрация в ФЖ IFN-г, IL-2, IL-4, IL-6, IL-7, и G-CSF была в 2-3 раза ниже. В том случае, если супрессорный потенциал ФЖ не выходил за установленную границу значений ИСА >0,6, то содержание в ФЖ IFN-г, IL-2, IL-4, IL-7, и G-CSF в исследуемых образцах находилось на уровне здоровых женщин.

При проведении корреляционного анализа оказалось, что цитокины, продуцируемые на местном уровне, взаимосвязаны не только с характером биологической активности ФЖ, но и с относительным содержанием регуляторных CD4+CD25+Т-клеток периферической крови. В частности, была выявлена достоверная обратная зависимость между количеством циркулирующих CD4+CD25+Т-клеток и концентрацией IL-1в (r= - 0,36, p< 0,05), TNF-б (r= - 0,35, p< 0,05), IL-8 (r= - 0,49, p< 0,01), а также их прямая взаимосвязь с уровнем IL-4 в ФЖ (r= + 0,31, p< 0,05). Установленный факт свидетельствует, очевидно, о сопряженности цитокин-опосредованных и клеточно-опосредованных механизмов регуляции фолликулогенеза, реализуемых как на местном, так и на системном уровне.

Поэтому в дальнейшем был проведен анализ цитокинового профиля ФЖ во взаимосвязи с особенностями фолликулогенеза при проведении у женщин контролируемой суперовуляции по программе ЭКО.

Таблица 7

Уровень цитокинов (пкг/мл) в ФЖ и показатели овариальной функции в группах пациенток ЭКО, различающихся по количеству полученных ооцитов и развитию синдрома гиперстимуляции яичников (Median)

Показатели	Контроль	Пациенток, различающиеся по количеству полученных ооцитов и развитию СГЯ
		I (? 8; СГЯ - нет)	II (>8; СГЯ - нет)	III (>8; СГЯ -есть)
Кол_О	8	4 **	13	15
Кач_О	100	100	90	87,5
Инд_Опл	67	66	68	51,5
IL-2	25	1,5 ** v	30,3	6,0 * v
IL-4	9,6	3,5 ** v	11,5	2,7 * v
IL-13	24	23,7	26	59 ** ^
IL-1в	23	23,7	24,9	34 * ^
IL-7	11	7,3 ** v	11,5	5,3 * v
G-CSF	166	88 **v	194	46 ** v
MIP-1в	75	65 *	122 ^	77

Примечания: достоверность различий медианы исследуемых параметров по сравнению с подгруппой II (* - < 0,05, ** - < 0,01). Стрелками помечены достоверные различия в уровне цитокинов по сравнению с женщинами-донорами ооцитов (контролем)

Сравнительный анализ пациенток ЭКО (Табл. 7), оппозитных по количеству ооцитов, полученных на пике стимулированной овуляции, а также различающихся по развитию синдрома гиперстимуляции яичников (СГЯ) показал тесную сопряженность между количеством созревающих ооцитов и уровнем цитокинов в микроокружении фолликула на пике стимулированной суперовуляции. Так, образование малого числа яйцеклеток (I группа) ассоциировано с дефицитом IL-2, IL-4, IL-7 и G-CSF. Схожая цитокиновая картина ФЖ определяется и при развитии СГЯ (III группа). Однако в этом случае регистрируется повышенный уровень IL-1в, провоспалительная активность которого вероятно и вызывает перитонеальную экссудацию и развитие болевого синдрома у женщин с СГЯ. Можно предположить, что в условиях развивающегося цитокинового дисбаланса, по-видимому, изменяются и качественные характеристики яйцеклеток, что снижает эффективность их последующего оплодотворения.

Таблица 8

Уровень цитокинов (пкг/мл) в ФЖ и показатели овариальной функции в группах пациенток ВРТ (ЭКО), различающихся по качеству полученных ооцитов (M±m)

