Антиген-индуцированные реакции иммунной системы при формировании памяти в норме и при иммунопатологических состояниях

Размещено на http://www.allbest.ru/

17

На правах рукописи

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Антиген-индуцированные реакции иммунной системы при формировании памяти в норме и при иммунопатологических состояниях

ГАВРИЛОВА Е.Д.

Новосибирск - 2011

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН.

Научный руководитель:

доктор биологических наук Кудаева Ольга Тимофеева

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Останин Александр Анатольевич

кандидат биологических наук, профессор Попова Нэлли Александровна

Ведущая организация: Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский национальный исследовательский медицинский университет им. Н.И.Пирогова» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1).

Защита состоится « 19 » января 2012 года в часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 НИИ Клинической Иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ Клинической иммунологии СО РАМН

Автореферат разослан « 2 » декабря 2011г.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор медицинских наук Колесникова Ольга Петровна

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Формирование иммунного ответа на конкретный антиген, тип иммунного реагирования, его динамика и выраженность определяется как «географией» антигена [Zinkernagel R.M et al., 1997], то есть путем поступления, дозой, продолжительностью персистирования и локализацией антигена в организме, так и особенностями самого организма, включая его текущее состояние [Gonzalez S.F. et al 2010; Pereira J.P.et al, 2010].

Развитие иммунного ответа не заканчивается образованием Т-эффекторов или синтезом антител, но и вызывает формирование иммунной памяти [Vitetta E.S. et al, 1991; Batista F.D.et al, 2009; Obar J.J.et Lefranзois L., 2010; Marelli-Berg F.M. 2010], характер которой зачастую трудно связать с особенностями иммунного ответа на первое введение антигена. Наблюдаемые при вторичном ответе реакции, как правило, не удается предсказать, исходя из предполагаемых в соответствии с известными закономерностями событий. Так, например, установлено [Swain S.L. et al., 2006], что выраженный гуморальный вторичный ответ часто наблюдается при первичной иммунизации низкими дозами антигена, а увеличение дозы приводит к парадоксальному снижению анамнестической реакции

Несмотря на огромные успехи в понимании тонких молекулярно-генетических механизмов регуляции синтеза антител и переключения кдассов и подклассов иммуноглобулинов в процессе развития гуморального ответа [Ada G.L. et Blanden R.V.1994; Dooms H.et Abbas A., 2006; Fearon D.T et al, 2006], выделении и характеристике многочисленных отдельных субпопуляций клеток памяти среди основных участников специфического иммунного ответа (Т-лимфоцитов: CD8+-, CD4+- и B-лимфоцитов) [Ада Г., Рамсей А. 2002; Lefrancois L., 2006; Calame K., 2006, Jameson S.C. et Masopust D., 2009], их роль и закономерности регуляции, а также взаимоотношения первичного и вторичного гуморального иммунного ответа и баланс клеточного и гуморального звеньев при вторичном ответе на уровне целостного организма в настоящее время ещё далеки от разрешения [Ahmed R. et Rouse B.T., 2006, Blanchard-Rohner G. et al, 2009].

Представляется вероятным, что формирование иммунной памяти при различных иммунопатологических состояниях отличается от этих процессов в норме. Известно, что индукция хронической РТПХ приводит к развитию аутоиммунной патологии, которая по клиническим и патоморфологическим признакам аналогична СКВ человека [Via C. S. et al. 1988, Kuzmina Z. et al, 2011]. При изучении иммунокомплексного гломерулонефрита, развивающегося при индукции хронической реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) была обнаружена супрессия первичного гуморального ответа [Козлов В.А. и др., 2002], что делает актуальным выявление особенностей формирования иммунной памяти при указанной патологии.

Понимание механизмов формирования иммунной памяти необходимо для успешной вакцинопрофилактики [Plotkin S.A.,2010], особенно учитывая случаи неудачной вакцинации отдельных индивидуумов, небольшую эффективность вакцин для создания клеточного анамнестического ответа, а также возникновение в последнее время новых, не встречаемых ранее инфекционных заболеваний. Кроме того, заболевания, в патогенезе которых лежат нарушения нормального функционирования иммунной системы (болезни с аутоиммунным компонентом, аллергии), по-видимому, развиваются по законам анамнестического иммунного ответа.

Целью данной работы является изучение клеточных и гуморальных реакций при антиген-индуцированных воздействиях и выявление регуляторных механизмов иммунных реакций, участвующих в процессе формирования иммунной памяти в норме и патологии.

В работе планируется решение следующих задач:

1. Изучить сопряжённую динамику первичного и вторичного клеточного и гуморального иммунного ответа у мышей на разные дозы антигена.

2. Изучить влияние повторного введения антигена в ранние сроки формирования первичного иммунного ответа на выраженность первичного и вторичного ответа.

3. Исследовать связь пролиферативной активности антителопродуцентов с интенсивностью вторичного иммунного ответа.

4. Изучить формирование иммунной памяти при хронической РТПХ как модели преимущественно Th1- или Th2-зависимых иммунопатологических состояний.

5. Оценить уровень TNF-б и уровень IgE в процессе формирования иммунной памяти в норме и при иммунопатологических состояниях, индуцированных хронической РТПХ.

6. Изучить возможную роль TNF-связывающего белка, рекомбинантного Il-1в и препаратов, изменяющих синтез NO, в регуляции гуморального ответа и формирования иммунной памяти.

Научная новизна работы: Получены новые данные о закономерностях формирования иммунной памяти в норме и при иммунопатологических состояниях.

Показано снижение вторичного иммунного ответа, вызванное предшествующей гиперстимуляцией первичного IgM- и IgG-ответа на фоне повторного введения антигена в позднюю лог-фазу первичного IgM-гуморального ответа. Этот эффект дозозависим и наблюдается только при первичной иммунизации субоптимальной дозой этого же антигена.

