Стан та перспективи впровадження нанотехнологій у біології та медицині

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

СТАН ТА ПЕРСПЕКТИВИ ВПРОВАДЖЕННЯ НАНОТЕХНОЛОГІЙ У БІОЛОГІЇ ТА МЕДИЦИНІ

ЧЕХУН В.Ф.

У сучасних умовах глобалізованого суспільства найважливіший фактор розвитку країни -- конкурентоздатність на світовій арені -- можна забезпечити лише своєчасним впровадженням інноваційних технологій. За багатьма прогнозами, обрис ХХІ ст. визначатимуть нанотехнології, які є рушійною силою нової науково-технічної революції, що приведе до істотних змін у багатьох галузях виробництва та медицини, і дають підстави для глибшого розуміння загальнобіологічних та еволюційних процесів. Створення біосумісних наноструктурованих матеріалів для потреб медицини належить до найбільш пріоритетних сфер людської діяльності, що дасть змогу забезпечити потреби ринку високоспецифічними і безпечними імплантами, квантовими люмінофорами, векторними системами доставки ліків, магнітної томографії тощо. Навчившись маніпулювати атомами і молекулами, наука виводить людство на орбіту нових можливостей у боротьбі з найпоширенішими хворобами та відтермінуванні процесів старіння.

Хочеться вірити, що нанотехнології розширять наші горизонти у сучасній молекулярній діагностиці, в терапії, адже наносвіт -- це унікальна царина окремих атомів і молекул, де панують закони квантової та молекулярної біології, які зумовлюють колективну поведінку трильйонів атомів і визначають об'ємні та функціональні властивості будівельних блоків різних видів матерії. Однак, не відкидаючи оптимізму щодо швидкого впровадження нанотехнологій у практику, варто зазначити, що багато складних завдань ще залишаються невирішеними.

У процесі розвитку та реалізації сучасної нанотехнологічної науки постають питання, які стосуються особливостей біосумісності ультрамалих частинок, їх розподілу в органах і тканинах, виведення цих агентів з організму та прояву токсичних ефектів (рис. 1). Пошук відповідей на ці питання слід розглядати як основу нової дисципліни -- нанотоксикології.

Актуальність поставлених завдань та координація науково-методичного потенціалу

Нанотехнології -- це відносно молода галузь інтегральної науки, яка завдяки тісній міждисциплінарній співпраці широкого кола фахівців дала поштовх до створення унікальних засобів для потреб біології та медицини. Їх впровадження становить основу сучасного прогресу в діагностиці й терапії найпоширеніших хвороб, у тому числі і злоякісних новоутворень. Так, застосування квантових міток дає змогу візуалізувати та диференціювати вогнища на початкових стадіях їх зародження. У лабораторній діагностиці з'являється можливість детектувати в тисячі разів меншу кількість білка, ДНК, вірусів порівняно з традиційними технологіями.

Останнім часом дедалі частіше розглядають можливості використання наносполук як векторних систем цільової доставки терапевтичних засобів. У рамках виконання постанови Президії НАН України «Про наукову та науково-організаційну діяльність Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України» від 26.12.2007 № 350 та під час реалізації Державної цільової науково-технічної програми «Нанотехнології та наноматеріали», цільової комплексної програми фундаментальних досліджень НАН України «Фундаментальні проблеми наноструктурних систем, наноматеріа- лів, нанотехнологій» отримано монодисперсні наночастинки золота, магнетиту, оксидів інших елементів з керованими оптичними і магнітними характеристиками, які здатні вибірково накопичуватися в пухлинних вогнищах та утворювати нанокомплекси з цитостатиками.

Створено нові стабільні лікарські форми нанокомпозиту на основі магнетиту, колоїдного золота, оксидів інших елементів і цитостатика в біосумісній матриці для магнітокерованої доставки його в пухлину. Досліджено фізико- хімічні властивості отриманих нанокомпози- тів на різних етапах приготування відповідно до розроблених технологій та фармакопейних вимог.

Створено систему апаратного забезпечення й еталонних зразків для метрологічного контролю нанокомпозитів. Змодельовано процеси транспорту магнітних нанокомпозитів до пухлини по судинах крові та розраховано параметри магнітів для їх концентрування, розподілу температури в пухлині при гіпертермії, що дозволяє істотно підвищити ефективність променевої і хіміотерапії онкологічних хворих.

