Оценка информативности лабораторных показателей при хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр

Размещено на http://www.allbest.ru/

ОЦЕНКА ИНФОРМАТИВНОСТИ ЛАБОРАТОРНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ИНФЕКЦИИ, ВЫЗВАННОЙ ВИРУСОМ ЭПШТЕЙНА?БАРР

14.03.10 - клиническая лабораторная диагностика

14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

эпштейн барр инфекция

Горейко Татьяна Владимировна

Санкт-Петербург - 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России

Научные руководители: доктор медицинских наук профессор

КАЛИНИНА Наталия Михайловна

доктор биологических наук

Дрыгина Лариса Борисовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор

РАХМАНОВА Аза Гасановна

доктор медицинских наук профессор

СЕРЕБРЯНАЯ Наталия Борисовна

Ведущая организация: ФГВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова» Министерства обороны Российской Федерации

Защита состоится «22» сентября 2011 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России.

Автореферат разослан «___ » _________ 2011 г.

Учёный секретарь

диссертационного совета

кандидат медицинских наук М.В. Санников

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Инфицированность вирусом Эпштейна-Барр (ВЭБ) регистрируется во всем мире и охватывает около 90% населения (Самарин Д.В., 2008; Carville A. et al., 2008; Sargsyan S.A. et al., 2010). Литературные данные последних лет свидетельствуют о патогенетической значимости ВЭБ не только для детей, но и для взрослых (Алексеев А.В., 2009; Бацков С.С., 2011). Наряду с известной ролью ВЭБ в качестве возбудителя инфекционного мононуклеоза (ИМ), лимфомы Беркитта и носоглоточной карциномы доказан его вклад в развитие аутоиммунной патологии и синдрома хронической усталости (Ершов Ф.И., 2006; Исаков В.А., 2006; Долгих Т.И., 2011).

Наиболее частым типичным и хорошо изученным еще в 70-е годы ХХ века проявлением первичной инфекции, вызванной ВЭБ (ИВЭБ), является ИМ, возникающий в 50% случаев при инфицировании в юношеском или во взрослом возрасте (Тимченко В.Н., 2001; Иванова В.В. и соавт., 2004; Самарин Д.В., 2008). В качестве единственных лабораторных критериев диагностики ИМ служили появление атипичных мононуклеаров в клиническом анализе крови и неспецифических гетерофильных антител в реакции Пауля-Буннеля (Straus S.E. et al.,1993).

Хроническая персистирующая инфекция, вызванная ВЭБ (ХИВЭБ), практически не исследована (Малашенкова И.К. и соавт., 2007; Павленко О.А. и соавт., 2009). Принято считать, что ХИВЭБ имеет выраженные клинические проявления только на фоне тяжелой депрессии иммунной системы, например, при иммуносупрессивной терапии, синдроме приобретенного иммунодефицита (Алексеев А.В., 2009). Однако в последние годы наметился рост клинических проявлений ХИВЭБ у пациентов без тяжелой иммунной патологии. Об этом свидетельствует увеличение уровня заболеваемости ХИВЭБ (Бошьян Р.Е., 2009). Подобная динамика определяется с одной стороны, развитием иммунодепрессии, обусловленной неблагоприятными факторами внешней и внутренней среды (Исаков В.А. и соавт., 2006; Ruan J.L. et al., 2004; Son S.W. et al., 2009), с другой стороны, появлением новых методов лабораторной диагностики ИВЭБ (Долгих Т.И., 2010; Siennicka J. et al., 2007). Несмотря на то, что настороженность врачей различного профиля в отношении ХИВЭБ повысилась, своевременная диагностика с дифференцировкой стадий вирусной инфекции проводится не всегда. Это связано с тем, что клинические проявления ИВЭБ могут варьировать в зависимости от состояния иммунной системы, сочетанного вирусного инфицирования и других причин.

Открытым остается вопрос о том, можно ли рассматривать персистенцию ВЭБ в макроорганизме как форму своеобразного симбиоза, или она связана с индукцией иммунодефицитного состояния, механизмы которого продолжают изучать до настоящего времени. Отечественными и зарубежными учеными получены данные о ведущей роли иммунных механизмов в патогенезе ИВЭБ (Исаков В.А., 2006; Petrova M. et al., 2006; Holmoy T., 2008; Gulley. M.L et al., 2008; Bieging K.T. et al., 2009). Согласно современным представлениям, при ИВЭБ меняются параметры клеточного и гуморального иммунитета, динамика которых изучена только при острой форме инфекции. Практически отсутствуют данные по изменению показателей иммунной системы при латентной ИВЭБ, реактивации ХИВЭБ у взрослых.

Несмотря на появление новых лабораторных технологий, применяемых для установления ИВЭБ, до сих пор нет определенности в отношении диагностической ценности многих из них (Siennicka J. et al., 2007). Методы иммуноферментного анализа (ИФА) и различные варианты иммуноблоттинга (ИБ), которые в настоящее время стали использоваться при серологическом исследовании, различаются по спектру определяемых антигенных белков ВЭБ. В настоящее время не накоплен достаточный отечественный опыт по применению ИБ в диагностике ИВЭБ и определении стадий течения инфекции.

