Фармакогностическое исследование представителей родов Origanum L. и Rhododendron L. Флоры восточной Сибири

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

Фармакогностическое исследование представителей родов Origanum L. и Rhododendron L. Флоры восточной Сибири

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Мирович В.М.

Улан-Удэ - 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный консультант: доктор фармацевтических наук, профессор

Федосеева Галина Михайловна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Анцупова Татьяна Петровна

доктор фармацевтических наук

Боковикова Татьяна Николаевна

доктор фармацевтических наук, профессор

Федосеева Людмила Михайловна

Ведущая организация ГОУ ВПО «Башкирский государственный

медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

В последние годы во всем мире остается высокий интерес к лекарственным препаратам, созданным на основе природного сырья.

В профилактике и комплексной терапии заболеваний органов дыхания широко используются растительные средства с антимикробным, противовоспалительным и иммуномодулирующим действием. Значительная часть таких средств создана на основе эфирных масел, природных полифенольных соединений, терпеноидов, полисахаридов (Машковский М.Д., 2008).

Распространенность патологии дыхательных путей носит глобальный характер и занимает одно из лидирующих мест в структуре заболеваемости по классам и группам болезней. Рост болезней органов дыхания обусловливается неблагоприятной экологической обстановкой, нерациональным питанием, стрессами, а также прогрессирующим ростом резистентности возбудителей патологии к широко применяемым и относительно новым антибиотикам, возрастающей этиологической ролью условно-патогенной микрофлоры (Чучалин А.Г., 2007; Стрельцова Е.Н., 2007).

В связи с этим была разработана Федеральная целевая программа «Концепция развития пульмонологической службы России на 2002-2007 годы». Одной из важных стратегий этой программы является разработка и внедрение для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания отечественных препаратов.

Обоснованность применения растительных средств в профилактике и лечении заболеваний органов дыхания определяется тем, что к ним практически не наблюдается привыкания микроорганизмов, они сочетают в себе комплексы биологически активных веществ (БАВ), обусловливающих многопрофильное действие на основные стадии патологического процесса (Соколов С.Я., 2000).

Расширение ассортимента растительных средств, применяемых для лечения болезней органов дыхания, может осуществляться за счет углубленного изучения растений научной, а также народной медицины. Особого внимания заслуживают растения, имеющие в своем химическом составе несколько групп БАВ, сочетание которых расширяет и усиливает фармакотерапевтическое действие. Так представители родов Origanum L. и Rhododendron L. накапливают эфирные масла, тритерпеноиды, полифенольные соединения, для них свойственно разностороннее фармакологическое действие (Ткаченко К.Г. в соавт., 2002; Мурашкина И.А., 2003; Белоусов М.В., 2004; Рогачев А.Д., 2009).

Номенклатура растительных средств отхаркивающего и противовоспалительного действия, в частности на основе травы душицы ограничена. Душица обыкновенная - Origanum vulgare L. используется в виде настоя, в составе сбора грудного №1, а также многокомпонентного бальзама «Первопрестольный».

Растения рода Rhododendron L. в Восточной Сибири широко распространены, имеют достаточные сырьевые ресурсы, и, несмотря на проведенные ранее химико-фармакологические исследования, они не внедрены в медицинскую практику. Сравнительное фармакогностическое исследование восточносибирских рододендронов позволит решить вопрос о целесообразности использования отдельных видов в медицине в комплексном лечении заболеваний органов дыхания.

Таким образом, расширение ассортимента растительных средств, рекомендуемых в терапии заболеваний органов дыхания за счет растений родов Origanum L. и Rhododendron L., является актуальной задачей.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы является комплексное фармакогностическое исследование представителей родов Origanum L. и Rhododendron L. флоры Восточной Сибири для получения новых растительных средств антимикробного, противовоспалительного и иммуномодулирующего действия, предназначенных для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания.

Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

- изучить ассортимент растительных средств, применяемых для лечения заболеваний органов дыхания; дать анализ современного состояния изученности растений родов Origanum L. и Rhododendron L;

- разработать научно-методические подходы к поиску и исследованию растений Восточной Сибири как возможных источников средств для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания;

- провести изучение химического состава душицы обыкновенной и видов рододендронов флоры Восточной Сибири; установить закономерности накопления и распределения БАВ по органам и фазам развития, обосновать рациональные сроки заготовки для указанных видов сырья;

- провести исследования по стандартизации перспективных видов сырья, разработать новую и усовершенствовать действующую нормативную документацию;

- разработать и экспериментально обосновать состав растительного сбора «Бронхофит», определить критерии подлинности, разработать методики количественного определения основных групп биологически активных веществ и нормы их содержания, составить проект Фармакопейной статьи предприятия;

- разработать технологии получения экстракционных средств из сбора «Бронхофит», травы душицы обыкновенной и побегов рододендрона Адамса, провести их стандартизацию.

Научная новизна работы

Сформулированы научно-методические подходы, в основе которых лежит проведение теоретических и экспериментальных исследований по поиску растений антимикробного, противовоспалительного и иммуномодулирующего действия, имеющих достаточный ресурсный потенциал, в дальнейшем осуществляется их комплексное фармакогностическое изучение и разработка одно- и многокомпонентных растительных средств.

В составе изучаемых растений выделено и идентифицировано 35 фенольных соединений: из них для рододендрона Адамса новых 5 фенольных соединений, для рододендрона мелколистного -10.

Впервые хромато-масс-спектрометрическим методом исследован состав эфирных масел. Идентифицировано 128 компонентов, из них для душицы обыкновенной впервые определено 22, для рододендрона Адамса -19, а рододендрона мелколистного - 34 компонента эфирного масла.

Выявлены закономерности накопления отдельных групп БАВ в душице обыкновенной, обусловленных климато-географическими факторами. Установлено, что душица обыкновенная, произрастающая в сибирском регионе, относится к хеморасе, характеризующейся низким содержанием фенольной фракции (соединений тимола и карвакрола) в составе эфирного масла, а накопление флавонов (производных лютеолина и апигенина) зависит от географической широты и климатических условий. Впервые изучена динамика накопления БАВ у восточносибирских видов рододендронов по органам и фазам развития, установлено, что их максимальное количество накапливают листья и побеги текущего года в период плодоношения.