Выявлено, что введение ингибитора синтеза ДНК ослабляет подъём количества IgM-антителопродуцентов, вызванный дополнительным введением антигена в лог-фазу IgM-ответа, но не влияет на выраженность первичного и вторичного IgG-ответа.

Получены данные об участии TNFб в регуляции физиологического баланса процессов дифференцировки В-лимфоцитов в антителопродуценты и клетки памяти, проявляющемся в основном в момент активного образования IgM-антителопродуцентов.

Обнаружена сопряженность между уровнем Il-1в и выраженностью гуморального ответа: повышенное содержание этой формы цитокина в момент иммунизация (0сутки), достоверно снижает первичный и стимулирует вторичный IgG-ответ, что свидетельствует об участии Il-1 в регуляции В-клеточной дифференцировки в индуктивную фазу гуморального ответа на этот антиген.

Установлено, несмотря на глубокую депрессию первичного ответа при аутоиммунных процессах, индуцированных хронической РТПХ, вторичный ответ у таких мышей более сохранен: причем lupus-реципиенты способны к формированию иммунной памяти, тогда как nonlupus-реципиенты отвечают на повторное введение антигена сдвигом в сторону клеточно-опосредованных реакций.

Теоретическая и практическая значимость исследования: Полученные данные расширяют имеющиеся представления о регуляции иммунного ответа и подтверждают возможность направленно изменять интенсивность иммунного ответа и формирование иммунной памяти. Экспериментально выявленный стимулирующий эффект дополнительного введения антигена обосновывает создание новых схем вакцинаций: выбор оптимальных доз и способов введения антигенов. Учет результатов исследования позволяет также внести существенные положительные коррективы в технологический процесс получения специфических антител. Результаты работы дают основания для разработки новых подходов к регуляции иммунных реакций при некоторых формах аутоиммунных заболеваний и аллергических состояний.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Антиген является фактором, модулирующим иммунный ответ: при его дополнительном введении отмечается усиление первичного и подавление вторичного ответа.

2. Формирование иммунной памяти к чужеродному антигену протекает независимо от аутоиммунных процессов, индуцированных хронической РТПХ.

3. Уровень первичной реакции на антиген не является предопределяющим для формирования иммунной памяти благодаря существованию дискордантных взаимоотношений между развитием первичного и вторичного иммунного ответа.

Личный вклад автора в проведении исследования. Все представленные результаты экспериментальных исследований получены лично автором, либо при его непосредственном участии.

Апробация работы: Результаты диссертационной работы были представлены на Международной конференции «Фундаментальная наука медицине» (г. Новосибирск, 2007г.) и на конференции «Дни иммунологии в Сибири-2007» (г. Омск), а также доложены на Всероссийской научной конференции «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и патологии» (г.Новосибирск, 2010г.), на международной конференции «Дни иммунологии в Сибири-2011» (г.Абакан) и на 8-й отчетной конференции НИИ КИ СО РАМН ( г. Новосибирск, 2011).

Апробация диссертации состоялась 27 октября 2011г. на семинаре НИИ клинической иммунологии СО РАМН.

Публикации: По теме диссертационной работы опубликовано 20 работ, в том числе 7 статей в журналах, рекомендованных ВАК.

Объем и структура работы: Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования в 5 главах, их обсуждения, заключения и выводов. Материалы диссертации изложены на 121 страницах машинописного текста, результаты собственных исследований содержат 27 рисунков и 6 таблиц. Список литературы включает 197 источников, из них 18 на русском языке.

Работа выполнена на базе лаборатории экспериментальной иммунотерапии отдела экспериментальной иммунологии НИИ клинической иммунологии СО РАМН.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Животные: В работе использовали мышей - гибридов первого поколения (C57Bl/6xDBA/2)F1 (B6D2F1), самок, гибридов первого поколения (CBAxC57BL/6)F1 (CB6F1), самцов и мышей линии DBA/2, самок, полученных из лаборатории экспериментальных животных (моделей) НИИКИ СО РАМН (Новосибирск). В опытах использовались мыши в возрасте 2-8 месяца. Животных содержали в соответствии с правилами, принятыми Европейской конвенцией по защите животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (Страсбург, 1986).

Органы, клетки и ткани выделяли по стандартным методикам [Гольдберг Е.Д. и др., 1992].

Индукция хронической РТПХ проведена у мышей путём переноса самкам B6D2F1 лимфоидных клеток родительской линии DBA/2. Клетки селезёнки, выделенных ex temporo в стерильной среде RPMI-1640, внутривенно вводили реципиентам в дозе 65x106 клеток двукратно с интервалом в 5 дней [Kimura M. et al., 1987]. В качестве контроля использовали интактных животных того же генотипа, пола, возраста, что и в опыте.

Определение белка в моче. Содержание белка в моче определяли колориметрически с красителем Кумасси (Kumsai brillant blue)[Bradford M., 1976]. Калибровочную кривую строили по BSA (100-1000 мкг/мл), результаты (среднее двух измерений) выражали в мг/мл. О развитии гломерулонефрита судили по появлению стойкой протеинурии (не менее 3 мг/мл в двух последовательных измерениях).

Гуморальный иммунный ответ на Т-зависимый антиген - эритроциты барана (ЭБ)-оценивали на пике ответа, свойственного генотипу, по количеству локальных зон гемолиза в жидкой в среде RPMI-1640 [Cunningham A.J., 1965].

Клеточный иммунный ответ оценивали по степени выраженности реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ): измеряли величину отёка лапы после введения разрешающей дозы ЭБ сенсибилизированным животным по стандартной методике[Yoshikai Y., 1979; Muracami M. et al., 1995].

Концентрацию TNFб и IgE в периферической крови и сыворотке крови определяли твёрдофазным вариантом метода иммуноферментного анализа с помощью тест-системы «eBioscience» (для TNFб), в первом случае, и BD OptEIA (для IgE), во втором. Результаты выражали в абсолютных значениях в пкг/мл и в мкг/мл, соответственно.

