Модификация гормональных функций и способности к адаптации самок крыс после пренатального стресса

Размещено на http: //www. allbest. ru/

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ ИМ. И.П.ПАВЛОВА

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

03.03.01 - физиология

Модификация гормональных функций и способности к адаптации самок крыс после пренатального стресса

Шамолина Татьяна Сергеевна

Санкт-Петербург 2011

Работа выполнена в лаборатории нейроэндокринологии Института физиологии им. И.П.Павлова РАН

Научный руководитель: доктор биологических наук Ордян Наталья Эдуардовна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Лебедев Андрей Андреевич Институт экспериментальной медицины РАМН

доктор биологических наук Ватаева Людмила Анатольевна Институт физиологии им. И.П.Павлова РАН

Ведущая организация: Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН

Защита диссертации состоится « 7 » февраля 2011 г. в ____ часов на заседании Диссертационного совета по защите докторских и кандидатских диссертаций (Д002.020.01) при Институте физиологии им. И.П.Павлова РАН (199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, д.6).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института физиологии им. И.П.Павлова РАН.

Автореферат разослан «______»______________2010г.

Ученый секретарь Диссертационного совета доктор биологических наук Н.Э. Ордян

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Одним из актуальных направлений современной физиологии и медицины является выявление факторов, определяющих индивидуальную предрасположенность к возникновению различных заболеваний. В этом отношении особое место занимает проблема психоэмоциональных стрессов, испытываемых матерями в период беременности и сопровождающихся гиперкортицизмом. У потомков таких матерей изменяются процессы созревания мозговых структур [Martinez-Tellez et al., 2009; Jia et al., 2010; Weinstock, 2007], что проявляется в виде психических расстройств, усиливающихся с возрастом [Talge et al., 2007; Van den Bergh et al., 2008; Vrekoussis et al., 2010], изменяется способность к обучению [Ватаева и др., 2004; Hosseini-Sharifabad and Hadinedoushan, 2007], увеличивается риск развития таких психопатологий как тревога и депрессия, а также сужается диапазон адаптивных возможностей организма в условиях острых и хронических стрессов различной модальности [Ордян и Пивина, 2003; Abe et al., 2007; Maccari and Morley-Fletcher, 2007; Mastorsci et al., 2009; Mikhailenko et al., 2010; Weinstock, 2007]. В этом отношении наиболее изученными являются эффекты пренатального стресса у особей мужского пола, тогда как его влияние на женский организм исследовано недостаточно.

Показано также, что животные, рожденные от матерей, подвергавшихся стрессорным воздействиям в последнюю треть беременности, демонстрируют изменения в игровом поведении в ювенильном возрасте и дефицит социального поведения в половозрелом возрасте [Frye and Oreck, 2004; Lee et al., 2007; Takahashi et al., 1992]. Вероятнее всего, пренатально стрессированные животные обладают и измененной реактивностью к социальному стрессу, однако этот вопрос изучен не был.

У пренатально стрессированных животных наблюдается выраженная модификация активности нейроэндокринных систем и, прежде всего, гипофиз-адренокортикальной (ГАС) системы, с изменением не только ее функциональной активности, но и чувствительности к регуляторным сигналам во всех звеньях [Ордян и Пивина, 2003; Bosch et al., 2007; Darnaudery and Maccari, 2008; Koehl et al, 1999; Weinstock et al., 1992]. Тот факт, что пренатально стрессированные животные уже в молодом возрасте демонстрируют нарушение гормональных функций, свидетельствует о возможном усугублении с возрастом последствий стрессов, перенесенных на ранних этапах онтогенеза. Однако этот вопрос практически не исследован.

В течение жизни эндокринная система женского организма подвергается глубоким изменениям. Возрастные перестройки касаются не только ГАС, но и другой важнейшей гормональной оси - гипофиз-гонады, снижение активности которой определяет постепенную потерю репродуктивных функций [Wise, 1991; Wu et al., 2005]. В работе Herrenkohl [Herrenkohl, 1986] было показано, что молодые пренатально стрессированные самки демонстрируют снижение репродуктивных способностей. Тем не менее, влияние пренатального стресса на состояние гипофиз-овариальной системы и ее возрастные перестройки не изучалось.

Установлено также, что пренатальный стресс оказывает выраженное негативное влияние на функциональную активность различных нейромедиаторных систем [Carboni et al., 2010; Peters, 1988; Takahashi, 1998]. При этом наибольшие отклонения регистрируются в активности серотонинергической системы [Poland et al., 1995; Hanley, Van de Kar, 2003]. Можно полагать, что изменение активности серотонинергической системы мозга служит одной из причин для возникновения и развития нарушений в гормональном и поведенческом статусе самок, родившихся от стрессированных матерей.

Цель и задачи исследования. Цель исследования заключалась в изучении последствий хронического психоэмоционального стресса в период внутриутробного развития на гормональные функции, поведение и способность к адаптации самок крыс разных возрастных групп.

Для достижения этой цели были поставлены следующие Задачи:

1. Изучить влияние пренатального стресса на активность гипофизарно-адренокортикальной системы самок в зависимости от возраста животных.

2. Исследовать эффекты пренатального стресса на репродуктивные функции и поведение в новой обстановке самок в зависимости от стадии эстрального цикла и возраста животных.

