Морфологические закономерности дегенерации и адаптации сетчатки глаз при экспериментальных ретинопатиях, коррекция биофлавоноидами

Размещено на http://www.allbest.ru/

1

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Морфологические закономерности дегенерации и адаптации сетчатки глаз при экспериментальных ретинопатиях, коррекция биофлавоноидами

03.00.25 - гистология, цитология, клеточная биология

Варакута Е.Ю.

Томск - 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава

Научный консультант:

доктор медицинских наук, профессор Логвинов Сергей Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Семченко Валерий Васильевич

доктор медицинских наук, профессор Суходоло Ирина Владимировна

доктор медицинских наук, профессор, академик РАМН Дыгай Александр Михайлович

Ведущая организация ГУ Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ. Проблема комбинированного действия факторов среды на организм человека является одной из ключевых в биологии, медицине и экологии. Организм всегда находится под прессом действия комплекса факторов и зачастую трудно оценить приоритетность того или иного фактора в возникновении патологии [Ушаков И.Б., 2003]. Однако в настоящее время практически отсутствуют адекватные модели взаимодействия факторов, которые помимо теоретического, имели бы практическое значение для человека, что и послужило поводом для создания модели комбинированного влияния света и экспериментального сахарного диабета на сетчатку глаз.

Поражение органа зрения при сахарном диабете является актуальной проблемой в связи с ростом частоты диабетической ретинопатии, которая в настоящее время стала ведущей причиной необратимой слепоты [Балаболкин М.И., Клебанова Е.М., 2000; Галстян Г.Р., 2002; Ei-Remessi A.B. et al., 2006]. Морфофункциональные изменения при стойкой гипергликемии касаются практически всех звеньев зрительного анализатора, однако, поражение сетчатки является основной причиной потери зрения [Можеренков В.П., Калинин А.П., 1991; Жабоедов Г.Д. и др., 2000; Нестеров А.П., 2000]. Начальные проявления диабетической ретинопатии возникают уже на ранних стадиях сахарного диабета, что подтверждается электронно-микроскопическими исследованиями базальной мембраны капилляров сетчатки [Anderson H.R. et al., 1995; Ljubimow A.W. et al., 1996; Li Q. et.al., 2002]. Экспериментально показано, что изменения касаются в большей степени сосудов микроциркуляторного русла сетчатки и характеризуются нарушениями гемодинамики, а также повреждением сосудистой оболочки глаз [Qaum T., Xu Q., Joussen A.M. et al., 2001; Cheung A.K.H., Fung M.K.L. Lo A.C.Y. et al., 2005; El-Remessy A.B., Al-Shabrawey M., Khalifa Y., 2006]. Также в некоторой степени страдают радиальные глиоциты, ассоциативные и ганглионарные нейроны сетчатки [Bensaoula T., Ottlecz A., 2001; Li Q. et al., 2002; Martin P.M. et al., 2004].

В литературе накоплено большое количество сообщений о повреждающем действии света на сетчатку глаз человека и животных. Как в клинике, так и на производстве нередки ситуации с потенциальной возможностью возникновения и развития фотодегенерации [Michels M. et al., 1990; Arafat A.F. et al., 1994; Bradham M.S. et al., 1995]. Имеются данные о появлении дегенеративных изменений на глазном дне у пациентов, слишком часто подвергавшихся офтальмоскопированию, нарушении сетчатки после глазных операций. [Bradham M.S. et al., 1995; Kohnen S., 2000; Kleinmann G., et al., 2002; Michael R., Wegener A., 2004; Dawson D.G. et al., 2005]. В эксперименте на белых крысах воздействие света высокой интенсивности вызывает деструктивные изменения всех элементов сетчатки глаза. Наблюдаются также гемодинамические расстройства, ультраструктурные нарушения эндотелиоцитов, базальной мембраны капилляров, что приводит к нарушению целостности гематоретинального барьера [Логвинов С.В. и др. 2003; Потапов А.В., 2006].

Общим в патогенезе диабетической ретинопатии и фотодегенерации сетчатки является нарушение микроциркуляции, а также индукция свободнорадикальных окислительных процессов [Островский М.А., 1994; Wolff S.P. et al., 1991; Baynes J.W., 1991; Kashiwagi A., Kikkawa R., 1991].

С точки зрения коррекции возможных нарушений сетчатки при указанных воздействиях вызывают интерес флавоноиды растительного происхождения. Это связано в первую очередь с выраженными антиоксидантными свойствами биофлавоноидов [Петров В.К. и др. 1996; Хазанов В.А. и др. 1999; Кондакова Н.В. и др., 1997; Теселкин Ю.О., 2003]. В Томском НИИ фармакологии СО РАМН предложены препараты: асковертин - смесь диквертина с аскорбиновой кислотой (патент РФ № 2150282, приоритет от 06.11.1998 г.) и каровертин - смесь диквертина, аскорбиновой кислоты и бета-каротина. Диквертин (дигидрокверцетин, таксифолин, 3,3,3,4,5,7-пентагидроксифлавон) относится к флавоноидам растительного происхождения [Плотников М.Б. и др., 1999; Плотников М.Б. и др. 2005]. В литературе имеются сведения о выраженных церебропротекторных свойствах асковертина. Он обладает антиоксидантным и атигипоксическим действием, влияет на тонус сосудов, нормализует мозговую гемодинамику, улучшает реологические свойства крови [Плотников М.Б. и др., 2005]. Имеются сведения, что флавоноиды диквертин и танакан повышают активность ферментов антиоксидантной защиты - супероксиддисмутазы и каталазы, тем самым, способствуя замедлению прогрессирования пролиферативной диабетической ретинопатии и улучшению электрофизиологических показателей сетчатки [Балаболкин М.И. и др., 2003]. Известно также, что витамин С способен усиливать антиоксидантные свойства флавоноидов, в частности, диквертина [Middleton E., Kandaswami C., 1992; Бобырева Л.Е., 1998; Плотников М.Б. и др., 2005]. Указанные свойства препаратов дают основание предполагать о возможности их использования для патогенетической коррекции фотоповреждения сетчатки на фоне аллоксанового диабета. Вместе с тем в доступной литературе отсутствуют сведения о модифицирующем влиянии данных биофлавоноидов на структурные изменения сетчатки глаза при экспериментальных ретинопатиях.