Значительный рост атипичных форм ИВЭБ среди взрослого населения, разнонаправленность мнений о причинах их возникновения, ограниченность данных о взаимосвязи показателей гуморального и клеточного звеньев иммунного ответа при ХИВЭБ, неопределенности при выборе метода выявления ВЭБ-инфекции и сложности при интерпретации результатов лабораторных исследований указывают на актуальность темы и служат основанием для проведения данного исследования.

Цель исследования: выявить особенности специфического гуморального и клеточного иммунного ответа при хронической персистирующей инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр для совершенствования алгоритма клинико-лабораторной диагностики.

Задачи исследования:

1. Определить диагностическую значимость выявления специфических антител к антигенам вируса Эпштейна-Барр у пациентов с хронической персистирующей инфекцией для установления стадии инфекционного процесса при использовании различных серологических методов.

2. Охарактеризовать особенности Т-клеточного звена иммунной системы, цитокинового статуса у пациентов с хронической инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

3. Провести сравнительный анализ параметров гуморального и клеточного иммунного ответа при хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

4. Выявить частоту сочетанной инфицированности герпесвирусами и охарактеризовать особенности параметров клеточного иммунитета.

5. Выделить группу наиболее информативных лабораторных показателей для диагностики хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Научная новизна. С использованием новых лабораторных технологий впервые охарактеризован специфический гуморальный иммунный ответ при хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Проведено определение параметров иммунной системы в отдаленные сроки после первичного инфицирования вирусом Эпштейна-Барр.

Установлена взаимосвязь параметров клеточного и гуморального иммунитета при различных фазах хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Охарактеризованы спектры специфических антител к белкам вируса Эпштейна-Барр в соответствии со стадией инфекционного процесса различными методами.

Теоретическая и практическая значимость. Уточнен иммунопатогенез хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр. Описаны на новом методическом уровне атипичные стадии инфекции, обусловленной вирусом Эпштейна-Барр. Охарактеризованы взаимоотношения вирус-хозяин при персистенции вируса Эпштейна-Барр.

На основании проведенного исследования выделена группа наиболее информативных лабораторных показателей для повышения качества диагностики ХИВЭБ и прогнозирования возможных осложнений. Даны рекомендации для практикующих врачей о возможностях использования современного серологического метода иммуноблоттинга. Предложены алгоритмы выявления атипичных стадий течения инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Обоснована необходимость комплексного исследования параметров Т- и В-клеточного иммунитета для определения различных вариантов течения хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Хроническая инфекция, вызванная вирусом Эпштейна-Барр, характеризуется тремя фенотипическими профилями гуморального иммунного ответа: наличием антител класса G к белкам VCA+NA в 71% случаев; VCA+NA+EA - 10%; VCA - 7%.

2. Метод иммуноблоттинга имеет более высокую диагностическую значимость при выявлении маркеров активации хронической ВЭБ-инфекции по сравнению с традиционными методами клинической лабораторной диагностики.

3. Наибольшую диагностическую значимость при определении стадии иммунного ответа при хронической персистирующей ВЭБ-ассоциированной инфекции имеет определение количества клеток СD3+, клеток с киллерным потенциалом - CD3+CD8+, CD3-CD(16+56)+, клеток, экспрессирующих HLA DR, В-лимфоцитов, продукция in vivo и in vitro IFN-б и IFN-г.

Личный вклад автора. Автором составлен дизайн исследования и проведен анализ результатов клинико-лабораторного обследования 345 больных с ХИВЭБ. Совместно со специалистами автор принимал участие в клиническом обследовании пациентов. В ходе выполнения работы проведен аналитический обзор современной отечественной и зарубежной литературы. Автором самостоятельно выполнены иммунохимические исследования, проведен статистический анализ полученных результатов, сделаны научные выводы.

Апробация работы. Материалы диссертационной работы представлены на национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология - практическому здравоохранению» (25-26 февраля 2010 г., Москва); Всероссийском конгрессе «Лабораторные технологии при организации медицинской помощи» (27 мая 2010 г., Москва); юбилейной 10-й научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, посвященная 125-летию основания СПбМАПО «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2010» (22 апреля 2010 г., Санкт-Петербург); межрегиональном форуме «Актуальные вопросы аллергологии и иммунологии - междисциплинарные проблемы» (27-30 сентября 2010 г., Санкт-Петербург); 11-й научно-практической конференции молодых ученых и специалистов, СПбМАПО «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины - 2011» (24 мая 2011 г., Санкт-Петербург); First European Joint Congress of EFCC and UEMS (13-16 October 2010, Lisbon, Portugal); 21st International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 19th IFCC-EFCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 8th Annual Meeting of the German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine (15-19 May 2011, Berlin, Germany).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 научных работ, из них 3 - публикации в изданиях, определенных перечнем ВАК Минобразования и науки РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 121 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа иллюстрирована 14 таблицами и 18 рисунками. Указатель литературы содержит 121 наименование, из которых 62 отечественные и 59 зарубежные.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Для решения задач исследования была сформирована группа пациентов с ХИВЭБ из 345 человек, которые проходили обследование и лечение в клинике ВЦЭРМ с 2008 год по 2010 год. Возраст обследованных пациентов находился в диапазоне от 22 до 69 лет (средний возраст 39,0 лет ±11,7 лет). Женщины составляли 57% (n=197), мужчины ? 43% (n=148).

