Влияние коллагена на функциональную активность лимфоцитов при системных заболеваниях соединительной ткани

СОДЕРЖАНИЕ

1. АУТОАНТИГЕНЫ ПРИ РЕВМАТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

1.1 Срыв толерантности и происхождение аутоантигенов при ревматоидных заболеваниях

1.2 Внутриклеточные мишени при системной красной волчанке

1.3 Основные аутоантигены при ревматоидном артрите

1.4 Внутриклеточные аутоантигены при системной склеродермии

1.5 Коллаген, как аутоантиген

1.6 Суставной хрящ и коллаген II типа

1.7 Базальная мембрана и коллаген IV типа

1.8 Роль коллагена при ревматических заболеваниях

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Материалы

2.2 Методы

2.3 Культуральный метод

2.4 Радиометрический пролиферативный тест

2.5 Иммуноферментный анализ

2.6 Метод латексной агглютинации

2.7 Статистический анализ

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

3.1 Влияние коллагена на функциональную активность лимфоцитов у детей с системными заболеваниями соединительной ткани

3.2 Коллаген- индуцированная пролиферация лимфоцитов периферической крови детей исследуемых групп

3.3 Синтез аутоантител в присутствии коллагена IV и II типов при системных заболеваниях соединительной ткани.

ВЫВОДЫ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ

ПЕРЕЧЕНЬ УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ, СИМВОЛОВ И ТЕРМИНОВ

APC - антигенпрезентирующие клетки; BCR - В -клеточный рецептор;

CD - кластер дифференцировки; C - коллаген;

dsДНК - двухцепочечная ДНК;

KS - критерий Колмогорова-Смирнова; T - T-критерий Вилкоксона;

U - U -критерий Манна-Уитни;

WW - критерий Вальда-Вольфовица; АИЗ - аутоиммунные заболевания; АТ - антитела;

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота; ИП - индекс пролиферации;

МПК - мононуклеары периферической крови; ПА - пролиферативная активность;

РНК - рибонуклеиновые кислоты; СКВ - системная красная волчанка;

ЮРА - ювенильный ревматоидный артрит; ЮС - ювенильный склероз.

ВВЕДЕНИЕ

Системные заболевания соединительной ткани группа заболеваний, которая характеризуется системным типом воспаления различных органов и систем. Такие заболевания сочетаются с развитием аутоиммунных и иммунокомплексных процессов. Преобладающим механизмом повреждения является дисрегуляция как Т- так и В-клеточных факторов иммунитета при наличии в избыточного содержания антигена, в том числе и аутоиммунного происхождения [5].

Данные последних лет свидетельствуют о том, что у детей и подростков СЗСТ стали встречаться значительно чаще. Одной из причин этого явления может быть изменение реактивности растущего организма с признаками повышенной чувствительности к разнообразным внешним и внутренним раздражителям на фоне возрастающих контактов с многочисленными бытовыми аллергенами, широким применением антибиотиков и других лекарственных средств, массовой иммунизацией населения. В связи с этим значительно расширился круг исследований по данной проблеме [1].

Примером таких заболеваний служит: системная красная волчанка (СКВ), ювенильный ревматоидный артрит(ЮРА), ювенильный склероз (ЮС)[5].

Для СКВ характерно хроническое системное воспалительное заболевание соединительной ткани и сосудов с выраженным аутоиммунным патогенезом [2]. Главные звенья патогенеза ЮС - это процессы усиленного коллагено- и фиброзообразования, выработка аутоантител к компонентам соединительной ткани - ламинину, коллагену IV [3]. Патологический процесс при ЮРА начинается в синовиальной оболочке сустава с нарушения микроциркуляции и поражения клеток, выстилающих синовиальную мембрану [31].

Несмотря на многочисленные исследования в области изучения патогенеза системные заболевания соединительной ткани, многие вопросы остаются не решенными. Диагностика возможных иммунокомплексных осложнений (почек, сосудов) ассоциируется с разрушением соединительной ткани и коллагена, поэтому актуально обратить внимание на её причастность в развитии заболеваний.

Исходя из выше изложенного целью данной работы явилась оценка влияния коллагена на пролиферацию лимфоцитов и синтез аутоантител при системных заболеваниях соединительной ткани.

Для реализации этого были поставлены следующие задачи:

1. Оценить пролиферацию лимфоцитов в присутствии коллагена II и IV типов при ЮС, ЮРА и СКВ in vitro.

2. Оценить уровень синтеза аутоантител (антиДНК и ревматоидного фактора (РФ)), индуцированных коллагеном.

1. АУТОАНТИГЕНЫ ПРИ РЕВМАТИЧЕСКИХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ (ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ)

Одним из основных механизмов, препятствующих развитию в организме аутоиммунной агрессии против собственных тканей, является формирования «неотвечаемости» к ним, называемой иммунологической толерантностью. Она не является врождённой, а формируется в эмбриональном периоде и состоит в негативной селекции. Именно нарушение такой толерантности и сопровождается развитием аутоиммунной агрессии и, как следствие, образование аутоиммунитета.

1.1 Срыв толерантности и происхождение аутоантигенов при ревматоидных заболеваниях

Признаком аутоиммунных заболеваний, таких как системная красная волчанка (СКВ), склеродермия, ревматоидный артрит, является продукция высокоспецифичных аутоантител. Механизмы, с помощью которых эти внутриклеточные молекулы распознают собственные антигены как чужеродные, пока мало изучены. Наличие АИЗ наводит на мысль об обхождении этих механизмов. При многих АИЗ развивается специфический Т- и/или В- клеточный иммунный ответ на аутоАГ, однако начало развития этих иммунных ответов и механизмы поддержания АИЗ до сих пор не понятны и связаны со следующими причинами: происхождением аутоАГ; представлением В-лимфоцитов, как АПК, аутоАГ и ролью ко-стимулирующих молекул в сохранении заболевания [47].