3. Оценить изменение функциональной активности подтипов рецепторов серотонина у пренатально стрессированных самок крыс.

4. Изучить чувствительность к социальным стрессорным воздействиям (содержание в переуплотненных группах или изоляции) пренатально стрессированных самок крыс.

5. Провести сравнительный анализ формирования пострессового патологического состояния в парадигме «стресс-рестресс» у контрольных и пренатально стрессированных животных.

Научная новизна. Впервые установлено наличие долговременных эффектов пренатального стресса на гормональные функции и поведение самок крыс, зависящих от возраста животных. У молодых пренатально стрессированных самок обнаружено повышенная чувствительность ГАС к сигналам обратной связи, которая в последующей жизни сменяется потерей эффективность торможения как базальной, так и стрессорной активности системы по механизму отрицательной обратной связи, более выраженной, чем у контрольных самок. Показано также, что у пренатально стрессированных самок возрастной паттерн секреции половых стероидных гормонов существенно нарушен, при этом уровень эстрадиола в крови практически не изменяется ни в течение эстрального цикла, ни с возрастом животных. Впервые установлены возрастные изменения в поведении в новой обстановке пренатально стрессированных самок, которые проявлялись в снижении уровня тревожности по мере старения в отличие от контрольных животных, у которых уровень тревожности с возрастом прогрессивно повышался. пренатальный стресс крыса репродуктивный

Впервые выявлено влияние пренатального стресса на функциональную активность центральных 5-ГТ2А/2С - подтипов рецепторов серотонина, которая была снижена у пренатально стрессированных самок в стадию эструса. Тогда как активность 5-ГТ1А - подтипа рецепторов не изменялась в различные стадии эстрального цикла, что коррелировало с отсутствием циклического колебания уровня эстрадиола в крови пренатально стрессированных животных.

Впервые изучена чувствительность к социальному стрессу, вызванному содержанием в период пубертата в изоляции или переуплотенных группах, пренатально стрессированных самок крыс. При этом пренатально стрессированные животные демонстрировали большую чувствительность к содержанию в переуплотненных группах, чем в изоляции.

Впервые установлено, что в парадигме «стресс-рестресс» как контрольные, так и пренатально стрессированные самки крыс формируют патологическое состояние, проявления которого в виде длительно сохраняющейся повышенной тревожности и наличия патологического торможения активности ГАС соответствует признакам посттравматического стрессового расстройства (ПТСР) у людей. Однако если у контрольных животных развитие патологического состояния идет по тревожному типу, то у пренатально стрессированных самок помимо высокой тревожности наблюдается и усиление депрессивноподобного поведения, которое устраняется хроническим введением антагониста 5-ГТ2А/2С - подтипа рецепторов серотонина кетансерина.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Стрессирование беременных самок крыс в последнюю треть гестации оказывает долговременные эффекты на гормональные функции и поведение в новой обстановке их потомков женского пола. Направленность изменений в гормональной сфере и поведении зависят от возраста животных.

2. Пренатальный стресс снижает функциональную активность 5-ГТ2А/2С - подтипов рецепторов серотонина и приводит к отсутствию зависимости активности 5-ГТ1А - подтипа рецепторов от стадии эстрального цикла, что, по всей видимости, обусловлено исчезновением циклического колебания уровня эстрадиола.

3. Пренатальный стресс изменяет чувствительность самок крыс к социальному стрессу, вызванному содержанием в период пубертата в переуплотненных группах или в изоляции.

4. В модели «стресс-рестресс», являющегося аналогом ПТСР у людей, пренатально стрессированные самки формируют патологическое состояние, проявляющееся в увеличении тревожности, усилении депрессивноподобного поведения, а также в характерных нарушениях регуляции гипофиз-адренокортикальной системы. Данная патология сопровождается сенситизацией 5-НТ2-подтипа рецепторов серотонина.

Теоретическая и практическая значимость. Полученные в работе результаты расширяют теоретическое представление о модифицирующем влиянии психоэмоциональных стрессорных воздействий в период беременности на активность гипофиз-адренокортикальной и гипофиз-овариальной систем потомков женского пола. Важное практическое значение имеет выявленная повышенная чувствительность пренатально стрессированных самок к социальному стрессу, вызванному содержанием в период пубертата в переуплотненных группах, а также более глубокие психоэмоциональные нарушения у этих животных вследствие тяжелых повреждающих стрессовых воздействий. Эти результаты следует учитывать при прогнозировании неблагоприятных последствий пренатального стресса на женский организм, а также использовать их с целью ранней диагностики психофизиологических расстройств.

Апробация работы. Результаты работы были представлены и обсуждены на международных и всероссийских конференциях: Межинститутской конференции молодых ученых, посвященной 100-летию акад. В.Н. Черниговского «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды» (Санкт-Петербург-Колтуши, 2007), Всероссийском симпозиуме с международным участием «Гормональные механизмы адаптации» (Санкт-Петербург, 2007), Одиннадцатой медико-биологической конференции молодых ученых «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2008), Межвузовской конференции молодых ученых «Герценовские чтения» (Санкт-Петербург, 2009), Двенадцатой медико-биологической конференции молодых ученых «Человек и его здоровье» (Санкт-Петербург, 2009), Международной научной конференции «Физиология развития человека» (Москва, 2009), European Neuropsychopharmocology Congress (Istanbul, Turkey 2009), VIII Всероссийской конференции «Нейроэндокринология-2010 (Санкт-Петербург, 2010), 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам» (Москва, 2010), XXI съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва-Калуга, 2010).