Статистическая обработка полученных данных. Поскольку распределение показателей внутри экспериментальных групп не являлось нормальным, статистическую обработку проводили с использованием непараметрического критерия Вилкоксона-Манна-Уитни [Гублер Е.В., 1978]. Все результаты представлены в виде средних значений измеряемых параметров (М). Отличия между сравниваемыми величинами показателей различных экспериментальных групп считали достоверными при p < 0,05. На рисунках и в таблицах, кроме специально оговоренных случаев, отмечены достоверные различия: * - между контрольной и опытной группой; # - между опытными группами.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЯ

1. Влияние дополнительного введения антигена на гуморальное звено иммунного ответа

Предварительные эксперименты, обнаружившие регуляторный эффект введения антигена в позднюю лог-фазу первичного иммунного ответа, были проведены на иммvунизированных мышах, которым под апоневроз задней лапки вводили 5х108 ЭБ для оценки реакции ГЗТ. При этом было установлено, что такое введение антигена, сопровождающееся локальной воспалительной реакции в месте введения, оказывает также выраженное супрессивное влияние на последующий вторичный гуморальный иммунный ответ. Мыши разных генотипов обнаруживают одинаковую закономерность подавления анамнестической реакции, отличие проявляется лишь в выраженности супрессии (Рис.1).

Причиной данного эффекта может быть как изменение цитокинового баланса в организме под влиянием индукции клеточного ответа в период образования клеток памяти, так и влияние самого антигена, воздействующего на процесс образования антителолпродуцирующих клеток. Для проверки последнего предположения было изучено действие дополнительного введения антигена в продуктивную фазу гуморального иммунного ответа на образование IgM- и IgG-антителопродуцентов в селезёнке. Учитывая, что в предыдущих опытах индукцию ГЗТ осуществляли на 4 сутки, при изучении эффекта антигена на образование АОК в продуктивную фазу ответа повторное введение ЭБ проводили также на 4-е сутки после первичной иммунизации. Так как количество IgM-АОК в селезёнке определяли через сутки после повторного введения ЭБ, мышей, у которых оценивали образование IgG-АОК, разделили на две группы: одним ЭБ вводили также на 4-е сутки после первой иммунизации, вторым - на 8-е сутки, то есть за сутки до оценки количества IgG-АОК в селезёнке на пике IgG-ответа, который приходился на 9 сутки после иммунизации.

Рис1. Уровень вторичного ответа при введении разрешающей дозы под апоневроз через 4 суток после первой иммунизации у мышей разных генотипов.

На Рис. 2 видно, что введение антигена в конце лог-фазы IgM-ответа приводит к гиперстимуляции гуморального ответа. В случае IgM-ответа многократное (от 3 до 7 раз при первичной иммунизации субоптимальной дозой) увеличение числа клеток, продуцирующих специфические антитела, происходит в достаточно краткий период - 1 сутки (Рис. 2А). В случае IgG-антителопродуцентов стимуляция ещё более выражена и характеризуется 10-кратным увеличением их количества у стимулированных животных (рис. 2 Б). Эффект наиболее выражен при первичной иммунизации субоптимальной дозой антигена.

Рис.2. Количество IgM-АОК и IgG-АОК в селезёнке мышей BDF1 при повторном введении антигена через 4 суток после иммунизации; (M).

В то же время дополнительное введение антигена за сутки до пика IgG-ответа (через 8 суток после иммунизации) не приводит к подобному эффекту, более того, число IgG-АОК даже достоверно снижается с 1 187 в контроле до 625 (в группе мышей с дополнительным введением субоптимальной дозы антигена 1х107 ЭБ). Объяснение этого различия между эффектами дополнительного введения антигена на пике IgM или IgG-ответа (т.е. на 4 или 8 сутки) может быть связано со стимулирующим действием комплексов IgM-антител с антигеном [Hjelm F., 2006].

На Рис. 3 продемонстрировано, что усиление IgM- и IgG- образования в селезенке при повторном низкодозовом введении антигена полностью аналогично увеличению числа IgM- и IgG-АОК при дополнительном введении разрешающей дозы антигена под апоневроз стопы.



Рис.3. Сравнение уровня первичного гуморального ответа у гибридов ВDF1 при разных способах и дозах дополнительного введения антигена на 4 сутки в лог-фазу IgM-ответа. Первичная иммунизации в дозе 1х107 ЭБ/мышь; (M).

По оси ординат - количество АОК на селезенку; по оси абсцисс: 1-IgM-АОК, 2-IgG-АОК

Белые столбцы - контрольная группа без дополнительного введения антигена (1 - n=9; 2 - n=10);

заштрихованные столбцы - опытная группа с повторным введением под апоневроз в дозе 5х108 ЭБ/мышь (n=10);

серые столбцы - опытная группа с повторным введением антигена в дозе 1х107 ЭБ/мышь (1- n=10; 2 - n=5),

черные столбцы - опытная группа с повторным введением антигена в дозе 2х108 ЭБ/мышь (1- n=10; 2 - n=5),.

*-достоверные отличия относительно контроля (p<0,05)

Эффект подавления вторичного ответа при введении разрешающей дозы антигена (и, как следствие, при развитии реакции ГЗТ) аналогичен таковому при внутривенном введении субоптимальной дозы антигена (Рис. 4), что с большей вероятностью свидетельствует о влиянии дополнительного поступления антигена, нежели о влиянии развивающегося клеточно-опосредованного Th1-зависимого процесса на формирование иммунной памяти. В пользу данной трактовки говорит и то, что в этих условиях наблюдается резкая стимуляция первичного гуморального ответа, тогда как при действии на системном уровне факторов, сопровождающих развитие ГЗТ как Th1-зависимого процесса, скорее было бы ожидать снижения числа IgM- и IgG-антителопродуцентов.