ЦЕЛЬ ИССЛЕДОВАНИЯ. Изучить закономерности дегенерации и адаптации клеточно-тканевых элементов сетчатки глаз при экспериментальных ретинопатиях, индуцированных воздействием света различной интенсивности и продолжительности, а также в комбинации с аллоксановым диабетом. Установить характер влияния асковертина и каровертина на морфофункциональное состояние компонентов сетчатки белых крыс при указанных воздействиях, а также сравнить возможные ретинопротекторные свойства данных препаратов.

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Создать модели ретинопатий посредством светового воздействия различной интенсивности и продолжительности, а также освещения в комбинации с аллоксановым диабетом на сетчатку глаз. Изучить вклад каждого фактора и их взаимодействие с целью выявления общих закономерностей повреждения и репарации тканевых компонентов сетчатки глаз.

Установить характер и динамику изменений нейрональной популяции и глиальных элементов сетчатки, а также глионейрональные взаимоотношения при фотоповреждении на фоне гипергликемии с использованием методов математического моделирования.

Изучить в динамике ультраструктурные изменения синаптоархитектоники сетчатки при воздействии указанных факторов.

Исследовать сосудистые реакции сетчатки и ультраструктуру гематоретинального барьера при фотоповреждении на фоне гипергликемии.

Определить последовательность и взаимосвязь клеточных реакций для выяснения их роли в тканевых механизмах дегенерации и адаптации при воздействии высоко- и низкоинтенсивного света на фоне гипергликемии.

Выявить модифицирующее влияние биофлавоноидов: асковертина и каровертина на сетчатку при воздействии указанных факторов и сравнить возможные ретинопротекторные эффекты препаратов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА. С помощью гистологических, электронномикроскопических и морфометрических методов впервые обнаружено, что при световом воздействии и освещении на фоне гипергликемии выраженность деструкции сетчатки в большей степени зависит от интенсивности освещения, а не от его продолжительности. При высокоинтенсивном световом воздействии и освещении на фоне гипергликемии в динамике на 7-е сут появляются очаговые изменения сетчатки. Выявлено, что наиболее поражаемыми структурами при указанных воздействиях являются нейросенсорные клетки (НСК) и пигментный эпителий (ПЭ). Изменения нейрональной популяции сетчатки при высокоинтенсивном световом воздействии и освещении на фоне гипергликемии характеризуются деструкцией закономерно убывающей в следующей последовательности: нейросенсорные клетки - ассоциативные нейроны - ганглионарные нейроны. Относительная сохранность ганглионарных нейронов, возможно, связана с высокой активностью в них белка bcl-2, в несколько раз превышающая активность гена p-53, что было выявлено при иммуногистохимическом исследовании сетчаток. В популяции ассоциативных нейронов наиболее подвержены деструкции амакринные нейроны, минимальной чувствительностью к повреждающим факторам обладают горизонтальные нейроны. По результатам исследования удельной площади органелл в биполярных и ганглионарных нейронах показана наибольшая чувствительность гранулярной эндоплазматической сети (ЭПС) и митохондрий, что лежит в основе хроматолитических изменений различной выраженности. Межнейрональные связи также высокочувствительны к световому воздействию. Обнаружено, что наибольшей деструкции подвержены синапсы наружного сетчатого слоя, а в очагах деструкции нейросенсорных клеток (при освещении 6000 лк) этот слой полностью отсутствует, и тела ассоциативных нейронов смещаются к наружной глиальной пограничной мембране. Во внутреннем сетчатом слое отмечается снижение общей численной плотности синапсов преимущественно за счет асимметричных контактов. Изменения синаптического пула сетчатки после длительного низкоинтенсивного светового воздействия на фоне гипергликемии и без нее имеет адаптивный характер, выражающийся сохранением общей численной плотности синапсов после 7 сут. светового воздействия. Однако имеет место и деструктивный эффект, характеризующийся снижением количества активно функционирующих искривленных контактов, и сохранность более статичных плоских синапсов. После освещения в течение 30 сут. наблюдается срыв адаптации, характеризующийся снижением численной плотности синапсов по сравнению с данными после 7 сут. светового воздействия. В механизмах репарации синаптического пула сетчатки после указанных воздействий ведущую роль играют процессы неосинаптогенеза и созревание контактов ювенильного типа. Реакция глиальных элементов сетчатки на воздействие повреждающих факторов неодназначна и характеризуется как регрессивными, так и прогрессивно-пролиферативными изменениями. Установлена роль радиальных глиоцитов в изоляции деструктивных элементов от неизмененной ткани посредством образования многослойных глиальных пластин. Пустоты, появившиеся вследствие гибели нейронов, также заполнены пролиферирующими глиальными отростками. Выраженность изменений компонентов гематоретинального барьера неодинакова и убывает в ряду: пигментоэпителиоциты - хориокапилляры - базальный комплекс.

Установлено, что курсовое введение биофлавоноидов асковертина и каровертина приводит к уменьшению очагов поражения, что связано с ростом удельной площади открытых сосудов, увеличением функциональной активности пигментного эпителия, большей сохранностью нейросенсорных клеток в обеих экспериментальных группах благодаря выраженным антиоксидантным и гемореологическим свойствам перпаратов. Выявлено, что данные антиоксиданты улучшают глионейральные и межнейрональные взаимодействия, способствуя снижению деструкции и увеличению регенераторного потенциала радиальной глии, повышая устойчивость нейронов внутренних слоев сетчатки и их синаптические контакты к повреждению. Показано, что наибольший ретинопротекторный эффект отмечен при однократном высокоинтенсивном воздействии, нежели при длительном непрерывном низкоинтенсивном освещении.

Впервые разработана математическая модель, позволяющая оценить изменения клеточных элементов сетчатки при воздействии высоко- и низкоинтенсивного света в комбинации с аллоксановым диабетом в любой момент времени на протяжении эксперимента, а также прогнозировать эти изменения по временному критерию.