Разработана рецептура грудного сбора «Бронхофит», содержащего БАВ антимикробного, противовоспалительного, иммуномодулирующего и антиаллергического действия. Изучен его химический состав: идентифицировано 55 компонентов эфирного масла и 16 фенольных соединений, обнаружены незаменимые аминокислоты и эссенциальные для иммунной системы микроэлементы.

Определены оптимальные условия получения экстрактов из сбора «Бронхофит», душицы обыкновенной и рододендрона Адамса. Для них установлены показатели подлинности и предложены методики количественного определения основных групп БАВ.

Эффективность и безопасность разработанных средств подтверждена биолого-фармакологическими испытаниями.

Новизна полученных результатов подтверждена 6 патентами РФ и авторским свидетельством.

Практическая значимость

Результаты фармакогностических, химических и фармакологических экспериментов свидетельствуют о перспективности разработки новых эффективных растительных средств для лечения и профилактики заболеваний органов дыхания с использованием душицы обыкновенной дикорастущей и культивируемой, а также видов рододендронов флоры Восточной Сибири.

Разработан проект изменения № 2 к ФС 55 «Трава душицы». Проект изменения, пояснительная записка, таблицы аналитических данных, материалы сравнительного изучения с аналогами находятся на рассмотрении в Фармакопейном комитете (письмо № 773/07 от 25.09.2008 г). Методика количественного определения суммы флавоноидов в траве душицы включена в межгосударственный стандарт «Трава душицы» (ГОСТ 2103-93), являющийся действующим по настоящее время.

Предложены способы получения экстрактов, которые могут быть реализованы в условиях фармацевтического производства: «Бронхофит» экстракт сухой, душицы экстракт жидкий (1:1), рододендрона Адамса экстракты жидкий (1:2) и сухой.

Разработаны проекты: ФСП 42-0048-55564631-08 на сбор «Бронхофит», ФСП 42-0049-55564631-08 «Рододендрона Адамса побеги», ФСП 42-0050-55564631-08 «Бронхофит» экстракт сухой», которые приняты в ООО «Русский лес» к рассмотрению и включены в план перспективного развития предприятия.

Материалы исследований включены в методические пособия, два из которых изданы с грифом УМО: «Охрана лекарственных и редких исчезающих растений» (Иркутск, 2002, 99 с.); «Морфологический анализ растений и лекарственного растительного сырья. Характеристика и представители основных растительных семейств» (Иркутск, 2003, 96 с.); «Микроскопические диагностические признаки лекарственных растений народной медицины Восточной Сибири» (Иркутск, 2007, 114 с); «Фитохимический анализ растений и сырья, содержащих простые фенольные соединения и кумарины» (Иркутск, 2009, 47 с). Материалы диссертации используются в учебном процессе при изучении фармакогнозии, основ экологии и охраны природы, а также на факультете повышения квалификации провизоров.

По результатам исследований в соавторстве опубликована монография «Дикорастущие и культивируемые лекарственные растения Восточной Сибири» (Иркутск, 2010, 192 с).

Положения, выдвигаемые на защиту:

- обоснование перспективности растений родов Origanum L. и Rhododendron L. флоры Восточной Сибири для разработки на их основе новых эффективных растительных средств, предназначенных для лечения заболеваний органов дыхания;

- результаты фитохимического изучения душицы обыкновенной и видов рододендронов восточносибирского региона, исследования закономерностей накопления БАВ в зависимости от некоторых экологических факторов;

- результаты исследований по стандартизации сырья душицы обыкновенной и рододендрона Адамса, материалы по разработке и совершенствованию нормативной документации на указанные виды сырья;

- результаты теоретических и экспериментальных исследований по разработке состава и стандартизации сбора «Бронхофит»;

- результаты по разработке технологии и показателей качества экстракционных средств.

Конкретное участие автора в получении научных результатов

Основная часть исследований (85% общего объема) выполнена лично автором. Отдельные фрагменты работы по стандартизации сырья душицы обыкновенной и побегов рододендрона Адамса проведены совместно с доцентом каф. фармакогнозии СПХФА Р.К. Шатохиной и ассистентом каф. фармакологии ИГМУ А.И. Левентой. Фармакологические исследования проведены на кафедре фармакологии и Центре лабораторной диагностики ИГМУ под руководством д-ра мед. наук, профессора Л.А Усова.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы были представлены на конференциях: - первом международном научном конгрессе «Традиционная медицина и питание: теоретические и практические аспекты» (Москва, 1994); - «Состояние и перспективы научных исследований в области фармации» (Самара, 1996); - «Сохранение разнообразия в Байкальском регионе» (Улан-Удэ, 1996, 1997); - международном симпозиуме «Россия - Германия: история, культура, наука» (Иркутск, 1999); - международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2003); - «Лекарственные растения в фармакологии и фармации» (Барнаул, 2004); - «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2004, 2006-2009); - «Traditional medicine: a current situation and perspectives development: materials of the III international scientific conference» (Ulan-Ude, 2008); - «Фармация Казахстана: интеграция науки, образования и производства» (Шымкент, 2009).

Связь задач исследований с проблемным планом

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом основных научных исследований ГОУ ВПО «Иркутский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по комплексной теме: «Изучение перспективных лекарственных растений Восточной Сибири» (номер государственной регистрации 01.2.00304320).

Публикации

Содержание работы отражено в 54 научных работах, из которых 16 статей в периодических изданиях, рекомендованных ВАК МО и науки РФ, 1 монография, 6 патентов РФ на изобретение и 1 авторское свидетельство.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 308 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований (4 главы), выводов, списка использованной литературы, включающего 334 источников, из которых 81 - на иностранных языках и приложений. Работа иллюстрирована 79 таблицами и 71 рисунком.

В первой главе дан анализ ассортимента растительных средств, применяемых при заболеваниях органов дыхания, и обоснована необходимость его расширения, а также проанализированы результаты современного состояния изученности растений родов Origanum L. и Rhododendron L.

Вторая глава содержит характеристику объектов, описание методов исследований и способы статистической обработки результатов.