Рис.4. Уровень вторичного ответа при дополнительном поступлении антигена в конце лог-фазу первичного IgM-ответа у мышей BDF1; (M).

По оси ординат - количество IgG-АОК на селезенку относительно контроля;

По оси абсцисс - группы экспериментальных животных:

1 - контрольная группа без дополнительного введения антигена (n=24);

2 - опытная группа с повторным введением антигена в дозе 1х107 ЭБ/мышь (n=26);

3 - опытная группа с повторным введением антигена под апоневроз стопы в дозе 5х108 ЭБ/мышь (n=25).

*-достоверные отличия (p<0,05)

Таким образом, подъём количества клеток-антителопродуцентов при повторном введении антигена в конце лог-фазы, показанный в наших экспериментах, оказывается очень резким, особенно для IgG-АОК (более чем на порядок). В случае IgM-ответа многократное (от 3 до 7 раз при первичной иммунизации субоптимальной дозой) увеличение числа клеток, продуцирующих специфические антитела, происходит в достаточно краткий период - 1 сутки. Такие эффекты предполагают участие мощных регуляторных факторов. В использованной нами схеме опыта - повторное введение антигена в ранние сроки развития первичного гуморального ответа - антиген может действовать непосредственно или, образуя иммунные комплексы со специфическими IgM-антителами, которые продуцируются в этот период уже в достаточном количестве и, как известно, приводят к стимуляции первичного ответа [Hjelm F., 2006]. В качестве одного из возможных механизмов реализации их действия может быть рассмотрена стимуляция пролиферативных процессов В-лимфоцитов, дифференцирующихся в антителопродуценты.

2. Пролиферативная активность антителопродуцентов и ее вклад в гуморальный иммунный ответ

Для изучения роли пролиферативных процессов в стимулирующем эффекте дополнительного поступления антигена была проведена серия экспериментов с введением гидроксимочевины (ГМ) - ингибитора синтеза ДНК [Morse B.S., 1969].

Схема эксперимента: Всех животных, предварительно иммунизированных субоптимальной дозой антигена, на четвертые сутки делили на три группы: 1 группа: контроль - без дополнительного поступления антигена; 2 группа - с дополнительным субоптимальным внутривенным введением (1х107 ЭБ/мышь) и 3 группа - с введением антигена под апоневроз (5х108 ЭБ/мышь).

При введении гидроксимочевины мышам в лог-фазу первичного IgM-ответа наблюдается выраженное подавление продукции IgM- и IgG-антител при стандартной иммунизации животных, но воздействие на стимуляцию IgM- и IgG-ответа оказывается неоднозначным (Рис. 5).

А - количество IgM-АОК; Б - количество IgG-АОК.

По оси ординат - количество АОК на селезенку; По оси абсцисс: доза дополнительного введения антигена; Белые столбцы - контрольная группа без введения гидроксимочевины (n=9-11) , серые столбцы - опытная группа с введением гидроксимочевины (n=9-10)

*- достоверные отличия относительно собственного контроля

Рис.5. Количество IgM- и IgG-АОК в селезёнке мышей BDF1 при повторном введении антигена через 4 суток после иммунизации на фоне введения гидроксимочевины. Первичная иммунизация - субоптимальной дозой антигена; (M).

Так, введение гидроксимочевины через 4 суток после иммунизации одновременно с повторным введением антигена вызывает ослабление стимулирующего эффекта в случае IgM-ответа, хотя количество IgM-АОК в селезёнке остаётся на достаточно высоком уровне, сравнимом с таковым в контрольной группе мышей, которых иммунизировали, но не подвергали дальнейшим воздействиям (Рис 5А).

Таким образом, большая часть IgM-АОК при стимуляции повторным введением антигена действительно представлена активно пролиферирующими клетками, при этом можно предположить как некоторое укорочение продолжительности клеточного цикла, так и сдерживание выхода клеток из делящегося пула. Однако определённая часть IgM-антителопродуцентов при этом оказывается принадлежащей к неделящейся популяции, что свидетельствует о существовании и других механизмов реализации стимулирующего влияния антигена, кроме усиления пролиферации антителопродуцентов. Возможно, при стимуляции в ответ вовлекаются клетки, которые без стимуляции менее интенсивно продуцируют антитела, что не позволяет определить их стандартными методами. Также речь может идти о клетках, которые при однократной иммунизации в этот период подвергаются апоптозу; повторное введение антигена может обеспечивать их сигналами для выживания [Crowley J.E., 2008, Tarlinton D, 2008].

На вторичный иммунный ответ элиминация пролиферации антителопродуцентов в позднюю лог-фазу первичного ответа (на 4 сутки) не влияет во всех вариантах (Таблица 1).

Таблица 1 Количество IgG-АОК в селезёнке мышей BDF1 при вторичном иммунном ответе на фоне введения гидроксимочевины; (M).

Дополнительное введение АГ Доза первичной иммунизации	Контроль (без АГ)	1х107в/в	5х108п/а
	без ГМ	с ГМ	без ГМ	с ГМ	Без ГМ	с ГМ
1х107в/в ЭБ/мышь	651 304 (n=15)	482 169 (n=15)	465 435 (n=16)	417 394 (n=15)	442 261 (n=15)	611 740 (n=15)

Отсутствие эффекта ГМ в данном случае можно объяснить тем, что при повторном введении антигена в активную пролиферацию вовлекаются клетки-предшественники IgG-антителопродуцентов, пролиферация которых начинается позднее и не подавляется ГМ. Чтобы исключить такую возможность, были проведены эксперименты с введением ГМ в более поздние сроки. Однако введение ингибитора на 6, 8, или 10 сутки первичного иммунного ответа также не приводит к снижению количества IgG-АОК при вторичном ответе. гуморальный иммунный антиген пролиферативный

Таким образом, элиминация пролиферирующих антителoпродуцентов в конце лог-фазы развивающегося IgM-ответа оказывает неоднозначный эффект на IgM и IgG-антителобразование в селезенке: полное ограничение подъема IgМ-антителобразующих клеток и только частичная отмена стимуляции как первичного, так и вторичного IgG-ответа. Введение ингибитора синтеза ДНК в более поздние сроки первичного ответа вовсе не приводит к видимым изменениям выраженности вторичного IgG-ответа. Это не позволяет нам выявить другую более значимую фазу первичного ответа, регуляция процессов в которой изменяет последующий вторичный ответ. Значит нельзя с уверенностью говорить и о том, что клетки-предшественники IgG-антителопродуцентов, которые пролиферируют позднее и по нашему мнению могут служить основой для анамнестической реакции, являются критичным фактором, вносящим вклад в формирование иммунной памяти.