В-клеточный гомеостаз является результатом очень тонкого баланса между клеточной апоптотической гибелью и выживанием. Этот процесс является точным, в результате которого происходит отбор аутореактивных клеток. Любой дефект этого процесса может либо предотвратить развитие В-клеток или, наоборот, способствовать выживанию аутореактивных клеток, которые в норме элиминируются. Иммунная система имеет в наличии несколько своеобразных контрольно-пропускных пунктов, направленных на устранение или нейтрализацию аутореактивные клеток, в процессе их развития и выхода на периферию. Критическим фактором в процессе клеточной толерантности В- клеток, являются сигналы от BCR [35].

Эксперименты выявили многочисленные гены, участвующие в процессе В- клеточной толерантности. В-клеточные нарушения и аутоиммунные процессы, возникающие в результате отсутствия или изменение экспрессии В-клетками специфических генов описаны ниже (рисунок 1) [35].

Рисунок 1. - Механизм образования аутореактивных В -клеток

Семейство Bcl-2 (проапоптотические молекулы)

Семейство Bcl-2 про-и антиапоптотических молекул играет важную роль в регуляции В-клеточного гомеостаза. Один протеин из этого семейства, Bcl-2 отвечает за выживание В- клеток в процессе их созревания. Гиперэкспрессия Bcl-2 может способствовать продлеванию синтеза аутоантител и вызывает аутоиммунные заболевания. Bim, другая молекула из этого семейства, имеет проапоптотическую функцию, и было показано, что взаимодействие с Bcl-2, инактивирует выживания В -клеток. При отсутствии Bim, у мышей наблюдаются большое количество В-клеток. Многие из этих мышей не доживают до 12-месячного возраста, в связи с наличием тяжёлого гломерулонефрита. Таким образом, молекулы, такие как Bim играют важную роль в предотвращении B-клеточных аутоиммунных заболеваний [35].

B-клеточный фактор выживания BAFF

Экспрессия молекул, таких как Bcl-2 в В-клетках могут быть стимулированы другими молекулами например, как BAFF, который продуцируют Т-клетки, моноциты / макрофаги, нейтрофилы и дендритные клетки, и это очень мощный B-клеточный модулятор. BAFF может связать три отдельных рецептора: BCMA (В-клеточный антиген созревания); BAFF рецептор (BAFFR) и TACI (трансмембранного активатора и CAMLinteractor). BCMA экспресируется на поверхности иммуноглобулин- продуцирующих клеток и, вероятно, играет важную роль в их выживания в лимфоидной ткани и костном мозге. BAFF трансгенные мыши имеют избыток лимфоцитов на периферии, которые продуцируют различные аутоантитела, а также развиваются СКВ подобные синдромы, и их состояние, характеризуется тяжелым гломерулонефритом. Лечение мышей с помощью В-клеток и аутоиммунными 145 BAFF ингибиторами подавляют иммунные реакции, уменьшает срок службы GCs, предотвращают протеинурии и продлевают жизнь мышей с СКВ-подобными синдромами. Такое лечение также предотвращает заболевание и в мышиной модели РА. Эти результаты показывают, что чрезмерное производство BAFF может быть ключевым фактором в развитии аутоиммунных заболеваний. BAFF способствует В- клеточному выживанию in vitro и in vivo, что свидетельствует о роли BAFF в периферическом В-клеточном гомеостазе и клеточном созревании [35].

Эта гипотеза была подтверждена, у BAFF-/ - мышей, у которых нарушается В-клеточное созревания. Показано наличие повышенного гуморального иммунного ответа. В-клетки в модели BAFF трансгенных мышей, так же экспресируют высокие уровни молекулы Bcl-2. В совокупности эти результаты предположили, что ненормальное производство BAFF может быть ключевым событием в определенных типах аутоиммунных заболеваний. Чтобы лучше проиллюстрировать это: сывороточные уровни BAFF значительно выше, у некоторых пациентов с СКВ и РА, и особенно высок у пациентов с синдромом Шегрена, и уровни BAFF, обнаруженные в синовиальной жидкости пациентов с РА, часто превышают уровни обнаруженные в крови. Это означает, что BAFF продуцируется при воспалительных поражениях на месте, и в ответ на воспаление и могут способствовать созреванию аутоиммунных В- клеток, путем изменения порога В- клеточного выживания [35].

Интересно, что одним из BAFF рецепторов, TACI, является важным негативным регулятором В- клеточной активации. Отсутствие TACI ведет к расширению B-клеточного пула, их гиперреактивности, производству аутоантител и в дальнейшем развитию СКВ подобных аутоиммунных синдромов [35].

BAFF может так же способствовать развитию злокачественных новообразований, возникающих в качестве вторичной проблемы аутоиммунных заболеваний, а также является мощным фактором выживания для злокачественных В-клеток. В совокупности эти наблюдения позволяют предположить возможную важную роль BAFF в патогенезе некоторых аутоиммунных заболеваний человека, и в настоящее время используют BAFF ингибиторы для лечения В- клеточной аутоиммунной патологий [35].