Последующие 4 главы посвящены комплексному фармакогностическому исследованию душицы обыкновенной и видов рододендронов. В разделе «Заключение» обсуждены полученные результаты и перспективы их практического применения, а также изложены научно-методические подходы к поиску и изучению лекарственных растений Восточной Сибири перспективных для разработки новых эффективных растительных средств, предназначенных для лечения заболеваний органов дыхания.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Образцы сырья представителей рода Rhododendron (рододендрон Адамса - Rh. adamsii Rehder, р. мелколистный - Rh. parvifolium Adams, р. даурский - Rh. dahuricum L. и р. золотистый - Rh. aureum Georgi) заготавливали на территории Иркутской области и Бурятии. Сырье душицы обыкновенной - Origanum vulgare L. было собрано в Иркутской области, Ставропольском крае, Новосибирской области, а также использовались коммерческие образцы. Образцы сырья душицы обыкновенной культивируемой собирали в питомнике лекарственных растений Иркутского государственного медицинского университета.

Растительное сырье для разработки и исследования сбора «Бронхофит» было приобретено через аптечную сеть и соответствовало требованиям нормативной документации.

Анатомическое исследование растительного сырья проводили по методике, описанной в ГФ XI, вып. 1. Микропрепараты изучали и фотографировали на световом инвестированном микроскопе «Zeiss Axiovert 200» с обработкой фотографий в программе Windows Adobe Photoshop 7,0.

Спектральные исследования проводили на приборах СФ-46; СФ-26; Unicam SP-800; Specord UV-Vis, FTLR Perkin Elmer Spectr One; ЯМР-спектры снимали на приборе VXR-500S фирмы «Varian».

Состав эфирного масла исследовали на газовом хроматографе Agilent Technologies (6890N), с квадрупольным масс-спектрометром (MSD 5973) в качестве детектора, на кварцевой колонке HP- 5MS. Идентификацию соединений проводили путем сравнения полных масс-спектров и времен удерживания с соответствующими данными чистых соединений и по данным масс-спектральной библиотеки NIST.

Исследования методом ВЭЖХ проводили на приборах «GILSTON» и «Shimadzu CLASS VP V6. 12SP1» с последующей компьютерной обработкой данных исследования с помощью программы «Мультихром» для «Windows».

Качественный и количественный состав аминокислот исследовали с помощью аминокислотного анализатора KLA-3B (Hitachi, Япония).

Изучение элементного состава образцов проводили на квадрупольном масс-спектрометре Agilent 7500 ce c использованием инертной системы ввода образца.

Золу общую и золу, нерастворимую в 10% растворе кислоты хлористоводородной определяли на приборе ММ «Мелистон».

При разработке методик количественного определения использовали государственные стандартные образцы (ГСО): лютеолин - ФС 42-0174-06; кверцетин - ТУ 9369-139-04868244-07, гиперозид - ФС 42-0106-03 и лютеолин-7-глюкозид - ФС 42-0175-06.

Использованы статистические методы обработки результатов химического эксперимента и биологических испытаний (ГФ XI).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Фитохимическое изучение душицы обыкновенной и видов рододендронов, произрастающих в Восточной Сибири

Выделение суммы фенольных соединений проводили по схеме (рис. 1). Для изучения состава агликонов флавоноидов в очищенных водных экстрактах изучаемых растений проводили ферментативный (душица обыкновенная) и кислотный (рододендроны) гидролиз. При разделении агликонов флавоноидов колоночной и препаративной бумажной хроматографией было выделено 8 агликонов (1-8). Исследования УФ-, ИК-спектров показали, что флавоноиды душицы обыкновенной являются производными лютеолина, апигенина, хризина и 5-оксифлавона; рододендрона Адамса - производными кверцетина, мирицетина и азалеатина; рододендрона мелколистного - кверцетина, мирицетина и дигидрокверцетина; даурского - кверцетина, мирицетина; золотистого - кверцетина (табл. 1).

Далее проводили изучение состава нативных флавоноидов душицы обыкновенной, рододендронов Адамса и мелколистного. Извлечения из сырья получали по схеме (рис. 1), разделение флавоноидов проводили на колонках, заполненных полиамидом.

Было выделено в индивидуальном состоянии 13 веществ флавоноидной природы. Вещества (9), (12), (15), (16), (20) являются агликонами. По спектральной характеристике, физико-химическим свойствам и в сравнении с заведомо известными веществами идентифицированы соединения: (9) - 5-оксифлавон, (12) - лютеолин, (15) - 7,3?,4?-триокси-5-метоксифлавонол (азалеатин), (16) - 5,7,3?,4?- тетраоксифлавонол (кверцетин), (20) - 5,7,3?,4?,5?- пентаоксифлавонол (мирицетин) (табл. 2).



Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 1. Схема выделения индивидуальных фенольных соединений из душицы обыкновенной и видов рододендронов

Таблица 1

Основные свойства агликонов флавоноидов, выделенных из растений родов Origanum L. и Rhododendron L. после гидролиза экстрактов

Вещество и его шифр	Формула	Т.пл.0С	Полосы поглощения в УФ-спектре, нм	Источник выделения
Апигенин (1)	С15Н10О5	340	338 270	Origanum vulgare
Лютеолин (2)	С15Н10О6	330	350,293пл 255,266пл	Origanum vulgare
Хризин (3)	С15Н10О4	290	313 270,245пл	Origanum vulgare
5-оксифлавон (4)	С15Н10О3	158-160	338, 296 268	Origanum vulgare
Кверцетин (5)	С15Н10О7	316- 318	370 258,274пл	Rhododendron adamsii Rhododendron dahuricum Rhododendron aureum Rhododendron parvifolium
Мирицетин (6)	С15Н8О8	350- 357	374 254,270пл	Rhododendron adamsii Rhododendron dahuricum Rhododendron parvifolium
Азалеатин (7)	С16Н12О7	317- 320	364 252,272пл	Rhododendron adamsii
Дигидроквер-цетин (8)	С15Н12О7	221- 239	290,327пл 262пл	Rhododendron parvifolium

Для идентификации гликозидов проводили кислотный и ферментативный гидролиз, регистрировали УФ-, ИК-спектры.