В работу не включались лица с наличием симптомов острой ИВЭБ и атипичных лимфоцитов в крови, а также лица, имеющие сопутствующие аутоиммунные заболевания, клинические проявления и наличие лабораторных маркеров ВИЧ 1 и 2 типов, вирусных гепатитов, онкологических заболеваний, психические расстройства, больные после химио- или лучевой терапии.

Критериями отбора пациентов в группу ХИВЭБ являлось наличие жалоб: быстрая утомляемость, общая слабость, эмоциональная лабильность, депрессивные состояния, бессонница, головная боль, ознобы, дискомфорт в горле, боли в мышцах. При клиническом обследовании обращали внимание на увеличение лимфатических узлов, субфебрилитет, гиперемию зева. У некоторых больных имело место увеличение печени и селезенки (табл. 1).

Таблица 1

Клинические проявления у пациентов с ХИВЭБ

Клинические проявления	Количество, абсолютное	Количество, %
Астеновегетативный синдром	345	100
Поражения лимфоглоточного кольца	231	67
Периферическая лимфоаденопатия	162	47
Артралгия, миалгия, невралгия	131	38
Субфебрилитет	107	31
Гепатолиенальный синдром	41	12

Данные клинического обследования пациентов свидетельствовали о полиморфном и неспецифичном характере клинических проявлений, тем не менее, клинические проявления были стойкими.

В условиях клинической лаборатории пациентам проводилось:

§ определение специфических антител к белкам ВЭБ, вируса простого герпеса 1 и 2 типов (ВПГ1/2), цитомегаловируса (ЦМВ) методом ИФА;

§ определение молекулярных особенностей белков ВЭБ методом ИБ;

§ общий анализ крови;

§ определение субпопуляционного состава лимфоцитов;

§ определение содержания, спонтанной и индуцированной продукции интерферонов альфа (IFN-б) и гамма (IFN-г).

Для определения антител IgM к VCA p18, IgG к EBNA-1 p72 и EA p138 ВЭБ использовались коммерческие диагностические тест-системы «ВектоВЭБ-VCA-IgM», «ВектоВЭБ-NA-IgG» и «ВектоВЭБ-EA-IgG» производства ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ», Россия, IgG к VCA ВЭБ - «ДС-ИФА-АНТИ-ВЭБ-VCA-G» (ООО НПО «Диагностические системы», Россия). С помощью тест-системы «ДС-ИФА-АНТИ-ВЭБ-VCA-G - АВИДНОСТЬ» (ООО «НПО «Диагностические системы»», Россия) определялся индекс авидности IgG-VCA.

При проведении ИБ использовалась тест-система «Anti-EBV-Profile 2 EUROLINE (IgG)», разработанная фирмой «EUROIMMUN», Германия. В сыворотке крови одновременно выявлялись антитела IgG к пяти белковым антигенам ВЭБ с различной молекулярной массой: VCA gp125 - нативный белок, VCA p19 - рекомбинантный белок, EBNA-1 - рекомбинантный, p22 - рекомбинантный белок, EA-D - рекомбинантный. Для выполнения процедур ИБ использовалась автоматизированная система ProfiBLOT 48 («TECAN Austria GmbH», Австрия). Результаты ИБ обрабатывались при помощи компьютерной программы EuroLineScun в полуколичественном выражении.

Антител IgM к белкам ВПГ 1/2 определялись методом ИФА на тест-системе «ВектоВПГ-IgM» (ЗАО «ВЕКТОР-БЕСТ», Россия), IgM и IgG к ЦМВ и IgG к ВПГ 1/2 - иммунохемилюминесцентным методом на анализаторе Immulite 2000 («Siemens MSD», США).

Клинический анализ крови проводили с помощью гематологического анализатора Coulter LH500 («Beckman-Coulter», США).

Исследование клеточного звена иммунитета включало определение следующих субпопуляций лимфоцитов: CD3+ (Т-лимфоциты), CD3+СD(16+56)+ (Т-NK-клетки), CD4+ (Т-хелперы), CD3+CD8+ (T-киллеры), CD4+CD8+ (дубль-позитивные Т-клетки), СD3?CD8+ (активированные NK-клетки), СD3?СD(16+56)+ (NK-клетки), CD19+ (В-лимфоциты), CD25+ (рецепторы к ИЛ-2), лимфоциты экспрессирующие HLADR, лимфоциты, экспрессирующие маркер готовности к апоптозу (CD95). Рассчитывался иммунорегуляторный индекс CD4/CD8. Иммунофенотипирование клеток периферической крови осуществляли в многоцветном анализе методом проточной цитометрии на Cytomics FC500 («Beckman-Coulter», США).

Из параметров цитокинового звена иммунитета определялись содержание в сыворотке, спонтанная и индуцированная продукция IFN-б (ООО «Протеиновый контур», Россия) и IFN- (ООО «Цитокин», Россия) методом ИФА.