Публикации по теме диссертации. Основное содержание диссертации отражено в 16 публикациях, из них 4 научные статьи в рецензируемых журналах, включенных в Перечень ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 209 источников. Работа изложена на 119 страницах и иллюстрирована 21 рисунком и 4 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Работа выполнена на cамках крыс линии Вистар в возрасте 3, 12 и 24 мес - потомках матерей, перенесших психоэмоциональный стресс в последнюю треть гестации. С этой целью беременных самок крыс с 15 по 19 дни беременности подвергали ежедневной часовой иммобилизации в течение 60 мин в пластиковых пеналах размером 20х7х6 в условиях повышенной освещенности (лампа 60 Вт, расположенная на высоте 50 см). После рождения крысята находились с матерью 30 дней без ограничения доступа к воде и пище. В каждой серии экспериментов использовали не менее 7 животных в каждой группе (контроль, пренатальный стресс, эструс, диэструс).

Методы изучения функций ГАС. Базальную и стрессорную активность ГАС изучали по изменение уровня кортикостерона в плазме крови в покое и через 30 мин после процедурного стрессорного воздействия. Изучение процессов торможения ГАС по механизму отрицательной обратной связи проводили с помощью двухдневного дексаметазонового теста [Жуков, 1990]. Для оценки процесса патологического торможения ГАС в модели «стресс-рестресс» использовали тест на быструю обратную связь [Liberson et al., 1997]. Непосредственно перед посадкой крыс в иммобилизационные пеналы на 30 мин им производили внутрибрюшинно инъекцию гидрокортизона в дозе 30 мкг/100 г веса. Затем отбирали кровь из хвостовой вены через 3, 10, 30 и 60 мин после начала иммобилизации.

Уровень кортикостерона в плазме крови определяли радиоиммунологическим методом с использованием антисывортки и [1,2,6,7-3Н]-кортикостерона с удельной активностью 76,5 Кю/ммоль.

Методы изучения функций половой системы. Половые функции самок крыс оценивали в возрасте 3, 12 и 24 месяцев путем анализа окрашенных вагинальных мазков по характерным изменениям клеточного состава влагалищного эпителия, а также определяли содержание эстрадиола и прогестерона в плазме крови с помощью иммуноферментного анализа с использованием стандартных наборов. В возрасте 3 и 12 месяцев у взрослых самок в стадиях эструса и диэструса извлекали матку и проводили морфометрическое описание по величине эндометрия и миометрия, а также размерам его слоев (кольцевой и продольной мускулатуры).

Методы изучения поведения. Поведение в новой обстановке самок крыс в зависимости от стадии цикла и возраста животных изучали в тесте «открытое поле» [Holl,1936]. Уровень тревожности у крыс определяли с помощью теста приподнятый крестообразный лабиринт (ПКЛ) [Pellow et al.,1985]. Для изучения поведенческих проявлений психопатологии, возникающей как результат сильных стрессорных воздействий («стресс-рестресс»), использовали тест вынужденное плавание [Porsolt et al, 1977].

Методы изучения активности серотониновых рецепторов. Изменение активности 5-ГТ1А-рецепторов головного мозга изучали по проявлению гипотермического эффекта в ответ на внутрибрюшинное введение в дозе 1 мг/кг 8-OH-DPAT (8-гидрокси-2-дипропиламинотетралина гидробромид) селективного агониста 5-ГТ1А-рецепторов. Для этого оценивали разницу ректальной температуры до и через 30 мин после введения 8-OH-DPAT. Изменение активности 5-ГТ2А/2C -рецепторов головного мозга оценивали по числу встряхиваний головой в течение 20 мин через 5 мин после внутрибрюшинного ведения агониста этого типа рецепторов - DOI (2,5-диметокси-4-йодоамфетамина) в дозе 0,5 мг/кг, а также с помощью определения уровня кортикостерона через 30 и 90 мин после внутрибрюшинного введения DOI в той же дозе. Все тесты проводились на животных, находящихся в стадии эструс и диэструс.

Методы стрессорных воздействий. Изучали чувствительность к социальным стрессам, вызванным содержанием животных в период пубертата в переуплотненных группах или в изоляции. С этой целью животных в возрасте 1 мес рассаживали в группы по 9-10 животных в клетке или по одиночке. В возрасте 2.5 мес у всех крыс определяли регулярность эстрального цикла, базальный уровень кортикостерона в крови и уровень тревожности в тесте ПКЛ. Затем число животных в клетках оптимизировали (5 животных в клетке) и через месяц адаптационного периода все эксперименты повторяли.