Досліджено біологічну і специфічну активність нанокомпозитів у модельних системах in vitro та in vivo з урахуванням особливостей їх фармакокінетики. Вивчено ефективність фотодинамічної терапії пухлин із застосуванням як фотосенсибілізатора нанокомпозитів порфірину з наночастинками золота. Уперше встановлено, що висока активність цих нано- композитів зумовлена переважанням у механізмі їх протипухлинної дії ролі синглетного кисню.

Розроблено методику визначення рівня продукції та накопичення вільних радикалів унаслідок впливу на клітину нанорозмірних матеріалів за допомогою люмінолзалежної хемілюмінесценції. Отримані з використанням цього методу дані збігаються з результатами цитоморфологічних досліджень, що дозволяє стверджувати про релевантність хемілюмінесцентного методу щодо характеристики цитотоксичної дії нанокомпозитних матеріалів різного походження.

Визначено комплексну систему цитомор- фологічних, імуноцитохімічних, біофізичних та інших маркерів для тестування дії наночас- тинок, що ґрунтується на визначенні рівня пошкодження та репарації ДНК, стану глутатіон- залежної системи детоксикації ксенобіотиків і змін активності та посттрансляційної модифікації ферменту ксантиноксидоредуктази.

Загалом до реалізації зазначених завдань залучено 11 установ НАН України, два національних університети і дві зарубіжні установи, науковці яких опублікували понад 500 статей, 12 монографій, отримали близько 100 патентів України, видали 5 методичних рекомендацій.

Перспективи фундаментального та прикладного значення отриманих результатів

На сьогодні феромагнітні наночастинки є одним із найцікавіших нанотехнологічних матеріалів, який досить широко застосовують у різних галузях народного господарства.

Ідея використання заліза та різних форм оксидів у вирішенні актуальних проблем медицини, зокрема онкології, не нова, оскільки залізо належить до есенціальних мікроелементів, які забезпечують функціонування живих організмів. Однак лише в останнє десятиріччя з'явилися методи застосування новітніх наноматеріалів на основі Fe та засобів їх доставки і локалізації в патологічному вогнищі. Особливого змісту це питання набуває в разі створення штучних нанорозмірних матеріалів з новими фізико-хімічними та біологічними властивостями.

Ендогенне залізо -- невід'ємна функціонально активна частина кожної живої клітини, що зумовлює його важливу роль у відтворенні багатьох процесів життєдіяльності в організмі людини і тварин. Завдяки високій хімічній активності залізо є одним із ключових елементів життя, відіграє важливу роль у процесах росту і поділу клітин, забезпеченні функції дихання, синтезу ДНК і загибелі клітини. Розмаїття біологічних функцій організму, в яких бере участь залізо, робить його однією з ключових ланок у патогенезі цілої низки захворювань, у тому числі онкологічних (рис. 2). Це покладає на дослідників велику відповідальність, адже вперше свідомо відбувається «схрещування» однорозмірних елементів живої і рукотворної природи.

Функціонування біологічних систем, зокрема організму людини і навіть окремої клітини, є таким складним і універсальним явищем, що навіть століття наукових пошуків не дали вичерпних знань щодо виникнення та функціонування живих систем і їх патологічних станів. Тому вивчення детальної структури і функцій складових цього процесу на рівні клітини і організму було і залишається актуальним.

Дослідження взаємодії штучних і природних нанорозмірних систем у відповідному просторі відкриє нові таємниці зародження життя та можливості оптимальної корекції проявів його різних форм. Адже результати наших попередніх досліджень дають змогу переглянути й доповнити, здавалося б, застарілу теорію Опаріна--Холдейна щодо походження життя. Згідно з цією теорією, процеси, що привели до виникнення життя на Землі, можна поділити на три етапи: виникнення органічних речовин; виникнення білків; виникнення білкових тіл. Однак про роль і місце іонів заліза як елементів Великого вибуху і постійного магнітного поля Землі (магнітних бур) у ній не згадується. Проте, за нашими попередніми даними, саме ці важливі елементи могли бути основним фактором і каталізатором синтезу та інтеграції в процесі утворення білкових тіл.