Статистическую обработку результатов исследования проводили с использованием пакета прикладных программ «Microsoft Excel 2007», «Statistica 6.0». Для проверки согласия с нормальным типом распределения использовали критерий Шапиро-Уилка W. Был использован метод описательной статистики с определением медианы показателей и интерквартильного размаха - [25; 75]. Для определения различий в двух группах использовали непараметрический U критерий Манна-Уитни. При сравнении нескольких групп проводился дисперсионный анализ Краскелла-Уоллиса и медианный тест, сравнение средних рангов для всех групп.

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ РАБОТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выявление специфических антител к антигенам вируса Эпштейна-Барр методом иммуноферментного анализа и иммуноблоттинга

Для подтверждения этиологии ВЭБ в возникновении симптомов заболевания у обследованных пациентов с подозрением на ХИВЭБ были использованы серологические методы исследования.

На первом этапе работы проведено полуколичественное определение продукции специфических IgG к капсидным (VCA), нуклеарным (NA) и ранним (EA) белкам ВЭБ в сыворотке пациентов (n=345) методом ИФА.

Обследование пациентов с ХИВЭБ не выявило антител класса M к капсидному белку VCA, что позволило исключить острую ВЭБ-инфекцию.

Частота определения антител IgG к VCA, NA и EA ВЭБ у обследованных пациентов представлены на рис. 1.

* ? различие с частотой выявления IgG к VCA и NA достоверно (р<0,001, Пирсон и хи-квадрат).

Рис.1. Частота выявления IgG к антигенам ВЭБ у пациентов с ХИВЭБ методом ИФА.

Показано, что у обследованных пациентов чаще выявлялись антитела класса G направленных к VCA и NA, чем к EA (p<0,001), что подтверждало наличие хронической ВЭБ-инфекции.

У обследованных пациентов антитела IgG к VCA выявлялись в 305 (88%) из 345 случае, а к NA ВЭБ - 320 (92%) из 345 пациентов с ХИВЭБ и были наиболее часто определяемыми серологическими маркерами.

Частота выявления IgG к раннему белку - EA, была достоверно ниже, чем IgG к NA и к VCA и составляла 10% (n=36).

Характеристика фенотипических профилей специфичекого гуморального иммунного ответа при ХИВЭБ представлена в табл. 2.

Таблица 2

Частота выявления различных профилей специфического гуморального ответа при ХИВЭБ

Профили антител к антигенам ВЭБ	Количество пациентов	Количество пациентов, %
VCA+NA	245	71%
VCA+NA+EA	36	10%
VCA	25	7%
NA	39	12%

Показано, что у пациентов с ХИВЭБ достоверно чаще выявлялось сочетание антител класса G к VCA и NA (p<0,001), что являлось отражением хронической персистенции вируса.

У 10% (n=36) пациентов были определены антитела к VCA, NA и EA. Появление в сыворотке антител класса G к этим белкам отражало активацию хронического процесса.

«Изолированное» выявление IgG к VCA регистрировалось в 7% случаев (n=25). Оценка стадии инфекционного процесса у этих пациентов не могла быть однозначной и требовала дополнительных диагностических подходов, позволяющих определять антитела к пептидам gp125, p22 и р19 VCA вируса.

В ходе исследования ни у одного из пациентов не было выявлено сочетание антител IgG к EA+VCA. Важно отметить, что данный профиль специфических антител ассоциирован с ВЭБ-связанными онкологическими заболеваниями (Gulley M.L. et al., 2008).

«Изолированное» выявление антител к NA в 12% можно интерпретировать как стадию перенесенного инфекционного процесса с «потерей» синтеза IgG к VCA (паст-инфекция) или элиминацию ВЭБ. Их определение имело ретроспективное значение.

Для установления или подтверждения инфекционного процесса с определением стадии жизненного цикла вируса у пациентов с наличием IgG к VCA при отсутствии IgG к NA был использован метод ИБ (n=25).

Среди пациентов с фенотипическим профилем специфического гуморального ответа VCA в 80% случаев выявлялись антитела IgG к VCA gp125 при соотношении gp125/p22>1, что свидетельствовало об обострении инфекции. Антитела IgG к VCA p19, маркера завершения обострения инфекционного процесса, были выявлены у 5 (20%) пациентов с ХИВЭБ.

Низкоавидные антитела IgG к VCA с индексом авидности меньше 60% были выявлены в 14% случаев (n=34) среди пациентов с профилем антител к VCA+NA, в 8% (n=3) с профилем антител к VCA+NA+EA. У пациентов с изолированным выявлением антител к VCA низкоавидные антитела не определялись. При использовании ИБ у всех пациентов с низким индексом авидности были обнаружены IgG к VCA р22 - маркеру давней ИВЭБ.

Для сравнения ИФА и ИБ из общей группы пациентов с ХИВЭБ методом случайно выборки были отобраны 80 человек (табл. 3).

Таблица 3

Сопоставимость методов ИФА и ИБ

Метод	Серологический маркер	Спектр вирусных белков	Класс антител	Результат
				«+»	«-»
ИФА	EA	р138	IgG	10 (12%)	70 (88%)
ИБ	EA	EA-D	IgG	21 (26%)	59 (74%)
ИФА	VCA	p18	IgG	66 (83%)	14 (17%)
ИБ	VCA	gp 125	IgG	65 (81%)	15 (19%)
		p19	IgG	66 (83%)	14 (17%)
		p22	IgG	59 (74%)	21 (26%)
ИФА	EBNA-1	p72	IgG	65 (81%)	15 (19%)
ИБ	EBNA-1	p79	IgG	61 (76%)	19 (24%)

Технология ИБ позволила установить наличие антител класса G к ранним белкам ВЭБ - EA-D у 21 пациента (26%). Таким образом, было показано, что диагностическая ценность выявления антител к ранним белкам ВЭБ методом ИБ в два раза выше, чем методом ИФА.