Для индукции экспериментального аналога реактивного тревожно-депрессивного состояния (ПТСР) использовали модель «стресс-рестресс» [Liberson et al., 1997]. Самок крыс контрольной и пренатально стрессированной групп, находящихся в стадии диэструса, подвергали тяжелому комбинированному стрессу, состоящему из двухчасовой иммобилизации, 20-минутного вынужденного плавания и после 15-минутного перерыва - эфирного стресса до потери сознания. Триггером для развития патологического состояния являлся рестресс, заключавшийся в экспозиции животных 30-минутному иммобилизационному стрессу через 7 дней после первого комбинированного стресса. Формирование тревожно-депрессивного состояния исследовали с помощью теста «вынужденное плавание», теста ПКЛ и теста на быструю обратную связь. Учитывая клинические наблюдения об эффективности использования блокаторов 5-ГТ2А/2C рецепторов серотонина для лечения депрессивных больных контрольные и пренатально стрессированные самки после рестресса были разделены на две подгруппы. Первой в течение 10 дней вводили блокатор 5- ГТ2А/2C рецепторов кетансерин в дозе 0,1 мг/кг веса тела, а другой подгруппе животных вводили физиологический раствор в том же объеме. По окончанию введения препарата или физиологического раствор крыс тестировали в ПКЛ или в тесте вынужденное плавание.

Для статистической обработки полученных результатов использовали t- критерий Стьюдента для независимых выборок, двухфакторный дисперсионный анализ по методу ANOVA. В качестве критерия достоверности принимали p<0.05. Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета прикладных программ Statistica 6.0.

2. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Изменение гормональных функций и поведения пренатально стрессированных самок крыс в зависимости от возраста животных.

Проведенные исследования показали увеличение базального уровня кортикостерона у молодых пренатально стрессированных самок, но не стрессорного гормонального уровня в ответ на процедурный стресс по сравнению с контрольными значениями (Рис. 1). У пренатально стрессированных животных наблюдалось прогрессирующее с возрастом снижение базального уровня, тогда как у контрольных особей эти изменения были менее выражены. Величина гормонального ответа ГАС на процедурный стресс у самок обеих групп достоверно уменьшалась по мере старения, но у годовалых пренатально стрессированных особей стрессорная реактивность была ниже контрольных значений, в то время как у 24-месячных крыс обеих групп этот показатель не различался.

Чувствительность ГАС молодых пренатально стрессированных самок к сигналам обратной связи была повышенной, что выражалось в более низком базальном и стрессорном уровне кортикостерона на фоне введенного дексаметазона (Рис. 2, А). С возрастом чувствительность ГАС к сигналам обратной связи у пренатально стрессированных крыс уменьшалась, что проявлялось не только в менее эффективном торможении базальной активности системы экзогенным глюкокортикоидом, но и, главным образом, стрессорного выброса кортикостерона (Рис. 2, Б, В). Полученные данные свидетельствует о значительном снижении эффективности механизмов отрицательной обратной связи в регуляции ГАС у этих животных по мере старения.

Рис.1 Влияние пренатального стресса на возрастные изменения базального и стрессорного уровней кортикостерона самок крыс. I - базальный уровень; II - стрессорный уровень. Светлые столбики - контрольные крысы; столбики со штриховкой - пренатально стрессированные самки. По оси абсцисс - возраст крыс; по оси ординат - уровень гормона. * - достоверные (p<0,05) различия между контрольными и пренатально стрессированными животными; # - достоверные (p<0,05) изменения по сравнению с предыдущим возрастным сроком

Таким образом, пренатальный стресс оказывает модифицирующее влияние на регуляцию ГАС у женских особей, усиливая процессы торможения у молодых и снижая чувствительность системы к сигналам обратной связи у старых животных.

Проведенные исследования уровня половых стероидных гормонов в плазме крови продемонстрировали четкую зависимость содержания эстрадиола от стадии эстрального цикла у 3-мес самок контрольной группы (рис.3, А).

Рис. 2 Дексаметазоновый тест у пренатально стрессированных самок крыс разного возраста. А - 3 мес.; Б - 12 мес.; В - 24 мес. I - введение физиологического раствора; II - введение дексаметазона. Светлые столбики - контрольные самки, столбики со штриховкой - пренатально стрессированные крысы. По оси абсцисс - базальный и стрессорный уровни кортикостерона.

*Достоверные (р<0,05) различия между контрольными и пренатально стрессированнными животными; # достоверные (р<0,05) различия по сравнению с введением физиологического раствора.

Пренатальный стресс привел к снижению уровня эстрадиола в крови 3-х и 12-месячных самок крыс в эструсе, в результате чего гормональные различия между стадиями цикла нивелировались. Уровень прогестерона у 3-х мес пренатально стрессированных самок был повышен в диэструсе, хотя с возрастом снижался также как и у контрольных животных (рис.3,Б).

Рис. 3 Влияние пренатального стресса на возрастные изменения уровня половых стероидных гормонов в крови самок крыс. А- эстрадиол; Б - прогестерон. I - 3; II - 12; III - 24 месяца. Светлые столбики - контрольные самки, столбики со штриховкой - подопытные крысы. По оси абсцисс - стадии эстрального цикла, Э- эструс; Д - диэструс. По оси ординат - уровень гормона. * - достоверные (р<0,05) различия между контрольными и пренатально стрессированнными животными; # достоверные (р<0,05) различия по сравнению с предыдущим возрастным сроком; & достоверные (р<0,05) различия между стадиями цикла

Кроме того, пренатальный стресс оказал существенное влияние на мофрометрические характеристики матки. Так, у молодых животных выявлено отсутствие изменений в толщине эндометрия в зависимости от стадии цикла и атрофия миометрия, преимущественно за счет циркулярной мускулатуры (Рис.4). Материнский стресс оказал модифицирующее влияние на возрастной паттерн изменения морфометрических характеристик матки крыс. У годовалых пренатально стрессированных самок по сравнению с молодыми особями толщина эндометрия снижалась только в диэструсе, тогда как в эструсе выявлено увеличение толщины общего миометрия за счет слоя циркулярной мускулатуры. В результате в годовалом возрасте самки обеих групп не различались по гистологической структуре матки.