Первоначально считалось, что центральной и периферической толерантности может эффективно «очистить» все аутореактивные Т-клетки. Хотя некоторые штаммы мышей, как известно, подвержены аутоиммунным заболеваниям, и аутореактивные Т-клетки считались уникальными для этих штаммов. В настоящее время известно, однако, что у всех людей имеются аутореактивные Т-клетки, способные вызвать аутоиммунные процессы. Как такое возможно, если механизмы центральной и периферической толерантности настолько эффективны? Существуют теорий, которые объясняют, как потенциально аутореактивные Т-клетки избегают механизмов толерантности. Большинство теорий сосредоточено на том, что если презентация собственных детерминант в тимусе слишком низкая, то в процессе отрицательной селекции может не произойти отбора аутореактивных Т-клеток, и они могут уйти на периферию [35].

В «географической теории», собственные детерминанты могут экспрессироваться в организме (например глаз), но не экспрессироваться в вилочковой железе. В настоящее время показано, что несколько "географически изолированных антигенов", экспрессируются в вилочковой железе. Например, антигены сетчатки IRBP экспрессируется в тимусе на низком уровне, и вызывают функциональную толерантность. На самом деле, многие другие нейропротеины, которые были рассмотрены как изолированные, можно найти и в вилочковой железе. Интересно, что у SJL мышей развёрнут мощный Т- клеточный ответ на собственные пептиды белка протеолипида (ПЛП)139-151 в связи с высокой частотой предшественников специфических 139-151 Т-клеток. Этот интактный репертуар аутореактивных Т-клеток существует, потому что ПЛП (DM20), которому не хватает 139-151 части, и является формой ПЛП, который экспрессируется в вилочковой железе. Таким образом, толерантность достигнута для всех потенциальных факторов на ПЛП, за исключением этого региона. Аналогичная ситуация сложилась и в отношении основных HLA-DR2 ограниченных эпитопов, аминокислот 85-99 основного белка миелина (ОБМ), уровень которого находится в обратной зависимости к уровню цистеин протеазы, аспарагин эндопептидаза (AEP). AEP экспрессируется в вилочковой железе, презентация 85-99 низка, что позволяет 85 -99-специфических Т клеткам избежать толерантности [35].

Экспрессия собственных антигенов в тимусе также частично зависит от AIRE (аутоиммунный регуляторного элемента) белка, который является фактором транскрипции, который способствует экспрессии генов, уникальных для других тканей (панкреатический антигены, антигены щитовидной железы, антиген миелина). Отсутствие этого фактора приводит к мультисистемным аутоиммунным заболеваниям. Тем не менее, как подчеркивалось выше, хотя многие собственные антигены экспрессируют только некоторые детерминанты, которые представляются окружающим Т-клеткам [35].

В «молекулярной теории», слабо экспрессированные детерминанты: 1) плохо процессированные собственные молекулы, 2) имеют слабое сродство к МНС молекуле, 3) деградация экзопептидов в результате расположения слишком близко к другим детерминантам, которые были успешно "захвачены" по различным MHC молекулам. Теория молекулярного поглощения основана на существовании иерархии экспрессии детерминант для каждого собственного пептида, установленном процессингом и презентации MHC II класса APCs. Отношения между иерархией детерминант и индукции толерантности была поддержана экспериментально. В исследованиях, где в качестве антигена был использован лизоцим белых куриных яиц, было показано, что у B10.A (H-2A) мышей, при их иммунизации интактном белком, был ответ на определенные кодоминантные детерминанты, в том числе HEL пептида 46-61. Когда у животных индуцировали толерантность к HEL, то отзывчивость к пептиду исчезла, но всё же наблюдался иммунный ответ на пептидные субдоминанты и к криптик детерминантам. Более интересно, степень реагирования на эти субдоминанты / криптик детерминанты была пропорциональна количеству антигена, используемого в индукции толерантности. Аналогичным образом, когда BALB / с (H-2, г) мыши были трансгенными для HEL, что делает HEL неоаутоантигеном, Т-клеточный репертуар, направленный против доминирующей I-Ed детерминанты, HEL: 106 - 116, был нейтрализован функционально. Сравнивая HEL-специфический иммунный ответ на HEL у трансгенных мышей, что и у нетрансгенных H-2d животных, было установлено, что Т-клетки направлены на хорошо экспрессируемые "доминирующие" собственные детерминанты. Интересно, что степень индукции толерантности вновь установлено, что напрямую связано с количеством экспрессии HEL (рисунок 2) [35].

Рисунок 2. - Индукция аутоиммунного ответа

1.2 Внутриклеточные мишени при системной красной волчанке

СКВ - аутоиммунное ревматическое заболевание, характеризующееся разнообразными клиническими проявлениями и присутствием аутоАТ в сыворотке (рисунок 3). Патогенез остается не известным, однако считается, что влияние экологического триггера в ассоциации с генетической предрасположенностью могут приводить к изменениям в ИС, включая дефекты механизма фагоцитоза и увеличение апопточеских лейкоцитов. Апоптоз нейтрофилов опосредуется Fas-FasL взаимодействием. На ранних этапах апоптоза лейкоцитов происходит изменение фосфолипидной мембраны с экстернализацией фосфатидилсерина. Такие клетки с измененной мембраной фагоциты воспринимают как апоптотические [29].