Практическая значимость работы. Получены новые знания о закономерностях морфофункциональных изменений структурных компонентов сетчатки при световом воздействии, освещении на фоне аллоксанового диабета и коррекции биофлавоноидами асковертин и каровертин. Данные об усилении альтерации при воздействии света на фоне диабета могут быть использованы для разработки гигиенических стандартов при проведении офтальмологического обследования больных с диабетической ретинопатией. Представленные в диссертации данные о протективном эффекте препаратов на сетчатку глаза при воздействии света на фоне аллоксанового диабета могут быть использованы для разработки новых подходов профилактики и патогенетического лечения одного из осложнений сахарного диабета - ретинопатии.

Материалы работы используются в учебном процессе при чтении лекций на кафедре гистологии, эмбриологии и цитологии Сибирского государственного медицинского университета по разделу “Органы чувств”.

Работа выполнена в соответствии с планом проблемной комиссии Межведомственного научного совета при Президиуме РАМН “Структурно-функциональные основы организации мозга в норме и патологии”.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Наиболее выраженную дегенерацию сетчатки вызывает кратковременное высокоинтенсивное световое воздействие на фоне экспериментального сахарного диабета. Данный эффект характеризуется очаговой гибелью НСК и ПЭ. В поздние сроки отмечаются процессы адаптации, характеризующиеся репарацией наружных отростков сохранившихся НСК и фагоцитозом деструктивно измененных фоторецепторов. Препараты асковертин и каровертин увеличивают сохранность НСК, приводя к снижению площади очагов поражения.

2. Нейроны внутренних слоев сетчатки менее чувствительны к указанным воздействиям по сравнению с НСК. При высокоинтенсивном освещении наиболее поражаемы амакринные нейроны, а наименее - горизонтальные. При длительном низкоинтенсивном световом воздействии изменения ассоциативных нейронов имеют обратимый характер и проявляются только на ультраструктурном уровне. Введение препаратов защищает мембранные структуры нейронов и улучшает межнейрональные взаимодействия.

3. Деструкция радиальной глии вносит значительный вклад в дегенерацию нейронной популяции сетчатки, а ее пролиферативная активность приводит к изоляции очагов деструкции от неизмененных тканей, что является отражением адаптации. Введение препаратов снижает деструкцию радиальной глии, препятствуя развитию вторичных альтеративных изменений.

4. Повреждение сосудов сетчатки и хориоидеи при воздействии указанных факторов, наряду с очаговой деструкцией ПЭ приводит к прорыву гематоретинального барьера, а при освещении (6000 лк) развитию неоангиогенеза. Введение препаратов предупреждает деструкцию компонентов сосудистой стенки, улучшает состояние гемореологии и вносит вклад в уменьшение площади очагов поражения.

АПРОБАЦИЯ. Материалы диссертации доложены на VII Международном конгрессе ассоциации морфологов (Казань, 2004); на научном совещании гистологов на тему “Актуальные проблемы учения о тканях” (Санкт-Петербург, 2006); V съезде по радиационным исследованиям (радиобиология, радиоэкология, радиационная безопасность) (Москва, 2006); VIII Международном конгрессе ассоциации морфологов (Орел, 2006); на конференции посвященной 100-летию со дня рождения проф. И.С. Кудрина (Тверь, 2006); на Всероссийской конференции с международным участием "Структурно-функциональные и ней-

рохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга (Москва, 2006; 2007); VII международной научно-практической конференции "Здоровье и образование в XXI веке" (Москва, 2007).

ПУБЛИКАЦИИ. По теме диссертации опубликована 30 работ, из них 11 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук.

ОБЪЕМ И СТРУКТУРА ДИССЕРТАЦИИ. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов. Работа изложена на 385 страницах, иллюстрирована 8 таблицами, 175 рисунками. Библиографический указатель включает 604 источников из них 177 на русском и 427 на иностранном языках.

СОБСТВЕННЫЕ НАБЛЮДЕНИЯ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Эксперименты проведены на 310-ти беспородных белых крысах самцах с первоначальной массой 150-180 г, полученных из вивария СибГМУ.

До начала эксперимента крыс выдерживали на протяжении двухнедельного карантинного срока в условиях вивария с учетом традиционных требований к содержанию экспериментальных животных на обычном пищевом рационе. Для исключения влияния сезонных колебаний эксперимент проводился в осеннее-зимний период. Начало экспериментальных воздействий, и взятие материала осуществляли в одно и тоже время суток - в 10-12 часов с учетом известных вариаций зрительных структур. Животных содержали в стандартных условиях вивария при световом режиме 12 часов день, 12 часов ночь с искусственным дневным освещением низкой интенсивности 20 лк.

При проведении экспериментов животных помещали в специально сконструированную установку из прямоугольных рефлекторов с вмонтированными в них лампами, освещающих клетку с 5-и сторон. В ней производилось тотальное кратковременное высокоинтенсивное (6000 лк) и длительное низкоинтенсивное (200 лк) освещение люминесцентными лампами ЛБ-40 с максимумом излучения в желто-зеленой области спектра. Перед освещением проводили атропинизацию и дикаинизацию глаз животных. Дозиметрический контроль освещенности осуществляли с помощью люксметра.

Сахарный диабет моделировали путем однократного внутрибрюшинного введения аллоксана в дозе 15 мг/100 г. Критерием тяжести заболевания служили уровень гипергликемии, потеря массы тела, выраженность полиурии. Содержание сахара в крови определяли глюкозооксидазным методом с помощью набора “Новоглюк” (г. Новосибирск) 1 раз в неделю. Средний уровень сахара на 7-е сут после введения аллоксана составил - 20,1 ммоль/л (контроль 5-7 ммоль/л).

В качестве предполагаемых ретинопротекторов использовали препараты "Асковертин" - (патент РФ № 2150282, приоритет от 06.11.1998г.) и «Каровертин» - (регистрационное удостоверение МЗ РФ № 003406.Р.643.10.2001), разработанные в НИИ фармакологии ТНЦ СО РАМН коллективом авторов: М.Б. Плотников, О.И. Алиев, М.Ю. Маслов и др. Асковертин вводили в дозе 70 мг/кг (20 мг/кг - диквертина, 50 мг/кг аскорбиновой кислоты, а каровертин - из расчета 10 мг/кг дигидрокверцетина, 50 мг/кг аскорбиновой кислоты и 1 мг/кг -каротина в 1% крахмальной слизи. При высокоинтенсивном световом воздействии препараты вводили в течение 5-ти дней ежедневно внутрижелудочно 1 раз в сутки, первое введение препарата осуществляли за двое суток до освещения. При длительном низкоинтенсивном световом воздействии - ежедневно на протяжении всего периода освещения.

