Гетерогенность и функциональная пластичность макрофагов второго типа активации

TGF-1 активирует экспрессию IL-17BR не только в моноцитах, но и в зрелых макроафгах второго типа

Для описания эффекта TGF-1 на макрофаги, эксперимент был построен следующим образом: макрофаги дифференцировались в присутствии IL-4 или IL-4 в комбинации с дексаметазоном в течение 5 дней, после чего клетки стимулировали TGF-1. Так как TGF-1-зависимый сигналлинг достаточно быстрый процесс (Schmierer and Hill, 2005), то экспрессия мРНК IL-17BR была исследована через 3 и 24 часа после начала стимуляции (Рис. 19). Результаты количественной ПЦР показали отсутствие эффекта TGF-1 на экспрессию мРНК IL-17BR через 3 часа стимуляции. Через 24 часа стимуляции статистически достоверное 5-и кратное увеличение экспрессии наблюдалось в случае М2IL-4/ГК, в то время как 2-х кратное увеличение экспрессии в случае M2IL-4 не было статистически достоверным. Полученные результаты указывают на то, что зрелые макрофаги сохраняют способность отвечать на стимуляцию TGF-1, причем М2IL-4/ГК обладают этой способностью в большей степени, чем M2IL-4.

Рисунок 19. Анализ способности TGF-1 усилить экспрессию мРНК IL17BR в зрелых макрофагах. Макрофаги дифференцировались в присутствии IL-4 или IL-4 в комбинации с дексаметазоном в течение 5 дней. Далее макрофаги стимулировали TGF-1 как указано. Экспрессию мРНК IL17BR исследовали при помощи количественной ПЦР. Экспрессия в М2IL-4 на 5 день взята за 1.

Анализ дифференциальной экспрессии генов в зрелых макрофагов, стимулированных TGF -1

Так как для М2IL-4 и М2IL-4/ГК была обнаружена разница в ответе на TGF-1, далее был исследован весь спектр генов, активируемых в этих клетках TGF-1. Макрофаги, полученные, так же как и для предыдущего эксперимента, стимулировали TGF-1 в течение 24 часов и использовали для выделения РНК, которая была исследована при помощи биочипов фирмы Affymetrix. Для получения статистически достоверных данных в эксперименте были использованы макрофаги от 5 различных доноров. Исследование дифференциальной экспрессии генов не выявило статистически достоверных различий между M2IL-4 и M2IL-4 стимулированными TGF-1 (Рис. 20). Этот результат подтверждал данные, полученные при анализе эффекта TGF-1 на экспрессию мРНК IL-17BR (Рис. 19), а так же данные других групп, где сообщалось, что зрелые макрофаги не способны эффективно отвечать на TGF-1 (Ashcroft, 1999). Однако, в M2IL-4/ГК стимуляция TGF-1 приводила к 4-х кратному и более повышению экспрессии более чем 90 генов (p<0.000001) (Рис. 20). Основываясь на полученных данных, дальнейшие исследования были сконцентрированы на M2IL-4/ГК. Для получения данных о генах, напрямую активируемых TGF-1, при помощи биочипов были также проанализированы M2IL-4/ГК стимулированные TGF-1 в течение 3-х часов. Анализ дифференциальной экспрессии генов в M2IL-4/ГК стимулированных TGF-1 в течение 3 и 24 часов, позволил выявить 2 группы генов, отличающихся по времени активации. Группа генов «раннего ответа» содержала 44 гена, экспрессия которых была усилена в 4 и более раз уже через 3 часа после стимуляции. Группа «позднего ответа» содержала 90 генов, экспрессия которых была усилена в 4 и более раз через 24 часа после стимуляции. 23 гена попали в обе группы. Полученных данные указывают на то, что TGF-1 активирует сложную программу регуляции транскрипции, и наблюдаемые эффекты содержат как непосредственные эффекты TGF-1 на экспрессию генов, так и вторичные, включающие пути передачи сигнала, использующие факторы, экспрессия которых активировалась TGF-1 (Li et al, 2006).

Рисунок 20. Анализ дифференциальной экспрессии генов пои помощи биочипов фирмы Affymetrix.