Рисунок 3. - аутоантитела в СКВ. Клинические ассоциации этих аутоантител

Аутоантигенами в СКВ, являются в основном внутримолекулярные белки и нуклеиновые компоненты (рибонуклеопротеиды), таких как snRNP, Ro, La, Sm, нуклеосомы или рибосомы. Аутоиммунные реакции к ДНК или РНК, характерные для СКВ требует Т- клеточной помощи для продукции высоко родственных антител, сами по себе эти нуклеиновые кислоты являются неиммуногенными. Большинство аутоантигенов СКВ являются рибонуклеопротеидами; действительно, есть все больше доказательств того, что иммунный ответ к dsDNA в первую очередь направлен против рибонуклеопротеидов, таких как нуклеосомы или к малым ядерным рибонуклеопротеидам (snRNP) [41].

Нуклеосомы выделяются ядром в цитоплазму и гибнут по механизму апоптоза. Они состоят из ядерных частиц с тетрамером из молекул гистонов H3 и 114 в центре, и окружены двумя гистоновыми димерами Н2А-Н2В. Два супервитка ДНК окружают этот гистоновый октамер. Существует все больше доказательств того, что нуклеосомы являются одним из основных антигенов в инициации СКВ. В исследованиях волчанки у мышей антинуклеосомные аутоантитела обнаруживаются на раннем этапе, до появления анти -dsDNA и антигистоновых антител. В большинстве исследований, нуклеосомы были самым реактивным субстратом у пациентов с СКВ (31-88%) по сравнению с антителами к dsDNA (21-82%). В отличие от анти-dsDNA антител, антинуклеосомная активность часто обнаружена в 25-62% пациентов с неактивной СКВ [41].

Sm аутоантигены малый ядерный рибонуклеопротеид (snRNP) также являются важными аутоантигенами при волчанки. Семь основных белков B, D1, D2, D3, E, F и G, образуют гептамерное кольцо около 20 нм в диаметре, snRNA проходит через центр, а Sm эпитоп распределяется на наружной поверхности кольца. В отличие от SmB/В белков, полипептиды SmD считаются Sm антигеном, которые наиболее специфичны СКВ. Глицин-аргинин (GR) богатая карбоксильная область SrnDl, распознаётся практически всеми Sm- преципитатами в волчаночной сыворотки. Как было обнаружено в экспериментах, 70% сывороток показали реактивность к конформации эпитопа в C-конце SMDL, которая содержит 8-кратное повторение GR. Лишь у немногих из этих больных наблюдалась реактивность ко всей рекомбинации белка Sm. Присутствие этих анти-SmDl обнаруживается в 93% случаях СКВ, в той же волчаночной сыворотке, антинуклеосомные антитела обнаруживаются лишь в 56% больных. Уровни анти- SmD сильно коррелируют с активностью заболевания. Уровень анти-dsDNA и анти- SmDl тесно связан с нефритом волчанки [41].

1.3 Основные аутоантигены при ревматоидном артрите

Ревматоидный артрит (РА) характеризуются хронически эрозивно- деструктивным, обычно симметричным, полиартритом мелких суставов. Основой заболевания являются хронические синовиты, сопровождающие гиперплазией синовиальных оболочек, мононуклеарной-плазматической клеточной инфильтрацией, разрастанием грануляционной ткани, разрушающие суставные поверхности хрящей и кости. Наряду с суставными отмечаются висцеральные поражения, обусловленные васкулитами и полисерозитами [24].

Для РА наиболее характерно наличие в крови в высоком титре (более 1:64) ревматоидного фактора (РФ)- это антитела класса IgM, продуцируемый CD5+ В-клетками, направленные против Fc-фрагмента (Сг2- и Сг3-домен) IgG, который имеет аномальный (модифицированный) состав олигосахаридов и выступает в роли антигена [41].

Также при РА мишенями являются компоненты РНК, ДНК, гистоны. Противомитохондриальные антитела чаще встречаются при сочетании артрита и первичного билиарного цирроза. Аутоантитела к лимфоцитам, коллагену, клеточным антигенам соединительной ткани. Они в свою очередь указывают на склонность к поликлональной активации В-лимфоцитов. Антитела к цитруллированным белкам возникают из-за метаболической конверсии L- аргенина в L-цитрулин под влиянием ферментов пептидаргининдезиминаз (PADI). При РА активен фермент PADI-4 (ген в локусе 1р36), который высоко экспрессируются в активированных макрофагах, лимфоцитвах, нейтрофилах, эндотелии. Цитруллированные белки- филаггрин, фибрин, фибронектин, виметин индуцирует синтез аутоантител [41].

В последнее время чувствительным и специфическим серологическим маркером РА являются антитела к цитруллированным белкам/пептидам (ACPA). Распознавание цитруллированных эпитопов в качестве мишеней привело к развитию первого, а затем второго поколения антител-антициклических цитруллированных пептидов (anti-CCP). Анти-Sa антител уже были определены десять лет назад, однако только в недавних исследованиях было подтверждено то, что анти- Sa направлена против цитруллированного виментина. Синтез ACPA связывают с рядом генетических факторов, в том числе с HLA-DRB1 и PTPN22 1858T аллелей. А также экологических факторов и факторов, связанных с образом жизни, в первую очередь курения и, возможно, использование пероральных контрацептивов и чрезмерное потребление кофеина. Таким образом, оценка ACPA, может иметь важное значение для оценки прогноза заболевания и помогает в разработке эффективных терапевтических стратегий в лечении заболевании [9].

1.4 Внутриклеточные аутоантигены при системной склеродермии

В качестве аутоантигенов склеродермии выступают компоненты ядрышка. Многие из ядрышковых аутоантигенов, ответственны за сбор рибосом, особенно за сплайсинг рибосомальной молекулы РНК [9].