3. Эндогенные модуляторы гуморального иммунного ответа

3.1 Уровень TNFб в сыворотке мышей BDF1 при антигенной гиперстимуляции первичного гуморального иммунного ответа. Стимуляция клеток-антителопродуцентов под влиянием вновь поступившего антигена может вызывать дополнительную секрецию цитокинов, которые играют ключевую роль в регуляции иммунного ответа. Одним из таких цитокинов является TNFб. Хотя наиболее выраженной является его роль в системном воспалении, показано участие TNFб во многих иммунных процессах, в том числе, в В-клеточной активации.

Рис.6. Количество TNFб в сыворотке самок мышей BDF1при антигенной гиперстимуляции гуморального иммунного ответа; (M).

По оси ординат - уровень TNFб в пкг/мл. По оси абсцисс - сутки после иммунизации; группы животных: белые столбцы - интактный контроль (n=6), горизонтальная штриховка - контрольная группа без дополнительного введения антигена (5 сутки (n=9), 9сутки (n=7)), диагональная штриховка - опытная группа с повторным введением антигена под апоневроз в дозе 5х108 ЭБ/мышь (5 сутки (n=11), 9сутки (n=10)), , серый столбцы - опытная группа с повторным введением антигена в дозе 1х107 ЭБ/мышь (5 сутки (n=10), 9сутки (n=11)), черные столбцы - опытная группа с повторным введением антигена в дозе 2х108 ЭБ/мышь (5 сутки (n=8), 9сутки (n=11)).

*- достоверные отличия опытной группы относительно контроля

Изучение уровня TNFб в наших исследованиях показало (Рис. 6), что как на пике IgM- и IgG-ответа концентрация TNFб у иммунных мышей контрольной группы достоверно не отличается от интактного контроля. В то же время антигенная стимуляция ответа сопровождается возрастанием уровня TNFб на пике IgM-ответа до 7,75 пг/мл в группе мышей (против 3,9 пг/мл в иммунизированном контроле). В дальнейшем происходит снижение концентрации TNFб и на пике IgG-ответа она не отличается от контрольных значений (4,5 пг/мл). Таким образом, подъём уровня TNFб приходится на период активного образования IgM-антителопродуцентов. Можно предположить, что резкая стимуляция иммунного ответа дополнительным поступлением антигена обусловлена взаимосвязанными процессами активации В-клеток и продукции ими TNFб, которые начинают поддерживать друг друга по принципу положительной обратной связи, что оказывается немаловажным при формировании иммунной памяти.

Для проверки этого предположения и отмены возможных эффектов TNFб мышам вводили TNF-связывающий белок вируса натуральной оспы в дозе 12 нг/мл (однократно - через 4 суток после иммунизации или трехкратно - через 4, 6 и 8 суток).

Данные Таблицы 2 свидетельствуют, что введение TNF-связывающего белка снижает первичный гуморальный ответ и оказывает стимулирующий эффект на вторичный ответ

Таблица 2. Величина первичного гуморального ответа у мышей BDF1на Т-зависимый антиген на фоне введения TNF-связывающего белка (M).

Пик гуморального иммунного ответа в контрольных и опытных группах (без АГ и с АГ)	Введение TNF-связывающего белка
	Без введения	n	Однократное (4 сутки)	n	Трехкратное (4,6 и8 сутки)	n
IgM-АОК (5 сутки)	Без АГ	10 972	10	5 590*	10
	АГ	15 132	6	8 123*	10
IgG-АОК (9 сутки)	Без АГ	393	10	252	6	271	10
	АГ	13 026	10	15 296	10	16 652	7
IgG-АОК (4 сутки после вторичной иммунизации)	Без АГ	883 947	24	958 985	22	1 334 123*	10
	АГ	655 608	24	721 601	27	702 435	17

Видно, что однократное введение белка на 4 сутки в момент дополнительного введения антигена вызывает двукратное уменьшение количества IgM-АОК как в контрольных группах мышей, так и в опытных группах, на фоне дополнительной стимуляции антигеном. Однако связывание TNFб не влияет на образование IgG-антителопродуцентов даже при многократном введении.

Изучение анамнестической реакции показало, что подавление IgM-ответа, вызванное связыванием TNFб, сопровождается стимуляцией вторичного ответа при стандартной иммунизации: трехкратное введение TNF-связывающего белка приводит к достоверному снижению количества вторичных IgG-АОК, что говорит о кумулятивном эффекте препарата. Подобный эффект не проявляется на фоне стимулированного ответа; возможной причиной этого может быть недостаточная доза TNF-связывающего белка в связи с повышенным уровнем TNFб при стимуляции.

Эти результаты свидетельствуют об участии TNFб в регуляции физиологического баланса между процессами дифференцировки В-лимфоцитов в антителопродуценты, либо в клетки памяти, что определяется в момент активного образования IgM-антителообразующих клеток.

3.2 Il-1 в регуляции иммунного ответа. Поскольку Il-1 играет немаловажную роль в стимуляции гуморального иммунного ответа [Bryant V.L., 2007], то интересно было оценить влияние рекомбинантного IL-1в на первичный и вторичный ответ in vivo в рамках нашей модели гиперстимуляции иммунного ответа.