Таблица 1. Функциональные группы генов, экспрессия которых увеличивалась при стимуляции TGF-1 не менее чем в 4 раза (FC?2)

Среди генов, экспрессия которых усиливалась под действием TGF-1 были выделены 5 функциональных групп (Таблица 1). Первая группа содержала 12 генов, участвующих в регуляции транскрипции, причем большинство из них (9 из 12) относились к генам «раннего ответа». Среди этих генов были обнаружены описанные Smad3-зависимые гены JUNB и FOS(Li et al, 2004) (Tаблица 1). Вторая группа содержала 5 генов, участвующих в регуляции сигнального пути, активируемого TGF- или BMP, включая гены, отвечающие за негативную обратную связь - Smad7 и Smad6 (Piek et al, 1999). Три из 5 генов этой группы относились к «раннему ответу» (Таблица 1). Следующие 3 группы генов (регуляция иммунного ответа, транспорт и процессинг липидов, клеточная адгезия) в основном включали гены из группы «позднего ответа» (24 из 25). Гены, участвующие в регуляции иммунного ответа включали различные рецепторы, растворимые факторы, сигнальные молекулы, а так же ферменты, участвующие в синтезе лейкотриенов. Среди генов, участвующих в метаболизме липидов был рецептор для окисленных LDL, OLR1 (Draude and Lorenz, 2000), а так же и некоторые аполипопротеины (Таблица 1). Подобная классификация генов, позволяет утверждать, что при стимуляции зрелых макрофагов TGF-1 наряду с активацией генов, напрямую зависимых от Smad, происходит повышение экспрессии ряда транскрипционных факторов, которые в свою очередь приводят к активации генов «позднего ответа».

Подтверждение данных, полученных при помощи биочипов

Для подтверждения данных, полученных при помощи биочипов, экспрессия мРНК Smad7, ID3, OLR1 и IL-17BR была исследована при помощи количественной ПЦР. M2IL-4/ГК стимулировали TGF-1 на 5-й день культуры, после чего клетки собирали через 1, 2, 3, 6, и 24 часа. Количественная ПЦР показала, что экспрессия мРНК OLR1 повышалась непрерывно на протяжении всего исследованного периода (Рис. 21). Повышение экспрессии мРНК OLR1 становилось статистически значимым через 3 часа стимуляции. В отличие от OLR1, увеличение экспрессии мРНК Smad7 и ID3 становилось статистически значимым уже через час после начала стимуляции клеток TGF-1 и сохранялась на этом уровне, на протяжении всего периода стимуляции (Рис. 21). В соответствии с ранее полученными данными (Рис. 19, Таблица 1), статистически достоверное увеличение экспрессии мРНК IL-17BR наблюдалось лишь через 24 часа стимуляции (Рис. 21). Важно отметить, что степень увеличения экспрессии генов, определенная при помощи количественной ПЦР, была значительно выше, чем степень увеличения экспрессии, выявленная при помощи биочипов. Так, например, экспрессия мРНК OLR1 увеличивалась в 19.7 раз по данным биочипов, но в 180 раз по данным количественной ПЦР. Эта разница в чувствительности двух методов позволила предположить, что возможно, усиление экспрессии генов в ответ на TGF-1 в M2IL-4 не было обнаружено по причине низкой чувствительности метода. Для проверки этого предположения экспрессия генов «раннего ответа» была исследована в M2IL-4 при помощи количественной ПЦР.

Рисунок 21. Анализ усиления экспрессии генов в M2IL-4/ГК в ответ на стимуляцию TGF-1. Макрофаги дифференцировались в присутствии IL-4 в комбинации с дексаметазоном в течение 5 дней. Стимуляция TGF-1 проводилась, как указано. Уровень экспрессии мРНК определялся при помощи количественной ПЦР, экспрессия на момент начала стимуляции принималась за 1.

Анализ экспрессии генов «раннего ответа» в M2IL-4 стимулированных TGF-1

М2IL-4 на 5-й день культуры стимулировали TGF-1 в течение 3 и 24 часов, после чего экспрессию мРНК OLR1, Smad7 и ID3 измеряли при помощи количественной ПЦР. Действительно, статистически значимое увеличение экспрессии мРНК было обнаружено в случае ID3 и OLR1 после 24 часов стимуляции. Однако, степень увеличения экспрессии бала существенно меньше, чем в случае M2IL-4/ГК. Так, через 3 часа стимуляции TGF-1, в M2IL-4 экспрессия мРНК Smad7 была увеличена в 2 раза, в то время как в M2IL-4/ГК она была увеличена в 20 раз. Похожая разница была обнаружена в случае мРНК ID3 (4 раза в M2IL-4 и 30 раз в M2IL-4/ГК) и OLR1 (1.6 раза в M2IL-4 и 12 раз в M2IL-4/ГК). Через 24 часа стимуляции эта разница становилась еще более выраженной в случае мРНК OLR1 (2.5 раза в M2IL-4 и 180 раз в M2IL-4/ГК). Вместе с данными, полученными при помощи биочипов, результаты количественной ПЦР указывают на то, что дексаметазон влияет на способность макрофагов отвечать на TGF-. Предположительно, обработка макрофагов дексаметазоном приводит к появлению фундаментального молекулярного различия в TGF--зависимом сигнальном пути между M2IL-4 и M2IL-4/ГК.

