Оценка иммунного статуса и ответа базофилов на аллергены при "латентной сенсибилизации" и аллергическом рините

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Оценка иммунного статуса и ответа базофилов на аллергены при "латентной сенсибилизации" и аллергическом рините

Усова Юлия Александровна

Санкт-Петербург 2011

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте иммунологии Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор Зурочка Александр Владимирович

академик РАН и РАМН, доктор медицинских наук, профессор Черешнев Валерий Александрович

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Жирков Анатолий Михайлович

доктор медицинских наук профессор Симбирцев Андрей Семенович

Ведущая организация: ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «10» марта 2011 г. в часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России.

Автореферат разослан « 9 » февраля 2011 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат медицинских наук Санников М.В.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. По данным ВОЗ более 20% людей на Земном шаре страдает различными атопическими заболеваниями, самым распространенным из которых является аллергический ринит (АР). По результатам популяционных исследований в США число больных аллергией превышает 40 млн. человек, в странах Западной Европы распространенность АР составляет от 13 до 24%, в России - от 15 до 35% в различных регионах (Богова А.В., 2008; Черняк Б.А., 2002). На Южном Урале в 2008 году общая заболеваемость БА составила 13,2 на 1000 населения, а в структуре первичной заболеваемости по обращаемости заболевания органов дыхания стоят на 1-м месте (Селянина Г.А., 2006; информационный сборник, 2009). Заболеваемость бронхиальной астмой (БА) у детей и подростков в промышленно развитых странах увеличилось за последние 20 лет в 3 - 4 раза (Ильина И.И., 2005; Johansson S.G.O. et al, 2002; ARIA, 2008).

По мнению исследователей программы ISAAC (International Study of Asthma and Allergy in Childhood) различная частота симптомов заболевания в отдельных регионах связана с внешнесредовыми, социально-экономическими и этническими отличиями. Для большинства западных стран последние десятилетия ознаменовались изменением привычек и характера питания, нерациональным использованием антибиотиков, широким распространением гормональной контрацепции, увеличением частоты стрессов в обществе и количества курящих, и наконец, глобальным изменением климата с увеличением содержания различных токсинов в окружающей среде (Мачарадзе Д.Ш., 2006; Strahan D. et al., 1997).

Существенной характеристикой АР является его частая ассоциация с БА - у 20-77% больных АР диагностируется БА и наоборот, пациенты с БА в 60-80% случаев страдают АР, с фарингитом, конъюнктивитом, атопическим дерматитом, синуситом, аденоидитом (Бархина Т.Г. и соавт., 2008; Польнер С.А., 2008; Баранов А.А. и соавт., 2008). Результаты эпидемиологических, патофизиологических и клинических исследований послужили основанием для того, чтобы рассматривать АР как предастму или в качестве риска БА (Ревякина В.А., 2006; Wutrich В., 2002; Boulay M.E, 2003).

АР проявляется не только назальными и глазными симптомами, но зачастую сопровождается утомляемостью, жаждой, нарушением сна, беспокойством, головной болью, нарушением работоспособности, тем самым резко снижает качество жизни (Емельянов А.В., 2004; Новикова С.А., 2005).

Немаловажен и тот факт, что АР налагает большой экономический груз на общество. Пик заболеваемости АР приходится на молодой трудоспособный возраст. Во Франции АР страдают 5-6% детей, 11-18% подростков и 25% взрослых. В Европе прямые затраты, связанные с лечением АР, составляют ежегодно 1-1,5 млрд. евро, а непрямые - 1,5-2 млрд. евро (Курбачева О.М., 2007; Simoens S. et al, 2009).

Наиболее значимым эндогенным компонентом патогенеза при атопических заболеваниях является аномалия конституции (атопия) - генетическая склонность организма к гиперпродукции Ig E в ответ на контакт с широко распространенными экзоаллергенами (Чучалин А.Г., 2007; ARIA, 2008). С другой стороны, известно, что атопия, как иммунобиологический феномен, чрезвычайно распространена в человеческой популяции. При этом наличие положительных кожных проб и/или обнаружение аллергенспецифических Ig E-антител (AC Ig E - антител) при отсутствии анамнестических данных о появлении клинических признаков аллергических заболеваний в ответ на воздействие аллергена расценивается как состояние «латентной сенсибилизации» (ЛС) (Йегер Л., 1986; Федосеев Г.Б., 2001). По данным исследователей распространенность ее, подтвержденная хотя бы к одному из аэроаллергенов, отмечается у 40-45% клинически здорового населения (Федосеев Г.Б., 2001; Паттерсон Р., 2000).

До сих пор остаются неизученными причины сохранения состояния клинического здоровья на фоне сформированной сенсибилизации. Во многом остаются невыясненными механизмы формирования клеточной аллергенспецифической сенсибилизации у клинически здоровых лиц, влияние отягощенного семейного аллергологического анамнеза на развитие «латентной сенсибилизации», которая может выявляться как у лиц с отягощенным семейным аллергоанамнезом, так и без такового. Разнице между ними с точки зрения характера иммунных реакций на имеющуюся сенсибилизацию, вопросам механизма перехода ЛС в клинически развернутое заболевание, а также выявлению спектра специфической сенсибилизации базофилов к различным группам аллергенов у здоровых и больных АР (диагностика in vitro) посвящена данная работа.

Цель исследования: изучить состояние иммунной системы у больных аллергическим ринитом в фазу клинической ремиссии заболевания и у клинически здоровых для выявления лиц с «латентной сенсибилизацией» с целью прогноза развития аллергического процесса.

Задачи исследования:

1. Оценить частоту выявления, уровни и спектр специфической сенсибилизации базофилов к различным группам аллергенов у практически здоровых лиц, не имеющих клинических признаков аллергических заболеваний, и больных аллергическим ринитом в фазу клинической ремиссии заболевания.