Рис.4 Влияние пренатального стресса на морфометрические характеристики матки крыс. А - толщина эндометрия; Б - толщина общего миометрия. I - 3 месяца; II - 12 месяцев. По оси абсцисс - стадии эстрального цикла: эструс (Э); диэструс (Д). По оси ординат - толщина слоев матки (мкм). Светлые столбики - контрольные самки; столбики со штриховкой - пренатально стрессированные особи. * - достоверные (p<0.05) различия между контрольными и подопытными крысами; # - достоверные (p<0.05) отличия от животных в стадии эструса; & - достоверные (p<0.05) отличия от самок 3 месячного возраста

Суммируя результаты поведенческого теста открытое поле, можно отметить, что по мере старения у контрольных самок наблюдалось достоверное (p<0,05) снижение двигательной активности, числа стоек и эмоциональности, а также увеличение длительности реакции замирания и повышение уровня тревожности. Тем не менее, у пренатально стрессированных животных уровень локомоторной и исследовательской активности практически не менялся на протяжении жизни, однако при сравнении с контролем выявлены противоположные по направленности возрастные изменения уровня тревожности, который достоверно (p<0,05) снижался по мере старения. При этом исследованные показатели ориентировочно-исследовательского поведения циклирующих пренатально стрессированных самок не зависели от стадии эстрального цикла. Основываясь на результатах гормональных анализов можно полагать, что отсутствие у пренатально стрессированных самок крыс изменений в ориентировочно-исследовательском поведении как в различные стадии цикла, так и по мере старения, вероятно, обусловлены отсутствием флуктуаций эстрадиола, уровень которого практически не изменялся ни в течение эстрального цикла, ни с возрастом животных.

2. Изменение активности рецепторов серотонина головного мозга у пренатально стрессированных самок крыс.

И у контрольных, и у пренатально стрессированных самок крыс 5-ГТ1А- рецепторы активны, что доказывает наличие гипотермического эффекта в обеих группах животных (Табл.1). Однако у подопытных крыс в отличие от контрольных не выявлена зависимость между выраженностью гипотермического эффекта и стадией эстрального цикла.

Табл. 1 Температура тела самок крыс до и после введения 8-OH-DPAT

К - контрольные самки, ПС - пренатально стрессированные; t1 - температура тела до введения 8-OH-DPAT, t2 - температура тела после введения препарата, Дt -температурная разница; * достоверные различия (p<0,05) между контрольными и пренатально стрессированными самками, # достоверные различия (p<0,05) между стадиями эстрального цикла.

На стадии эструса у пренатально стрессированных крыс происходит значительное снижение активности 5ГТ2А/2C - рецепторов: число потряхиваний головой после введения DOI более чем в 3 раза меньше, чем у контрольных животных (Рис.5), а также уровень кортикостерона в ответ на введение DOI у них не повышался, что наблюдалось у контрольных самок (Рис.6).

Рис.5 Рефлекторные потряхивания головой у самок крыс после введения DOI. Светлые столбики - контрольные самки, столбики со штриховкой - пренатально стрессированные крысы. По оси абсцисс - стадии эстрального цикла. По оси ординат - количество потряхиваний головой. * достоверные (р<0,05) различия между контрольными и пренатально стрессированнными животными; # достоверные (р<0,05) различия между стадиями эстрального цикла

Рис. 6 Изменение концентрации кортикостерона на фоне введения DOI у самок крыс в стадии эструс. I - введение физиол. раствора; II - введение DOI. По оси абсцисс - время, мин; по оси ординат - уровень гормона, нмоль/л

* достоверные (р<0,05) различия между контрольными и пренатально стрессированнными животными; # достоверные (р<0,05) различия между введением физ. раствора и DOI, & достоверные (р<0,05) различия между временными интервалами инъекций. Остальные обозначения те же, что и на Рис.5.

В литературе показано наличие корреляционной зависимости между уровнем серотонина в гипоталамусе и фазами полового цикла у самок крыс. Содержание этого моноамина увеличивается в аркуатном ядре в фазу эструса и уменьшается в фазу диэструса [Bethea et al., 2002], а недостаток эстрогенов вызывает нарушения в серотонинергической системе. После овариоэктомии уменьшается содержание серотонина в ряде структур мозга. Параллельно падает уровень экспрессии м-РНК 5-НТ1А-, 5-НТ2А- и 5-НТ2С-подтипов серотониновых рецепторов, их количество и связывающая способность [Fink et al., 1997]. Можно полагать, что выявленные нами изменения в активности 5-ГТ1А- и 5ГТ2А/2C - подтипа рецепторов серотонина в стадию эструс у пренатально стрессированных животных обусловлены снижением эстрадиола, выявленное у этих животных именно в стадию эструс.

3. Влияние пренатального стресса на способность к адаптации пренатально стрессированных самок крыс.