Представленные в табл. 3 данные указывают на сопоставимость методов ИФА и ИБ по выявлению антител класса G к VCA (83%). Преимущество метода ИБ заключалось в возможности выявления антител к вирусному капсидному антигену gp125 - маркер обострения инфекции, и р22 - маркер давности инфекционного процесса.

Положительные результаты IgG к EBNA-1 в ИФА (81%) превалировали над результатами IgG к EBNA-1 в ИБ (76%), однако различия были не достоверные. Установленные вариации результатов ИФА и ИБ объяснялись различием используемых в исследовании рекомбинантных вирусных антигенов - p72 и p79 и давали возможность полагать, что антитела направленные к EBNA-1 p72 продуцируются чаще, чем к EBNA-1 p79.

Таким образом, показана дополнительная диагностическая значимость метода ИБ при выявлении у пациентов только IgG к VCA методом ИФА. Метод ИБ является более чувствительным при реактивации ХИВЭБ. Использование индекса авидности IgG к VCA для определения давности инфекционного процесса не всегда является надежным. Альтернативой данному тесту может быть определение антител IgG к р22 вирусного белка VCA методом ИБ.

Характеристика показателей клеточного иммунного ответа пациентов с хронической инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна-Барр

Для характеристики особенностей иммунного ответа при ХИВЭБ у 345 пациентов были проанализированы показатели иммунной системы.

Количество лейкоцитов в крови у более 80% пациентов с ХИВЭБ находилось в пределах референтного интервала. Абсолютный лимфоцитоз и моноцитоз наблюдался у 69 и 76 пациентов с ХИВЭБ, что составляло 20,3% и 22,0%, соответственно, от всей обследуемой группы.

Результаты исследования субпопуляционного состава лимфоцитов представлены на рис. 2.



Рис. 2. Особенности параметров клеточного иммунитета у пациентов с ХИВЭБ.

У 26% обследованных пациентов было повышено абсолютное содержание клеток CD3+. При подсчете относительного содержания CD3+ лимфоцитов, увеличение количества отмечалось у 46,9% пациентов. Медиана и интерквартильный размах показателя в группе с ХИВЭБ составляли (76,0 [71,0; 79,0])%, что превышало значения установленного референтного интервала. Таким образом, при исследовании показателя относительного и абсолютного содержания CD3+ лимфоцитов у каждого четвертого пациента отмечалось повышение числа Т-клеток, преимущественно за счет Т-хелперов (Th).

37% пациентов характеризовалось снижением числа Т-киллеров. В связи с этим у 55,4% пациентов с ХИВЭБ отношение лимфоцитов CD4/CD8 увеличивалось. Медиана данного показателя составляла 1,8 [1,3; 2,4]. Наблюдалось увеличение доли CD3+CD4+ (Th) и снижения доли CD3+CD8+(T-киллеры) за счет миграции в очаг воспаления.

Имело место увеличение абсолютного содержания «дубль»-позитивных Т-клеток (CD4+CD8+) у 50% лиц с ХИВЭБ. Повышенное количество незрелых «дубль»-позитивных Т-клеток могло быть обусловлено значимой вирусной нагрузкой и свидетельствовало о наличии аутоиммунного компонента в характере иммунного реагирования, последнее подтверждалось увеличением числа пациентов с повышенным индексом соотношения CD4/CD8.

Изменения субпопуляционного состава лимфоцитов в группе пациентов с ХИВЭБ также характеризовались тенденцией к уменьшению абсолютного и относительного содержания CD3+CD8+(T-киллеры) и CD3-CD(16+56)+ (NK-клетки). Снижение количества клеток с киллерной активностью в периферической крови свидетельствовало либо о недостаточности цитотоксической активности врожденного и адаптивного иммунного ответа, либо о миграции этих клеток в очаг воспаления, у одной трети пациентов с ХИВЭБ. При этом у 20% пациентов наблюдалось увеличение количества CD3+CD(16+56)+ клеток, так называемых TNK-клеток эффекторов, обладающих свойствами, как Т-лимфоцитов, так и NK-клеток и играющих регуляторную роль в воспалительных процессах, ограничивая интенсивность иммунного ответа, а также аутоагрессию (Ярилин А.А., 2010).

Увеличение количества клеток, экспрессирующих низкоаффинный рецептор к IL-2 - CD25 наблюдалось в 19,4% случаев, что указывало на активацию и пролиферацию клеток у 19,4% обследуемых пациентов.

При проведении корреляционного анализа была выявлена достоверная умеренная взаимосвязь абсолютного содержания клеток CD25+ c абсолютным содержанием клеток CD3+CD4+ (p<0,05; rф=0,37). Связь абсолютного содержания клеток с CD25+ c клетками CD3+CD8+ была слабая - rф=0,17. Выявленные достоверные положительные корреляции указывали на активацию преимущественно Th.