Дексаметазон регулирует поверхностную экспрессию TGFRII

Так как регуляция экспрессии рецепторов для TGF- на уровне мРНК была описана в макрофагах (Ashcroft, 1999; Pioli et al, 2004) и опухолевых клетках (Peltier et al, 2003), экспрессия мРНК TGFRI (ALK5) и TGFRII в разных популяциях макрофагов была исследована при помощи количественной ПЦР. Макрофаги культивировали в течение 5 дней в среде без стимуляторов, в присутствии дексаметазона, IL-4 и их комбинации. Полученные данные показали, что дексаметазон приводит к двухкратному повышению экспрессия мРНК рецепторов, которое не является статистически значимым. Исследование общего количества белка TGFRII так же не выявило существенных различий между макрофагами, стимулированными и не стимулированными дексаметазоном.

Так как активность рецептора может регулироваться на уровне поверхностной локализации, экспрессия TGFRII и endoglin (вспомогательный рецептор для TGF) на поверхности макрофагов была исследована при помощи проточной цитометрии. Эксперимент показал, что TGFRII экспрессируется на высоком уровне на поверхности макрофагов, стимулированных дексаметазоном (M2ГК) или его комбинацией с IL-4 (M2IL-4/ГК). При этом поверхностная экспрессия TGFRII была значительно ниже в случае нестимулированных макрофагов, и полностью отсутствовала в случае M2IL-4 (Рис. 22). Количественный анализ полученных данных показал, что дексаметазон приводит к 13 кратному увеличению поверхностной экспрессии TGFRII в M2ГК по сравнению с контрольными макрофагами и более чем 20 кратной разнице между M2IL-4/ГК и M2IL-4

Рисунок 22. Анализ поверхностной локализации рецепторов TGFRII и endoglin. Макрофаги культивировали в течение 5 дней в присутствии дексаметазона и IL-4 как указано. Поверхностную экспрессию рецепторов исследовали при помощи проточной цитометрии.

(Рис. 22). В то же время endoglin экспрессировался в равной степени на поверхности всех исследованных популяций макрофагов, указывая на то, что наблюдаемый эффект не является общим для всех рецепторов к TGF а специфичен для TGFRII.

Дексаметазон приводит к поверхностной экспрессии рецептора к TGF-

Для исследования влияния дексаметазона на экспрессию TGFRII в присутствии цитокинов, отличных от IL-4, макрофаги культивировали в среде с добавлением IL-13, M-CSF и GM-CSF в комбинации с дексаметазоном или без него. Исследование поверхностной экспрессии TGFRII через 5 дней культуры показало, что, так же как и IL-4, IL-13 приводил к снижению уровня экспрессии TGFRII до фонового уровня. Стимуляция макрофагов M-CSF приводила к сохранению хорошо определяемой экспрессии TGFRII на поверхности клеток, в то время как стимуляция GM-CSF приводила к сохранению лишь незначительной экспрессии TGFRII. Добавление дексаметазона в культуральную среду приводило к существенному повышению количества TGFRII на поверхности клеток независимо от стимуляции.

Для исследования способности этих макрофагов отвечать на TGF-1, была проанализирована экспрессия мРНК генов OLR1, IL17BR, ID3 и Smad7. Макрофаги культивировали 5 дней в среде, содержащей IL-13, M-CSF или GM-CSF с добавлением и без добавления дексаметазона и стимулировали TGF-1 в течение 24 часов (Рис. 23). Количественная ПЦР показала, что экспрессия мРНК IL17BR и Smad7 не может быть активирована TGF-1 в контрольных макрофагах и макрофагах, стимулированных каждым цитокином в отдельности без добавления дексаметазона. В то же время, экспрессия мРНК ID3 и OLR1 повышалась в ответ на стимуляцию TGF-1 в контрольных макрофагах и макрофагах, стимулированных M-CSF (Рис. 23). Эти данные хорошо согласуются с обнаруженной остаточной экспрессией TGFRII в контрольных макрофагах и макрофагах, стимулированных M-CSF.