Животных выводили из эксперимента посредством декапитации под эфирным наркозом. В максимально короткий срок после умерщвления осуществляли энуклеацию глаз. В контрольную группу входили 50 интактных крыс, которых содержали в идентичных условиях вивария с экспериментальными животными. График опытов планировался таким образом, что забой экспериментальных животных производился одновременно с контрольной группой крыс.

Серии экспериментов 1, 3, 4 и 5 выполнены совместно с к.м.н. А.А. Жданкиной. Эксперименты проводили с соблюдением приказа Министерства здравоохранения СССР за № 755 от 12.08.77 об обеспечении принципов гуманного обращения с животными и федеральным законом РФ "О защите животных от жестокого обращения" от 01.01.1997.

Микроскопическое исследование

Глазные яблоки фиксировали в жидкости Карнуа и заливали в парафин. Отвесные срезы задней стенки глаза окрашивали гематоксилином и эозином [Ромейс Б., 1954], крезиловым фиолетовым по Nissl [Лили Р., 1969] - для выявления хроматофильного вещества в перикарионах нейронов.

Иммуногистохимические исследования

С целью проведения иммуногистохимического исследования материал фиксировали в 12% нейтральном формалине в течение 24 часов [Эллиниди В.Н. и др., 2002]. Далее объекты заливали в парафин по обычной схеме. На парафиновых срезах проводили двухэтапные реакции для выявления белков-маркеров апоптоза - p 53 и bcl-2. На первом этапе депарафинированные срезы подвергали предварительной высокотемпературной обработке с целью демаскировки антигена, а затем инкубации с первыми (специфичными) антителами в течение ночи при температуре +4^о С. На втором этапе проводили инкубацию со вторыми антителами, авидин-биотин-пероксидазным комплексом с последующим выявле- нием пероксидазы хрена диаминобензидином.

Готовые срезы докрашивали квасцовым гематоксилином и заключали в канадский бальзам. Подсчет p-53 иbcl 2- положительных нейронов производили по 4-бальной шкале на 100 клеток с каждой сетчатки при увеличении 10x40. Формула подсчета следующая [Эллиниди, В.Н., 2002]: Histochemical scores = P(i) х i где, i - интенсивность окрашивания, выраженная в баллах от 0-4, P(i) - процент клеток, окрашенных с разной интенсивностью.

Таблица 1. Распределение животных по сериям эксперимента.

Электронно-микроскопическое исследование

Для изучения ультраструктурных изменений заднюю стенку глаз фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида, забуференного на 0,2 М какодилатном буфере (рН 7,4). Материал постфиксировали в 2% растворе четырехокиси осмия на холоде в течение 3-х часов, дегидратировали в спиртах восходящей концентрации и заливали в эпон.

На осмированных препаратах плохо выявляются филаментозные парамембранные образования, поэтому для количественного изучения синаптического пула на этапе дегидратации, без предварительного осмирования, сетчатки контрастировали в 5% растворе фосфорно-вольфрамовой кислоты (ФВК) на абсолютном спирте в течение 3-х часов.

На ультратоме LKB-4 (Швеция) готовили полутонкие и ультратонкие срезы. Просмотр и фотографирование полутонких срезов производили на световом микроскопе “Люмам И1”. Ультратонкие срезы помещали на медные сетки. Осмированные препараты докрашивали уранилацетатом и цитратом свинца (Reynolds, 1963) и изучали в электронном микроскопе JEM - 7A.

Морфометрический анализ

На парафиновых срезах, окрашенных гематоксилином и эозином определяли удельную площадь очагов поражения сетчатки с использованием окулярной сетки Автандилова с 5-ти срезов каждой сетчатки при увеличении 10х40. На срезах, окрашенных крезиловым фиолетовым, подсчитывали процент ганглионарных нейронов с очаговым и тотальным хроматолизом на 200 клеток с каждой сетчатки. На полутонких, окрашенных толуидиновым синим срезах, производили подсчет НСК клеток с деструкцией ядра (пикноз, рексис, лизис) на 1000 клеток с каждой сетчатки. Определяли количество слоев и плотность распределения ядер в (НЯС). Подсчет клеток производили в окулярной рамке на площади 146 мкм² с 5 срезов каждой сетчатки при увеличении 10х90. Высчитывали удельную площадь среза слоев сетчатки, а также открытых неизмененных и сосудов хориоидеи с явлениями сладжа и тромбоза. Определяли глио-нейрональный индекс - отношение числа радиальных глиоцитов к ассоциативным нейронам ВЯС на 50 полях зрения с каждой сетчатки при увеличении 10х90. Высчитывали процент пикноморфных радиальных глиоцитов, нейронов внутреннего ядерного и ганглионарного слоев на 200 клеток с каждой сетчатки. На электронных микрофотографиях внутреннего ядерного и ганглионарного слоев определяли удельную плотность органелл ассоциативных и ганглионарных нейронов с помощью открытой квадратной тестовой решетки с шагом 5 мм при увеличении 10000.