2. Оценить диагностическую значимость определения клеточной чувствительности к аллергенам на модели базофилов in vitro у практически здоровых лиц и больных аллергическим ринитом, характер и степень выраженности сенсибилизации.

3. Оценить состояние иммунной системы у лиц с «латентной сенсибилизацией» в зависимости от наличия или отсутствия отягощенного семейного аллергологического анамнеза и сравнить с состоянием иммунного статуса у больных аллергическим ринитом в фазу клинической ремиссии заболевания.

4. Выявить изменения показателей иммунитета, являющиеся предикторами развития состояния «латентной сенсибилизации» у практически здоровых лиц и аллергического ринита у лиц с «латентной сенсибилизацией» в зависимости от наличия или отсутствия отягощенного семейного аллергоанамнеза.

5. Создать математические модели прогнозирования риска развития аллергического процесса на основании выявленных наиболее информативных показателей иммунного статуса.

Научная новизна и теоретическая значимость. Уточнены иммунные механизмы формирования и развития аллергического процесса от состояния «латентной сенсибилизации» у практически здоровых лиц до патогенетически значимой сенсибилизации и клинической манифестации заболевания. При воспроизведении in vitro контакта причинно - значимого аллергена с базофилами впервые отработан метод изучения клеточных механизмов их активации у здоровых людей и больных АР. Определен характер изменений в различных звеньях иммунной системы при формировании «латентной сенсибилизации» у практически здоровых лиц в зависимости от наличия или отсутствия отягощенного семейного аллергологического анамнеза, от уровня и характера сенсибилизации. У больных АР подтверждена девиация иммунного ответа в сторону преобладания Th-2 типа, что характеризуется преобладанием в периферической крови Тh2 лимфоцитов - основных клеток, объясняющих ключевые патофизиологические проявления при аллергическом воспалении и являющихся важным критерием прогнозирования заболевания при «латентной» сенсибилизации.

Практическая значимость. Доказана высокая диагностическая значимость теста определения активации базофилов на аллергены in vitro по экспрессии высокочувствительных и высокоспецифичных маркеров CD203c как доступного и перспективного метода исследования гиперчувствительности немедленного типа. Он может использоваться как для экспериментальных и фармакологических исследований, так и для диагностики в клинической практике. Выявление «латентной сенсибилизации» путем определения активации базофилов в цельной крови при использовании широкой панели аллергенов и оценка количества Th2-лимфоцитов дают возможность сформулировать критерии формирования групп риска по развитию аллергических заболеваний у практически здоровых лиц, создать базу данных лиц с «латентной сенсибилизацией», а также производить мониторинг состояния больных аллергическим ринитом.

2. Основные положения, выносимые на защиту

1. Активация базофилов на аллергены in vitro обнаруживается как у практически здоровых лиц с «латентной сенсибилизацией», но не имеющих клинических проявлений (группа нереализованного риска) так и у больных аллергическим ринитом (группа реализованного риска).

2. Метод оценки специфической активации базофилов на аллергены у больных аллергическим ринитом и в группе здоровых лиц с «латентной сенсибилизацией» является высокочувствительным и информативным.

3. Для лиц с «латентной сенсибилизацией» и больных аллергическим ринитом в отличие от здоровых без сенсибилизации характерны общие изменения, направленные на элиминацию антигена (количество моноцитов, гранулоцитов, фагоцитарных реакций нейтрофилов, спонтанной и индуцированной бактерицидности нейтрофилов, общего Ig A, уровней Т-хелперов, Т-цитотоксических лимфоцитов, NK-лимфоцитов), но степень изменения этих показателей иммунного статуса в изучаемых группах была разной. латентный сенсибилизация аллергический иммунитет

4. Создание математических моделей прогнозирования риска возникновения аллергических заболеваний у практически здоровых лиц, основанных на данных изучения активации базофилов и показателей системного иммунитета является перспективным методом профилактической медицины.

Личный вклад автора. Данные, представленные в работе, получены лично автором. Автором проведен аналитический обзор современной отечественной и зарубежной литературы, самостоятельно выполнены иммунологические и аллергологические исследования, проведена работа по организации всех исследований, проведен анализ полученных результатов, сделаны научные выводы.

Внедрение результатов. Результаты исследования внедрены в практику работы НИИ Иммунологии, отделения Иммунологии и аллергологии Клиники ГОУ ВПО «Чел ГМА Росздрава», в учебный процесс кафедры Микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО Чел ГМА Росздрава.

Апробация работы. Основные положения работы были доложены на Объединенном иммунологическом Форуме: IV Съезд иммунологов России, IX конгресс РААКИ, IV Конференция РЦО, III Конференция по иммунологии репродукции, XII Всероссийский форум «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (г. Санкт-Петербург, 2008 г.), на VII Конференции иммунологов Урала (г. Архангельск, 2009 г.), на Международном симпозиуме «Взаимодействие нервной и иммунной систем в норме и патологии» (г. Санкт-Петербург, 2009 г.), на X Международном конгрессе «Современные проблемы аллергологии и иммунологии», посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д. Адо (г. Казань, 2009 г.), на Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология практическому здравоохранению» (г. Москва, 2010 г.), на VIII Съезде иммунологов Урала (г. Сыктывкар, 2010 г.), на Международном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии, междисциплинарные проблемы» (г. Санкт-Петербург, 2010 г.).

Апробация диссертации была проведена на совместном заседании НИИ иммунологии, кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики, кафедры иммунологии и аллергологии, ЦНИЛ ГОУ ВПО Чел ГМА Росздрава.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 6 - публикации в научных изданиях, определенных перечнем ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 174 страницах машинописного текста, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 3 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 15 рисунками. Список литературы включает 129 источников, из них 90 - отечественных и 39 иностранных.

2. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В процессе работы проведено исследование иммунного и аллергологического статусов у 60 практически здоровых лиц в возрасте от 18 до 50 лет, и у 30 лиц с АР, средний возраст которых составил 28,68±1,9 лет. Диагноз «аллергический ринит» был верифицирован врачом аллергологом-иммунологом по данным анамнеза на основании клинических признаков заболевания и подтвержден проведенными положительными аллергопробами, данными функционального и лабораторного обследования в МУЗ ГКБ №2 г. Челябинска, где впоследствии все пациенты и находились на диспансерном учете. Среди обследованных нами пациентов согласно Российской классификации АР 8 человек (26,67%) составили лица с сезонным АР (пыльцевая сенсибилизация), 8 человек (26,67%) с круглогодичным АР (бытовая и эпидермальная) и 14 человек (46,66%) с круглогодичной формой АР с сезонными обострениями (бытовая, эпидермальная и пыльцевая сенсибилизация). На момент обследования все пациенты находились в стадии клинической ремиссии заболевания. Во все исследуемые группы вошли лица, проживающие и работающие на территории города Челябинска, 41 мужчина и 49 женщин. Различие показателей в зависимости от пола в обследуемых группах не имело статистической значимости, в связи с чем, мы сочли возможным объединить пациентов без учета их половой принадлежности.

Для оценки иммунологических показателей в периферической крови методом проточной цитометрии определяли общее количество лейкоцитов, относительное и абсолютное содержание гранулоцитов, моноцитов и лимфоцитов с использованием одноплатформенной технологии с помощью гетерогенного гейтирования по панлейкоцитарному маркеру CD45+ и показателям светорассеяния с применением калибровочных частиц Flow-Count Fluorespheres фирмы Beckman Coulter, США.

Содержание различных субпопуляций лимфоцитов оценивали методом проточной цитометрии с использованием двухпараметрических реагентов линии IОTest: CD3-FITC/CD19-PЕ, CD3-FITC/CD4-PЕ, CD3-FITC/CD8-PЕ, CD3-FITC/CD(16+56)-PЕ, CD3-FITC/CD25-PЕ, CD3-FITC/-HLA-DR-PЕ фирмы Beckman Coulter, США на лазерных проточных цитометрах Epics™ XL™ и Cytomicx FC 500 фирмы Beckman Coulter, США.

Также были использованы:

1. Метод оценки внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов крови с помощью НСТ-теста в модификации А.Н. Маянского и М.Е. Виксмана (1979).

2. Метод исследования фагоцитарной активности нейтрофилов и моноцитов крови на модели поглощения частиц латекса (Фрейдлин И.С., 1986).

3. Метод количественного определения уровня иммуноглобулинов класса A, M и G в сыворотке крови с использованием «сэндвич»- варианта твердофазного иммуноферментного анализа.

4. Метод количественного определения уровней С1-ингибитора, С3а и С5а компонентов комплемента в сыворотке крови (ИФА).

Оценка уровня активации базофилов на аллергены in vitro проводилась с использованием набора Allergenicity Kit® Beckman Coulter, который состоит из трехцветной комбинации моноклональных антител (смесь двуцветного реагента CD203c-PE/CD3-PC7 и одноцветных крысиных моноклональных антител CRTH2-FITC), активирующего раствора, положительного контроля для IgЕ-опосредованной активации базофилов, стоп-раствора, лизирующего и фиксирующего агентов.

Исходя из собственных наблюдений и данных литературы о частоте встречаемости причинно значимых аллергенов при сенсибилизации у больных атопическими заболеваниями, к которым в том числе относится и аллергический ринит, была составлена панель аллергенов: клещ D.pteronissimus, домашняя пыль, библиотечная пыль, микст сорных трав, смесь луговых трав и подсолнечника, смесь пыльцы деревьев, пыльца березы висячей, шерсть кошки, шерсть собаки, перхоть лошади, морская свинка, перо подушки. Все аллергены производства Филиала ФГУП НПО «Микроген» ФГУП «Аллерген» г. Ставрополь. Для каждого образца крови готовились 5 проб: проба «Neg» - негативный контроль; проба «Pos» - позитивный контроль; пробы «Test» - 3 смеси аллергенов: - бытовые (домашняя пыль, библиотечная пыль, клещ D.Pteronissimus), - эпидермальные (шерсть кошки, шерсть собаки, перхоть лошади, морская свинка), - пыльцевые (смесь луговых трав и подсолнечника, смесь сорных трав, пыльца березы висячей).

Для работы с реактивами использовались стандартные пластиковые пробирки размером 12х75мм. В каждую из 5-ти пробирок вносилось по 100 мкл цельной гепаринизированной крови и по 20 мкл трехцветной комбинации антител (CD203c-PE/CD3-PC7 и CRTH2-FITC), а также 20 мкл моноклональных антител CD4-PC5. В пробирку с негативным контролем вносился фосфатно-солевой буферный раствор ФСБР в количестве 20 мкл, с позитивным контролем - 20 мкл рабочего раствора положительного контроля К+, в 3 оставшиеся пробирки по 20 мкл смесей бытовых, эпидермальных и пыльцевых аллергенов соответственно.

Для усиления процесса активации базофилов вносили по 100 мкл активирующего раствора во все пробирки. После окрашивания и добавления всех вышеперечисленных компонентов содержимое пробирок аккуратно перемешивалось на вортексе. Далее проходила инкубация на водяной бане при 37°С в течение 15 минут в процессе которой происходила / или не происходила активация базофилов на аллергены. После этого к содержимому всех пробирок добавлялся стоп-раствор в количестве 100 мкл, содержащий 0,1% раствор азида натрия NaN3 - для равномерной остановки процесса активации изучаемых клеток. Для лизирования эритроцитов добавляли 2 мл раствора «Fix and Lyse», приготовляемого Ex tempore, и инкубировали еще 10 минут в хорошо защищенном от света месте при комнатной температуре.