Как показали проведенные исследования, для всех самок крыс, содержащихся в переуплотненных группах, было характерно удлинение эстрального цикла, который в норме у крыс составляет 4 дня. Как среди контрольных, так и среди пренатально стрессированных особей было выявлено сходное соотношение самок, имеющих цикл 4,5-5 дней, и самок с длинным циклом, составляющим от 7 до 14 дней. При этом в обеих экспериментальных группах увеличение продолжительности полового цикла происходило за счет удлинения стадии диэструса.

Через месяц после рассадки животных по 4-5 особей в клетку, практически у всех контрольных самок продолжительность эстрального цикла составила 4 дня, тогда как среди пренатально стрессированных животных нормализация продолжительности цикла выявлена только у 63,2 % самок. У остальных животных отмечались те или иные нарушения длительности эстрального цикла и его отдельных стадий: в основном выявлено увеличение продолжительности цикла за счет стадии диэструс.

Содержание в переуплотненных группах привело к повышению базальной концентрации кортикостерона в плазме крови пренатально стрессированных самок (Рис.7, А). После оптимизации численности животных уровень кортикостерона у контрольных и подопытных самок не различался.

В стадии диэструса пренатально стрессированные крысы, содержащиеся в условиях высокой плотности популяции, демонстрировали более низкий уровень тревожности по сравнению с контрольными животными. После оптимизации численности животных в клетке у контрольных самок наблюдалось увеличение уровня тревожности. У пренатально стрессированных особей тревожность также возрастала после рассадки, но была достоверно ниже контрольных значений по всем исследованным параметрам.

Содержание животных в изоляции привело к изменению длительности эстрального цикла и соотношения его отдельных стадий у всех самок крыс. Около 50% контрольных и пренатально стрессированных самок характеризовались укорочением длительности эстрального цикла. Остальные животные имели либо нормальную продолжительность эстрального цикла, либо удлиненную. При этом у контрольных самок крыс увеличение длительности эстрального цикла происходило за счет стадии диэструса, тогда как у пренатально стрессированных животных удлинялся эструс. При переводе самок на содержание в группах у большинства животных длительность эстрального цикла увеличивалась, однако у пренатально стрессированных самок сохранялись особи с удлиненной стадией эструс.

Вызванный изоляцией социальный стресс привел к повышению базального уровня кортикостерона как контрольных, так и пренатально стрессированных самок (Рис.7, Б). После перевода крыс на групповое содержание гормональный фон контрольных животных оставался высоким, тогда как у подопытных самок наблюдалось снижение базальной концентрации кортикостерона.

Рис.7 Влияние социального стресса на уровень кортикостерона у самок крыс. А - переуплотненные группы, Б - изоляция. I - до рассадки; II - после рассадки. Светлые столбики - контрольные самки, столбики со штриховкой - подопытные крысы. По оси ординат - уровень гормона, нмоль/л. * достоверные (р<0,05) различия между контрольными и пренатально стрессированнными животными. ** - (p<0,01)

Уровень тревожности самок, выросших в изоляции, практически не изменился в зависимости от стадии эстрального цикла ни у контрольных, ни у пренатально стрессированных животных. При переводе крыс на содержание в группах у контрольных животных такая зависимость появлялась в отличие от пренатально стрессированных особей.

Показано, что у крыс социальный стресс, вызванный изоляцией или социальной нестабильностью, оказывает значительное влияние на поведение, гормональный статус, стрессорную реактивность и репродуктивные функции [Baranyi et al., 2005; Ehlers et al., 1993; LeFevre., McClintock, 1992; Schrijver et al., 2002]. Наибольший эффект социального стресса наблюдается, когда такого рода воздействию животные подвергаются в период полового созревания [Leussis, Andersen, 2008; McCormick et al., 2007]. Наши исследования показали, что пренатальный стресс может являться тем фактором, который изменяет чувствительность самок крыс к социальному стрессу. При этом в условиях переуплотненной группы пренатально стрессированные животные демонстрируют более высокую степень дезадаптации по сравнению с контрольными животными. И, напротив, у выросших в изоляции пренатально стрессированных самок даже после перевода их на групповое содержание не только нормализуется активность ГАС, но и сохраняются такие изменения в репродуктивных функциях, которые могут обеспечить им больший «репродуктивный успех» по сравнению с интактными животными.

Экспозиция контрольных и пренатально стрессированных самок комбинированному стрессу с последующим рестрессом привела к патологическому торможению гормонального стрессорного ответа ГАС, что проявлялось в снижении уровня кортикостерона через 60 мин после начала иммобилизации по сравнению с 30-мин точкой. Однако у пренатально стрессированных крыс обнаружен отставленный запуск стрессорной реакции и повышенная стрессорная реактивность (Рис.8).

Рис. 8

Как у контрольных, так и у пренатально стрессированных животных наблюдалось достоверное (p<0,05) увеличение уровня тревожности через 1 сут после рестресса, сохраняющееся таковым и через 10 сут.

При этом введение кетансерина практически не оказало влияния на показатели уровня тревожности контрольных и пренатально стрессированных самок.

Однако у пренатально стрессированных животных обнаружено увеличение времени неподвижности в тесте «вынужденное плавание» через сутки и через 10 сут после рестресса (рис.9).