Рисунок 23. Исследование способности макрофагов отвечать на стимуляцию TGF-1. Макрофаги культивировали в среде с добавлением цитокинов и дексаметазона, как указано, в течение 5 дней и стимулировали TGF-1 в течение 24 часов. Экспрессию мРНК OLR1, IL17BR, ID3 и Smad7 исследовали при помощи количественной ПЦР.

Стимуляция макрофагов дексаметазоном, независимо от того в какой комбинации он использовался, приводила к существенному увеличению экспрессии мРНК OLR1, ID3 и Smad7 в ответ на TGF-1. Для IL17BR, существенное увеличение экспрессии наблюдалось только в случае стимуляции макрофагов комбинацией IL-13 и дексаметазона, так как необходимым условием для включения экспрессии гена IL17BR является наличие в среде IL-4 или IL-13 (Gratchev et al, 2004).

Кинетика и дозозависимость действия дексаметазона на поверхностную экспрессию TGFRII

Для исследования зависимости уровня поверхностной экспрессии TGFRII от концентрации дексаметазона, использованного для стимуляции, макрофаги культивировали в течение 5 дней в присутствии IL-4 и различных концентраций дексаметазона в диапазоне от 1x10-7 до 1x10-9M. Уровень поверхностной экспрессии определялся при помощи проточной цитометрии. Эксперимент показал четкую зависимость уровня экспрессии TGFRII от концентрации дексаметазона. Различие между клетками, стимуляция которых включала дексаметазон, и контрольными клетками, стимулированными только IL-4, становилось статистически достоверным при концентрации дексаметазона 1x10-8 M. Эта концентрация попадает в диапазон, соответствующий диапазону физиологических концентраций кортизола в крови здорового взрослого человека (от 4x10-9 до 2x10-8M) (Рис. 24). Стоит отметить, что концентрация 1x10-8 M приводит к уровню поверхностной экспрессии TGFRII, который лишь в 3 раза ниже, чем уровень экспрессии, наблюдаемый на поверхности макрофагов, обработанных фармакологической концентрацией дексаметазона - 1x10-7M (Рис. 24), которая обнаруживается в крови пациентов при системной терапии с использованием глюкокортикоидов, например при лечении ревматоидного артрита (Wenting-Van Wijk et al, 1999).

Рисунок 24. Анализ зависимости уровня поверхностной экспрессии TGFRII от концентрации дексаметазона. Макрофаги культивировали в течение 5 дней в присутствии IL-4 и различных концентраций дексаметазона. Уровень экспрессии TGFRII измеряли при помощи проточной цитометрии. Уровень экспрессии в макрофагах стимулированных IL-4 и дексаметазоном в концентрации 1x10-7M был взят за 100%.

Для понимания, является ли изменение уровня поверхностной экспрессии TGFRII прямым эффектом дексаметазона, или же это результат сложных процессов, происходящих при дифференцировке макрофагов, была исследована кинетика увеличения поверхностной экспрессии TGFRII. Макрофаги культивировали в присутствии IL-4 или комбинации IL-4 и дексаметазона в концентрации 1x10-7M. Поверхностная экспрессия TGFRII исследовалась на 1, 2, 3, 4 и 5 дни культуры при помощи проточной цитометрии. Эксперимент показал, что в M2IL-4 экспрессия TGFRII падала до уровня фона в течение первых 3-х дней культуры (Рис. 25). Эти данные хорошо согласуются с опубликованными данными о потере поверхностной экспрессии TGFRII макрофагами (Ashcroft, 1999). При этом в M2IL-4/ГК поверхностная экспрессия TGFRII незначительно снижалась после 1 дня культуры, и затем непрерывно повышалась, достигая плато на 4-й день культуры (Рис. 25). Разница в поверхностной экспрессии TGFRII между M2IL-4 и M2IL-4/ГК становилась статистически достоверной уже на 1-й день культуры (Рис. 25). Полученные данные указывают на то, что для поддержания поверхностной экспрессии TGFRII, глюкокортикоид должен присутствовать в культуральной среде на протяжении всего периода дифференцировки макрофагов. Таким образом, можно утверждать, что физиологические концентрации глюкокортикоидов достаточны для поддержания способности макрофагов отвечать на TGF-. При этом особое внимание следует уделять повышению поверхностной экспрессии TGFRII наблюдаемому при повышении концентрации глюкокортикоидов. Этот эффект небходимо учитывать при использовании глюкокортикоидов в терапевтических целях.