При добавлении ртути к клеточным культурам, она преимущественно локализуется в ядрышке. Это интересное наблюдение свидетельствует о том, что ртуть и другие токсины могут как-то повреждать ядрышко, и это приводит к аутоиммунным реакциям к компонентам этой органеллы. Так как металлы часто требуются для реакции окисления, то повреждения аутоантигенов склеродермии можно объяснить воздействием ртути. Некоторые антигены склеродермии, в том числе топоизомераза I, большая субъединица РНК- полимеразы II, и UBF/NOR-90 действительно сегментируются при контакте с ртутью. Аналогичные некоторые реакции окисления происходят в сосудистой склеродермии пациентов, которая часто характеризуется гипоперфузией и реперфузией. Была создана мышиная модель иммунного ответа на фибрилларин- один из аутоантигенов склеродермии. На этой модели было показано, что воздействие хлорида ртути сопровождается развитием антинуклеарного ответа на фибрилларин. Это значит, что фибрилларин модифицируется хлоридом ртути таким образом, что это он уже не распознаётся антителами. Данная модификация требует наличие двух остатков цистеина, поэтому можно предположить, что ртуть нарушает дисульфидные связи в фибрилларине [24].

1.5 Коллаген, как аутоантиген

К настоящему времени известно 27 различных типов коллагена. Он является преобладающим компонентом кожи, сухожилий, костной, хрящевой ткани, стромы всех паренхиматозных органов, базальных мембран, стенок кровеносных сосудов и кишечника, некоторые обладают агрегирующими свойствами. Различия соединительных тканей обусловлены вариабельностью размеров, количеством коллагена, толщиной и длиной образующихся фибрилл, а также их ориентацией. Максимальную распространенность и биологическое значение имеют коллагены I-IV типов, в связи с чем их определяют как основные [2].

Следует отметить, что в последние годы наблюдается повышенный интерес к изучению биохимических параметров обмена коллагена при различных заболеваниях и, как свидетельствуют результаты исследований, их динамика в большинстве своем является отражением тяжести патологического процесса в различных физиологических системах [5].

Обнаружена зависимость между содержанием аутоантител к отдельным типам коллагена и характером внешних и кардиальных проявлений дисплазии соединительной ткани. Рост уровня антиколлагеновых антител у пациентов свидетельствует о нарушении механизмов аутоиммунной регуляции метаболизма коллагена [8].

1.5.1 Суставной хрящ и коллаген II типа

Суставной хрящ, это соединительная ткань, состоящая из узкоспециализированных клеток - хондроцитов, которые поддерживают функциональность матрикса. Структурно, матрикс суставного хряща сложно организован. Состоит из сети фибрилл коллагена типа II (CII), и других, менее встречающихся типов коллагена IX и XI. Хондроциты несут ответственность за производство и функционирование фибриллярной сети, но, в отличие от других паренхимных клеток, межклеточного взаимодействия является минимальным, передача сигнала осуществляется путём взаимодействия между собой клеток матрикса. У взрослых, хондроциты относительно инертны, обновление и синтеза матрикса происходят очень медленно. Коллаген II является доминирующим коллагеном сустава [30].

Участие коллагена II типа в аутоиммунных процессах при РА привели к исследованиям эффектов, возникающих при иммунизации животных суставным хрящом, первоначально всё проводилось на крысах, затем на мышах, а потом и на других видах, включая приматов. Клинически и гистологические, особенности коллаген-индуцированного артрита (CIA) напоминают РА, но есть две особенности: во-первых, индукция болезни требует использование адъюванта, во-вторых (CIA) как правило, монофазная болезнь может быть вызвана, при иммунизации мышей сингенным, а не (как обычно) ксеногенным коллагеном II типа. У CII-иммунизированных мышей развивается высокий уровни аутоантител к коллагену II типа, которые являются патогенными [30].

Определение эпитопов на коллаген II типа, было достигнуто с помощью использования моноклональных антител (mAb), полученных от мышей с CIA, на которых были проведены тестирования этих моноклональных антител против химерных молекул. Пептидные последовательность коллагена II типа были вставлены в рекомбинантные CX. Таким образом были определены несколько триплетных последовательностей аминокислот - аргинин-глицин-X, где X является гидрофобным остатком. Цитруллинированные белки выступают также в роли реагентов в иммунных реакциях, которые имеют непосредственное отношение к прогнозированию и диагностике РА, и может являться источником иммунных комплексов. Фермент, ответственный за деаминацию (deimination) аргинина (citrullination), пептиди-аргининдеаминазы, имеет доступ к аргинин-содержащим эпитопам коллагена II типа на поверхности волокон, и таким образом потенциально инициирует цитруллинированние неоэпитов коллагена II типа. Однако циторуллинирование не объясняет всей иммуногенности хряща в РА, но возможно, что это один из белков в воспаленных суставах, который является производным цитруллинированного эпитопа. В таком случае, суставной хрящ выступает: в качестве источника аутоантител к собственному коллагену, и как участник в иммунном ответе, и как очевидно иммунный комплекс в воспалительном пути [30].

Считается, что главным в иммунотерапии, трансплантации и при лечение аутоиммунных заболеваний, является восстановление собственной иммунологической толерантности. Такая терапия при ревматоидных заболеваниях может иметь хорошие результаты, как при использовании успеха анти воспалительных биологических и В- клеточных антител, при восстановление толерантности к собственной суставной частности коллагена [30].