Результаты проведенных экспериментов представлены на Рис. 7. Видно, что введение IL-1в на 4 сутки после иммунизации не оказывает существенного влияния на величину как первичного, так и вторичного иммунного ответа. Вероятно, данный интерлейкин не является ключевым регулятором пролиферации антителопродуцентов и клеток памяти в этот период, предшествующий пику IgM-ответа, и следовательно, нет оснований предполагать его решающее участие в механизме обнаруженной модуляции иммунных реакций под действием дополнительного введения антигена.

Рис.7. Гуморальный иммунный ответ у мышей BDF1 на фоне введения IL-1в; (M).

В то же время введение IL-1в одновременно с первичной иммунизацией животных (в опытах без дополнительной антигенной стимуляции) значимо снижает уровень первичного IgG-ответа на антиген (Рис. 7Б) и стимулирует позднее проявляющуюся анамнестическую реакцию на тот же антиген (Рис. 7В), но не изменяет уровень первичного IgM-ответа (Рис. 7А).

Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными в системе in vitro [Koyama N. et al., 1988] и говорящими о том, что IL-1в стимулирует дифференцировку В-лимфоцитов лишь в первые двое суток после их контакта с антигеном. Учитывая эти и другие имеющиеся в литературе данные можно сделать вывод, что обнаруженное нами дискордантное действие IL-1в на первичный IgG-ответ и на образование клеток памяти является выражением его важной роли в регуляции В-клеточной дифференцировки на ранних этапах развития гуморальных иммунных реакций.

3.3 Уровень IgE в сыворотке мышей BDF1 в динамике развития первичного и вторичного гуморального иммунного ответа. Il-4 является важнейшим эндогенным регулятором дифференцировки и функциональной активности В-клеток. Для оценки его уровня в организме использовали определение концентрации IgE в сыворотке крови, поскольку существуют многочисленные данные об однозначной прямой корреляции между концентрацией IgE и продукцией Il-4 в организме [Umland S.P. et al, 1992; Schorlemmer H.U et al, 1997].

Многократные измерения уровня IgE в динамике развития гуморальных иммунных реакций на разные дозы антигена (со второго дня после первичной иммунизации до пика вторичного IgG-ответа) не выявили существенных изменений этого параметра по сравнению с интактными (неиммунизированными) животными. Это позволяет предположить, что хотя Il-4 и необходим для осуществления гуморального иммунного ответа, его физиологический уровень достаточно высок и не лимитирует активацию и пролиферацию антигенспецифических В-лимфоцитов.

3.4.Оксид азота (NO) в регуляции гуморального иммунного ответа. Показано, что продукция NO в органах иммунной системы увеличивается при иммунизации и влияет на формирование T-клеток памяти, скорее всего за счет нарушения процессов апоптоза антиген-активированных клеток [Меньщикова Е.Б. и др., 2000; Vig M et.al, 2004]. Поэтому интересно было оценить влияние уровня NO на развитие гуморальных иммунных реакций. С этой целью иммунизированным мышам на протяжении 8 суток (ежедневно, начиная с 4 суток) вводили либо аминогуанидин - ингибитор продукции NO [Iadecola C. et al, 1997], либо L-норвалин, стимулирующий его образование в клетках [Erden C.D., 2003].

Предполагалось, что введение этих препаратов может изменить количество клеток, продуцирующих IgM- и IgG-антитела. Однако результаты проведенных экспериментов не дают убедительных доказательств того, что уровень продукции NO влияет на развитие исследованных иммунных реакций: достоверных изменений выраженности интенсивности ни первичного, ни вторичного гуморального ответа обнаружено не было.

4. Формирование иммунной памяти при развитии патологии

В качестве модели использована хроническая РТПХ, индуцированная в системе DBA/2(DBA/2xC57Bl/6)F1, развитие которой идет по двум оппозитным вариантам, приводя к возникновению либо иммунокомплексного гломерулонефрита (lupus-реципиенты), либо иммунопатологического состояния без выраженного поражения почек (nonlupus-реципиенты). Показано, что развитие обоих вариантов хРТПХ сопровождается выраженной супрессией первичного иммунного ответа на Т-зависимый антиген, особенно резко снижено количество IgG-АОК в селезёнке, которое составляет 0,4% и 10,2% относительно контроля, соответственно, у nonlupus- и lupus-реципиентов [Кудаева О.Т. и др., 2010]. Учитывая это, у животных с различными клиническими вариантами течения хРТПХ было изучено формирование иммунной памяти и проверено, сохранена ли у них способность, несмотря на супрессию первичного иммунного ответа, отвечать его повышением на дополнительное введение антигена.

Результаты проведенных экспериментов представлены на Рис. 8. Видно, что анамнестическая реакция у мышей с обоими вариантами иммунопатологии достоверно подавлена по сравнению с интактным контролем. В то же время выраженность супрессии при вторичном иммунном ответе оказывается значительно меньшей, нежели при первичном IgM и IgG-ответе: при первичной иммунизации субоптимальной дозой антигена у nonlupus-реципиентов количество вторичных IgG-АОК составляет 41%, а у lupus-66 % относительно контроля, при первичной иммунизации оптимальной дозой антигена эти значения достигают 30,5 и 50% соответственно.

Супрессия гуморального ответа более выражена в группе nonlupus-реципиентов, что проявляется как в отношении первичного IgG-ответа, так и при оценке количества IgG-антителопродуцентов в селезёнке и костном мозге при вторичном ответе (Рис.8).

Таким образом, глубокая депрессия первичного ответа не сопровождается подавлением в такой же степени анамнестической реакции; вторичный иммунный ответ оказывается относительно более сохранным, особенно при иммунизации оптимальной дозой антигена у lupus-реципиентов.

Рис.8. Уровень вторичного гуморального иммунного ответа у реципиентов с хронической РТПХ (M).