После этого центрифугировали пробирки в течение 5 мин при 200g, удаляли супернатант. Для отмывки клеток использовали 3 мл ФСБР, снова центрифугировали 5 мин при 200 g, удаляли супернатант. Ресуспензировали полученные клетки в 500 мкл 0,1% раствора формальдегида.

Анализ проводили на лазерных проточных цитометрах Epics™ XL™ фирмы Beckman Coulter, США и FC-500 Beckman Coulter USA, оснащенных детекторами прямого и бокового светорассеяния (FS и SS) и 5-ю каналами флуоресценции, позволяющими оценивать, в том числе и флуоресцентные конъюгаты FITС, PE и PC7. Базофилы выделялись по экспрессии CRTH2 (CD 294) и CD203c, предварительно исключались Т-лимфоциты CD3+клетки. Неактивированные и покоящиеся базофилы имеют фенотип CRTH2pos CD203dimCD3neg (CRTH2 позитивные, СD203c-слабая экспрессия, CD3 негативные). Активированные базофилы in vitro определяются как CRTH2pos CD203brightCD3neg (СD203c-яркая экспрессия).

Для оценки уровня активации базофилов в тесте использовался коэффициент соотношения процента активации базофилов в пробах со смесями аллергенов к уровню их активации в негативном контроле (индекс активации). Для удобства был введен коэффициент позитивности К plus/neg и K allerg/neg (К bit/neg, K epid/neg, K pilc/neg к бытовым, эпидермальным и пыльцевым аллергенам соответственно), который мы считали положительным при К allerg/neg ?1,15. Также учитывался коэффициент активации базофилов в пробе к уровню их активации в положительном контроле K allerg/ plus, считающийся нами положительным от 0,4 и более.

Исследования проводились в НИИ Иммунологии ГОУ ВПО Чел ГМА Росздрава.

Статистическая обработка результатов исследований проводилась стандартными методами с применением пакета прикладных программ "Statistica for Windows 6.0", с определением средней арифметической вариационного ряда (М) и ошибки средней арифметической (m). Достоверность отличия между полученными показателями в исследуемых группах оценивалась по U критерию Mann-Whitney. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Корреляционный анализ был выполнен с использованием модуля «Nonparametrics. Correlations Spearman» («Непараметрические. Корреляции Спирмена»). Для выделения статистически достоверных коэффициентов корреляции принят уровень значимости для медико-биологических исследований (р<0,05). Для проведения факторного анализа был использован модуль [Statistics/Multivariate exploratory techniques/Factor analysis] программы STATISTICA for Windows ver.6.0. Для проведения многомерного статистического исследования и создания модели прогнозирования были выбраны модули «Discriminant Analysis» и «Multiple Regression» («Дискриминантный анализ» и «Множественная регрессия»).

3. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выявление активации базофилов на аллергены in vitro у больных аллергическим ринитом и у практически здоровых лиц

Для диагностики аллергенспецифической сенсибилизации как клинически выраженной, так и состояния «латентной сенсибилизации» в настоящее время помимо традиционного обнаружения аллергенспецифических Ig E-антител в мире стали широко использовать ряд функциональных клеточных in vitro тестов на базофилах и мастоцитах, имеющих ряд преимуществ по сравнению с другими лабораторными методами и использующиеся при получении противоречивых результатов кожно-аллергических проб или невозможностью их проведения по клиническим показаниям, а также технической трудоемкостью иных методов (латексная, лекарственная, пищевая, инсектная и другие виды сенсибилизации). После идентификации популяции базофилов по наиболее специфичным для них маркерам CRTH2 (CD294) была проведена оценка экспрессии маркера дегрануляции или активации СD203с, как наиболее специфичного и информативного для базофилов. В результате нашего исследования у 38 из 60 клинически здоровых лиц (63,33%) была обнаружена положительная реакция активации базофилов на аллергены, т.е. было выявлено состояние «латентной сенсибилизации». У 4-х лиц мы не смогли оценить реакцию активации базофилов на аллергены, так как уровень активации базофилов в положительном контроле не отличался от такового в негативном контроле (Bas neg = Bas plus), поэтому результаты обследования этих лиц далее нами не учитывались. У 18 практически здоровых лиц нами не была обнаружена активация базофилов на аллергены. У 28 из 30 больных аллергическим ринитом (93,33%) нами было подтверждено наличие сенсибилизации данным методом. У 2-х человек из этой группы реакция активации базофилов на аллергены также не могла быть адекватно оценена, поэтому в группу сравнения эти лица не вошли.

Таким образом, мы получили 3 группы обследуемых пациентов: в первую группу, принятую нами за контрольную, вошли 18 практически здоровых человек, не имеющих признаков наличия сенсибилизации (ни клинических, ни лабораторных), вторую группу составили 28 человек с клинически выраженной сенсибилизацией к бытовых, эпидермальным и пыльцевым аллергенам, третью группу составили 38 человек с лабораторно верифицированной «латентной сенсибилизацией».

Все здоровые, а также больные АР были разбиты на группы в зависимости от количества аллергенов, к которым была выявлена повышенная активация базофилов. Так как литературные данные не дают четкого определения полисенсибилизации и зачастую противоречивы в его формулировке, мы в своем исследовании условно расценивали случаи выявления активации базофилов к одной смеси аллергенов как низкую степень полисенсибилизации, к двум смесям - как среднюю и к трем смесям - как высокую степень полисенсибилизации.

Низким уровнем активации базофилов на аллергены мы условились называть соотношение процента активации базофилов в пробах с аллергенами к проценту активации базофилов в положительном контроле

(K allerg/plus) в пределах от 0,4 до 0,7, средним уровнем - от 0,8 до 1,0, высоким - более 1,0.

Характер сенсибилизации у больных аллергическим ринитом и у практически здоровых лиц

ЛС у здоровых лиц формируется к наиболее часто встречаемым аллергенам, с которыми человек контактирует в течение всего года. При этом у лиц с отягощенным семейным аллергологическим анамнезом, и у тех, кто отрицает наличие аллергических заболеваний среди ближайших родственников, спектр сенсибилизации совпадает: наиболее часто выявляется бытовая и эпидермальная сенсибилизация - к круглогодичным аллергенам с которыми имеется постоянный и длительный контакт.