По результатам проведенного анализа в сравнении с достоверными образцами и по данным литературы были идентифицированы соединения: (10) - апигенин-7-Я-D-глюкопиранозид (космосиин), (11) - лютеолин-7-Я-D-глюкуронид, (13) - хризин-7-Я-D-глюкуронид, (17) - азалеатин-3-Я-D-глюкопиранозид, (18) - кверцетин-3- Я-D-галактопиранозид (гиперозид), (19) - кверцетин-3-б-L-арабофуранозид (авикулярин), (21) -дигидрокверцетин -3-Я-L-арабофуранозид. Соединение (14) отнесено к гликозидам (апигенина) (табл. 2).

Идентификацию фенолкарбоновых кислот проводили по температуре плавления, хроматографическому поведению, продуктам расщепления, данным элементного анализа, УФ- и ИК-спектроскопии (табл. 3).

Таблица 2

Основные свойства нативных флавоноидов, выделенных из растений родов Origanum L. и Rhododendron L.

Вещество и его шифр	Формула	Т.пл.0С	Полосы поглощения в УФ-спектре, нм	Источник выделения
5-оксифлавон (9)	С15Н10О3	158-160	338,296 268	O. vulgare
Космосиин (апигенин-7-Я-D-глюкопиранозид) (10)	С21Н20О10	178	337,330 267,284	O. vulgare
Лютеолин-7-Я-D-глюкуронид (11)	С21Н18О12	190-193	350 257,267	O. vulgare
Лютеолин (12)	С15Н10О6	330	350,293 255,266п	O. vulgare
Хризин-7-Я-D- глюкуронид (13)	С21Н18О10	224-226	306 п 270	O. vulgare
Гликозид апигенина (14)	-	-	338 270	O. vulgare
Азалеатин (15)	С16Н12О7	317-320	364 252	Rh. adamsii
Кверцетин (16)	С15Н10О7	316- 318	370 258,274п	Rh. adamsii Rh. parvifolium
Азалеатин-3-Я-D-глюкопиранозид (17)	С22Н22О12	-	359 265	Rh. adamsii
Гиперозид (кверцетин-3--D-галактопиранозид) (18)	С21Н20О12	236-237	362 257,269п	Rh. adamsii Rh. parvifolium
Авикулярин (кверцетин-3--L-арабофуранозид) (19)	С20Н18О11	216-217	360, 260,270п	Rh. adamsii Rh. parvifolium
Мирицетин (20)	С15Н8О8	350- 357	374 254	Rh. adamsii Rh. parvifolium
Дигидрокверцетин-3-Я- L -арабофуранозид (21)	С20Н16О11	-	295 245	Rh. parvifolium

Таблица 3

Физико-химические свойства ароматических кислот, выделенных из растений родов Origanum L. Rhododendron L.

Соединение и шифр	Формула	Т.пл.0С	Значения Rf	Окраска пятен	2•10-5 М р-р в абс. этаноле	Источник выделения
			1	2	3	УФ-свет	+ пары NH3
Производные бензойной кислоты:
Ванилиновая (23)	С8Н8О4	201-204	0,40	0,29	0,50	голубая	голубая фл.	260,290пл	Origanum vulgare Rh. adamsii
Протокатеховая (24)	С7Н6О4	196-198	0,86	0,23	0,64	фиолетовая	фиолетовая фл.	217,258, 295пл	Origanum vulgare Rh. adamsii
П-оксибен-зойная (25)	С7Н6О3	212-214	0,88	0,39	0,58	фиолетовая	фиолетовая	255	Origanum vulgare Rh. adamsii
Сиреневая (26)	С9Н11О4	-	0,82	0,22	0,53	-	-	219,272	Origanum vulgare
Производные коричной кислоты
Феруловая (27)	С10Н10О4	-	0,84	0,32	0,63	синяя	фиолетовая	242, 300пл, 328	Rh. adamsii
Кофейная (28)	С9Н8О4	196-198	0,69	0,25	0,47	сине-голубая	желто-зеленая фл.	245,290пл, 330	Origanum vulgare Rh. adamsii
Синаповая (29)	С11Н12О5	-	0,57	0,25	0,66	сине-зе-леная	сине-зеленая фл.	235, 260, 300	Rh. parvifolium
Хлорогеновая (30)	С16Н6О3	203-204	0,63	0,33 (0,55)	0,74	сине-голубая	зелено-голубая фл.	245, 300пл, 326	Origanum vulgare Rh. parvifolium
Коричная (31)	С9Н8О2	133	0,81	0,27	0,56	-	-	275	Origanum vulgare

Системы: 1 - н-бутанол-лед. кислота уксусная -вода (4:1:2); 2 - 2% кислота уксусная; 3 - 15% кислота уксусная.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Наличие ароматической части в молекуле и карбоксильных групп подтверждаются соответствующими полосами поглощения в ИК-спектрах.

Идентифицированы производные бензойной кислоты: (23) - ванилиновая, (24) - протокатеховая, (25) - п-оксибензойная, (26) - сиреневая; коричной кислоты: (27) - феруловая, (28) - кофейная, (29) - синаповая, (30) - хлорогеновая, (31) - коричная.

Соединение (32) имеет температуру плавления 67-68⁰С, в УФ-спектре (EtOH) максимумы поглощения л_max: 275, 310 нм, в ИК-спектре имеются частоты характерные для кумарина. Соединение (32) идентифицировано как кумарин. Соединение (33) имеет температуру плавления 269-270⁰С, в УФ-спектре (EtOH) имеются максимумы поглощения л_max: 230, 250, 271, 316; + натрия этилат - 240, 390. Соединение (33) идентифицировано как 6,7-диоксикумарин (эскулетин).

Идентификация соединения (22) проведена по данным УФ-, ИК- и ЯМР- спектроскопии. В УФ-спектре (EtOH) имеется максимум поглощения при 268 нм, от прибавления натрия этилата наблюдается гипсохромный сдвиг до 263 нм. В ИК-спектре имеются максимумы поглощения 1680-1545 см ^-1 - валентные колебания -С=С-, 1680 см ^-1 - альдегидная группа, 3380-3490 см ^-1 валентные колебания ОН-групп.