1.5.2 Базальная мембрана и коллаген IV типа

Наиболее известный коллаген базальной мембраны (БМ) это коллаген IV типа. БМ (или базальная пластинка), специализированная структура, найденная на «тканевой границе», лежащая в основе эпителиальных, эндотелиальных клеток, жира, мышц и нервных клеток. БМ состоит из коллагена IV, ламинина, гепарин сульфата, протеогликанов. Молекула коллагена IV больше, чем молекулы фибриллярных коллагенов, и они содержат несколько (Gly-XY) повторов. Молекула коллагена IV типа связывается с помощью тетрамеризации 7S доменов и димеризации НС1 области, тройного винтового взаимодействия и взаимодействия с другими компонентами базальной мембраны для формирования открытой сеточной структуры [25].

Эта структура стабилизирована дисульфидными связями в 7S регионе, а также лизин-производных перекрестных связей инициированной лизилоксидазой. Существует шесть разных типов цепей коллагена IV типа, образующих три типа гетеротримеров: [б1(IV)]2б2(IV), б3(IV)б4(IV)б5(IV) и [б5(IV)]2б6(IV) [22, c.19-20].

СIV представлен гетеротримером, состоящим из двух цепей б1(IV) и одной - б2(IV). Каждая цепь состоит из коллагеновой области (1400 аминокислотных остатков Gly-Xaa-Yaa, которые прерываются в нескольких участках короткими неколлагеновыми последовательностями), находящейся между короткой неколагенновой последовательностью из 25 остатков на N-конце и глобулярным неколлагеновым доменом (NC1) из 230 аминокислотных остатков на карбоксильном конце. Каждая цепочка гликозилирована, содержит 50 гидроксилизин-связанных дисахаридных единиц вдоль коллагеновой области, и аспарагин-связанный олигосахарид расположенных вблизи N-конца [25].

У млекопитающих ген коллагена IV типа имеет уникальное расположение: он находятся попарно (head-to-head) на трех разных хромосомах (Рисунок 1.4.). Гены коллагена IV типа, по всей видимости, большие и сложные, COL4A1 и COL4A5 гены превышают более 100 килобаз, содержащий 52 и 51 экзонов соответственно [25].

1.5.3 Роль коллагена при ревматических заболеваниях

Описано, что при ревматизме под влиянием токсинов в значительной степени разрушаются структура коллагеновых волокон, что способствует генерализации инфекции, ревматического процесса [2].

Рисунок 4. - Схематическое иллюстрирование расположения генов коллагена IV типа на хромосомах

Большой интерес представляет обмен коллагена и его нарушения при аутоиммунных заболеваниях соединительной ткани. Её дезорганизация реализуется через различные виды лимфокинов и монокинов, стимулирующих пролиферацию фибробластов, синтез коллагена и фибронектина. Антигенные свойства коллагеновых белков при диффузных заболеваниях соединительной ткани проявляется наличием антител и клеточных иммунных реакций на коллаген. Было показано, что с аутоиммунными реакциями на коллаген I, II, и III типа, IgG, нативную ДНК, РНК и кардиолипин связаны такие начальные проявления ревматоидного артрита, системной красной волчанки, системной склеродермии, как поражения кожи, суставов, синдром Рейно и вовлечение в патологический процесс жизненно важных органов - легких, сердца, почек. При этом титр антител ко всем изучаемым изоформам коллагена нарастает с увеличением степени активности этих заболеваний и снижается при успешном лечении. Но даже при минимальной степени активности нормализации показателей специфических антител получено не было. Возможно, это объясняется тем, что коллаген является одним из компонентов экстрацеллюлярного матрикса, которые у больных с различными аутоиммунными заболеваниями естественным образом вовлекаются в патологический процесс, а гиперактивация В- клеточного звена иммунитета и стимуляция других культур лимфоцитов дополнительно способствуют продуцированию антител к коллагенам [2].

Наиболее часто при ревматоидном артрите обнаруживают повышенный титр антител к коллагену II типа и расценивают его как показатель выраженной деградации хряща [45]. А Cook A.D. с соавторами дополнили, что при ревматоидном артрите определяются антитела даже к фрагментам коллагена II типа [10].

Данные о состоянии коллагена при системной красной волчанке немногочисленны и неоднородны. Гистопатологические исследования показали сопряженность разрушения хряща, остеопороза и васкулитов с уменьшением фибриногена, коллагена I типа и фибронектина. При оценке иммунофлюоресценции с моноклональными антителами было показано, что главный компонент базальной мембраны - протеогликан гепаран сульфат имеет тенденцию к уменьшению в коже и почках у пациентов с системной красной волчанкой. В почках же выявлено избыточное накопление IV типа коллагена [2].

При системной склеродермии описывают избыточное накопление коллагена I и III типа в коже, коррелирующие с тяжестью и длительность заболевания, а в эксперименте - с активностью индукторов коллагеногенеза. Увеличенные титры антител к коллагену I и III типов в сыворотке крови при ювенильной системной склеродермии предлагается расценивать как дополнительный критерий для диагностики на ранних этапах заболевания[3].

Антитела к коллагенам небезразличны, они сами могут вызывать деструкцию соединительной ткани. Так, по данным, при ревматоидном артрите антитела к коллагену I типа дополнительно способствуют разрушению коллагенового матрикса кости. Продукты деградации коллагена и антитела к ним могут стимулировать дальнейшее разрушение коллагенового матрикса. На основании этого получены экспериментальные модели склеродермии - индукция антителами к человеческому коллагену V типа или фактором роста-в, также стимулирующим фиброгенез, ревматоидного артрита - коллагеном II типа и антителами к нему [2].