Были выявлены следующие виды «латентной сенсибилизации» (рис.1) - бытовая у 21 человека (37,5%), эпидермальная у 22 человек (39,3%), пыльцевая у 27 лиц (48,2%). У 12-ти человек (21,4%) выявлена полисенсибилизация ко всем смесям аллергенов (бытовые, эпидермальные, пыльцевые), у 1-го (1,79%) к совокупности бытовых и эпидермальных аллергенов, у 3-х человек к смесям эпидермальных и пыльцевых аллергенов (5,35%), у 4-х к смесям бытовых и пыльцевых аллергенов (7,14%), у 8 лиц только к пыльцевым аллергенам, у 4-х человек (7,14%) только к бытовым аллергенам и у 6 - только к эпидермальным (10,71%). Такой высокий процент обнаружения повышения активации базофилов на аллергены у практически здоровых лиц поставил перед нами вопрос, в каком проценте случаев выявляется повышенная активация базофилов на аллергены in vitro у больных АР в фазу клинической ремиссии. По результатам наших исследований (рис.1) у больных АР выявлено, что имеет место сенсибилизация у 19 (67,86%) человек к бытовым аллергенам, у 16 (57,14%) человек к эпидермальным и у 20 (71,43%) к пыльцевым аллергенам. В том числе у 6 (21,42%) обследуемых была выявлена сенсибилизация лишь к пыльцевым аллергенам, у 1 (3,57%) только к бытовым, у 4-х человек (14,29%) - к бытовым и эпидермальным, у 3-х (10,71%) - к эпидермальным и пыльцевым, у 5 (17,86%) - к бытовым и пыльцевым, у 10 (35,71%) - полисенсибилизация к эпидермальным бытовым и пыльцевым аллергенам.

Рисунок 1. Характер сенсибилизации у больных аллергическим ринитом, характер «латентной сенсибилизации» у практически здоровых лиц Примечание: * - достоверные отличия с группой практически здоровых лиц по U-критерию Манна-Уитни, p<0,05

Как показали наши исследования у здоровых лиц низкая степень «латентной полисенсибилизации» обнаруживается в 28,57 % случаев, средняя (умеренная) - в более низком проценте - 12,5%. При этом в достаточно большом проценте случаев выявляется как отсутствие активации базофилов на аллергены (32,14%), так и высокая степень «латентной полисенсибилизации» (26,79%).

У больных АР наряду с меньшим процентом случаев отсутствия активации базофилов на аллергены (у 2-х человек из 30, что соответствует 6,67%), обнаруживается повышение частоты выявления клеточной активации к нескольким смесям аллергенов, при этом средняя и высокая степень полисенсибилизации встречается примерно в равных соотношениях (у 11 человек (36,67%) и 10 человек (33,33%) соответственно). Это можно объяснить неполной ремиссией или недостаточной эффективностью патогенетической терапии, возможно в силу более выраженных нарушений в иммунном статусе у этих больных.

Показатели активации базофилов при контакте с аллергенами in vitro у больных АР, практически здоровых лиц и лиц с «латентной сенсибилизацией»

Анализ полученных данных (табл.1) показал, что у больных АР по сравнению с группой здоровых лиц отмечалось достоверное повышение уровня активации базофилов на пыльцевые аллергены и достоверное повышение коэффициента соотношения процента активации базофилов в пробах со смесями бытовых, эпидермальных и пыльцевых аллергенов к уровню их активации в негативном контроле (р<0,05). Больные АР отличались от здоровых лиц с «латентной сенсибилизацией» достоверно более высоким коэффициентом позитивности.

Здоровые лица с латентной сенсибилизацией отличались от практически здоровых лиц достоверно более высоким коэффициентом соотношения процента активации базофилов в пробах со смесями бытовых, эпидермальных и пыльцевых аллергенов к уровню их активации в негативном контроле и в позитивном контроле.

Таблица 1 Сравнительная характеристика показателей активации базофилов при контакте с аллергенами in vitro у больных АР, практически здоровых лиц и лиц с «латентной сенсибилизацией»

P<0.05 - * отличия достоверны по U-критерию Манна-Уитни между показателями группы здоровых лиц и показателями группы больных аллергическим ринитом;

** достоверность отличий по U-критерию Манна-Уитни между показателями группы здоровых лиц с «латентной сенсибилизацией» и показателями группы больных аллергическим ринитом;

*** достоверность отличий по U-критерию Манна-Уитни между показателями группы здоровых лиц с латентной сенсибилизацией и показателями группы здоровых лиц

По данным литературы, формирование аллергического процесса тесно связано с нарушением в системе регуляции, связанной с девиацией иммунного ответа. Полученные нами данные свидетельствуют о том, что у больных АР в сравнении с контрольной группой здоровых обнаруживается достоверно более высокий уровень Th2-лимфоцитов (рис. 2).

Рисунок 2 Содержание Th2-лимфоцитов (СD3+CD4+CD294+) х109/л у практически здоровых лиц и больных аллергическим ринитом

Примечание: * - достоверность отличий между группами больных АР и практически здоровых лиц

по U-критерию Манна-Уитни, р<0,05

Частота выявления, характер и степень «латентной сенсибилизации» практически здоровых лиц в зависимости от наличия или отсутствия отягощенного аллергологического семейного анамнеза

При сборе семейного аллергоанамнеза из 60 здоровых лиц 25 человек (41,67%) указали на наличие аллергических заболеваний среди ближайших родственников, 35 человек отрицали наличие каких-либо аллергических заболеваний в семье. Из 30 больных АР 25 человек (83,33%) имели отягощенным по аллергическим заболеваниям анамнез, 5 больных АР (16,66%) отрицали наличие аллергических болезней в семье.

