Исследованы ткани молочной железы здоровых самок и особей со спонтанными злокачественными опухолями мышей линии BYRB [1].

Экспериментально измерялась ЗФ (л_max = 570 нм) и фосфоресценция (л_max = 680 нм) образцов тканей, окрашенных водным раствором эритрозина (или эозина) при фотовозбуждении лазерным импульсом длительностью 10 нс (л_ex = 532 нм).

Кинетика длительной люминесценции регистрировалась с помощью фотоумножителя с управляющим электродом для "запирания" ФЭУ на время вспышки лазера.

Образцы помещали в герметичную термостатируемую камеру. Газовый состав в камере регулировался дозированной продувкой газообразным азотом с чистотой 99.5%.

Результаты и их обсуждение

На рисунке 1 показана характерная кинетика ЗФ эритрозина в опухолевой ткани молочной железы мыши при различной концентрации кислорода в атмосфере над образцом. Наибольшая интенсивность сигнала (кривая 1, рис.1) зарегистрирована при естественном составе воздуха через 2 мкс после "отпирания" ФЭУ. По мере увеличения времени продувки камеры азотом и, следовательно, уменьшения концентрации кислорода, участок нарастания сигнала на кривой исчезает, амплитуда сигнала падает и кинетика становится монотонно затухающей (кривые 2 - 4, рис.1).

Мы полагаем, что на временном отрезке от 0 до ~10 мкс кривая ЗФ складывается из трех составляющих, имеющих различную природу [2-4]:

, (1)

где A₁, А₂ и A₃ - неотрицательные константы, N_T (t) - концентрация триплет-возбужденных молекул красителя, N_D (t) - концентрация синглетного кислорода.

Первое слагаемое в этом уравнении определяет составляющую люминесценции, обусловленную синглет-триплетной аннигиляцией (СТА), второе - триплет-триплетной аннигиляцией (ТТА), а третье - термостимулированной ЗФ (ТЗФ).

Кривая 1 на рис.1 демонстрирует нарастание ЗФ на начальном участке благодаря накоплению синглетного кислорода в процессе столкновений триплет-возбужденных молекул красителя с молекулярным кислородом в основном (триплетном) состоянии. С уменьшением содержания кислорода в среде при неизменной концентрации красителя эффект нарастания ЗФ за счет СТА не проявляется на фоне быстро спадающих во времени ТТА и ТЗФ (1). Этот режим затухания ЗФ реализован в кривых 2, 3 и 4 на рисунке 1.

Для определения доли аннигиляционных вкладов в регистрируемый сигнал была исследована кинетика ЗФ красителей в двух крайних случаях: после длительной продувки камеры азотом и при естественном составе воздуха в камере. Полученные экспериментальные кривые ЗФ для нормальной и опухолевой ткани при малой и большой концентрации кислорода в камере показаны на рисунке 2 (кривые с номером 1 на вставках A и B, D и E, рис.2, соответственно).

Из рисунка видно, что как в здоровой, так и в опухолевой ткани при естественном составе воздуха над образцами и, следовательно, значительной концентрации молекулярного кислорода в клетках, кинетика ЗФ имеет на коротких временах участок нарастания, которого нет при малых концентрациях кислорода. При этом в здоровых и патогенных тканях кинетика ЗФ существенно различается.

опухолевая ткань замедленная флуоресценция фосфоресценции

При анализе этих кривых учитывалось, что функция времени N_T (t) в выражении (1) пропорциональна мгновенному значению интенсивности фосфоресценции образца I_фос (t), т. е

, (2)

где B₁, В₂ и B₃ - неотрицательные постоянные коэффициенты.

Технически с помощью вычислительных средств подбирались такие значения коэффициентов B₂ - B₃ и такие параметры пробных функций B₁*N_Д (t), при которых правая часть (2) наилучшим образом аппроксимирует экспериментальную кривую I_ЗФ (t) по методу наименьших квадратов.

Для случая малых концентраций кислорода в клетках в качестве пробной функции N_Д (t) взята затухающая экспонента, отражающая предположение о том, что при малой концентрации кислорода и большой концентрации триплетных возбуждений величина N_Д (t) только убывает, т.к. практически весь триплетный кислород переведен в синглетное состояние уже к моменту окончания лазерной вспышки. Для больших концентраций кислорода в клетках в качестве N_Д (t) бралась сумма трех или четырех лоренцевых кривых, обеспечивающих участки нарастания и спада кривой.

Результаты такой аппроксимации при малой и большой концентрациях кислорода для здоровой и опухолевой тканей показаны на рисунке 2 (кружки на вставках A и B, D и E рис.2, соответственно). Коэффициенты B₂ и B₃ сведены в таблицу 1. Там же приведены относительные вклады (оцененные по площади под соответствующей кривой) в сигнал ЗФ от процессов СТА, ТТА и ТЗФ. Из рисунка видно, что сделанные предположение относительно вида N_Д (t) позволяют удовлетворительно аппроксимировать экспериментальные кривые ЗФ при обеих концентрациях кислорода в камере как для нормальных, так и для опухолевых тканей.