Высокая информативность аутоантител к коллагену заключается не только в возможности оценки его метаболизма, но и в определении выраженности аутоиммунных процессов к белкам внеклеточного матрикса.

Аутоиммунные процессы, как известно, являются необходимым компонентом поддержания гомеостаза, в том числе коллагенового. Возникающий при метаболизме коллагена иммунный ответ в виде циркулирующих типоспецифических аутоантител - в целом физиологический процесс элиминации продуктов жизнедеятельности соединительнотканных структур - отражает, кроме того, уровень активности иммунной системы, ее снижение или формирование аутоиммунных феноменов и персистирующих иммунных реакций, указывает на вовлеченность в патологический процесс отдельных типов коллагена [8].

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1 Материалы

Исследована стерильная гепаринизированная кровь 48 детей с ЮРА, 21 - СКВ, 16 - ЮС и 63 детей с отсутствием иммунообусловленной патологии. Исследуемые дети отличались по возрасту и полу. В каждой из групп были дети, не достигшие 10 лет, а также старше их. На круговых диаграмма рисунка 5 представлено отличие детей по возрасту, а на рисунке 6 по полу.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 5. - Возрастные различия исследуемых детей

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рисунок 6. - Половые различия исследуемых детей

При выполнении работы были использованы следующие реактивы:

1) NaCl 9%;

2) фиколл-верографин (с= 1,077 г/см2);

3) RPMI 1640 - синтетическая питательная среда;

4) HEPES Na соль( ПанЭко, артикул: Ф134);

5) Коллаген II (Flucka, 27662,ФРГ);

6) Коллаген IV(Sigma,C 7521, ФРГ);

7) антиДНК(«CaptiaTM anti-dsDNA», США);

8) РФ («RF LATEX», «Chematil», Италия);

В работе также были использованы следующие оборудование:

1) Стеклянные или пластиковые конические (центрифужные) пробирки;

2) Пипетки полуавтоматические одноканальные “Biohit” (Финляндия);

3) 96-луночные полистироловые планшеты для культивирования клеток;

4) Центрифуга;

5) Термостат;

6) Харвестр;

7) в -счётчик;

8) планшетный фотометр;

9) СО2-инкубатор;

аутоантиген ревматоидный заболевание коллаген

2.2 Методы

2.2.1 Культуральный метод

Использовался для оценки функциональной активности лимфоцитов in vitro. Для этого в искусственных условиях требуется соблюдение ряда правил:

1 )поддержание стерильности среды.

2 )обеспечение культивируемых клеток оптимальной газовой средой. В процессе метаболизма клетки нуждаются в присутствии 5 % СО2, уровень которого поддерживается специальным оборудованием: СО2-инкубатором.

4) поддержание необходимого уровня осмотичности. Использовали раствор HEPES Na соль.

3) поддержание необходимого уровня рН. Стабилизация рН на оптимальном для клеток уровне 7,3-7,35 достигается добавлением в сбалансированные солевые растворы (ССР) буферных солей - фосфатов, бикарбонатов.

4) обеспечение клеток необходимыми питательными веществами и ростовыми факторами проводится с помощью питательной среды. Для лимфоцитов человека, как правило, применяют среду серии RPMI (Roswell Park Memorial Institute) - RPMI-1640 [31].

Схема постановки: 1) в качестве биологического материала использовали стерильную периферическую кровь детей с системными заболеваниями соединительной ткани и кровь детей без патологии; 2) в стерильный плоскодонный планшет вносили по 100 мкл полной культуральной среды и сред с митогенами (коллаген IV 10-мкг/мл и II типа 5- мкг/мл), а затем вносили в лунки суспензии лимфоцитов (для каждого образца - в три лунки); 4) ставили на инкубацию. На 3 сутки отбирали супернатант, замораживали при -22 0 до последующего анализа концентрации антител [6].

2.2.2 Радиометрический пролиферативный тест

На рисунке 7 показан классический пролиферативный тест, в котором лимфоциты и APC инкубируют в присутствии митогена (коллагена IV и II типа). APCs экспрессируют MHC II и презентируют антигены Т-клеткам. Стимуляция пролиферации включает в себя распознавание и дальнейшее получение сигнала. Цитокины, образующиеся в результате Т-клеточной активации и взаимодействия с APC, необходимы для пролиферации. Некоторое количество радиоактивности (в минуту [CPM]), сопровождается включением меченых нуклеотидов в ДНК пролиферирующих клеток, и затем измеряется в опытных и контрольных лунках [31].

Схема постановки: за 6 часов до окончания культивирования клеток вносили в каждую лунку метил-3Н-тимидин и продолжали культивирование ещё 18 часов. Затем клетки переносили на бумажные фильтры с помощью специального прибора харвестера. Фильтры отмывали, помещали в специальные флаконы со сцинтилляционной жидкостью и регистрировали образцы на в-счетчике.

Рисунок 7. - Пролиферативный тест [31]

Рассчитывали индекс пролиферации (ИП) по формуле: ИП = вА (митоген)/ вС (интактные) (2.1.)

Где вА (митоген) - активность изотопа, характеризующий пролиферативную активность мононуклеаров при стимуляции митогенами, вС (интактные) - активность изотопа, характеризующий спонтанную пролиферативную активность лимфоцитов.