Возможно, это свидетельствует о более жёстко закреплённых процессах формирования иммунной памяти, устойчивых к действию факторов, регулирующих высоту первичного ответа. Выяснение причин дискорданса между уровнем первичного и вторичного ответа при хронической РТПХ требует дальнейшего исследования.

Данные, представленные на Рис. 9, демонстрируют, что дополнительное введение антигена в позднюю лог-фазу развивающегося первичного ответа, так же как и у мышей в норме, приводит к гиперстимуляции IgG-ответа.

Рис. 9. Уровень первичного IgG-гуморального ответа у мышей с РТПХ при дополнительном введении антигена (M).

Однако количество IgG-АОК в nonlupus- и lupus-группах, остается сниженным по сравнению с аналогичными мышами в контрольной группе, причем у nonlupus-мышей это снижение достигает степени достоверности (Рис. 9), что, вероятно, можно объяснить имеющимся у них преобладанием Th1-зависимых иммунных реакций.

Известно, что индукция РТПХ сопровождается мощным всплеском продукции цитокинов разными популяциями иммунных клеток - «цитокиновым штормом» [Ferrara J.L. , 2000; Krenger W. et Ferrara J.L., 1996]. В частности, в обоих случаях на ранних стадиях происходит возрастание продукции Il-4 [Murphy W.J.et al, 1998, Rus V. et al, 1995].

Ранее по оценке уровня IgE нами показано, что происходит выраженная стимуляция продукции Il-4 при хронической РТПХ, которая только при достижении относительно более высоких значений сопровождается формированием аутоиммунной патологии [Гойман Е.В.и др., 2009].

Рис.10. Уровень IgE у реципиентов с хронической РТПХ при формировании иммунной памяти; (М).

Оценка уровня IgE при формировании иммунной памяти у животных с патологией, проведенная в данной работе, еще раз подтвердило, что индукция РТПХ приводит к стимуляции IgE (Рис. 10). Группы контрольных животных содержат более низкий уровень этого иммуноглобулина, чем nonlupus- и lupus-реципиенты. Причем низкий уровень IgE в контрольных группах не изменяется под действием антигена. В то время у мышей с патологией после формирования иммунной памяти вторичный IgG-ответ сопровождается определенным сдвигом в сторону снижения уровня IgE в сыворотке, причем у lupus-мышей это снижение статистически достоверно. Эти данные можно расценить как косвенное свидетельство того, что исследованные нами иммунопатологические состояния приводят к принципиальному изменению механизмов цитокиновой регуляции гуморальных иммунных реакций.

Резюмируя полученные в работе данные, можно сказать, что изменения уровней первичного и вторичного ответов, выявленные при использовании разных доз антигена на животных разных генотипов, свидетельствуют, что для образования пула клеток памяти и/или долгоживущих плазматических клеток достаточно минимального антигенного стимула, который является пусковым сигналом достаточно жёстко закреплённых процессов формирования иммунной памяти. Первичный, как IgM-, так и IgG-ответ, который определяется деятельностью короткоживущих антителопродуцентов, более подвержен влиянию регулирующих факторов. Показанная в работе обратная зависимость между уровнями первичного и вторичного ответа на антиген демонстрирует наличие закономерной связи интенсивности анамнестической реакции с величиной первичного IgM- и IgG-ответа в ситуации резко выраженной стимуляции последнего. Закономерности соотношения первичного и вторичного ответа могут иметь значение для выбора оптимальных доз и схем введения антигенов при вакцинациях и технологическом получении специфических антител.

ВЫВОДЫ

1. Повторное введение антигена в позднюю лог-фазу первичного ответа приводит к резкому увеличению количества как IgM-, так и IgG-антителопродуцентов на пике первичного ответа и в тоже время снижает уровень вторичного IgG-ответа, что свидетельствует о модулирующем действии антигена. Эффект на первичный ответ дозозависим и наблюдается только при субоптимальной иммунизации мышей.

2. При введении антигена в позднюю лог-фазу первичного ответа как подкожно (под апоневроз), так и при внутривенном введении наблюдается подавление анамнестического ответа. Это указывает на то, что фактором, супрессирующим формирование иммунной памяти, являются системные реакции, вызванные дополнительным введением антигена, а не локально развивающееся воспаление в месте его поступления в организм.

3. Введение гидроксимочевины - ингибитора синтеза ДНК - одновременно с дополнительным введением антигена во время лог-фазы первичного IgM-ответа снижает подъём IgM-АОК, но не отменяет стимуляцию образования количества первичных и вторичных IgG-АОК, что указывает на важную роль в стимуляции IgM-ответа, вызванной повторным введением антигена, пролиферативных процессов.

4. При стимуляции ответа наблюдается подъём уровня TNFб, пик которого приходится на период активного образования IgM-антителопродуцентов. Связывание TNFб, введением TNF-связывающего белка вируса натуральной оспы в момент дополнительного поступления антигена, подавляет стимуляцию первичного и подавление вторичного ответа, что позволяет говорить о важной роли TNFб в дифференцировке В-лимфоцитов в антителопродуценты и клетки памяти.

5. Введение Il-1в в момент иммунизации, но не в позднюю лог-фазу развивающегося IgM-ответа, достоверно снижает первичный и стимулирует вторичный IgG-гуморальный ответ, что свидетельствует об участии Il-1в в регуляции гуморальных иммунных реакций в индуктивную фазу первичного ответа на антиген.

6. Глубокая депрессия первичного ответа в экспериментальных моделях, индуцированных хронической РТПХ, не сопровождается подавлением в такой же степени анамнестической реакции. Эффект проявляется более выражено у lupus-реципиентов при первичной иммунизации оптимальной дозой антигена. Это свидетельствует о более жёстко закреплённых процессах формирования иммунной памяти, устойчивых к действию факторов, регулирующих высоту первичного ответа, у мышей при развитии аутоиммунных патологических состояний.