При этом увеличение времени неподвижности не было связано со снижением двигательной активности, поскольку в открытом поле пренатально стрессированные самки совершали такое же количество побежек и вертикальных стоек, как и контрольные крысы.

При введении кетансерина у пренатально стрессированных самок происходит значительное сокращение времени иммобилизации и по этому показателю они приближаются к контрольным крысам, у которых этот показатель значимо не изменялся ни через сутки, ни через 10 суток после рестресса.

Рис.9 Депрессивноподобное поведение самок крыс, подвергнутых комбинированному стрессу с последующим рестрессом. 1- крысы в диэструсе, 2- 1 сут после рестресса, 3- 10 сут после рестресса и ведения физ.р-ра, 4- 10 сут после рестресса и введения кетансерина. Светлые столбики - контрольные самки, столбики со штриховкой - подопытные крысы. По оси ординат - время иммобилизации, сек. * - Достоверное (р<0,05) отличие от соответствующих крыс в диэструсе, # - достоверное (р<0,05) отличие между контрольными и пренатально стрессированными самками

Таким образом, в парадигме «стресс-рестресс» как контрольные, так и пренатально стрессированные самки крыс формируют устойчивое патологическое состояние, проявления которого в виде длительно сохраняющейся повышенной тревожности и наличия патологического торможения стрессорной активности ГАС соответствует признакам ПТСР у людей [Yehuda et al., 1993]. Однако если у контрольных животных развитие патологического состояния идет по тревожному типу, то у пренатально стрессированных самок крыс помимо высокой тревожности наблюдается и усиление депрессивноподобного поведения. Несмотря на то, что и контрольные и пренатально стрессированные самки демонстрируют патологическое торможение ГАС по механизму быстрой отрицательной обратной связи, у пренатально стрессированных крыс также наблюдается повышенная стрессорная реактивность системы, что может служить дополнительным патологическим фактором в ходе формирования у них данного состояния. Возможно, именно этим объясняется длительное до 140 дней сохранение патологической активности ГАС у пренатально стрессированных самок, которые были обнаружены в исследованиях Louvart с коллегами (Louvart et al., 2009). И хотя эти авторы использовали иную модель ПТСР, можно с уверенность заключить, что пренатальный стресс является фактором, не только увеличивающим предрасположенность к возникновению ПТСР, но и «утяжеляющим» патологические проявления этого заболевания.

ВЫВОДЫ

1. Влияние пренатального стресса на гормональные функции гипофизарно-адренокортикальной системы самок крыс зависит от возраста животных. Если у молодых пренатально стрессированных самок чувствительность гипофизарно-адренокортикальной системы к сигналам обратной связи повышена, то у старых животных эффективность торможения как базальной, так и стрессорной активности системы по механизму отрицательной обратной связи снижена.

2. Пренатальный стресс вызывает значительную модификацию функционального состояния гипофизарно-овариальной системы у самок крыс. У пренатально стрессированных молодых самок содержание прогестерона в крови повышено в стадию диэструс, а эстрадиола понижено в стадию эструс, и уровень эстрадиола не меняется в зависимости от стадии цикла. Возрастные изменения в уровне эстрадиола и состояния репродуктивных органов раньше проявляются у пренатально стрессированных животных, чем у контрольных самок.

3. Проявлением действия пренатального стресса на поведение самок в новой среде является снижение двигательной активности и увеличение уровня тревожности в стадию эструс. Пренатально стрессированные животные характеризуются также отсутствием различий в уровне активности на разных стадиях эстрального цикла. Возрастные изменения поведения у пренатально стрессированных самок проявляется в снижении, а у контрольных животных в повышении уровня тревожности.

4. После пренатального стресса у самок крыс активность центральных 5-ГТ2А/С - подтипов рецепторов серотонина в стадию эструс снижена. Активность 5-ГТ1А - подтипа рецепторов у пренатально стрессированных животных не изменяется. Вместе с тем воздействие стресса в пренатальный период развития приводит к нивелированию различий в активности этих рецепторов на разных стадиях эстрального цикла.

5. Пренатально стрессированные животные проявляют большую чувствительность к социальному стрессу, вызванному содержанием в переуплотненных группах в период пубертата, что проявляется в повышении базального уровня кортикостерона, нарушении длительности эстрального цикла и его отдельных стадий. При этом, находясь в изоляции, пренатально стрессированные самки демонстрируют более адаптивную реакцию по сравнению с контрольными животными, о чем свидетельствует не только сокращение общей длительности эстрального цикла, но и увеличение продолжительности эструса, что увеличивает вероятность наступления беременности.

6. В парадигме «стресс-рестресс» как контрольные, так и пренатально стрессированные самки крыс формируют патологическое состояние, проявляющееся в виде длительно сохраняющейся повышенной тревожности и патологического торможения активности гипофизарно-адренокортикальной системы. У контрольных животных развитие патологического состояния идет по тревожному типу, тогда как у пренатально стрессированных самок помимо высокой тревожности наблюдается усиление депрессивноподобного поведения, которое устраняется хроническим введением кетансерина - антагониста 5-ГТ2А/2С - подтипа рецепторов серотонина.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

СТАТЬИ:

1. Пивина С.Г., Шамолина Т.С., Акулова В.К., Ордян. Н.Э. Чувствительность к социальному стрессу у самок крыс с измененной стрессорной реактивностью гипофизарно-адренокортикальной системы // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова.- 2007. - Т. 93. № 11. - С. 1319-1325.