При анализе ПМР-спектра вещества (22) выявлен тип соединения: ArOH (д, м.д. 4,62); ArH (д, м.д. триплет в области 6,69-6,71 и дуплет 7,52-7,54). Из анализа ЯМР ¹³С спектра выявлен тип соединения: ArOH (д, м.д. 128,7); ArX в мета- положении (д, м.д. 130,4); ArX в орто-положении (д, м.д. 116,4); R-C=O (д, м.д. 181,3). На основании проведенных исследований соединение (22) идентифицировано как 2,3-диоксибензальдегид.

Использование ВЭЖХ в определении некоторых БАВ рододендрона Адамса

Метод ВЭЖХ более информативен и позволяет охарактеризовать основные компоненты, содержащиеся в смеси. Изучение состава спиртового извлечения рододендрона Адамса проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «CILSTON» (рис. 2)

В результате были идентифицированы соединения: олеаноловая кислота (0,06%); урсоловая кислота (5,64%); Я-ситостерин (17,35%); 2,3- диоксибензальдегид (1,50%); арбутин (3,98%); кемпферол (0,49%); кофейная кислота (2,43%); гиперозид (0,29%); рутин (16,52%); нарингенин (15,31%); кверцетин (6,83%).

Таким образом, для рододендрона Адамса впервые идентифицировано 5, а для рододендрона мелколистного - 10 фенольных соединений.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Хроматограмма спиртового извлечения побегов рододендрона Адамса

Изучение компонентного состава эфирных масел

В составе эфирного масла душицы обыкновенной дикорастущей было обнаружено 136 компонентов (идентифицировано 33), в культивируемой - 155 компонентов (идентифицировано 39). Состав эфирного масла душицы обыкновенной в период цветения в условиях Восточной Сибири представлен в основном сесквитерпенами (31 компонент). Из монотерпенов идентифицировано 9 компонентов, а фенолы представлены 2 соединениями.

По нашим данным в составе эфирного масла душицы обыкновенной дикорастущей содержание фенольной фракции невысокое, суммарное количество тимола и карвакрола составляет 1,34%. Основными компонентами эфирного масла являются: монотерпены - (-)-4-терпинеол (14,39%), б-терпинеол (5,14%), Я-линалоол (2,0%); сесквитерпены - кариофиллен оксид (27,20%), (-)-спатуленол (7,89%), (+,-)-Я-бисаболен (2,84%), 12-оксабицикло[9.1.0]додека-3,7-диен (3,58%), кариофиллен (2,59%) (рис. 3).

В эфирном масле душицы обыкновенной культивируемой сумма фенолов составляла только 0,27%. Основные компоненты эфирного масла: монотерпены - (-)-4-терпинеол (2,15%), Я-линалоол (1,74%), б-терпинеол (0,85%); сесквитерпены - (-)-спатуленол (25,02%), кариофиллен оксид (13,77%), кариофиллен (5,62%), 12-оксабицикло[9.1.0]додека-3,7-диен (4,00%), (+,-)-Я-бисаболен (3,70%), б-кариофиллен (1,22%) (рис. 4).

Кроме того, в анализируемых образцах эфирного масла были обнаружены другие компоненты, которые приводятся в литературе как характерные для душицы обыкновенной: р-цимен, 1,8-цинеол, (-)-Я-боурбонен, Я-кариофиллен, р-цимен-8-ол и др. (Ткачев А.В., 2002). Впервые в эфирном масле душицы обыкновенной идентифицировано 22 компонента.

Качественный состав эфирного масла душицы обыкновенной, культивируемой в условиях Восточной Сибири, незначительно отличается от душицы обыкновенной дикорастущей этого же региона. Разница основных компонентов эфирного масла заключается в их количественных соотношениях. origanum rhododendron бронхофит дыхание

Таким образом, нами установлено, что душица обыкновенная, произрастающая и культивируемая в сибирском регионе по содержанию фенолов в составе эфирного масла относится к четвертой хеморасе, а именно, с низким содержанием тимола и карвакрола, что характерно также для душицы обыкновенной из Европейской части России и Западной Сибири (Ткачев А.В., 2002; Ткаченко Г.К. в соавт., 2002). В составе эфирного масла душицы обыкновенной преобладают сесквитерпены.

Рис. 3. Хроматограмма компонентного состава эфирного масла душицы обыкновенной дикорастущей

В составе эфирного масла рододендрона Адамса было обнаружено 53 компонента, методом хромато-масс-спектрометрии идентифицировано 27 компонентов. В составе монотерпенов идентифицировано 3 компонента, а в составе сесквитерпенов 24 соединения.

Рис. 4. Хроматограмма компонентного состава эфирного масла душицы обыкновенной культивируемой

Преобладающими компонентами эфирного масла являются гермакрон (26,24%), ±-транс-неролидол (18,44%), селин-3,7(11)-диен (8,28%), гвайя-3,9-диен (5,8%), (+)-ледол (4,56%), фенилметилкетон (3,89%), (+)- леден (2,5%), 1Н-циклопроп [е] азулен, декагидро - 1,1,7 - триметил - 4 - метилен (2,39%).

В составе эфирного масла рододендрона мелколистного было установлено 134 компонента, идентифицировано 29. Все компоненты эфирного масла рододендрона мелколистного отнесены к сесквитерпенам.

Преобладающие компоненты эфирного масла рододендрона мелколистного: изоаромаденрен эпоксид (13,78%), патчоулол (4,928%), б-кадинол (4,72%), ф-кадинен (4,23%).

Впервые в составе эфирного масла рододендрона Адамса идентифицировано 19, а рододендрона мелколистного - 34 компонента.

Закономерности накопления БАВ в надземных органах душицы обыкновенной и видах рододендронов

Душица обыкновенная характеризуется изменчивостью химического состава под влиянием условий внешней среды, что сказывается на качественном и количественном содержании БАВ, а также, учитывая, что при введении растения в культуру могут наблюдаться изменения его химического состава, нами исследованы закономерности накопления основных групп БАВ душицы обыкновенной дикорастущей и культивируемой.

В надземных органах душицы обыкновенной, несмотря на различное количественное содержание флавоноидов, обращает внимание закономерность накопления производных лютеолина и апигенина (табл. 4).