Для оценки изменений синаптоархитектоники фотографировали по 15 случайно выбранных полей зрения внутреннего сетчатого слоя с 5 срезов каждой сетчатки при стандартном увеличении 8500. При конечном увеличении 30000 на сканированных электронно-микроскопических фотографиях определяли количество межнейронных контактов (площадь поля зрения - 50 мкм²) и высчитывали численную плотность синапсов на 100 мкм² нейропиля. Выявленные ФВК-позитивные контакты в зависимости от плоскости среза подразделяли на ряд категорий. Анализировали только те контакты, в которых четко были видны все элементы ССЕ: электронноплотный материал пресинаптической зоны, синаптической щели и постсинаптической части. В плоскость среза контактов неопределенного вида попадала только часть ССЕ. Подсчитывали количество определенных контактов с асимметричной и симметричной организацией ССЕ. Для асимметричных контактов характерно дискретное расположение ФВК-позитивного материала пресинаптической зоны в виде плотных проекций (ПП) пресинаптической решетки, а в симметричных контактах электронно-плотный материал персинаптической зоны неорганизован в отдельные филаментозные образования. Асимметричные контакты, в свою очередь, по степени выраженности ПП дифференцировали на типы: А, В, С [Семченко В.В., Степанов С.С., 1987]. В контактах типа А высота ПП пресинаптической решетки была больше 60 нм, в контактах типа В соответствовала 50-60 нм, а контактах типа С - меньше 50 нм. Длину активной зоны контакта (АЗК), которая на ФВК-контрастированном материале соответствовала всему синаптическому профилю, определяли с помощью тестовой решетки с шагом 3 мм. По протяженности АЗК все контакты делили на очень мелкие (<100 нм), мелкие (100-200 нм), малые (200-300 нм), средние (300-500 нм), крупные (500-700 нм) и очень крупные (>700 нм). Подсчитывали численную плотность плоских, "+" и "-" изогнутых синапсов [Семченко В.В., Степанов С.С., 1995].

Цифровой материал обработан общепринятыми методами вариационной статистики [Автандилов Г.Г. и др., 1990]. Для каждой выборки вычисляли выборочное среднее и стандартную ошибку выборочного среднего. С помощью критерия Колмогорова обнаружено отсутствие согласия данных с нормальным распределением, в связи с чем, для оценки различий между независимыми выборками применяли критерий Манна-Уитни. Различия считались достоверными при р<0,05. Полученные данные обрабатывали также методом корреляционного анализа. Статистическая обработка результатов была проведена с использованием пакета STATISTICA 6.0. По данным экспериментов проводилось построение математической модели изменений при помощи методов, реализованных в программной среде mathCAD (интерполяция, регрессия, аппроксимация).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Проведенные исследования показали, что световое воздействие вызывает закономерные, зависящие от интенсивности, продолжительности воздействия и времени после освещения изменения всех компонентов сетчатки. Аллоксановый диабет усиливает деструктивные эффекты света, что в первую очередь связано с патологией сосудов микроциркуляторного русла. Наибольшим изменениям после светового воздействия, а также освещения на фоне аллоксанового диабета подвержены пигментный эпителий, нейросенсорные клетки, синапсы и радиальная глия.

В первую очередь как при высоко-, так и при низкоинтенсивном воздействии изменения возникают в наружных сегментах НСК, так как они являются первичными акцепторами световых квантов, характеризующиеся крайне высоким содержанием полиненасыщенных жирных кислот и белков. Данные изменения характеризуется расслоением, фрагментацией, вакуольной дегенерацией мембран, что отмечают многие исследователи [Логвинов С.В. и др., 2005; Johnson D.D. et al., 1986; Mirshahi M. et al., 1991; Rosner M. et al., 1992; Chen E., 1993; Unoki K. et al., 1994; Koutz R. et al., 1995; Organisciak D.T., et al., 2003]. Высокоинтенсивное световое воздействие вызывает очаговый характер изменений сетчатки с практически полным исчезновением в очагах фотосенсорного и наружного ядерного слоев. После светового воздействия относительная площадь очагов в срезах составляет 27% от всей сетчатки, освещение на фоне аллоксанового диабета приводит к увеличению площади поражения в 2 раза. Такой мозаичный характер повреждения при изучаемых воздействиях, возможно связан, с изначально различной функциональной активностью сосудов микроциркуляторного русла и пигментного эпителия сетчатки.

На 7-е сут после освещения (6000 лк) в очагах поражения происходит снижение удельной площади фотосенсорного слоя по отношению к контролю в 4 раза и в 5,3 раза в группе после освещения на фоне аллоксанового диабета. К 30-м сут в обеих группах в участках, соответствующих очагам, фотосенсорный слой практически отсутствует. В обычных условиях в наружных сегментах НСК совершаются первичные процессы зрительной рецепции - возбуждение и адаптация, в экстремальных ситуациях, будь то слишком яркое или длительное освещение, в них разыгрываются процессы окисления. При этом обесцвеченный ретиналь, поглощая свет в присутствии кислорода и субстратов окисления - белков и липидов, выступает в качестве фотосенсибилизатора процессов свободнорадикального окисления в сетчатке и играет ведущую роль в развитии повреждения мембран наружных сегментов НСК [Островский М.А. и др., 1991; Островский М.А., Федорович И.Б., 1982, 1994; Masuda K. et al., 1995; Sakmar T.P., 2002]. Кроме того, установлено, что различные изомеры ретиналя являются эффективными фотогенераторами синглетного кислорода. В результате его химического тушения ретиналем и фосфоинозитидами мембран НСК образуются их гидроперикисные производные, способные индуцировать реакции свободнорадикального окисления липидов [Кулиев И.Я., Шведова А.А., 1982]. Внутренние сегменты на начальных этапах после обоих видов воздействий увеличиваются в размерах, в них происходит деструкция гранулярной ЭПС, что приводит к нарушению синтеза структурных белков, а также транспортных процессов и как следствие - замедление регенерации наружных сегментов. Также развивается деструкция митохонрий. Сначала наблюдается набухание митохондрий, что является компенсаторно-приспособительной реакцией. В последующем отмечена деструкция крист митохондрий, а некоторые из них имеют вид полых мешочков, что с одной стороны приводит к нарушению процессов энергообразования, а с другой стороны активизирует каспазный механизм апоптоза [Zamzami N. et al., 1996].

На 14-30-е сут после освещения в очагах поражения внутренние сегменты резко осмиофильны, подвергаются фрагментации и теряют связь с перикарионом. В некоторых участках фотосенсорный слой полностью отсутствует.

Курсовое введение асковертина и каровертина приводит к достоверному снижению площади очагов поражения при световом воздействии в 1,5 раз, при освещениии на фоне аллоксанового диабета в 1,6 раза.

