Кинетика замедленной флуоресценции экзогенных флуорофоров в биологических тканях

Размещено на http://www.allbest.ru/

Кинетика замедленной флуоресценции экзогенных флуорофоров в биологических тканях

Летута С.Н., Кувандыкова А.Ф.

Введение

Бесконтактные оптические методы диагностики биотканей позволяют, не травмируя объект исследования, оперативно обнаружить патологию и получить о ней необходимую информацию. Из известных оптических методов обнаружения опухолей наиболее перспективным и высокочувствительным является лазерная флуоресцентная диагностика (ЛФД) [1-4]. Метод ЛФД основан на сравнении спектрально-люминесцентных свойств эндогенных или экзогенных флуорофоров в клетках патологических и здоровых биологических тканей.

В данной работе представлены результаты исследований особенностей кинетики замедленной флуоресценции (ЗФ) и фосфоресценции молекул органических красителей, внедренных в биологические ткани. На основании полученных данных обоснована возможность использования в качестве измеряемого параметра для ЛФД времени жизни возбужденных состояний флуорофоров [5, 6].

Методы и объекты исследования

Объектом исследования служили ткани молочной железы здоровых самок мышей линии BYRB и особей со спонтанными злокачественными опухолями той же линии [7]. После оперирования мышей вырезанные фрагменты тканей помещались в физиологический раствор на 5-10 минут.

В качестве экзогенных флуорофоров были выбраны красители ксантенового класса - эритрозин и эозин [8]. Выбор данного класса красителей обусловлен их спектрально-люминесцентными свойствами: высоким квантовым выходом в триплетное состояние, интенсивной замедленной флуоресценцией и фосфоресценцией, хорошей растворимостью в воде и способностью проникать внутрь клеток [9]. Фрагменты тканей выдерживали в водном растворе красителя с концентрацией 10-3 М в течение 3-4 минут.

Окрашенные ткани помещались в герметичную термостатируемую камеру. Одновременно в камере располагалось шесть различных образцов. Таким образом, для них обеспечивались одинаковые условия эксперимента, что повышало достоверность результатов при исследовании длительной люминесценции красителей в тканях.

Экспериментально измерялась кинетика затухания ЗФ (лmax = 570 нм) или фосфоресценции (лmax = 680 нм) молекул красителей после импульсного фотовозбуждения. Для заселения S1 уровней молекул использовалось излучение второй гармоники лазера на YAG:Nd3+ с длиной волны л = 532 нм, работающего в импульсно-периодическом режиме. Параметры возбуждающего импульса: длительность импульса 10 нс, энергия до 20 мДж.

Кинетика затухания длительной люминесценции регистрировалась через монохроматор МДР-41 с помощью ФЭУ-84 с управляющим электродом. В момент возбуждения образцов, осуществлялось “запирание” ФЭУ путем подачи на управляющий электрод импульса отрицательной полярности амплитудой ~ 100 В. Синхронизация запуска лазера, регистрирующей системы и запирания ФЭУ, а также, сбор, накопление и первичная обработка экспериментальных данных осуществлялись на автоматизированной установке, включающей предварительный усилитель, аналогово-цифровой преобразователь, крейт-КАМАК и ПК.

Результаты и их обсуждение

В клетках биотканей содержатся различные тушители триплетных состояний, с которыми эндогенные молекулы красителей могут взаимодействовать. Наиболее эффективным тушителем триплетных состояний флуорофоров является молекулярный кислород. Тушение сопровождается фотосенсибилизированной генерацией синглетного кислорода [10-12].

Как показано в [10-12], в процессе аннигиляции мигрирующего синглетного кислорода с оставшимися непотушенными триплетными возбуждениями молекул красителей могут образовываться синглетные S1-состояния флуорофоров, дающие дополнительный вклад в ЗФ. В таком случае регистрируемая кинетика ЗФ складывается из трех сигналов различной природы - термоактивированной флуоресценции (ТЗФ), а также ЗФ, обусловленной синглет-триплетной и триплет-триплетной аннигиляцией (Т-Т аннигиляция). В результате кинетическая кривая трансформируется и становится немонотонно зависящей от времени. На коротких временах наибольший вклад в суммарный сигнал дает синглет-триплетная аннигиляция. В качестве иллюстрации сказанного на рисунке 1 показана кинетика ЗФ эритрозина в ткани молочной железы мыши линии BYRB при различной концентрации кислорода в атмосфере над образцом. Концентрация кислорода в атмосфере варьировалась путем дозированного продувания камеры с образцом азотом.