2. Шамолина Т.С., Пивина С.Г., Ордян Н.Э. Изменение активности гипофиз-адренокортикальной и репродуктивной систем пренатально стрессированных самок крыс в процессе старения // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. - 2009.- Т. 95. №. 9.- С. 984-992.

3. Шамолина Т.С., Пивина С.Г., Ордян Н.Э. Влияние социальной изоляции в период пубертата на репродуктивные функции и поведение пренатально стрессированных самок крыс // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. -2010.-Т. 96. №. 6. - С. 598-608.

4. Пивина С.Г., Ракицкая В.В., Шамолина Т.С., Ордян Н.Э. Изменение морфометрических характеристик матки крыс под действием пренатального стресса //Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова.- 2010.-Т. 96. №. 6.- С. 621-626..

ТЕЗИСЫ:

5. Шамолина Т.С., Пивина С.Г., Акулова В.К. Изменение чувствительности к социальному стрессу пренатально стрессированных самок крыс // Межинститутская конференция молодых ученых, посв. 100-летию акад. В.Н. Черниговского «Механизмы регуляции и взаимодействия физиологических систем организма человека и животных в процессах приспособления к условиям среды»: тезисы доклада. - Санкт-Петербург-Колтуши, 2007.- С.83

6. Пивина С.Г., Шамолина Т.С., Ордян Н.Э.Функциональные особенности гипофизарно-адренокортикальной системы у стареющих пренатально стрессированных самок крыс. // Всероссийский симпозиум с международным участием «Гормональные механизмы адаптации»: тезисы доклада. - Санкт-Петербург, 2007.- С. 63

7. Шамолина Т.С.Изменение активности гипофиз-адренокортикальной и репродуктивной систем пренатально стрессированных самок крыс в процессе старения. // Материалы одиннадцатой медико-биологической конференции молодых ученых «Человек и его здоровье»: тезисы доклада.- Санкт-Петербург, 2008.- С.372-373.

8. Шамолина Т.С. Изменение чувствительности к социальному стрессу у самок крыс с повышенной стрессореактивностью. // Материалы межвузовской конференции молодых ученых «Герценовские чтения»: тезисы доклада. - Санкт-Петербург, 2009. - С. 124-126.

9. Шамолина Т.С., Пивина С.Г. Изменение активности 5- ГТ2-рецепторов серотонина головного мозга у пренатально стрессированных самок крыс. // Материалы двенадцатой медико-биологическая конференция молодых ученых «Человек и его здоровье»: тезисы доклада. - Санкт-петербург, 2009. - С. 427-428.

10. Ордян Н.Э., Пивина С.Г., Шамолина Т.С., Акулова В.К., Галеева А.Ю. Нейроэндокринные аспекты действия материнского стресса на гормональные функции и поведение потомков. // Материалы международной научной конференции «Физиология развития человека»: тезисы доклада. - Москва, 2009. - С. 158.

11. Шамолина Т.С., Пивина С.Г., Ордян Н.Э. Социальное окружение в пубертатный период модифицирует эффекты пренатального стресса на уровень тревожности: экспериментальное исследование на животных. // Материалы международной научной конференции «Физиология развития человека»: тезисы доклада. - Москва, 2009. - С. 173.

12. Ordyan N., S. Pivina, T. Shamolina, J. Fedotova Prenatal stress increases an anxiety, and alters corticosterone response to 5-HT2A/C agonist in adult female offspring. // European Neuropsychopharmocology. V. 19 (Suppl. 3), 2009. S294. Papers of the 22 nd ECNP Congress. - Istanbul, Turkey, 2009.

13. Шамолина Т.С., Пивина С.Г., Федотова Ю.О., Ордян Н.Э. Влияние пренатального стресса на формирование депрессивноподобного состояния у самок крыс. // VIII Всероссийская конференция «Нейроэндокринология-2010»: тезисы докладов. - Санкт-Петербург, 2010. - С. 153.

14. Ордян Н.Э., Пивина С.Г., Федотова Ю.О., Шамолина Т.С., Галеева А.Ю. Синдром пренатального стресса и предрасположенность к возникновению тревожно-депрессивных расстройств: разработка подходов к фармакокоррекции. // Материалы 5-й Международной конференции «Биологические основы индивидуальной чувствительности к психотропным средствам»: тезисы доклада. - Москва, 2010.

15. Федотова Ю.О., Пивина С.Г., Шамолина Т.С., , Ордян Н.Э. Синдром пренатального стресса и предрасположенность к возникновению когнитивно-аффективных расстройств при дисбалансе эстрогенов. // XXI съезд физиологического общества им. И.П. Павлова: тезисы докладов. - Москва-Калуга, 2010. - С. 640.

16. Ордян Н.Э., Шамолина Т.С., Пивина С.Г., Федотова Ю.О. Изменение активности серотонинергической системы мозга как фактор риска возникновения тревожно-депрессивных расстройств у пренатально стрессированных самок крыс. // Обзоры по клинической фармакологии и лекарственной терапии. - 2010. - Т.8., №1.- С.57.

Размещено на Allbest.ru