Рисунок 25. Анализ зависимости уровня поверхностной экспрессии TGFRII от стадии дифференцировки макрофагов. Макрофаги культивировали в присутствии IL-4 или IL-4 в комбинации с дексаметазона в концентрации 1x10-7M. Уровень экспрессии TGFRII измеряли на 1, 2, 3, 4 и 5 дни при помощи проточной цитометрии. Уровень экспрессии в моноцитах был взят за 100%.

Функциональная активнось TGFRII

Повышенная поверхностная экспрессия TGFRII должна приводить к эффективной активации Smad-зависимого сигнального пути при стимуляции клеток TGF-. Для исследования активации Smad-зависимого сигнального пути было проанализировано фосфорилирование Smad2 в ответ на стимуляцию клеток TGF-. M2IL-4 и M2IL-4/ГК на 5-й день культуры стимулировали TGF-1 и при помощи Вестерн блоттинга определяли количество фосфорилированного Smad2 (Рис. 26). Было обнаружено, что уже через 10 минут стимуляции количество фосфорилированного Smad2 было не менее чем в 10 раз больше в M2IL-4/ГК по сравнению с M2IL-4, причем это различие сохранялось на протяжении 2 часов стимуляции. Общее количество Smad2 в M2IL-4/ГК и M2IL-4 различалось незначительно (Рис. 26).

Рисунок 26. Анализ фосфорилирования Smad2 в M2IL-4/ГК и M2IL-4 при стимуляции TGF-1. Макрофаги культивировали в течение 5 дней и стимулировали TGF-1 как указано. Smad2 и фосфо-Smad2 (pSmad2) исследовали при помощи Вестерн блоттинга.

Хотя уровень фосфорилирования Smad2 в M2IL-4/ГК и M2IL-4 существенно различался, разницы в кинетике процесса обнаружено не было. В обеих популяциях макрофагов фосфорилированный Smad2 наблюдался уже через 10 минут стимуляции и его уровень оставался неизменным на протяжении 2-х часов. Однако, как было обнаружено при анализе дифференциальной экспрессии генов, TGF-1 активировал экспрессию Smad7 - негативного регулятора Smad-зависимого сигнального пути (Ten Dijke and Hill, 2004). Поэтому далее была исследована возможная разница в функционировании негативной регуляции Smad-зависимого сигнального пути между M2IL-4/ГК и M2IL-4. Для этого эксперимента были выбраны временные точки 1 час, когда наблюдается значительно количество фосфорилированного Smad2, и 24 часа. Анализ количества фосфорилированного Smad2 показал, что через 24 часа стимуляции, его количество снижается до фонового уровня в M2IL-4, в то время как в M2IL-4/ГК Smad-зависимый сигнальный путь сохраняет достаточно высокую активность (Рис. 27).

Рисунок 27. Анализ фосфорилирования Smad2 в M2IL-4/ГК и M2IL-4 при стимуляции TGF-1. Макрофаги культивировали в течение 5 дней и стимулировали TGF-1 как указано. Smad2 и фосфорилированный Smad2 (pSmad2) исследовали при помощи Вестерн блоттинга.

Эти данные позволяют заключить, что повышенная поверхностная экспрессия TGFRII приводит к эффективной активации Smad-зависимого сигнального пути при стимуляции макрофагов TGF-1. Более того, сохраняющаяся в M2IL-4/ГК в течение 24 часов активность Smad-зависимого сигнального пути указывает на то, что негативная регуляция этого процесса замедлена или даже полностью инактивирована при стимуляции макрофагов глюкокортикоидами.

Влияние дексаметазона на негативную обратную связь Smad-зависимого сигнального пути

Для выяснения механизма замедленной негативной обратной связи, наблюдаемой в M2IL-4/ГК, была исследована экспрессия мРНК факторов, участвующих в этом процессе. M2IL-4/ГК и M2IL-4 были стимулированы TGF-1 в течение 24 часов и экспрессия мРНК Smurf2, RNF111, FKBP1A, SKIL и SIRT1 была исследована при помощи количественной ПЦР. Все вышеперечисленные факторы, за исключением SIRT1 необходимы для эффективного функционирования негативной обратной связи. Механизм действия этого процесса включает интернализацию рецептора, его полиубиквитинирование и деградацию. Отсутствие разницы в экспрессии этих факторов между M2IL-4/ГК и M2IL-4 (Рис. 28) позволяет предположить, что при активации Smad7 количество TGFRII на поверхности клетки должно снижаться. Действительно, в M2IL-4/ГК количество рецептора снижалось примерно на 30% через 24 часа стимуляции TGF-1 (Рис. 29). Несмотря на очевидное снижение поверхностной экспрессии рецептора, вопрос о причине недостаточной активности негативной обратной связи остается.