Ультраструктурные изменения наружных и внутренних сегментов НСК после освещения в группах животных, получавших препараты, были аналогичны описанным выше, однако проведение количественного анализа позволяет нам сделать вывод об их защитном эффекте.

На первые сутки как после светового воздействия, так и после освещения на фоне аллоксанового диабета удельная площадь фотосенсорного слоя значимо не отличалась от контрольных значений. На 7-е, 14-е и 30-е сут в очагах поражения наблюдалось достоверное снижение данного показателя, однако он оставался выше значений групп без использования препаратов. Наблюдаемые эффекты препаратов асковертин и каровертин в отношении наружных отростков НСК, вероятно, связаны как с их антиоксидантной активностью, так и с проявлением иных свойств, способствующих снижению патологических процессов. Во-первых, как было показано выше, высокоинтенсивное световое воздействие запускает процессы фотооксидации в дисках фоторецепторов, в результате чего активируется выработка свободных радикалов. Ведущая составляющая препаратов - диквертин является ловушкой радикалов, цепьпрерывающим агентом [Тюкавкина Н.А. и др., 1995; Теселкин Ю.О. и др., 1996, 1999; Теселкин Ю.О., 2003; Плотников М.Б. и др., 2005]. Во-вторых, наружные сегменты состоят из мембранных дисков, основным компонентом которых являются липиды, относящиеся к легкоокисляющимся субстратам. Диквертин имеет способность оказывать “мембраностабилизирующее” действие, улучшая липидный обмен и замедляя образование липидных гидропероксидов. Аскорбиновая кислота, входящая в состав препаратов, повышает фармакологическую активность диквертина и сама выступает в роли антиоксиданта, при этом между ними отмечается мощный эффект синергизма [Middleton E., Kandaswami C., 1992; Плотников М.Б. и др., 2005]. В-третьих, степень восстановления наружных сегментов напрямую зависит от состояния внутренних сегментов [Baker B.N. et al., 1986; Moria M. et al., 1986]. Доказано, что применение асковертина в условиях ишемии мозга приводит к снижению деструкции митохондрий и эндоплазматической сети [Плотников М.Б. и др., 2000; Пугаченко Н.В. и др., 2000; Логвинов С.В. и др., 2001]. В связи с чем, можно предположить, что использование препаратов при световом воздействии ведет к снижению деструкции митохондрий и гранулярной эндоплазматической сети внутренних сегментов НСК, улучшая ферментативную активность митохондрий и белоксинтезирующую функцию клетки. В состав каровертина входит также антиоксидант в-каротин в дозе 1 мг/кг. Однако ретинопротекторное действие каровертина существенно не отличается от эффектов, вызванных асковертином. Возможно, это связано с меньшим, чем в асковертине, содержанием дигидрокверцетина.

Более выраженный деструктивный эффект светового воздействия при аллоксановом диабете в отношении НСК объясняется не только прямым повреждающим действием яркого света, но и опосредованным механизмом, связанным с сосудистыми изменениями. Уже на начальной стадии сахарного диабета наблюдаются патологические изменения хориокапилляров, выражающиеся сужением просвета за счет набухания ядросодержащей части эндотелиоцитов, утолщением базальной мембраны, деструкцией перицитов [Сорокин Е.Л., Смолякова Г.П., 1997; Kern T.S., Engerman R.L., 1995; Yang Y. et al., 1997; Imesch P.D. et al., 1997; Dagher Z. et al., 2004; Hughes S., et al., 2007]. Нарушаются также вязкостные характеристики крови, увеличивается агрегация эритроцитов, снижается их деформируемость, наблюдается гиперфибриногенемия, в связи с чем, происходит ухудшение транспорта кислорода и развивается микроангиопатия [Галенок В.А. и др., 1987; Евграфов В.Ю. и др., 2004; Le Devehat C. et al., 1994; Antonetti D.A. et al., 2006]. Следует отметить, что в начальный период развития диабета НСК менее подвержены изменениям, чем нейроны внутренних слоев сетчатки, вероятно вследствие того, что их наружные сегменты погружены в пигментный эпителий, обладающий мощной антирадикальной защитой. Таким образом, фотосенсорный слой остается относительно интактным [Гаджиев В.Г., 1998]. Однако деструктивные изменения пигментоэпителиоцитов и нарушение их взаимосвязей с НСК при высокоинтенсивном световом воздействии способствуют снижению защитных свойств фоторецепторов, т.к. известно, что сохранность структуры и функции пигментного эпителия является одним из условий нормального функционирования сетчатки [Думброва Н.Е., 1991].

Ядросодержащие части НСК подвергаются деструкции в виде кариопикноза, рексиса и лизиса. Анализ данного показателя свидетельствует о следующих закономерностях: во-первых, тяжесть поражения в большей степени зависит от интенсивности воздействия, нежели от его продолжительности. Об этом мы можем судить по показателю деструкции ядер через сутки после светового воздействия. Обнаружено, что содержание деструктивно измененных ядер НСК выше после кратковременного высокоинтенсивного светового воздействия по сравнению с таковым при низкоинтенсивном световом воздействии продолжительностью 1, 7, 14 и 30 сут.

Во-вторых, НСК наиболее восприимчивы, как к световому воздействию, так и к освещению на фоне аллоксанового диабета, однако обладают высокой способностью к адаптации, о чем свидетельствует относительная сохранность наружных отростков при низкоинтенсивном световом воздействии, возрастающей продолжительности. Основная масса НСК восстанавливает свое строение даже при тотальной деструкции наружных отростков, что является отражением репаративных возможностей НСК.

В-третьих, действие препаратов антиоксидантов наиболее эффективно при кратковременном высокоинтенсивном световом воздействии, нежели при длительном низкоинтенсивном.

Световое воздействие (6000 лк) вызывает деструкцию ядер НСК уже через сутки после освещения. На 7-е сут появляются очаги повреждения, где содержание деструктивных ядер НСК максимально и достигает 49,01±0,47% - при световом воздействии и 77,92±1,31% - при освещении на фоне гипергликемии (контроль 0,4±0,008%, р<0,05). На 21-25 сут по данным математического моделирования процент дегенеративно измененных ядер НСК снижается, оставаясь выше контрольных значений, что связано с фагоцитозом погибших клеток ПЭ, радиальными глиоцитами, макрофагами, мигрирующими из микроциркуляторного русла в сетчатку. В последующие сроки отмечена динамика роста данного показателя с максимумом на 35-е сут.