При анализе субпопуляций, экспрессирующих «поздние» маркеры активации, выявлено увеличение количества клеток CD95+ у 12% пациентов и увеличение клеток HLA DR+ у 9,2% пациентов.

Количество В-лимфоцитов было снижено у 27% обследованных пациентов, что отличало острую ВЭБ-инфекцию от хронической. Снижение числа В-лимфоцитов у одной третьи пациентов с ХИВЭБ можно объяснить следующими причинами. Во-первых, происходит дифференцировка в антигенспецифические плазматические клетки-продуценты специфических антител, во-вторых, процессы апоптоза В-лимфоцитов превалируют над пролиферацией, в-третьих, происходит накопление В-клеток в периферических органах иммунной системы - лимфоузлах, селезенке, лимфоидных скоплениях.

Характеристика цитокиновой системы включала оценку спонтанной, индуцированной продукций и содержания в сыворотке IFN-б и IFN-.

Медиана показателей содержания в сыворотке IFN-б и медиана спонтанной продукции in vitro имела низкие значения, что указывало на отсутствие адекватного противовирусного ответа как in vivo (уровень в сыворотке), так и in vitro (клетки не были преактивированы в организме хозяина имеющейся ИВЭБ). Низкий уровень индуцированной продукции IFN-б свидетельствовал о снижении функциональной способности клеток отвечать на антигенный стимул.

Анализ показателей IFN- выявил, что у 71% пациентов с ХИВЭБ спонтанная продукция IFN- и у 51% пациентов содержание в сыворотке IFN- превышали референтные значения, отражая высокую функциональную активность Th1. Наблюдалась положительная корреляция (р<0,05; rф=0,35) содержания в сыворотке и спонтанной продукции IFN- и числом Т-киллеров, что свидетельствует об активации адаптивного иммунного ответа.

Таким образом, при обследовании пациентов с ХИВЭБ было установлено, что преобладал Th1 тип иммунного ответа, о чем свидетельствовали увеличение количества клеток CD3+CD4+ и высокая способность лейкоцитов к продукции IFN-. Вместе с тем, у пациентов с ХИВЭБ наблюдалось снижение количества клеток с киллерной активностью в периферической крови: CD3+CD8+ и CD3-CD(16+56)+.

Анализ показателей IFN-б выявил, что у всех пациентов с ХИВЭБ резкое снижение уровня сывороточного IFN-б сочеталось с существенным понижением индуцированной продукции IFN-б лейкоцитами, что указывало на депрессию этого звена иммунной защиты, а также являлось показанием для назначения терапии препаратами IFN-б.

Взаимосвязь показателей специфического гуморального и клеточного иммунитета у пациентов с хронической инфекцией, вызванной вирусом Эпштейна-Барр

На основании лабораторных данных пациенты с ХИВЭБ были разделены на группы.

Первую группу составили пациенты с хронической персистирующей инфекцией, вызванной ВЭБ (n=245), которые характеризовались наличием антител класса G к VCA и NA.

Вторую группу составили пациенты с реактивацией ХИВЭБ (n=20). У этих пациентов с помощью метода ИБ были определены антитела IgG к VCA gр125 и VCA р22.

Третью группу (n=39) составляли пациенты с паст-инфекцией, у которых были выявлены только IgG к NA.

Пациенты с реактивацией ХИВЭБ и наличием антител IgG к VCA, NA и EA составили четвертую группу (n=36).

При сравнении показателей клеточного иммунитета в четырех группах пациентов с ХИВЭБ, значения медиан относительного и абсолютного содержания моноцитов и лимфоцитов крови не имели достоверных различий. Пациенты второй группы, с обострением ХИВЭБ, характеризовались тенденцией к относительному лимфоцитозу, а значение медианы составило (38 [29; 46]) %.

Результаты исследования субпопуляционного состава лимфоцитов представлены в табл. 4.

Таблица 4

Показатели клеточного звена иммунной системы (медиана [нижний квартиль; верхний квартиль])