Рисунок 28. Анализ экспрессии факторов, участвующих в регуляции негативной обратной связи Smad-зависимого сигнального пути. Макрофаги культивировали в течение 5 дней в присутствии IL-4 или IL-4 в комбинации с дексаметазоном, и стимулировали TGF-1 в течение 24 часов. Экспрессию мРНК Smurf2, RNF111, FKBP1A, SKIL и SIRT исследовали при помощи количественной ПЦР.

Ответ на это вопрос дает анализ экспрессии мРНК SIRT1, которая оказалась повышена в M2IL-4/ГК. SIRT1 представляет собой фермент деацетилазу, который может приводить к деацетилированию Smad7 и его инактивации. Таким образом, повышенная поверхностная экспрессия TGFRII в комбинации с пониженной активностью негативной обратной связи приводит к продолжительной активности Smad-зависимого сигнального пути в M2IL-4/ГК.

Рисунок 29. Анализ поверхностной экспрессии TGFRII после 24 часов стимуляции TGF-1. МIL-4/ГК на 5-й день культуры стимулировали TGF-1 в течение 24 часов. Экспрессию TGFRII исследовали при помощи проточной цитометрии.

Проведенное исследование указывает на то, что зрелые макрофаги сохраняют способность отвечать на TGF- и эта способность может усиливаться при использовании глюкокортикоидов в терапевтических концентрациях. Так как эффект глюкокортикоидов на макрофаги не зависит от других факторов, воздействующих на клетку, то и ответ макрофагов на TGF- может изменяться в зависимости от цитокинового окружения. Полученные данные можно использовать для создания адекватной модели для исследования свойств опухоль ассоциированных макрофагов in vitro и поиска подходов для воздействия на их фенотип и функциональную активность.

Исследование влияния TGF- на макрофаги интересно прежде всего тем, что с начала 90-х годов прошлого века существовало мнение, что макрофаги неспособны отвечать на TGF-. Было известно, что моноциты несут на своей поверхности до 400 активных рецепторов к TGF- и способны ответить на стимуляцию снижением своего воспалительного потенциала, однако зрелые макрофаги теряют способность реагировать на TGF- по причине потери экспрессии рецептора (Ashcroft, 1999; Brandes et al, 1991; McCartney-Francis and Wahl, 1994; Wong et al, 1991). Действительно, эксперименты, проводимые с нестимулированными макрофагами, и макрофагами, дифференцированными в присутствии IL-4, подтвердили ранее опубликованные данные. Однако, физиологические условия, в которых происходит дифференцировка макрофагов, не ограничиваются отдельными цитокинами (в данном случае IL-4). В циркуляции млекопитающих присутствует натуральный ГК - кортизол. Синтетический аналог кортизола - дексаметазон, использованный в представленных в данной работе экспериментах в концентрациях, соответствующих физиологическим, эффективно поддерживал поверхностную экспрессию рецептора к TGF- в первичных человеческих макрофагах. Более того, повышение концентрации дексаметазона до фармакологических приводило к существенному повышению поверхностной экспрессии рецептора. Особенно стоит отметить, что дексаметазон повышал поверхностную экспрессию TGFRII на уровне регуляции его клеточной локализации, так как общее количество белка TGFRII в клетках было постоянным независимо от наличия глюкокортикоидов в среде. Подобный эффект глюкокортикоидов, то есть регуляция клеточной локализации белков без изменения уровня их экспрессии, наблюдался ранее в случае вирусных гликопротеинов (John et al, 1988), бета-катенина (Guan et al, 2004) и компонента плотного контакта ZO-1 (Buse et al, 1995). Несмотря на то, что данный феномен известен уже почти 20 лет, механизм этого явления остается неизученным.

Обнаружение условий необходимых для сохранения способности макрофагов отвечать на TGF-, позволило исследовать эффект этого фактора роста на экспрессию генов в макрофагах. Было обнаружено повышение экспрессии целого ряда факторов, регулирующих транскрипцию, участвующих в регуляции иммунного ответа и клеточной адгезии. Кроме того, в отдельную группу могут быть выделены гены, отвечающие за метаболизм липидов. Обнаруженные гены характерны для макрофагов, участвующих в хронических воспалительных процессах, таких как, например, атеросклероз. Соответствие полученного макрофагального фенотипа макрофагам, обнаруживаемым в атеросклеротической бляшке, прослеживается, прежде всего, по экспрессии генов, участвующих в метаболизме липопротеидов. Так было показано, что макрофаги атеросклеротической бляшки экспрессируют apolipoprotein E (APOE)(Ramji et al, 2006), лектин-подобный рецептор для oxLDL-1 (LOX или OLR1)(Draude and Lorenz, 2000), аполипопротеин C-II (APOC2)(Kawano et al, 2002), сортилин-подобный рецептор L (SORL1 или LR11), LRPAP1 и ABC транспортер ABCG1. Все эти гены участвуют в регуляции содержания холестерина в крови и так или иначе связаны с патогенезом атеросклероза (Carter, 2007; Ramji et al, 2006).