Так, для того щоб довести, наскільки значущими і функціонально важливими є нано- частинки заліза, в рамках комплексного проекту «Взаємодія наноструктурних матеріалів з нормальними та пухлинними клітинами, розробка методів доставки, безпека їх використання» було проведено дослідження щодо їх взаємовпливу із сироватковим альбуміном. Методом диференціальної сканувальної мі- крокалориметрії встановлено, що акцепція функціоналізованих наночастинок магнетиту молекулами сироваткового альбуміну людини (САЛ) відбувається в другому домені білкової глобули. При цьому їх взаємодія з альбуміном, а також комплексування з САЛ наночастинок золота, вуглецевих нанотрубок та фулеренів супроводжується значними змінами нативної архітектоніки білкової глобули. Показано, що синтезовані на основі САЛ наносфери з різним ступенем перехресної зшивки демонструють підвищену акцепторну активність щодо клітинних мембран злоякісних клітин та значно більшу транспортну ємність відносно речовин гідрофобної і гідрофільної природи порівняно з нативним альбуміном. Інкорпоровані в наносфери наночастинки магнетиту повністю зберігають свої природні теплопровідні, електропровідні та магнітні властивості, що свідчить про перспективність їх застосування в гіпертермії та векторній терапії хворих на злоякісні новоутворення. Розуміння молекулярних основ утворення залізо-альбумінових комплексів може не лише сприяти створенню нового покоління структурно стабільних наночастинок Fe3O4, а й поповнити базу сучасних знань щодо механізму взаємодії органічних і неорганічних сполук. Такий підхід дав змогу дослідити певні конформаційні зміни в білку за участю наночастинок заліза, які найбільшою мірою проявляються під дією магнітного поля. Саме тоді й відбувається агрегація цього білкового комплексу, і він стає функціонально значущою білковою структурою, що логічно вписується в зазначену вище теорію зародження життя на Землі.

Разом з тим, до кінця зрозуміти поведінку складних систем надзвичайно важко. Хоча з упевненістю можна сказати, що після взаємодії вони починають поводити себе як єдине ціле з проявом певних властивостей. За наявності дієвих способів керування станом цих струк- турованих форм можна як активувати, так і суттєво сповільнювати процеси метаболізму і нормальних, і трансформованих клітин.

Водночас результати фундаментальних досліджень останніх років відродили інтерес до вивчення ролі, яку відіграє обмін ендогенного заліза, і засвідчили його значення у пухлинному процесі, що дозволяє розглядати цей мікроелемент як перспективний маркер і мішень для лікування пацієнтів зі злоякісною патологією. В організмі метаболізм заліза відбувається за допомогою низки залізовмісних білків, які є фізіологічно активними внутрішньоклітинними регуляторами. Тому визначення змін залізовмісних комплексів у тканинах організму у відповідь на введення екзогенного заліза у складі біополімерних нанокомпозитів і механізмів, які лежать в їх основі, -- це важливі питання, що відкривають перспективу спрямованої модифікації такої відповіді в заданому напрямі.

Особливий інтерес ці дослідження становлять у контексті раку молочної залози, оскільки гормональний статус жінки тісно асоційований зі значними коливаннями вмісту заліза в організмі. Як дефіцит заліза, так і його надлишок можуть мати негативні наслідки для організму в цілому. Поряд із цим є дані, що свідчать про синергізм порушень метаболізму заліза та естрогенів при виникненні раку молочної залози.

У процесі злоякісної трансформації надлишок заліза сприяє утворенню активних форм кисню, які спричинюють ушкодження ДНК. При цьому естроген може бути додатковим субстратом цих реакцій завдяки приєднанню гідроксильної групи і утворенню катехолес- трогену -- одного з чинників гормонального канцерогенезу.

Численні дослідження останніх років доводять роль порушень обміну ендогенного заліза і активних форм кисню в реалізації цитотоксичних ефектів багатьох протипухлинних препаратів, у тому числі паклітакселу, цисплатину, етопозиду, доксорубіцину. Можливість такого підходу до лікування онкологічних хворих показано у деяких експериментальних роботах і підтверджено результатами наших власних досліджень [1--3] (рис. 3). клінічний наносполука терапевтичний протипухлинний

Рис. 3. Інтегральна схема цитотоксичного ефекту феромагнітних наночастинок на пухлинні клітини

Так, уперше встановлено, що одним з важливих механізмів формування резистентності до протипухлинних препаратів є порушення регуляції металовмісних білків та обміну ендогенного заліза [2]. Показано, що в пухлинних клітинах, резистентних як до цисплатину, так доксорубіцину, спостерігається гіперметилу- вання промотора гена рецептора трансфери- ну І, а також зміни рівня білків -- регуляторів обміну ендогенного заліза (рецептор трансфе- рину, трансферин, легкі та важкі ланцюги фе- ритину, феропортин і гепсидин). Отримані дані свідчать, що одним із механізмів формування медикаментозної резистентності до різних за механізмом дії протипухлинних препаратів є порушення обміну заліза на рівні метилування генів -- регуляторів обміну заліза. Крім того, ми встановили, що цілеспрямоване інгібування білка легкого ланцюга феритину мікроРНК miR-133a збільшує чутливість клітин MCF-7/ DOX і MCF-7/CP до доксорубіцину та цисплатину (рис. 4).