Для средней полосы России и сибирского региона характерно соотношение лютеолина и апигенина в среднем как 75:25 (или 3:1), т.е. производных лютеолина накапливается в 3 раза больше. Для южных районов характерно соотношение как 58:42 (или 1,4:1). Таким образом, у душицы обыкновенной по содержанию производных лютеолина и апигенина имеется две хеморасы (с соотношением указанных соединений - 3:1 и 1,4:1).

Увеличение содержания производных лютеолина в душице обыкновенной в средней полосе России и сибирском регионе, по нашему мнению, связано с приспособлением этого растения к более суровым климатически условиям (низкие зимние температуры, короткий летний период).

Таблица 4

Количественное содержание флавоноидов в надземных органах душицы обыкновенной в период цветения из различных географических мест

Место сбора	Содержание, в %	Соотношение производных лютеолина и апигенина
	Производные лютеолина	Производные апигенина	Сумма флавоноидов, производных лютеолина и апигенина
Иркутская обл., с. Ново-Грудинино,	0,38±0,02	0,13±0,03	0,51	78,7:21,3
Иркутская обл., с. Каменка	0,58±0,03	0,21±0,02	0,79	73,4:26,6
Иркутская обл., п. Куйтун	0,71±0,06	0,26±0,02	0,97	74,2:25,8
Новосибирская обл.,с. Карпысак	0,31±0,04	0,10±0,03	0,41	75,6:34,4
Московская обл.	0,37±0,02	0,14±0,01	0,51	72,4:27,6
Ставропольский край, г. Армавир	0,49±0,03	0,36±0,03	0,85	57,7:42,3
Азербайджан, окрестн. г. Баку	0,52±0,03	0,38±0,02	0,90	57,8:42,2

При изучении распределения флавоноидов спектрофотометрическим, а дубильных веществ - перманганатометрическим методами установлено, что в надземных органах душицы обыкновенной культивируемой и дикорастущей наибольшее количество этих соединений накапливалось в листьях.

Изучение динамики накопления БАВ по фазам вегетации показало, что в период цветения отмечается не только максимальное содержание эфирного масла, но также флавоноидов и дубильных веществ. Душица обыкновенная, культивируемая в условиях Восточной Сибири по содержанию эфирного масла, флавоноидов и дубильных веществ равноценна душице обыкновенной дикорастущей и может быть рекомендована для использования в медицинской практике (табл. 5).

Таблица 5

Количественное содержание БАВ в траве душицы обыкновенной в период цветения из различных мест сбора

Место сбора	Содержание, в %
	Эфирное масло	Флавоноиды	Дубильные вещества
			общие полифенолы	осаждаемые раствором желатины
Иркутская обл. (культивируемая)	0,13	1,65±0,06	13,53±1,30	5,12±0,16
Иркутская обл. (дикорастущая)	0,10	1,55±0,04	12,33±1,38	4,66±0,15
Новосибирская обл. (дикорастущая)	0,12	1,45±0,03	10,17±0,89	4,12±0,18
Ставропольский край (дикорастущая)	0,10	1,66±0,07	13,63±0,29	5,34±0,20

Флавоноиды кверцетин, гиперозид, дигидрокверцетин-3-Я-L-арабинозид содержались во всех надземных органах исследуемых видов рододендронов. Накопление авикулярина было характерно для листьев этих растений, листья рододендрона Адамса содержали также азалеатин-3-Я-D-глюкозид. Рутин был обнаружен в листьях рододендронов даурского, золотистого и Адамса.

В цветках рододендрона даурского накапливается цианидин-3-рамноглюкозид, в листьях рододендрона мелколистного цианидин-3-б-L-арабинозид, а в цветках - хризантемин.

Цветки рододендрона даурского содержали 3,58% антоцианов, листья рододендрона мелколистного - 2,87%, цветки - 2,00%, а стебли - 0,75% антоцианов.

В исследуемых видах рододендронов максимальное количество дубильных веществ и флавоноидов накапливается в цветках, листьях и стеблях текущего года (рис. 5).

Рис 5. Динамика накопления флавоноидов и дубильных веществ (общие полифенолы) в надземных органах рододендронов: I - Адамса, II- мелколистного, III- даурского, IV- золотистого.

Ц- цветки, Л1 - листья первого года жизни, Л2 - листья второго года жизни, С1 - стебли текущего года, С2- стебли второго года жизни, СО - стебли одревесневшие.

Максимальное содержание дубильных веществ и флавоноидов в надземных органах рододендронов приходилось на период цветения и плодоношения, снижение же их количества было характерно в период завязывания и созревания плодов. Только у рододендрона золотистого максимум содержания простых фенолов наблюдался в фазу завязывания и созревания плодов. В качестве лекарственного сырья рододендронов Адамса, даурского и мелколистного нами рекомендуется использовать побеги текущего года, у рододендрона золотистого - листья 2 и 3 года жизни. Сроки заготовки сырья - период плодоношения, когда заканчивается основной прирост побегов текущего года жизни. Данные рекомендации способствуют быстрому восстановлению зарослей после заготовки сырья.

В значительном количестве накапливают дубильные вещества рододендроны золотистый и мелколистный, простые фенольные соединения - рододендроны золотистый и даурский, флавоноиды и эфирное масло (более 0,8%) накапливают рододендроны Адамса, мелколистный и даурский (табл. 6).

Таблица 6

Количественное содержание БАВ в надземных органах рододендронов в период плодоношения

Вид	Место сбора	Содержание в %
		Эфирное масло	Флаво-ноиды	Простые фенолы	Дубильные вещества
					общие полифенолы	осаждаемые раствором желатины
Р. Адамса (побеги)	Бурятия, окр. п. Монды	1,20±0,09	2,19±0,025	4,27±0,29	6,24±0,10	4,30±0,10
Р. мел-колистный (побеги)	Иркутская обл. окр. п. Култук	1,02±0,10	1,72±0,09	5,58±0,15	9,68±0,53	7,34±0,17
Р. даурский (побеги)	Иркутская обл., окр. г. Тулуна	0,08±0,01	1,82±0,05	10,20±0,35	4,97±0,24	2,85±0,11
Р. золотистый (листья)	Иркутская обл., Нижнеу-денский р-он	следы	1,19±0,11	10,66±1,13	15,28±0,76	11,76±0,57

Стандартизация и разработка нормативной документации на сырье душицы обыкновенной и рододендрона Адамса

Исследования заключаются в разработке методик качественного и количественного определения основных групп БАВ, отвечающих за фармакологическую активность, определении числовых показателей, а также макро- и микроскопических признаков сырья.