Показатель	1-я группа (n=245)	2-я группа (n=24)	3-я группа (n=39)	4-я группа (n=36)	Референтный интервал
CD3+, в мкл.	1500 [1210; 1756]	2060* [1704; 2333]	1594 [1329; 1951]	1234 [1090;1654 ]	950ч1800
CD3+, %	77 [71; 82]	76[72; 78]	77 [73; 79]	75 [69; 79]	52ч76
CD3+CD(16+56)+ , в мкл.	73 [45; 162]	108 [58;166]	85 [62; 199]	59 [40; 141]	5ч200
CD3+CD(16+56)+ , %	4,3 [2,3; 8,2]	3,6 [2,5; 5,3]	3,9 [2,7; 6,9]	3,8 [1,4; 4,7]	0,1ч8,0
CD3+CD4+, в мкл.	902 [752; 1064]	1339 [693; 1577]	939 [878; 1039]	781 [714;1244 ]	570ч1100
CD3+CD4+, %	47 [39; 53]	47 [41; 51]	43 [41; 53]	48 [46; 51]	31ч46
CD3+CD8+ (T-киллеры), в мкл.	485 [383; 677]	682 [554; 832]	669 [437; 823]	356* [300; 484]	450ч850
CD3+CD8+,%	25 [21; 31]	24 [23; 37]	26 [20; 35]	23 [18; 27]	23,0ч40,0
CD4+CD8+, в мкл.	17 [9; 33]	16 [9; 31]	12 [7; 24]	3* [2; 18]	5ч18
CD4+CD8+, %	0,8 [0,5; 1,5]	0,7 [0,3; 2,3]	0,4 [0,4; 1,2]	0,2* [0,1; 0,5]	0,1ч1,1
CD3-CD8+, в мкл.	81 [45; 110]	105 [67;135]	72 [48; 77]	75 [46;141]	18ч150
CD3-CD8+, %	4,2 [2,4; 6,6]	3,8 [2,4; 5,9]	2,7 [2,4; 3,9]	4,3 [2,8; 6,6]	1,5ч6,0
Соотношение D4/CD8	1,9 [1,3; 2,4]	2,0 [1,0; 2,2]	1,7 [1,2; 2,6]	2,2 [1,6; 2,9]	1,0ч1,7
CD3-(CD16+56)+, в мкл.	171** [115; 303]	370 [228; 594]	289 [245; 329]	174** [127; 255]	180ч420
CD3-CD(16+56)+, %	8** [6; 14]	15 [12; 17]	14 [10; 18]	9** [8; 14]	9ч19

*? значимое отличие от остальных групп (р<0,050; дисперсионный анализ Краскела-Уоллиса и медианный тест);

**? значимое отличие от 2-й и 3-й групп (р<0,050; непараметрический U критерий Манна-Уитни).

Наиболее многочисленная первая группа пациентов с ХИВЭБ, характеризовалась достоверным снижением относительного и абсолютного количества NK-клеток (CD3-CD16+56+), которые определяют эффективность противовирусного ответа.

У пациентов с обострением ХИВЭБ (вторая группа) отмечалось достоверное увеличение абсолютного числа CD3+ лимфоцитов, что связано, по всей вероятности, с активностью процессов пролиферации антигенспецифичных Т-клеток.

Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов у пациентов с паст-инфекцией (третья группа) выявила, что исследуемые показатели не выходили за пределы референтных значений. Этот факт являлся подтверждением, что NA, стимулировал выработку специфических антител, являющихся диагностическими маркерами паст-инфекции.

Четвертая группа пациентов с реактивацией ХИВЭБ характеризовалась сниженным количеством в периферической крови Т-киллеров и NK-клеток, что указывало на подавление противовирусного ответа.

Анализ количества В-лимфоцитов, которым конституционно присуща экспрессия HLADR, выявил разницу более чем в 5% между количеством клеток HLADR+ и содержанием В-лимфоцитов во всех группах пациентов с ХИВЭБ. Можно предположить, что маркеры поздней активации HLADR экспрессировались Т-лимфоцитами, что указывало на активацию в Т-клеточном звене. В большей степени активация наблюдалась у пациентов с реактивацией ХИВЭБ (VCA+NA+EA).

Сравнительный анализ показателей продукции IFN-б (табл. 13) выявил, что содержание в сыворотке и спонтанная продукция имели достоверно сниженные значения в первой группе пациентов с ХИВЭБ. Выявленное достоверное снижение количества NK-клеток в периферической крови пациентов с хронической персистирующей инфекцией совместно с достоверно низкими показателями продукции IFN-б in vivo и in vitro указывает на низкую противовирусную активность клеток иммунной системы. При реактивации ХИВЭБ в четвертой группе пациентов эти показатели были достоверно выше, чем в остальных группах, но не превышали референтных интервалов. Это указывало на отсутствие адекватной активации клеток ВЭБ. Не обнаружено достоверных различий между величинами индуцированной продукции IFN-б у пациентов с различными фазами ХИВЭБ, а средние показатели не превышали нижнюю границу референтного интервала (табл. 5).

Таблица 5

Характеристика показателей системы интерферонов у пациентов с ХИВЭБ (медиана [нижний квартиль; верхний квартиль])

Группа	IFN-б	IFN-
	Содержание в сыворотке (0?50)	Продукция	Содержание в сыворотке (0?50)	Продукция
		спонтанная (0?50)	индуци-рованная (100?500)		спонтанная (30?50)	индуци-рованная (1000?5000)
	пг/мл	пг/мл
1-я	2* [2;3]	2* [2; 7]	90 [50; 148]	54 [31; 120]	66 [34;128]	534 [335; 956]
2-я	4 [3; 11]	2 [2; 11]	101 [56; 161]	58 [46; 106]	279* [201;382]	799 [760; 1041]
3-я	7 [8; 22]	7[2; 26]	84 [50; 159]	42 [27; 113]	143 [41;280]	554 [319; 974]
4-я	16* [4; 32]	20* [6; 50]	58 [26; 120]	57 [47; 302]	91 [57; 150]	703 [416; 1079]

*? значимое отличие от остальных групп (р<0,005; непараметрический U критерий Манна-Уитни)

Во второй группе пациентов с обострением ХИВЭБ выявлено достоверное увеличение спонтанной продукции IFN-, что сочеталось с увеличением числа T-клеток. В связи с длительностью вирусной инфекции клетки, продуцирующие IFN- к моменту обследования были функционально истощены, и при их исследовании in vitro отмечалось снижение индуцированной продукции у 75% пациентов. В других группах продолжался вялотекущий с низкой иммуногенной активностью процесс, отражением которого явилось достоверное увеличение спонтанной продукции IFN-, но не столь значительное, как во второй группе пациентов с ХИВЭБ, что характерно для хронической инфекции.