Рис. 4. Схематичне зображення особливостей обміну ендогенного заліза в чутливих (а) і резистентних (б) клітинах раку молочної залози людини лінії MCF-7

У системі in vitro встановлено, що наслідком дії нанокомпозиту (наночастинки феромагнетику + цисплатин) на чутливі й резистентні клітини лінії MCF-7 є істотні зміни експресії білків і мікроРНК, які беруть участь у регуляції апоптозу, інвазії, адгезії та метастазуванні. Показано, що в механізмах реалізації апоптич- ної програми під впливом нанокомпозиту важливу роль відіграють порушення гомеостазу ендогенного заліза. Зокрема, наслідком впливу нанокомпозиту є зміни метилування та експресії рецептора трансферину, трансферину, легких і важких ланцюгів феритину, які найбільш виражені в клітинах резистентної лінії і призводять до активації утворення вільних радикалів та оксидативного стресу [4, 5].

Отримані результати стали підґрунтям для розроблення і патентування способу верифікації цитотоксичних ефектів наноферомагне- тиків (патент № 75163), способу оцінки біологічної активності наноферомагнетиків (патент № 82350)та способу визначення змін активних форм кисню під впливом наноферомагнетику (патент № 89196).

На основі вивчення ультраструктурних ефектів взаємодії нанорозмірних комплексів з компонентами цитоскелета чутливих і резистентних пухлинних клітин ми встановили, що стабілізоване залізо надходить у клітини досліджуваних ліній за допомогою рецептор- опосередкованого ендоцитозу і в різні часові інтервали визначається в лізосомах і фагосо- мах з електроннощільним вмістом, що є свідченням лізосомального шляху метаболізму оксиду заліза [4].

У клінічних дослідженнях виявлено зв'язок рівня феритину в сироватці крові та пухлинній тканині з чутливістю до неоад'ювантної хіміотерапії у хворих на рак грудної залози [3]. Показано, що високий рівень феритину в сироватці крові та пухлинній тканині свідчить про резистентність хворих на рак молочної залози до неоад'ювантної хіміотерапії. Отже, показники рівня феритину можна використовувати як об'єктивний критерій визначення чутливості раку молочної залози до неоад'ювантної хіміотерапії як на рівні організму, так і на рівні пухлини (патенти № 106148 і 84044 «Спосіб прогнозування чутливості до неоад'ювантної терапії у хворих на рак молочної залози»).

Встановлено також роль білків обміну ендогенного заліза у формуванні молекулярних підтипів раку молочної залози. Показано, що найвищий рівень експресії феритину та геп- сидину спостерігається в пухлинах хворих на рак молочної залози базального підтипу, якому притаманний агресивний перебіг і низька чутливість до протипухлинної терапії. Отримані дані можуть допомогти в розробленні нових діагностичних критеріїв та вдосконаленні існуючих схем протипухлинного лікування з урахуванням рівня експресії феритину і гепси- дину в клітинах раку молочної залози певного молекулярного підтипу.

На основі великого комплексу проведених робіт науковці академічних установ уперше розробили новий вітчизняний протипухлинний препарат «Фероплат», що містить на- ночастинки магнітної рідини та цисплатин (рис. 5). Доклінічні дослідження довели, що за показниками протипухлинної та антиметас- татичної дії «Фероплат» не лише не поступається офіційному препарату «Цисплатин», а й перевершує його, особливо при резистентних формах злоякісних новоутворень. На основі цієї наукової розробки видано методичні рекомендації «Критерії та методи оцінки біологічної безпеки металовмісних наноматеріалів при створенні протипухлинних векторних систем» (2014), затверджені двома експертними комісіями МОЗ України та НАМН України «Фармакологія» і «Онкологія».

Отже, залучення сучасного нанотехнологіч- ного інструментарію сприяє започаткуванню якісно нового етапу у вирішенні ключових проблем біології та медицини. Створення інноваційних лікарських засобів спонукало до розроблення нових систем їх доставки. В останні десятиліття галузь контрольованої доставки ліків стала одним із найперспективніших напрямів наукових досліджень [6].