Однако, макрофаги атеросклеротической бляшки, имеющие фенотип характерный для хронического воспалительного процесса, по многим параметрам схожи с опухоль ассоциированными макрофагами. Наиболее ярким примером этого соответствия является повышенная экспрессия ферментов, участвующих в синтезе лейкотриена В4. Так в образцах опухолей пищевода обнаруживалась повышенная экспрессия ALOX5AP и LTA4 гидролазы - ферментов, необходимых для синтеза лейкотриена В4, роль которого в прогрессии и метастазировании опухолей была показана, например, для почечно-клеточной карциномы (Matsuyama et al, 2005).

Несмотря на то, что фенотип макрофагов, полученных в культуре при стимуляции IL-4, дексаметазоном и TGF- отражает лишь некоторые свойства опухоль ассоциированных макрофагов, можно утверждать, что полученная модель отражает часть свойств необходимых этим клеткам для участия в патогенезе опухолей. Для приближения к физиологической ситуации необходимо включить в модель другие цитокины, производимые опухолью, сигналы, получаемые макрофагами в результате межклеточных контактов, а так же такие физические факторы, как гипоксия.

Выводы

Клонирование и функциональный анализ маркера макрофагов второго типа активации стабилина-1 позволяет утверждать, что данный белок представляет собой многофункциональный скавенджер рецептор, участвующий в эндоцитозе различных продуктов распада. Повышенная экспрессия стабилин-1 при стимуляции макрофагов дексаметазоном полностью согласуется с повышенным эндоцитозным потенциалом этого типа клеток.

На примере IL-4 и дексаметазона исследована гетерогенность популяции макрофагов второго типа активации. Показано, что для макрофагов, стимулированных IL-4 характерна продукция компонентов внеклеточного матрикса и ферментов для его перестройки, в то время как дексаметазон приводит к развитию макрофагов с высоким эндоцитозным и фагоцитозным потенциалом.

Исследование способности макрофагов первого и второго типов активации реагировать на различные экзо- и эндогенные стимулы позволило подтвердить гипотезу о пластичности макрофагального фенотипа.

Исследование макрофагов второго типа, стимулированных трансформирующим фактором роста бета, позволило выявить IL17RB как маркер этого типа макрофагов, что еще раз подтвердило концепцию гетерогенности макрофагальной популяции.

Проведен глобальный анализ дифференциальной экспрессии генов, в зрелых макрофагах, стимулированных трансформирующим фактором роста бета. На основании полученных данных можно сделать вывод, что TGF стимулирует в макрофагах продукцию лейкотриенов, стимулирующих хемотаксис моноцитов и Т клеток. Кроме того, исследован механизм ответа макрофагов на TGF и опровергнута гипотеза о неспособности макрофагов реагировать на этот цитокин по причине потери поверхностной экспрессии рецептора. Показано, что глюкокортикоиды отвечают за транспорт рецептора на поверхность клетки, обеспечивая эффективный ответ на TGF.

Список работ опубликованных по теме диссертации

Gratchev A, Kzhyshkowska J, Kannookadan S, Ochsenreiter M, Popova A, Yu X, Mamidi S, Stonehouse-Usselmann E, Muller-Molinet I, Gooi L, Goerdt S. Activation of a TGF-{beta}-Specific Multistep Gene Expression Program in Mature Macrophages Requires Glucocorticoid-Mediated Surface Expression of TGF-{beta} Receptor II. J Immunol. 2008;180:6553-6565.

Kzhyshkowska J, Gratchev A, Schmuttermaier C, Brundiers H, Krusell L, Mamidi S, Zhang J, Workman G, Sage EH, Anderle C, Sedlmayr P, Goerdt S. Alternatively Activated Macrophages Regulate Extracellular Levels of the Hormone Placental Lactogen via Receptor-Mediated Uptake and Transcytosis. J Immunol. 2008;180:3028-3037.