Среди здоровых лиц с выявленными реакциями активации базофилов на аллергены высокая степень ЛС в большем проценте случаев (46,66%) выявлена у лиц, отрицающих наличие аллергических заболеваний среди ближайших родственников. У лиц с отягощенным семейным аллергоанамнезом обнаруживают высокую степень ЛС в несколько меньшем проценте (39,13%). Лица с отсутствием отягощенного аллергоанамнеза, вероятно, обладают более высокой толерантностью к аллергенной нагрузке, связанной с хорошей компенсаторной деятельностью со стороны регуляторных систем организма (иммунной, нервной, эндокринной), поддерживающих гомеостаз организма, что и позволяет им обнаруживать высокую степень ЛС без клинической манифестации аллергических заболеваний.

Сравнительный анализ показателей иммунного статуса у больных аллергическим ринитом в фазу клинической ремиссии и практически здоровых лиц с «латентной сенсибилизацией»

Были проанализированы нарушения параметров иммунной системы у практически здоровых лиц с активацией базофилов на аллергены и у больных АР. У здоровых лиц без клинической манифестации аллергических заболеваний в ответ на появление «латентной сенсибилизации» отмечаются статистически значимые изменения, характеризующие функцию систем, направленных на элиминацию антигена, путем усиления интенсивности фагоцитоза нейтрофилов и увеличения фагоцитарного числа нейтрофилов. Нейтрофилы этих лиц характеризуются увеличенной способностью к окислительно-восстановительным реакциям, проявляющихся в статистически значимом повышении активности индуцированного НСТ-теста, увеличении НСТ-индуцированного индекса. Увеличение абсолютного числа лимфоцитов и моноцитов в периферической крови свидетельствует об активации иммунной системы, при этом у них выявляется достоверно более высокий уровень Т-хелперов и NК-лимфоцитов (таблица 2).

Таблица 2 Показатели иммунного статуса больных АР и практически здоровых лиц в зависимости от наличия или отсутствия «латентной сенсибилизации»

Примечание: * - достоверность отличий между группами здоровых и здоровых лиц с ЛС по U-критерию Манна-Уитни, р<0,05

** - достоверность отличий между группами здоровых лиц с ЛС и больными АР по U-критерию Манна-Уитни, р<0,05

*** - достоверность отличий между группами практически здоровых лиц и больными АР по U-критерию Манна-Уитни, р<0,05

Больные АР показали достоверно более выраженную активность фагоцитоза и бактерицидности нейтрофилов в НСТ-тесте, что может быть расценено как общий компенсаторный механизм в ответ на наличие сенсибилизации. Одновременно отмечалось достоверно более высокое число клеток с маркером HLA DR и достоверно более высокий уровень общего Ig A в сыворотке крови.

Иммунологические критерии прогноза формирования аллергопатологии у практически здоровых лиц без сенсибилизации и у здоровых лиц с «латентной сенсибилизацией» в зависимости от наличия или отсутствия отягощенного семейного аллергологического анамнеза

Проведенный нами корреляционный анализ в группах обследованных показал, что при всех вариантах иммунопатологии (от обнаружения активации базофилов на аллергены in vitro у практически здоровых лиц до появления клинической картины аллергического ринита) формируются и разные варианты взаимосвязей между отдельными показателями иммунитета. Значимость выявленных связей подтверждена ранговыми коэффициентами корреляций Спирмена rS для которых был выбран уровень значимости, принятый для медико-биологических исследований (р<0,05). С целью интерпретации корреляционных взаимосвязей между показателями были проведены факторный, дискриминантный и регрессионный анализы.

Результаты факторного анализа показали, что у лиц с ЛС и у больных АР количество корреляций, включенных в структуру факторов, и общая факторная нагрузка значительно возрастают. Расширение структуры факторов в группе больных АР за счет новых корреляций, отсутствующих у здоровых лиц с ЛС может свидетельствовать с одной стороны, о включении дополнительных механизмов компенсации для сохранения клинического здоровья в ремиссию заболевания, но с другой, об усилении процессов дезинтеграции в иммунной системе, которые при дополнительной антигенной нагрузке (аллергенной либо инфекционной) могут привести к срыву адаптационных процессов.

Учитывая полученные данные, нами с целью определения наиболее информативных взаимосвязанных показателей, определяющих способности реагирования иммунной системы в исследуемых группах, и для принятия решения о том, какие переменные наилучшим образом различают совокупности между собой, были выполнены регрессионный и пошаговый дискриминантный анализы.

При проведении регрессионного анализа было выявлено, что из всего обилия лабораторных показателей в наиболее информативные предикторы были включены в основном показатели, связанные с аллергологическим статусом, а также уровень общих Ig A и Ig G, показатели функциональной активности нейтрофилов и их относительное количество. Это свидетельствует о том, что состояние аллергии в основном связано как с процессами активации тех или иных популяций лейкоцитов, так и с механизмами, участвующими в регуляции иммунных процессов.

Результаты проведенного дискриминантного анализа свидетельствуют о том, что для развития АР у здоровых лиц с ЛС без отягощенного семейного аллергологического анамнеза требуются как нарушения соотношения популяций лейкоцитов (базофилов, эозинофилов, Т-цитотоксических лимфоцитов), уровня общего Ig G, так и усиление реагирования базофилов на аллергены in vitro. Число информативных предикторов, дискриминирующих группу здоровых лиц с ЛС и без отягощенного семейного аллергологического анамнеза от больных АР, примерно равно числу информативных предикторов, дискриминирующих группу лиц с ЛС и отягощенным семейным аллергологическим анамнезом от больных АР. При этом общими предикторами между ними являются: % базофилов, % эозинофилов, число клеток с маркером HLA DR и уровень общего Ig G, участвующего в эффекторной фазе иммунного ответа.