Показатели	Контроль (Median)	Пациентки, различающиеся по качеству полученных ооцитов
		Кач_О = 100%	Кач_О < 60%
Овариальная функция	Кол_О	8	9,0 1,0	9,8 2,4
	Кач_О	100	100	47,7 4,4 **
	Инд_Опл	67	81 5,0	42,6 12,5 **
Th1	IFN-г	55	56 8,7	7,5 4,6 **
	IL-2	25	20,5 2,8	1,6 0,4 **
Th2	IL-4	9,6	7,6 1,0	1,2 0,2 **
	IL-5	2,7	2,3 0,1	1,2 0,1
	IL-6	13	42,6 19,5	5,7 3,1 **
	IL-10	10	10,4 0,9	3,8 1,3 **
	IL-13	24	47,5 23	37,6 18
Про- воспалительные	IL-1в	23	27,3 2,2	16,2 3 *
	TNF-б	10	12,8 2,1	4,3 1,6 **
	IL-12 (p70)	12	15,0 2,9	6,2 2 **
	IL-17	16	25,7 5,8	3 2 **
Факторы роста	IL-7	11	8,7 0,9	1,2 0,1 **
	G-CSF	166	144 17	10,5 6,8 **
	GM-CSF	136	222 40	336 201
Хемокины	IL-8	21	50,6 34,7	27,5 5
	MIP-1в	75	125 23	48,7 9,8 *
	MCP-1	1	34,8 16,8	3,3 2,3

Примечание: * - p<0,05 и ** -p < 0,01 достоверность различий средних значений исследуемых параметров между оппозитными группами пациенток ВРТ (ЭКО)

Действительно, из полученных данных видно (Табл. 8), что в группе женщин, у которых 100% яйцеклеток, полученных на пике стимулированной овуляции, имели высокую оценку качества (4-5 баллов по международной шкале), базальная секреция цитокинов в ФЖ находится на уровне медианных значений контроля. Во второй группе, где выход яйцеклеток высокого качества был ниже в 2 раза, обнаруживалась принципиально иная картина.

Видно, что концентрация подавляющего большинства цитокинов находится на нижней границе чувствительности метода. При этом регистрируется дефицит Th1 (IFN-г, IL-2) и Th2 (IL-4, IL-6, IL-10) цитокинов, провоспалительных (IL-1в, TNF-б, IL-12, IL-17, IL-6) и противовоспалительных (IL-10) медиаторов, ростовых факторов (IL-7, G-CSF) и MIP-1в (хемокина). Полученные данные свидетельствуют, что для созревания ооцитов в морфологически качественные яйцеклетки необходимым фактором является наличие и поддержание в микроокружении фолликула определенного баланса цитокинов.

Поэтому несомненный научно-практический интерес представляют данные о связи уровня и биологической активности цитокинов ФЖ с клинической эффективностью ЭКО. Так, результаты частотного анализа показывают, что проградиентное уменьшение содержания в ФЖ IL-2 характеризуется четким, линейным трендом снижения эффективности ЭКО с 91 до 19%. (Рис. 2).

Рис. 2. Эффективность ВРТ (ЭКО) в группах женщин, с различным уровнем IL-2 в фолликулярной жидкости



Рис. 3. Эффективность ВРТ (ЭКО) в группах женщин, с различным уровнем IL-8 в фолликулярной жидкости

Аналогичная, но обратная зависимость частоты развития беременности регистрируется при увеличении в ФЖ уровня IL-8 (Рис. 3).

Полученные результаты дополнительно свидетельствуют, что уровень цитокинов, продуцируемых в микроокружении фолликула в период созревания ооцитов и имплантации оплодотворенной яйцеклетки, может иметь определенную диагностическую ценность в раннем прогнозе успешного или неэффективного проведения ЭКО. Это, возможно, может послужить основой для определения иммунологических критериев раннего прогноза развития беременности.

Поэтому для оценки диагностической ценности выделенных диапазонов признаков в прогнозе эффективности ЭКО определяли их диагностические коэффициенты (ДК), специфичность и чувствительность (SP и SN), информативность по К. Шеннону (J_Sh) и относительный риск (RR).

Достоверность различия частот встречаемости признаков в группах определялась точным методом Фишера. Информативность каждого признака вычислялась по соотношению двух вероятностей P(Xi/A₁) и P(Xi/A₂), где А₁ и А₂ - классы прогноза; Xi - номер признака, а P(Xi/Ak) - вероятность (частость) события.

Информативность по К. Шеннону J(Sh) по формуле:

Jxi= P(Xi/A₁) / 10 lg P(Xi/A₂) [P(Xi/A₁) - P(Xi/A₂)]

Диагностический коэффициент (ДК) вычислялся по формуле:

ДК = 10 lg x P(Xi/A₁) / P(Xi/A₂)

Использование такого математического подхода позволило все выделенные и диагностически значимые показатели сгруппировать в отдельные комплексы признаков, ранжированных по степени значимости для прогноза неэффективного vs успешного цикла ЭКО (табл. 9 и 10). Из результатов видно, что количественный состав и уровень информативности выделенных диапазонов признаков, прогнозирующих неэффективность ЭКО, существенно превышает аналоги...