Kzhyshkowska J, Marciniak-Czochra A, Gratchev A. Perspectives of mathematical modelling for understanding of intracellular signalling and vesicular trafficking in macrophages. Immunobiology. 2007;212:813-825.

Gratchev A, Kzhyshkowska J, Kothe K, Muller-Molinet I, Kannookadan S, Utikal J, Goerdt S. Mphi1 and Mphi2 can be re-polarized by Th2 or Th1 cytokines, respectively, and respond to exogenous danger signals. Immunobiology. 2006;211:473-486.

Kzhyshkowska J, Workman G, Cardo-Vila M, Arap W, Pasqualini R, Gratchev A, Krusell L, Goerdt S, Sage EH. Novel function of alternatively activated macrophages: stabilin-1-mediated clearance of SPARC. J Immunol. 2006;176:5825-5832.

Kzhyshkowska J, Gratchev A, Goerdt S. Stabilin-1, a homeostatic scavenger receptor with multiple functions. J Cell Mol Med. 2006;10:635-649.

Kzhyshkowska J, Mamidi S, Gratchev A, Kremmer E, Schmuttermaier C, Krusell L, Haus G, Utikal J, Schledzewski K, Scholtze J, Goerdt S. Novel stabilin-1 interacting chitinase-like protein (SI-CLP) is up-regulated in alternatively activated macrophages and secreted via lysosomal pathway. Blood. 2006;107:3221-3228.

Martens JH, Kzhyshkowska J, Falkowski-Hansen M, Schledzewski K, Gratchev A, Mansmann U, Schmuttermaier C, Dippel E, Koenen W, Riedel F, Sankala M, Tryggvason K, Kobzik L, Moldenhauer G, Arnold B, Goerdt S. Differential expression of a gene signature for scavenger/lectin receptors by endothelial cells and macrophages in human lymph node sinuses, the primary sites of regional metastasis. J Pathol. 2006;208:574-589.

Gratchev A, Kzhyshkowska J, Utikal J, Goerdt S. Interleukin-4 and dexamethasone counterregulate extracellular matrix remodelling and phagocytosis in type-2 macrophages. Scand J Immunol. 2005;61:10-17.

Kzhyshkowska J, Gratchev A, Brundiers H, Mamidi S, Krusell L, Goerdt S. Phosphatidylinositide 3-kinase activity is required for stabilin-1-mediated endosomal transport of acLDL. Immunobiology. 2005;210:161-173.

Cupurdija K, Azzola D, Hainz U, Gratchev A, Heitger A, Takikawa O, Goerdt S, Wintersteiger R, Dohr G, Sedlmayr P. Macrophages of Human First Trimester Decidua Express Markers Associated to Alternative Activation. Am J Reprod Immunol. 2004;51:117-122.

Kzhyshkowska J, Gratchev A, Martens JH, Pervushina O, Mamidi S, Johansson S, Schledzewski K, Hansen B, He X, Tang J, Nakayama K, Goerdt S. Stabilin-1 localizes to endosomes and the trans-Golgi network in human macrophages and interacts with GGA adaptors. J Leukoc Biol. 2004.

Politz O, Gratchev A, McCourt PA, Schledzewski K, Guillot P, Johansson S, Svineng G, Franke P, Kannicht C, Kzhyshkowska J, Longati P, Velten FW, Johansson S, Goerdt S. Stabilin-1 and -2 constitute a novel family of fasciclin-like hyaluronan receptor homologues. Biochem J. 2002;362:155-164.

Birk RW, Gratchev A, Hakiy N, Politz O, Schledzewski K, Guillot P, Orfanos CE, Goerdt S. [Alternative activation of antigen-presenting cells: concepts and clinical relevance]. Hautarzt. 2001;52:193-200.

Gratchev A, Schledzewski K, Guillot P, Goerdt S. Alternatively activated antigen-presenting cells: molecular repertoire, immune regulation, and healing. Skin Pharmacol Appl Skin Physiol. 2001;14:272-279.

Gratchev A, Guillot P, Hakiy N, Politz O, Orfanos CE, Schledzewski K, Goerdt S. Alternatively activated macrophages differentially express fibronectin and its splice variants and the extracellular matrix protein betaIG-H3. Scand J Immunol. 2001;53:386-392.

Goerdt S, Politz O, Schledzewski K, Birk R, Gratchev A, Guillot P, Hakiy N, Klemke CD, Dippel E, Kodelja V, Orfanos CE. Alternative versus classical activation of macrophages. Pathobiology. 1999;67:222-226.

Размещено на Allbest.ru