Для того чтобы у абсолютно здорового человека развилось состояние «латентная сенсибилизация», требуются изменения достаточно большого количества основных параметров иммунной системы, в том числе связанных с ее регуляцией. При этом в процесс дезадаптации включаются не только девиация иммунного ответа, но и функциональное состояние базофилов в покое и при дополнительной антигенной нагрузке. Значимость вклада выделенных информативных предикторов в этом случае для лиц с отягощенным семейным аллергоанамнезом и для лиц, отрицающих наличие аллергических заболеваний в семье, различна, что свидетельствует о том, что иммунопатологический процесс в этих группах обеспечивается разными механизмами.

Вычисление диагностического коэффициента для каждого из вышеуказанных параметров позволило нам вывести формулы математической модели прогнозирования риска развития той или иной аллергической патологии у практически здоровых лиц без активации базофилов на аллергены in vitro. Была рассчитана лямбда Уилкса (Wilks' Lambda), F-статистика Фишера и коэффициент детерминации модели R**2. При этом уровень значимости для F-критерия соответствовал р<0,001. Корректность выбранной модели проверена с помощью метода исследования остатков графическим способом и статистикой Дарбина-Уотсона.

Математическая модель прогнозирования риска развития состояния латентной сенсибилизации для здоровых лиц с отягощенным семейным аллергоанамнезом = 7,51 K pilc/plus + 10,3 ИНФ + 0,92 Kbit/neg + 0,19 Th2 - 0,97 НСТ сп.акт - 2,65 K bit/plus + 1,74 % базофилов + 0,99 HLA DR отн, % + 2,0 общ.IgG + 71,93 НСТ сп.инд. + 1,03 CD8 отн, % - 0,77 K pilc/neg +1,8 CD25отн, % + 1,32 палоч.нейтр., отн. % + 0,05 K plus/neg + 0,05 CD16 CD56 абс. + 8,24 лимф.абс. + 1,09 общ.IgA + 0,48 НСТ инд.акт - 23,55 НСТ инд.индекс; ( ? - 55,0641 у.е.)

Математическая модель прогнозирования риска развития состояния латентной сенсибилизации для здоровых лиц с неотягощенным семейным аллергоанамнезом = 4,92 K pilc/plus + 11,80 ИНФ + 0,65 Kbit/neg + 0,27 Th2 - 0,54 НСТ сп.акт + 1,72 K bit/plus + 2,72 % базофилов + 1,16 HLA DR отн, % + 1,93 общ.IgG + 27,96 + НСТ сп.инд. + 1,02 CD8 отн,% - 0,18 K pilc/neg +1,6 CD25отн, % + 2,13 палоч.нейтр, отн. % - 0,21 K plus/neg + 0,06 CD16 CD56 абс. + 9,41 лимф.абс. +1,73 общ.IgA + 0,64 НСТ инд.акт - 31,39 НСТ инд.индекс; ( ? - 65,1332 у.е.)

Математическая модель прогнозирования риска развития аллергического ринита для практически здоровых лиц = 8,93 K pilc/plus + 13,14 ИНФ + 1,42 Kbit/neg - 0,15 Th2 - 1,04 НСТ сп.акт - 3,5 K bit/plus - 0,36 % базофилов + 1,5 HLA DR отн, % + 2,23 общ.Ig G + 74,3 НСТ сп.инд. + 1,12 CD8 отн, % - 0,89 K pilc/neg +2,15 CD25отн, % + 1,56 палоч.нейтр, отн % - 0,005 K plus/neg + 0,065 CD16 CD56абс + 9,56 абс. кол-во лимф +1,88 общ.IgA + 0,65 НСТ инд.акт - 32,87 НСТ инд. индекс. (?- 74,2043 у.е.)

При уже сформировавшейся ЛС переход в состояние АР требует изменения гораздо меньшего количества предикторов, в основном связанных с нарушением формирования первичного и вторичного иммунного ответов и в меньшей степени с девиацией иммунного ответа. Для компенсации имеющейся ЛС у лиц без отягощенного семейного аллергоанамнеза необходимо сохранение соотношения популяций лейкоцитов (базофилов, эозинофилов, Т-цитотоксических лимфоцитов), уровня общего Ig G , так и наличие механизмов, препятствующих усилению реагирования базофилов на аллергены in vitro. Для лиц с отягощенным семейным аллергологическим анамнезом на первый план выступает сохранение продукции Ig A, Ig G, функциональной способности клеток к элиминации аллергена (индекс фагоцитоза нейтрофилов), сохранение иммунорегуляторного индекса и адекватной активации Т-лимфоцитов.

Математическая модель прогнозирования риска развития АР у лиц с латентной сенсибилизацией, имеющих отягощенный семейный аллергологический анамнез = 25,29 ИФН + 1,5 K bit/neg + Ig A 0,98 + 0,45CD HLA DR + 4,97 Ig G + 5,18 лейкоциты*109/л + 4,42 % эозинофилов - 0,74 % базофилов - 0,38 НСТ сп. акт. - 3,82 ИРИ - 1,1 K pilc/neg - 0,14 bas bit + 0,08 CD16 CD56. (? 90,8928 у.е.)

Математическая модель риска прогнозирования развития АР у лиц с латентной сенсибилизацией, не имеющих отягощенного семейного аллергологического анамнеза = 59,91 моноциты *109/л - 18,14 % базофилов + 1,92 %эозинофилов + 3,84 Ig G общ. + 0,37 CD HLA DR - 7,1 K bit/plus + 0,44 bas epid + 0,05 Th2 - 0,65 % моноцитов + 1,47 % CD8. (?63,739 у.е.)