Необходимо отметить, что после освещения на фоне аллоксанового диабета изменения НСК более выражены по сравнению с таковыми после светового воздействия. Кроме того, математическое моделирование показало более медленное снижение содержания деструктивных ядер НСК с минимумом на 24-26 сут, по сравнению с таковым при изолированном освещении. Данный эффект, вероятно, связан с усилением сосудистых нарушений, а также окислительных процессов, что играет существенную роль в патогенезе диабетической ретинопатии [Engerman R., Kern T., 1995; Fagrell B. et al., 1999].

После курсового введения препаратов сохранность НСК значительно повышается. Так на 7-е сут количество деструктивных ядер после светового воздействия при введении асковертина составляет 4,98±0,09% и 6,37±0,49% - при введении каровертина, при освещении на фоне аллоксанового диабета с коррекцией асковертином - 7,93±0,39% и 8,8±0,39% - при использовании каровертина, оставаясь достоверно выше контроля (p<0,05).

При низкоинтенсивном световом воздействии ретинопротекторный эффект препаратов менее выражен, что возможно связано со свойством препаратов на основе биофлавоноидов накапливаться в участках с высоким содержанием свободных радикалов и играть роль донора электронов по отношению к радикальному субстрату [Плотников М.Б. и соавт., 2005].

Таким образом, чем выше активность свободнорадикального окисления, тем эффективнее препарат.

В последние годы большинство исследователей доказывают ведущую роль апоптоза в гибели клеток при повреждении сетчатки, не исключая развития некротических изменений [Marti A. et al., 1998; Carmody R.J.et al., 1999; Kueng-Hitz N. et al., 2000; Reme C.E., 2000; Grimm C. et al., 2001; J. Wu et al., 2002]. Полученные нами результаты с одной стороны свидетельствуют в пользу развития некротических изменений нейросенсорных клеток при изучаемых воздействиях, с другой стороны позволяют сделать вывод о немаловажной роли апоптоза в повреждении НСК. Известно, что для индукции апоптотической гибели клеток повреждающий стимул должен быть такой силы, чтобы клетка имела энергетические и материальные ресурсы для процессов транскрипции и трансляции проапоптотических белков [Лушников, Е.Ф., 2001; Мушкамбаров Н.Н., Кузнецов С.Л., 2003].

Высокоинтенсивное световое воздействие является мощным повреждающим фактором, что свидетельствует в пользу некротической гибели НСК. Кроме того, при освещении (6000 лк) продукты деградации НСК вызывают миграцию макрофагов и микроглии, являющихся клетками воспаления. Что также говорит в пользу некротического характера гибели НСК, так как наличие воспаления является дифференциальным признаком некроза. Макрофаги и микроглия генерируют свободные радикалы, а микроглиоциты также секретируют провоспалительные цитокины: интерлейкин-1 и фактор некроза опухоли, запускающие каспазный механизм апоптотической гибели НСК, что вовлекает в процесс все новые и новые клетки [Srinivasan B., Roque C.H., Hempstead B.L., 2004; Zeng H., Zhu X., Zhang C. et al., 2005; Krady J.K., et al., 2005]. При длительном низкоинтенсивном световом воздействии, по-видимому, доминирующим типом смерти НСК является апоптоз. Их гибель не имеет массового характера и не вызывает миграцию фагоцитов.

Среди ультраструктурных изменений НСК уже на первые сутки после светового воздействия, а также освещения на фоне аллоксанового диабета нами были выявлены клетки с типичными признаками апоптоза - маргинация хроматина, наличие апоптотических телец в склеральных отростках радиальной глии. Хотя иммуногистохимический анализ показал отсутствие в НЯС проапоптотического гена p-53 и антиапоптотического белка bcl-2, что согласуется с литературными данными об отсутствии влияния гена p-53 на индуцированный светом апоптоз в НСК [Kueng-Hitz N. et al., 2000]. Вероятно, в индукции апоптоза здесь задействованы другие механизмы - через индукцию c-fos гена, либо активация митохондриальной ветви апоптоза [Paylor R. et al., 1994; Roffler-Tarlov S. et al., 1996; Hafezi F. et al., 1997; Marti A. et al., 1998; Kueng-Hitz N. et al., 2000; Reme C.E., 2000; Choi S. et al. 2001; Donovan M. et al., 2001; Grimm C. et al., 2001; Wu J. et al., 2002]. Существенный вклад в развитие апоптоза НСК в последнее время отводят лизосомам, индуцирующим этот процесс посредством активации фактора некроза опухоли [Tardy C. et al., 2004; Dermaut B., et al., 2005].

Пигментоэпителиоциты, находясь в тесном контакте с НСК, участвуют в утилизации разрушенных наружных сегментов. В сетчатке млекопитающих одна клетка фагоцитирует отработанные мембранные диски от 30-ти фоторецепторов [Nandrot E.F., Kim Y.,. Brodie S.E. et al., 2004]. В экстремальной ситуации при освещении (6000 лк) уже через сутки наблюдается усиление фагоцитарной активности (ПЭ), выражающееся повышением количества фагосом, гипертрофией апикальных микроворсинок. При световом воздействии повышается метаболическая активность ПЭ, что характеризуется увеличением количества пиноцитозных пузырьков, посредством которых осуществляется транспорт воды, лактата и других продуктов обмена от фоторецепторов к ПЭ. Так, было замечено, что освещение приводит к увеличению объема сетчатки за счет повышенного образования воды, особенно в НЯС и фотосенсорном слое [Huang B., Karwoski C.J., 1992; Li J.D.et al., 1994]. В определенный момент ПЭ не справляется с повышенной функциональной нагрузкой. Так, на 1-е сут после освещения (6000 лк) мы наблюдали эпителиоциты с деструкцией митохондрий, исчезновением микроворсинок, и ядрами с маргинально расположенным гетерохроматином, что характерно для апоптоза. По данным R.C. Geiger et al. (2005) недоокисленные продукты обмена вызывают нерепарируемые повреждения ДНК клеток, осмотический лизис органелл, в частности митохондрий, а также разрушение цитоскелета клетки, а именно актиновых микрофиламентов, большая часть которых сосредоточена в области микроворсинок.