7. Дискордантные изменения первичного гуморального ответа на Т-зависимый антиген и последующей анамнестической реакции, наблюдаемые при физиологических и иммунопатологических состояниях, в частности, при дополнительном поступлении этого же антигена в организм или действии других регулирующих факторов, таких как TNFб и Il-1в, свидетельствуют о том, что уровень первичной реакции на антиген не является предопределяющим для формирования иммунной памяти.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Колесникова О.П. Регуляторные взаимодействия между клеточным и гуморальным иммунным ответом при формировании иммунной памяти. // Материалы Всероссийского научного симпозиума «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет»-Новосибирск,19-21 июля 2005 // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т.4. - №2 .- С.83.

2. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Колесникова О.П. Регуляторные механизмы и взаимосвязь между клеточным и гуморальным иммунным ответом при формировании иммунной памяти. // Материалы 2-й Российской школы по иммунотерапии // Цитокины и воспаление. - 2005. - Т.4. - №3. - С.133.

3. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т. Колесникова О.П. Регуяторные взаимодействия между клеточным и гуморальным звеньями иммунного ответа при формировании иммунной памяти на Т-зависимый антиген.// Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике. Сб. материалов 7-й отчетной конференции ГУ НИИКИ СО РАМН, Новосибирск.- 2006. - С.33-36.

4. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Колесникова О.П.. Регуляторные взаимодействия между клеточным и гуморальным ответом при формировании иммунной памяти. // Вестник Уральской медицинской академической науки.-2006-№3-1(14)- С.32-35.

5. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Колесникова О.П. Стимуляция синтеза антител в продуктивную фазу ответа низкими дозами антигена. Тезисы 3 Международной конференции «Фундаментальная наука - медицине» - Новосибирск. - 2007. - С. 112.

6. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Колесникова О.П. // Антиген как фактор регуляции синтеза антител в продуктивную фазу иммунного ответа // Омский научный вестник. - 2007. - Т.61. - №3. - С.17-18.

7. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Колесникова О.П. Козлов В.А. Роль пролиферативной активности антителопродуцентов в формировании иммунной памяти // Матер. конфер. «Дни иммунологии в Сибири-2008».Сиб. мед. журн. - 2008. - Т.23. - №3 (выпуск 1). - С.89.

8. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Колесникова О.П. Козлов В.А. Роль пролиферирующих антителопродуцентов в формировании иммунной памяти// Тез. Объединенного иммунологического форума Санкт-Петербург - 2008. Рос. иммунол. журн. - 2008. - Т.2(11). - №2-3. - С.119.

9. Гойман Е.В., Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Колесникова О.П. Уровень IgE в динамике развития разных вариантов хронической реакции трансплантат против хозяина.//Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2009. - №2/1(24). - С.27-28.

10. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Перминова О.М., Колесникова О.П. Изучение общего уровня IgE при первичном и вторичном иммунном ответе.//Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2009. - №2/1(24). - С.244-245.

11. Кудаева О.Т., Гаврилова Е.Д., Гойман Е. В., Ненашева Е.В., Колесникова О.П., Козлов В.А. Особенности иммунодепрессии при хронической реакции «трансплантат против хозяина» // Иммунология - 2010.-№4.-С.199-203.

12. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Гойман Е.В., Колесникова О.П. Особенности иммунного ответа при хронической реакции трансплантат против хозяина. Всероссийск. научн-практ. конф. с межд. участием «Дни иммунологии в Сибири», Красноярск. - 2010.- С.13-15.

13. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Колесникова О.П., Козлов В.А. Стимуляция иммунного ответа: резистентность к ингибиторам пролиферации.//БЭБиМ.-2010.-Т.149.- №3.-С.328-331; 304-307 (англ).

14. Кудаева О.Т., Гаврилова Е.Д., Колесникова О.П., Козлов В.А. Формирование иммунной памяти при стимуляции первичного гуморального ответа.// Росс.иммунолог.журн. .- 2010.- Т.4(13).- №3.- С.237-247.

15. Гаврилова Е.Д., Ткачев В.О., Кудаева О.Т., Колесникова О.П. Участие TNFб в феномене антигенной гиперстимуляции гуморального иммунного ответа. // Всероссийск. конф. «Молекулярно-генетические основы функционирования цитокиновой сети в норме и при патологии», Новосибирск, 2010. -Цитокины и воспаление. - 2010.- T.10. - №3. - С.51-52.

16. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Ткачев В.О., Гилева И.П., Колесникова О.П. Регуляция процессов антителообразования при антигенной гиперстимуляции гуморального иммунного ответа// Матер. конфер. «Дни иммунологии в Сибири-2011».-Абакан.-С.10-12.

17. Кудаева О.Т., Гаврилова Е.Д., Ткачев В.О., Гилева И.П., Колесникова О.П. Дискордантное развитие первичного и вторичного иммунного ответа при экспериментольных воздействиях.// Матер XIVвсероссийского научного Форума « Дни иммунологии в Санкт-Петербурге 2011» - 2011. -Медицинская иммунология. - Т.13.- №4-5. - С.320-321.

18. Гаврилова Е.Д. Антиген как фактор регуляции первичного гуморального иммунного ответа.// Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике. Сб. материалов 8-й отчетной конференции НИИКИ СО РАМН. -Новосибирск.- 2011. - С.22-24.

19. Кудаева О.Т., Гаврилова Е.Д. Дискордантное развитие первичного и вторичного иммунного ответа.// Иммунопатогенез и иммунотерапия основных заболеваний человека: от эксперимента к клинике. Сб. материалов 8-й отчетной конференции НИИКИ СО РАМН. -Новосибирск.- 2011. - C.36-38.

20. Гаврилова Е.Д., Кудаева О.Т., Ткачев В.О., Гилёва И.П., Колесникова О.П. Участие TNFб в регуляции процессов антителообразования.//Вестник Уральской медицинской академической науки. -2011. - № 2/2, (35) - С. 19-20.

Размещено на Allbest.ru

...