Для определения вклада Т-Т аннигиляции в регистрируемый сигнал была исследована кинетика ЗФ эритрозина в биотканях в атмосфере азота. Заметим, что нам не удалось получить абсолютно совпадающие результаты для разных животных, но установлена общая закономерность которая заключается в том, что в различных образцах кинетическая кривая в полулогарифмических координатах может быть аппроксимирована двумя прямыми. Так, на рис. 2 приведена кинетика ЗФ с константами затухания k1 = 0,131•106 с-1 и k2 = 0,07•106 с-1 соответственно. В среднем, соотношение констант k1/k2 составляет примерно 2 ч 3. Это позволяет высказать предположение и развитии в клетках биотканей процесса триплет-триплетной аннигиляции. В жидкой цитоплазме клеток такой процесс вполне возможен. флуоресценция молекула кислород краситель

Установлено, что при прочих равных условиях в нормальных и патогенных тканях кинетика длительной люминесценции различна. Вклад синглет-триплетной аннигиляции в суммарный сигнал ЗФ в нормальных тканях заметно меньше, чем в опухоли, что свидетельствует о меньшей концентрации кислорода в них. Этот вывод не согласуется с результатами работы [13], в которой показано, что содержание кислорода в пораженных онкологическими заболеваниями биотканях ниже, чем в нормальных. Ранее в работах [3,6] нами было показано, что в клетках, выделенных из опухолей и культивируемых на твердом биоматериале, содержание кислорода также меньше, чем в клетках здоровых тканей.

На рисунке 3 представлены фрагменты кинетики ЗФ эритрозина в опухоли и непораженной опухолью мышечной ткани мыши при нормальном атмосферном давлении. Опухоль диаметром 5 мм была локализована с внешней стороны правой передней лапы животного. Освобожденные от кожного покрова ткани окрашивали в течение 3 минут водным раствором красителя концентрацией 10-3 М, после чего измерялась кинетика ЗФ. Хорошо видно, что концентрация кислорода в опухоли больше, чем в нормальной ткани.

В отличие от ЗФ интенсивность фосфоресценции молекул красителей с течением времени монотонно уменьшается. На рисунке 4 показана кинетика затухания фосфоресценции эритрозина в нормальной и патогенной тканях при атмосферном давлении.

Аппроксимация этих кривых дает функцию вида:

Iфос=A1exp(-t/ф1) + A2exp(-t/ф2)

Значения величин ф1 и ф2 для кинетики затухания фосфоресценции эритрозина в опухолевой ткани равны 4,2±0,13 и 28,9±1,1 мкс, а для кинетики затухания фосфоресценции эритрозина в здоровой ткани равны 4,9±0,2 и 50,2±1,5 мкс соответственно.

Выводы

Установленные различия в кинетике длительной люминесценции флуорофоров в тканях можно использовать при разработке метода ЛФД. Метод ЛФД, основанный на измерении времени жизни длительной люминесценции флуорофоров весьма перспективен. Высокая чувствительность метода позволит обнаруживать патологические изменения в клетках на очень ранней стадии. В качестве экзогенных флуорофоров могут быть использованы любые соединения, обладающие длительной люминесценцией и отвечающие требованиям, предъявляемым к таким препаратам.

Список литературы

1. Осипова Е.А. Флуоресцентные методы исследования опухолей век и конъюктивы на основе эндогенных и экзогенных флуорофоров. Автореф. дисс. на соискание уч. ст. к. м. н. - М.: 2009.

2. Рогаткин Д.А. Лазерная клиническая диагностика как одно из перспективных направлений биомедицинской радиоэлектроники // Медицина и биотехнология. - 1998. - № 3. с. 34.

3. Летута С.Н., Маряхина В.С., Пашкевич. С.Н., Рахматуллин Р.Р. Длительная люминесценция органических красителей в клетках биологических тканей // Оптика и спектроскопия, 2011, т. 110, № 1, с. 72-75.

4. Тучин В.В. Лазеры и волоконная оптика в биомедицинских исследованиях. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 1998. - 384 с.: ил.

5. Floor A. Harms, Wadim M. de Boon, Gianmarco M. Balestra, Sander I. A. Bodmer and other, Oxygen-dependent delayed fluorescence measured in skin after topical application of 5-aminolevulinic acid // Biophotonics. - 2011. - p. 1-9.

6. Летута С.Н., Маряхина В.С., Пашкевич. С.Н., Рахматуллин Р.Р. Кинетика длительной люминесценции молекулярных зондов в клетках биологических тканей // Вестник ОГУ - 2011. - №1, с. 182-186.

7. Moiseeva E. V. Original Approaches to Test Anti-breast Cancer Drugs in a Novel Set of Mouse Models. Proefschrift Universiteit Utrecht, 2005. p. 191.

8. Селиванов Е.В. Красители в биологии и медицине: Справочник. - Барнаул: Азбука, 2003. - 40 с.

9. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток, мембран и липопротеинов. М.: Наука, 1989. 277 с.

10. Кучеренко М.Г., Кецле Г.А., Мельник М.П., Летута С.Н. Селективное лазерное усиление флуктуаций скорости реакций А+В>0// Известия АН СССР. Сер. физ.- 1993.- Т.57.- с.175.

11. Кучеренко М.Г., Кецле Г.А., Мельник М.П., Летута С.Н. Изменение кинетики аннигиляционной люминесценции красителей в полимерах под действием лазерного импульса// Оптика и спектроскопия- 1995.- Т.78.- с. 649.

12. Кучеренко М.Г. Кинетика нелинейных фотопроцессов в конденсированных молекулярных системах; Оренбургский гос.ун-т. - Оренбург: ОГУ, 1997. - 386 с., с илл.

13. Эммануэль Н.М., Кавецкий Р.Е., Тарусов Б.Н., Сидорик Е.П. Биофизика рака. Киев: Наукова думка, 1976. 287 с.

Размещено на Allbest.ru