Снижение удельной площади ПЭ в срезе сетчатки на 1-е сут после освещения наблюдались только в группе со световым воздействием на фоне гипергликемии до 3,9±0,34% по сравнению с контролем (5,43±0,09%, p<0,05). По мнению некоторых авторов, длительная гипергликемия способствует апоптотической гибели клеток ПЭ [Turko I.V. et al., 2003]. Возможно, это связано с усилением окислительного напряжения и повышением активности индуцибельной NO-синтазы, ответственной за увеличение синтеза NO [Ellis E.A., Grant M.B., Murray F.T., et al. 1998; Chiou G.C., 2001; Du Y., Miller C.M., Kern T.S., 2003]. В присутствии супероксидного радикала NO превращается в перокснитрит, обладающий довольно значительной окислительной способностью, что приводит к нарушению многих клеточных структур, в том числе ДНК клеток [Реутов В.П., Сорокина Е.Г., 1994, 1998; Архипова М.М. и др., 2000; Roufail E. et al., 1998]. Гибель ПЭ каскадно нарастает, что приводит к срыву адаптации и появлению очагов поражения на 7-е сут после светового воздействия. Пигментоэпителиоциты уменьшаются в размерах, повышается осмиофилия ядра и цитоплазмы, в таких клетках исчезает базальная складчатость, в цитоплазме появляются мембранные комплексы. Встречаются участки с полным отсутствием пигментного эпителия и фотосенсорного слоя. Подобные изменения наблюдаются и при иных видах воздействий - коротковолновым светом, диаминофеноксипентаном, индоцианом, комбинированным воздействием ионизирующей радиации и света [Логвинов С.В., Потапов А.В., 2000; Дробатулина Д.А., 2004; Li J., et al., 1993; Wang H.M., et al., 1994; Masuda K., Watanabe I., 1995; Ikagawa H., et al., 2005].

Деструкция ПЭ стимулирует миграцию в субретинальное пространство фагоцитов и микроглии, которые с одной стороны участвуют в удалении продуктов деградации наружных сегментов фоторецепторов, а с другой стороны сами оказывают цитотоксическое действие на ПЭ и НСК [Zhang C., Lei B., Lam T.T., 2004; Zeng H., Zhu X., Zhang C. et al., 2005].

К 14-30-м сут после освещения животных в группах без коррекции препаратами большинство ядер пигментоэпителиоцитов в очагах подвержены пикнозу, наблюдается прогрессирующее снижение удельной площади ПЭ в срезе сетчатки по сравнению с контролем (p<0,05). Вне очагов часть клеток сохраняет нормальное строение, часть гипертрофирована, в последних наблюдается усиление фагоцитарной активности.

Курсовое введение препаратов-антиоксидантов при световом воздействии, а особенно при освещении на фоне аллоксанового диабета способствует развитию реактивных изменений ПЭ - гипертрофии клеток и микроворсинок, усилению базальной складчатости, повышению содержания фагосом. В связи, с чем происходит увеличение удельной площади ПЭ по сравнению с показателями групп сравнения (p<0,05), а на 7-е и 14-е сут после освещения на фоне гипергликемии при введении асковертина, и с контролем (p<0,05). Высокая сохранность ПЭ, увеличение его фагоцитарной активности, сохранение связи между ПЭ и наружными сегментами НСК а, следовательно, улучшение транспорта метаболитов из хориоидальных сосудов сетчатки при высокоинтенсивном световом воздействии и в особенности при освещении животных с аллоксановым диабетом на фоне введения препаратов, являются на наш взгляд, одними из ведущих факторов, способствующих защите рецепторной и ядросодержащей части НСК от повреждения.

При сравнении удельной площади ПЭ в группах с коррекцией асковертином и каровертином отмечено достоверное увеличение данного показателя на 7 и 14-е сут после освещения на фоне гипергликемии в группе с коррекцией асковертином, что вероятно связано с более высоким содержанием в этом препарате основного антиоксиданта дигидрокверцетина, по сравнению с каровертином.

В процессах дегенерации ПЭ при длительном низкоинтенсивном световом воздействии определенную роль играет нарушение биоритмов. Известно, что сбрасывание дисков НСК и фагоцитоз их ПЭ - это циркадно-зависимый процесс, который контролируется секрецией допамина и мелатонина [Nguyen-Legros J., Hicks D., 2000; Nir I., et al., 2002]. В сетчатке крыс преобладают палочковые НСК, которые освобождаются от мембранных дисков в утренние часы, одновременно в ПЭ наблюдается активизация фагоцитарной активности, что приводит к быстрой утилизации источника свободнорадикального окисления и перикисного окисления липидов [Young, R.W. 1977; Nandrot E.F., Kim Y., Brodie S.E., 2004]. Срыв этого отлаженного механизма приводит к накоплению в субретинальном пространстве вблизи апикальной поверхности ПЭ отработанных мембранных дисков, находящихся на разных стадиях лизиса уже при освещении в течение 1 сут. Часть пигментоэпителиоцитов увеличена в размерах за счет накопления фагосом, микроворсинки гипертрофированы, усилена базальная складчатость, что говорит об активизации фагоцитоза и транспортных процессов. В некоторых клетках наблюдается срыв компенсации, и на смену реактивным приходят деструктивные изменения, которые проявляются резкой осмиофилией и вакуолизацией цитоплазмы, исчезновением микроворсинок и пикнозом ядра. Такой мозаичный характер изменений наблюдается при увеличении длительности освещения до 7-ми, 14-ти и 30-ти сут. Даже при освещении в течение 30-ти сут не обнаруживаются участки, в которых полностью отсутствует ПЭ, что отмечено при высокоинтенсивном воздействии. Обращает на себя внимание, также отсутствие существенных отличий по показателю удельной площади пигментного эпителия при освещении в течение 7-ми, 14-ти и 30-ти сут, что возможно связано с адаптацией пигментоэпителиоцитов к постоянному низкоинтенсивному воздействию.