Критериями формирования групп риска по развитию аллергических заболеваний, помимо выявления отягощенного семейного аллергологического анамнеза, является выявление ЛС путем определения активации базофилов на аллергены в цельной крови при использовании широкой панели аллергенов, а также оценка количества Th2, связанного с девиацией иммунного ответа. Выявленные нами изменения позволят создать базу данных для формирования групп риска по развитию аллергических заболеваний у лиц с ЛС, а также для мониторинга состояния больных АР с целью профилактики развития у них БА и возможного контроля лечения АСИТ. В целом, полученные данные позволяют уточнить иммунные механизмы формирования и развития аллергического процесса от состояния ЛС у практически здоровых лиц до формирования патогенетически значимой сенсибилизации и клинической манифестации аллергического заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Активация базофилов на аллергены in vitro обнаруживается как у практически здоровых лиц, не имеющих клинических признаков аллергических реакций (в 63,33 % случаев), так и у больных аллергическим ринитом в фазу клинической ремиссии заболевания (в 93,33 % случаев).

2. Здоровые лица, отвечающие активацией базофилов на аллергены, но не имеющие клинических проявлений, составили группу лиц с «латентной сенсибилизацией» (63,33% среди всех здоровых лиц), с наиболее часто выявляемой бытовой и эпидермальной сенсибилизацией - к круглогодичным аллергенам, с которыми имеется постоянный и длительный контакт.

3. Характер и степень выраженности сенсибилизации у больных аллергическим ринитом (группа реализованного риска) и здоровых лиц с «латентной сенсибилизацией» (группа нереализованного риска) разный. Частота выявления бытовой, эпидермальной и пыльцевой сенсибилизации у больных аллергическим ринитом выше, чем у здоровых лиц.

4. Нарушения соотношения популяций лейкоцитов (базофилов, эозинофилов, Т-цитотоксических лимфоцитов, уровня CD HLA DR), а также уровня общего Ig G, участвующего в эффекторной фазе иммунного ответа, являются предикторами развития аллергического ринита у здоровых лиц с «латентной сенсибилизацией».

5. У больных аллергическим ринитом в сравнении с контрольной группой здоровых обнаруживается девиация иммунного ответа в сторону преобладания Th2-лимфоцитов. Для лиц с «латентной сенсибилизацией» и больных аллергическим ринитом в отличие от здоровых без сенсибилизации характерно усиление функции элиминации антигена, но степень изменения этих показателей иммунного статуса в изучаемых группах различна.

6. Построенные математические модели позволят прогнозировать в зависимости от наличия или отсутствия отягощенного семейного аллергоанамнеза риск развития состояний «латентная сенсибилизация» и АР у практически здоровых лиц.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Результаты исследования предназначены для использования в медицинских учреждениях специалистами в области клинической лабораторной диагностики и клинической иммунологии и аллергологии.

Рекомендуется проводить функциональный тест определения активации базофилов на аллергены in vitro:

- для диагностики, контроля эффективности терапии, прогноза развития и течения заболевания больным аллергическим ринитом помимо стандартного определения уровня АС IgE-антител и кожно - аллергологических проб;

- с целью первичной профилактики аллергических заболеваний у практически здоровых людей, особенно имеющих отягощенный аллергологический семейный анамнез.

- для составления больным аллергическим ринитом и лицам с «латентной сенсибилизацией» гипоаллергенной и элиминационной диеты.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных изданиях по перечню ВАК Минобрнауки РФ

1. Усова Ю.А. Диагностическое значение определения клеточной чувствительности к аллергенам на модели базофилов in vitro / Ю.А.Усова, А.В. Зурочка, С.В. Квятковская, О.В. Маслова // Российский иммунологический журнал - 2008. - Т.2(11), № 2-3.- С.216-217.

2. Усова Ю.А. Показатели иммунного статуса лиц с аллергическим риноконъюнктивитом в сравнении с практически здоровыми лицами с латентной сенсибилизацией / Ю.А. Усова, С.В. Квятковская, А.В. Зурочка, О.В. Маслова // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2009. - №2/1 (24).- С.174-175.

3. Усова Ю.А. Оценка клеточного звена иммунитета и клеточной чуствительности к аллергенам на модели базофилов in vitro у больных АРК и практически здоровых лиц с латентной сенсибилизацией в сравнении с контрольной группой здоровых лиц / Ю.А.Усова, А.В. Зурочка, С.В. Квятковская, О.В. Маслова // Российский аллергологический журнал.- 2010.- №1, Вып 1.- С.70-71.-

4. Усова Ю.А. Применение метода оценки сенсибилизации базофилов для диагностики и мониторинга у больных аллергическим ринитом и клинически здоровых лиц / Ю.А.Усова, А.В. Зурочка, С.В. Квятковская, О.В. Маслова // Российский иммунологический журнал. - 2010.- Т.4 (13), №2.- С. 168- 172.

5. Усова Ю.А. Оценка клеточной чувствительности к аллергенам на модели базофилов in vitro у больных АРК и практически здоровых лиц с «латентной сенсибилизацией» в зависимости от наличия или отсутствия отягощенного семейного аллергологического анамнеза / С.В. Квятковская, О.В. Маслова // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2010.- №2 /1 (29).- С.75- 76.

6. Усова Ю.А. Показатели иммунного статуса у больных АРК и практически здоровых лиц с «латентной сенсибилизацией» в зависимости от наличия или отсутствия отягощенного семейного аллергологического анамнеза / Ю.А.Усова, А.В. Зурочка, С.В. Квятковская, О.В. Маслова // Российский аллергологический журнал.- 2010.-№5, Вып.1. - С.303-304.

Статьи, тезисы докладов и статей

7. Усова Ю.А. Сравнительная характеристика показателей иммунного статуса лиц с аллергическим риноконъюнктивитом и практически здоровых лиц с латентной сенсибилизацией / Ю.А. Усова, С.В. Квятковская, А.В. Зурочка, О.В. Маслова // «Современные проблемы аллергологии, иммунологии, и иммунофармакологии: Х международный конгресс, посвященный 100 -летию со дня рождения А.Д. Адо». Сборник трудов конгресса.- Казань, 2009.- С.153.