Таблица 1. Подгоночные коэффициенты в уравнении (2) и относительные интегральные вклады различных типов длительного послесвечения в общий сигнал

Анализ данных таблицы 1 свидетельствует о том, что в атмосфере азота относительный вклад ТТА в ЗФ заметно больше в нормальной ткани. Причиной тому может быть меньшая вязкость цитоплазмы, приводящая к большей подвижности молекул флуорофора и росту вероятности их взаимодействия. Различия в вязкости цитоплазмы в здоровых и опухолевых клетках установлены в работе [5-9]. Полученные нами результаты подтверждают эти выводы и дают косвенный метод оценки вязкости цитоплазмы в клетках.

Заметим, что интенсивность и длительность свечения, обусловленного СТА, в здоровой и опухолевой тканях отличаются, но относительный интегральный вклад этого процесса в кинетику ЗФ в разных тканях при малой концентрации кислорода одинаков. Равенство вкладов можно объяснить тем, что "выгорание" синглетного кислорода в здоровых тканях идет быстрее за счет большей подвижности молекул в менее вязкой цитоплазме. Этот предположение подтверждается кинетикой безразмерных функций B₁*N_D (t) (вставка С на рис.2), отражающих ход концентрации синглетного кислорода.

Cравнение кривых ЗФ и данных табл.1 при большой и малой концентрациях кислорода в камере показывает, что в целом изменение относительных вкладов трех составляющих ЗФ соответствует ожидаемому возрастанию роли СТА при увеличении концентрации кислорода. Вместе с тем нужно отметить, что это возрастание необычно велико, поскольку оно привело к полному исчезновению вклада в сигнал от триплет-триплетной аннигиляции в образцах.

Обращает на себя внимание существенная разница в ходе безразмерных функций B₁*N_D (t) при большой концентрации кислорода в камере (вставка F на рис.2). Мгновенные значения B₁*N_D (t) через коэффициент B₁ зависят от условий образования столкновительных пар флуорофор - кислород, т.е. потенциально могут быть индикаторами специфического состояния клеток. С другой стороны, B₁*N_D (t) через N_D (t) увеличивается с ростом концентрации молекулярного кислорода в клетке. Однако представляется маловероятным, что столь значительное отличие кривых B₁*N_D (t) у нормальной и опухолевой тканей объясняется разными в концентрациями молекулярного кислорода в клетках.

Известно [10-13], что в клетках тканей человека и животных имеют место механизмы, поддерживающие сравнительно "безопасную" концентрацию кислорода и его активных форм (АФК) в цитоплазме. К ним относят защитные меры надклеточного уровня, снижающие снабжение клеток кислородом, а также внутриклеточные процессы - четырехэлектронное восстановление внутриклеточного кислорода при участии цитохромоксидазы без освобождения свободных радикалов; ферментативное удаление образовавшегося супероксидного анион-радикала и перекиси водорода, антоксидантную нейтрализацию АФК и др. Однако в наших экспериментах все эти механизмы либо выключены (нет кровоснабжения), либо недостаточно эффективны по сравнению с мощным диффузионным потоком кислорода прямо из атмосферы через мембрану клетки. В этих условиях концентрация молекулярного кислорода внутри разных клеток должна определяться только его внешним парциальным давлением и растворимостью в цитоплазме.

Таким образом, заметное увеличение B₁*N_Д (t) в пораженных тканях по сравнению с нормальными (вставка F на рис.2) обусловлено не разными исходными концентрациями кислорода в клетках, а более благоприятными условиями для образования синглетного кислорода и процессов СТА. Однако обратное соотношение эффективностей СТА в этих же образцах при пониженных концентрациях кислорода (табл.1 и вставка С на рис.2) не соответствует этому предположению.

С учетом этих противоречивых обстоятельств можно дать следующую интерпретацию полученных результатов. По-видимому, наблюдаемые сигналы ЗФ обусловлены суперпозицией свечения молекул красителя, адсорбированных мембраной, связанных внутри - и межклеточными белками, и молекул, растворенных в воде цитоплазмы. При естественном составе воздуха над образцами кислород, имея высокую концентрацию и большую подвижность, успевает "потушить" триплетные возбуждения молекул красителя в воде еще до "отпирания" ФЭУ и начала регистрации сигналов. При этом в эксперименте фиксируется только ЗФ от красителя, связанного белками и находящегося в мембране, где подвижность кислорода и доступность красителя для него значительно меньше.

С этой точки зрения следует считать, что найденная нами разница в ходе B₁*N_Д (t) и в характеристиках ЗФ в разных тканях при большой концентрации кислорода скорее обусловлены отличиями в свойствах их мембран, внутри - и межклеточных белков. В этих условиях кинетика ЗФ определяется в основном процессами синглет-триплетной аннигиляции и ТЗФ связанных люминофоров. Этот вывод подтверждается отсутствием в наблюдаемом сигнале ЗФ вклада от ТТА, которая у связанных люминофоров и должна быть полностью "выключена". Отметим в этой связи, что изменения мембран и внутриклеточного состава в патологических тканях установлены в ряде работ [14-20].

При малых концентрациях кислорода экспериментально регистрируется ЗФ как связанных белками, так и растворенных в воде цитоплазмы молекул красителя, что приводит к другим значениям B₂ и B₃ и, возрастанию роли ТТА в процессе. Об участии в формировании общего сигнала диффузионно-подвижных молекул красителя в цитоплазме свидетельствует заметный интегральный вклад ТТА в ЗФ (таблица 1).

Выводы