Результати комплексних досліджень і технологічні розробки, отримані під час виконання науково-технічних проектів, розкривають механізми взаємодії нанорозмірних систем, збагачуючи наші уявлення про загальнобіоло- гічні процеси, а також створюють практичну платформу для впровадження нових підходів діагностики і лікування хворих на злоякісні новоутворення.

Варто зазначити, що на сьогодні понад 25% світового ринку лікарських засобів займають ліки з удосконаленою системою доставки, додатково функціоналізованими компонентами та специфічними флуоресцентними мітками. Розроблена нами векторна система не лише забезпечує цільову доставку, а й дозволяє вирішити проблему подолання природних бар'єрів організму до набутої резистентності.

Ера нанотехнологій по-справжньому увійшла в реальне життя: матеріалознавці, фізики, хіміки, біологи, медики навчилися оперувати об'єктами одного й того самого наномасштабу, спілкуючись при цьому «однією мовою». Науковці та суспільство сподіваються, що ця мова виявиться зрозумілою й тим, від кого залежить подальша доля реалізації перспективних вітчизняних наукових розробок.

Насамкінець хочу висловити подяку нашим партнерам з академічних інститутів: електрозварювання ім. Є.О. Патона, електродинаміки, проблем матеріалознавства ім. І.М. Францевича, фізики, металофізики ім. Г.В. Курдю- мова, хімії поверхні ім. О. О. Чуйка, загальної і неорганічної хімії ім. В.І. Вернадського, біохімії ім. О.В. Палладіна, біоколоїдної хімії ім. Ф.Д. Овчаренка, НТК «Інститут монокристалів», а також із Київського національного університету імені Тараса Шевченка, Національного технічного університету України «КПІ», Національного центру токсикологічних досліджень (National Center for Toxicological Research, USA).

Література

1. Shpyleva S.I., Tryndyak V.P., Kovalchuk O., Starlard-Davenport A., Chekhun V.F., Beland F.A., Pogribny I.P. Role of ferritin alterations in human breast cancer cells. Breast Cancer Res. Treat. 2011. 126(1): 63--71.

2. Chekhun V.F., Lukyanova N.Yu., Burlaka A.P., Bezdenezhnykh N.A., Shpyleva S.I., Tryndyak V.P., Beland F.A., Pogribny I.P. Iron metabolism disturbances in the MCF-7 human breast cancer cells with acquired resistance to doxorubicin and cisplatin. Int. J. Oncology. 2013. 43(5): 1481--86.

3. [Антіпова С.В., Шепіль О.В., Лук'янова Н.Ю., Чехун В.Ф. Зв'язок рівня феритину в сироватці крові та пухлинній тканині з чутливістю до неоад'ювантної хіміотерапії у хворих на рак молочної залози. Онкология. 2013. Т 15, № 3. С. 204--209].

4. Chekhun V., Lukianova N., Demash D., Borikun T., Chekhun S., Shvets Yu. Manifestation of key molecular genetic markers in pharmacocorrection of endogenous iron metabolism in MCF-7 and MCF-7/DDP human breast cancer cells. CellBio. 2013. 3(4): 217--27.

5. Chekhun V.F., Yurchenko O.V., Naleskina L.A., Demash D.V., Lukianova N.Yu., Lozovska Yu.V. In vitro modification of cisplatin cytotoxicity with magnetic fluid. Experimental oncology. 2013. 35(1): 15--19.

6. Park K., Mrsny R.J. Controlled Drug Delivery: Present and Future. Controlled Drug Delivery. 2000. 752: 2--12.

Анотація

Наведено основні результати ряду унікальних комплексних досліджень і технологічних розробок, що не лише розкривають механізми взаємодії на- норозмірних систем, а й створюють практичну платформу для впровадження нових підходів діагностики і терапії в клінічну практику.

Ключові слова: нанокомпозити, пухлинні клітини, векторна доставка ліків, лікарська резистентність.

Изложены основные результаты ряда уникальных комплексных исследований и технологических разработок, не только раскрывающих механизмы взаимодействия наноразмерных систем, но и создающих практическую платформу для внедрения в клиническую практику новых подходов диагностики и терапии.

Ключевые слова: нанокомпозиты, опухолевые клетки, векторная доставка лекарств, лекарственная резистентность.

Размещено на Allbest.ru