Стандартизация сырья душицы обыкновенной проводится в соответствии с ГФ XI по содержанию эфирного масла (для цельного сырья не менее 0,1 %, для измельченного сырья - не менее 0,08 %).

По результатам фармакологических исследований, проведенных нами и другими исследователями, установлено, что флавоноиды душицы обыкновенной обладают противовоспалительной, антиоксидантной, спазмолитической активностью, что обеспечивает широту фармакотерапевтического влияния. Для повышения качества сырья душицы обыкновенной нами предложено проводить стандартизацию по дополнительному показателю - содержанию суммы флавоноидов.

Разработаны и предложены методики качественного обнаружения флавоноидов: проба Chinoda; тонкослойная хроматография на пластинках «Силуфол» в системе хлороформ-этанол-вода (52:28:7) с детекцией основных флавоноидных соединений лютеолина, лютеолин-7-глюкуронида и космосиина по окраске пятен и значению Rs с использованием ГСО лютеолина.

Количественное содержание суммы флавоноидов предлагается проводить спектрофотометрическим методом. При добавлении к спиртовому извлечению душицы обыкновенной раствора алюминия хлорида в УФ спектре появляется максимум поглощения при 400 нм, который совпадает с максимумом поглощения спектра лютеолина в присутствии алюминия хлорида, поэтому в качестве стандартного образца нами был использован ГСО лютеолина. Было установлено, что оптимальным экстрагентом является 60% спирт этиловый, максимальный выход флавоноидов из сырья с размером частиц 1-2 мм достигается через 90 минут с последующим наступлением равновесия, соотношение сырья и экстрагента 1:50, устойчивое окрашивание извлечения наступало при добавлении 2 мл 2% раствора алюминия хлорида через 30 минут.

Относительная ошибка среднего результата с достоверной вероятностью 95% не превышала ±5,52%. Оценка основных валидационных параметров предлагаемой методики позволила сделать вывод о ее соответствии критериям по показателям: правильность, прецизионность, специфичность и линейность.

Экспериментальные исследования по изучению стабильности сырья душицы по содержанию суммы флавоноидов показали, что количество флавоноидов не снижается в течение 2-х лет наблюдения, что соответствует срокам годности сырья травы душицы (ФС 55).Таким образом, в результате проведенных исследований нами предложено проводить стандартизацию сырья душицы обыкновенной, наряду с определением эфирного масла, по содержанию флавоноидов (табл. 7).

Для анализа сырья рододендрона Адамса были разработаны и обоснованы методики качественной реакции и тонкослойной хроматографии флавоноидов (с детекцией основных соединений - кверцетина и гиперозида).

Стандартизацию сырья рекомендовано проводить по содержанию эфирного масла и флавоноидов. Содержание эфирного масла в сырье предлагается проводить методом 1 (ГФ XI) в навеске сырья 25 г при степени измельченности сырья 3 мм, время перегонки - 2 ч.

Разработана методика спектрофотометрического количественного определения суммы флавоноидов. Максимумы поглощения извлечения из побегов рододендрона Адамса и спиртового раствора кверцетина при добавлении к ним алюминия хлорида совпадает при длине волны 430 нм, поэтому ГСО кверцетина был выбран нами в качестве стандартного образца.

Установлены оптимальные параметры экстракции сырья побегов рододендрона Адамса: размер частиц сырья 1 мм, соотношение сырья и экстрагента 1:100, экстрагент - 90% спирт этиловый, содержащий 1% HCl, время экстракции 90 мин. Устойчивое окрашивание извлечения наступает через 30 минут при добавлении 1 мл 1% алюминия хлорида.

Таблица 7

Показатели и нормы качества травы душицы обыкновенной (проект изменения № 2 к ФС 55 «Трава душицы»)

Разделы ФС	Метод анализа	Нормы
Качественные реакции
Флавоноиды	Качественная реакция (проба Chinoda)	Красное окрашивание
	Хроматография (ТСХ)	Обнаруживается 3 пятна
Числовые показатели	Раздел дополнен нормой содержания суммы флавоноидов
Количественное определение
Цельное сырье
Эфирное масло, %, не менее	Метод 2, ГФ XI	0,1
Сумма флавоноидов, %, в пересчете на лютеолин, не менее	Спектрофото-метрия	1,0
Измельченное сырье
Эфирное масло, %, не менее	Метод 2, ГФ XI	0,08
Сумма флавоноидов, %, в пересчете на лютеолин, не менее	Спектрофото-метрия	1,0

Примечание: жирным шрифтом в таблице выделены показатели и нормы, которые для данного вида лекарственного растительного сырья предложены впервые

Относительная ошибка среднего результата с достоверной вероятностью 95% не превышала ±5,20%. Валидационная оценка методики количественного определения суммы флавоноидов в побегах рододендрона Адамса показала соответствие критериям правильность, прецизионность, специфичность и линейность. Были установлены также другие числовые показатели, нормы качества и сроки годности сырья (табл. 8).

Душица обыкновенная является пластичным видом, поэтому были изучены микроскопические признаки душицы обыкновенной, выращенной в условиях Восточной Сибири. Исследования показали идентичность анатомического строения душицы обыкновенной культивируемой дикорастущим образцам сырья и соответствие их разделу «Микроскопия» нормативной документации (ФС 55).

Для определения анатомо-диагностических признаков сырья рододендрона Адамса, было проведено сравнительное анатомическое изучение надземных органов других видов рододендронов, произрастающих в сибирском регионе (рододендронов даурского, золотистого и мелколистного). В результате установлено, что микродиагностика побегов рододендрона Адамса может проводиться по листьям и почечным чешуйкам, т. к. в их строении имеются отличительные признаки от близких видов.