2.2.3 Иммуноферментный анализ

Полученный супернатант анализировался на концентрацию аутоантител (антиДНК) методом двухстадийного непрямом иммуноферментного анализа, с использованием набора «CaptiaTM anti-dsDNA», США.

Очищенный антиген адсорбирован на стенках лунок стандартного микропланшета. Предварительно cупернатант вносился в лунки, присутствующие в них антитела, специфичные к двухспиральной ДНК, связываются с иммобилизованным антигеном. Несвязавшиеся антитела удаляли промывкой. Затем добавляли в лунки антитела к иммуноглобулинам человека, меченых ферментом пероксидазой хрена (HRP конъюгат), происходило их связывание с комплексом “антиген-антитело”, иммобилизованным на поверхности лунок. Несвязавшийся конъюгат удаляли промывкой. Затем добавляли субстрат, это приводило к развитию окраски, интенсивность которой прямо пропорциональна концентрации специфических антител к нативной ДНК. Фотометрирование планшета позволяет определить интенсивность окраски и интерпретировать концентрацию специфических антител к двухспиральной ДНК в наших исследуемых образцах.

Интерпретация результатов. Отрицательный результат: если индекс пробы ? 0,90. Указывает на отсутствие определяемого уровня специфических антител к dsDNA. Положительный результат: если индекс пробы ? 1,10. Указывает на наличие специфических антител к dsDNA. Результаты измерялись в МЕ/мл.

2.2.4 Метод латексной агглютинации

У детей с ЮРА, с использованием набора «RF LATEX»( «Chematil», Италия), оценивался уровень РФ методом латексной агглютинации.

Перед постановкой реакции супернатант и набор выдерживали в течение 30 мин при комнатной температуре, затем пипетировали на слайд в отдельные лунки: супернатант пациентов - 20 мкл; положительный контроль - 20 мкл; отрицательный контроль - 20 мкл. Затем добавляли в каждую лунку по 20 мкл латексного реагента, осторожно перемешивали содержимое лунок стеклянной палочкой. Результаты учитывали через 2-3 мин.

Регистрация результатов: анализ образцов пациентов проводить после получения результатов отрицательного и положительного контролей;

отсутствие агглютинации в сыворотке указывает на отсутствие РФ; отрицательным будет результат, содержащий в образце РФ менее 20 МЕ/мл;

положительный: результат (четкая агглютинация) указывает на количественное содержание РФ в сыворотке пациента. При положительной реакции (четкая агглютинация) тест повторялся, с удваиванием разведение сыворотки (1:2; 1:4; 1:8; 1:16; 1:32 и т.д.). Наибольшее разведение, при котором происходила агглютинация, считалось титром реакции.

Производился пересчет содержания РФ в МЕ/мл. Приблизительные значения РФ в международных единицах на мл соответствуют наивысшему разведению с положительным результатом, умноженным на 10.

Концентрация РФ равная 20 МЕ/мл в плазме - диагностическое значение и свидетельствует о ревматоидном процессе [31].

2.2.5 Статистический анализ

Полученные количественные данные обрабатывались в пакете «Statistica 8.0». Для сравнения двух независимых групп использовались непараметрические критерии. Статистически значимыми различия считали при р< 0,05.

При сравнении более двух независимых групп применялся медианный критерий и дисперсионный анализ по Краскелу- Уоллису. Затем, те показатели, для которых было характерны статистически значимые различия, анализировались с помощью критериев Манна-Уитни (U), Вальда-Вольфовица (WW), Колмогорова-Смирнова (K), являющихся непараметрическими альтернативами t-критерия для двух независимых выборок. В случае оценки влияния коллагена на функциональную активность лимфоцитов (сравнении зависимых групп) использовался критерий Вилкоксона (T) [7].

3. 

4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

В последние годы наблюдается повышенный интерес к изучению биохимических параметров обмена коллагена при различных заболеваниях [5]. Возможно, это объясняется тем, что коллаген является одним из компонентов экстрацеллюлярного матрикса, которые у больных с различными аутоиммунными заболеваниями естественным образом вовлекаются в патологический процесс, а гиперактивация как Т так и В- клеточного звена иммунитета и стимуляция других культур лимфоцитов дополнительно способствуют продуцированию антител к коллагенам [2].

4.1 Влияние коллагена на фунциональную активность лимфоцитов у детей с системными заболеваниями соединительной ткани

Нами было исследовано влияние коллагена на функциональную активность лимфоцитов у детей с СЗСТ и детей без иммунообусловленой патологии. Сравнение между спонтанной и индуцированной коллагеном пролиферацией лимфоцитов исследуемых групп проводилось с помощью критерия Вилкоксона. В присутствии коллагена IV типа не установлено статистически значимого влияния на уровень пролиферативной активности лимфоцитов у детей контрольной группы и детей с системными заболеваниями соединительной ткани (СКВ, ЮС). Однако выявлена тенденция к снижению в пролиферативной активности (р = 0,097) в присутствии коллагена II типа у детей с ЮРА по сравнению со спонтанной пролиферацией (таблица 1.).

Литературные данные свидетельствуют о том, что коллаген является иммуногенной молекулой, и может выступать вероятным источником воспалительных иммунных комплексов. Так, для ЮРА характерна ярко выраженная суставная патология. Главным компонентом суставного хряща является коллаген II типа, к которому вероятно и направлен иммунный ответ [30].

Таблица 1. - Влияние коллагена IV и II типа на пролиферативную активность лимфоцитов у детей с системными заболеваниями соединительной ткани (СКВ, ЮС, ЮРА) и в контрольной группе