Таблица 8

Требования и нормы на сырье «Рододендрона Адамса побеги», включенные в проект ФСП 42-0049-55564631-08

ПОКАЗАТЕЛИ	НОРМЫ
	цельное	измельченное
Качественная реакция (проба Chinoda)	Красное окрашивание
Хроматография (ТСХ)	Обнаруживается 3 пятна
Сумма флавоноидов, в пересчете на кверцетин %, не менее	1,6	1,6
Эфирное масло, %, не менее	0,1	0,1
Влажность, %, не более	13	13
Зола общая, %, не более	4	4
Зола, нерастворимая в 10% р-ре кислоты хлористоводородной, %, не более	1	1
Листьев пожелтевших, %, не более	5	5
Ветвей с буровато-серой корой, %,не более	10	10
Частиц, не проходящих сквозь сито диаметром 5 мм, %, не более		5
Частиц, проходящих сквозь сито диаметром 0,5 мм, %, не более		10
Органическая примесь, %, не более	1	1
Минеральная примесь, %, не более	0,5	0,5
Срок годности	2 года	2 года

Разработка рецептуры и стандартизация сбора «Бронхофит»

Разработка рецептуры грудного сбора «Бронхофит» (трава душицы 30,0; трава чабреца 20,0; листья подорожника 20,0; трава череды 20,0; плоды шиповника 10,0) проводилась на основе изучения сведений об этиологии и патогенезе заболеваний органов дыхания, состава биологически активных веществ растений, опыта их использования в академической и традиционной медицине. Оптимальное соотношение компонентов сбора устанавливали экспериментально по результатам фармакологического изучения вариантов сбора.

При изучении химического состава в сборе были обнаружены эфирное масло, флавоноиды, полисахариды, фенолкарбоновые кислоты, тритерпеновые соединения, аскорбиновая кислота, каротиноиды.

Методом хромато-масс-спектрометрии в составе эфирного масла было идентифицировано 55 компонентов. Основными компонентами являются p-цимен (24,75%), карвакрол (18,74%), г-терпинен (10,01%), борнеол (9,94%), 1,8 цинеол (5,74%), тимол (5,27%), терпинеол-4-ол (4,46%), кариофиллен оксид (2,69%), камфен (1,38%) (рис. 6).



Рис. 6. Хроматограмма компонентного состава эфирного масла сбора «Бронхофит»

Содержание фенольных соединений исследовали методом ВЭЖХ на хроматографе «GILSTON» (рис. 7).

Рис. 7. Хроматограмма спиртового извлечения сбора «Бронхофит»

В составе сбора идентифицировали 16 фенольных соединений: флавоноиды - рутин, лютеолин-7-глюкуронид, лютеолин, нарингенин, дигидрокверцетин, кверцетин, кемпферол, апигенин; кислоты - галловая, хлорогеновая, феруловая, коричная; кумарины - дигидрокумарин, эскулетин; танин, эпикатехин. Методом ТСХ установили содержание лютеолин-7-глюкозида, космосиина, кофейной кислоты.

С помощью аминокислотного анализатора в сборе идентифицировали 17 аминокислот, среди них 8 незаменимых аминокислот.

При изучении элементного состава в сборе было обнаружено 9 макро- и 54 микроэлемента. Среди них содержатся эссенциальные для иммунной системы микроэлементы: Fe, I, Cu, Zn, Co, Cr, Mo, Se, Mn, Li.

По содержанию токсичных элементов сбор «Бронхофит» соответствует ПДК, указанным в СанПиН 2.3.2.1078-01 от 2001 года: свинца не более 6 мг/кг (найдено 1,6 мг/кг), мышьяка не более 0,5 мг/кг (найдено 0,16 мг/кг), кадмия не более 2 мг/кг (найдено 0,044 мг/кг), ртути не более 0,1 мг/кг (найдено 0,018 мг/кг).

В анализируемом сборе было найдено экстрактивных веществ, извлекаемых 30% спиртом этиловым 37,77±1,9%, эфирного масла - 0,12%, дубильных веществ (общие полифенолы) 9,57±0,28%, полисахаридов (гравиметрическим методом) - 7,83±0,28%, флавоноидов - 1,28±0,07%, аскорбиновой кислоты -109±0,10 мг%, органических кислот - 2,83±0,18% , эфирного масла - 0,12%.

Стандартизацию сбора, исходя из количественного содержания БАВ и их фармакологической активности, предложено проводить по содержанию эфирного масла, флавоноидов и полисахаридов, как групп веществ, обусловливающих фармакотерапевтическое действие.

В ходе проведения работы по стандартизации были определены внешние и анатомо-диагностические признаки сбора «Бронхофит». Предложены качественные реакции обнаружения флавоноидов (проба Chinoda), полисахаридов и восстанавливающих сахаров.

Количественное содержание эфирного масла в сборе предлагается проводить методом 2 (ГФ XI) в навеске 25 г со степенью измельченности сырья 3 мм, время перегонки 2 часа.

Для количественного определения суммы флавоноидов нами рекомендован спектрофотометрический метод. При изучении спектральной характеристики спиртового извлечения сбора в присутствии алюминия хлорида установлено, что максимум поглощения находится при 385 нм и совпадает с максимумом ГСО лютеолин-7-глюкозида, который был использован нами в качестве стандартного образца.

Было установлено, что оптимальными параметрами экстракции сырья являются: 60% спирт этиловый, измельченность сырья 1 мм, соотношение сырья и экстрагента 1:100, время экстракции 60 мин. Количество комплексообразователя 1% раствора алюминия хлорида 1 мл, комплекс становился стабильным через 40 минут. Относительная ошибка среднего результата с достоверной вероятностью 95% не превышала ±5,47%.

Для количественного определения суммы полисахаридов предложен спектрофотометрический метод с использованием кислоты пикриновой. При разработке методики были изучены оптимальные условия экстракции и осаждения водорастворимого полисахаридного комплекса. Размер частиц сырья должен быть 1 мм, соотношение сырья и экстрагента 1:25, время экстракции 2ч, соотношение извлечения и 95% спирта этилового, необходимого для осаждения полисахаридов 1:3. Время кислотного гидролиза суммы полисахаридов 2 ч.

Относительная ошибка...