Выявлялась сильная взаимосвязь между относительным количеством клеток CD3+CD16+CD56+ и спонтанной продукцией IFN- у пациентов третьей группы, что позволило предположить, что именно TNK-клетки вносят вклад в увеличение продукции IFN- (rф=0,87; р<0,05). Известно, что TNK-клетки выполняют регуляторную функцию, являясь основными продуцентами IFN-. Активация этих клеток свидетельствует о том, что при латентной вирусной инфекции (третья группа пациентов) снижение числа NK-клеток сопровождается подключением «резервного» звена противовирусной защиты.

В четвертой группе пациентов с ХИВЭБ определялась положительная корреляция между показателями продукции интерферонов и количеством клеток их продуцирующих. Выявленные статистически значимые корреляции отражали активацию моноцитов и клеток с киллерным потенциалом.

Влияние микстинфицирования герпесвирусами на показатели иммунного ответа

У пациентов с ХИВЭБ в 83% (n=286) были обнаружены антитела IgG к антигенам вируса простого герпеса 1 и 2 типа (ВПГ 1/2) и цитомегаловируса (ЦМВ), что свидетельствовало о частой ассоциации вирусов семейства Herpesviridae.

Специфические антитела IgM к антигенам ЦМВ и ВПГ 1/2 выявлены не были, что позволило исключить активное течение вирусной инфекции у пациентов.

Сочетание антител класса IgG к ВЭБ и ВПГ 1/2 встречалось в 9%, сочетание антител класса IgG к ВЭБ и ЦМВ - 6%. Моноинфекция, обусловленная ВЭБ встречалась крайне редко, была установлена у пяти человек (2%) молодого возраста (от 25 до 32 лет).

Была выявлена положительная корреляция уровня антител герпесвирусов (сумма индексов позитивности) от возраста (р=0,05; rф=0,37). Таким образом, возраст являлся предрасполагающим фактором формирования микстформ герпесных инфекций.

При проведении анализа изменения параметров клеточного звена иммунной системы при сочетанном инфицировании ВЭБ с ЦМВ и/или ВПГ 1/2 выявлено достоверное снижение относительного содержания лимфоцитов в группе пациентов с ХИВЭБ и наличием серологических маркеров ЦМВ относительно групп пациентов с наличием антител к ВПГ 1/2.

У пациентов с ХИВЭБ при наличии IgG к ЦМВ количество лимфоцитов составило (22,5 [19,5; 26,5]) % и не выходило за пределы референтного интервала ? 19ч37 %.

Полученные данные указывают на тенденцию к относительному лимфоцитозу среди пациентов с серологическими маркерами ВПГ 1/2 типов. У 30% обследованных пациентов с ХИВЭБ и наличием серологических маркеров ВПГ 1/2 был выявлен относительный лимфоцитоз, что указывает на активное влияние ВПГ 1/2 на иммунную систему (рис. 3).

* ? различия достоверны при р<0,05

Рис. 3. Относительное содержание лимфоцитов у пациентов с микст инфекцией

Результаты исследований не показали взаимосвязи между наличием микстинфекции и субпопуляционным составом лимфоцитов.

Содержание в сыворотке крови и спонтанная продукция IFN-б не превышали 50 мг/мл, и достоверно не различались у пациентов с различными формами герпесной микстифекции.

Индуцированная продукция IFN-б в группе пациентов с наличием антител к трем герпесвирусам составляла (86 [50; 198]) пг/мл и была больше, чем при герпесном микстинфицировании, обусловленном двумя вирусами: ВЭБ и ЦМВ ? (17 [14; 157]) пг/мл; ВЭБ и ВПГ ? (63 [2; 198]) пг/мл, однако достоверных различий не выявлено.

При оценке уровня IFN- у пациентов с микстинфекцией были выявлены достоверные различия показателей спонтанной продукции IFN-. Спонтанная продукция IFN-, отражающая преактивацию мононуклеаров персистирующими вирусами, при наличии антител к трем герпесвирусам составила (76 [37; 159]) пг/мл и была выше установленного референтного интервала.

У пациентов с ХИВЭБ в сочетании с антителами к ЦМВ или ВПГ 1/2 эта преактивация была незначительной и не проявлялась повышением спонтанной продукции IFN-.

У пациентов с ХИВЭБ и наличием антител к ЦМВ отмечались наименьшие показатели индуцированной продукции IFN- ? (374 [247; 385]) пг/мл (р<0,05).

Таким образом, на основании проведенных исследований охарактеризованы механизмы иммунной защиты у пациентов при различных фазах ХИВЭБ и выделена группа наиболее информативных лабораторных показателей, которые вошли в алгоритм диагностики ВЭБ-инфекции (рис. 4).

Рис. 4. Алгоритм лабораторной диагностики ВЭБ-инфекции.

ВЫВОДЫ

1. У пациентов с хронической ВЭБ-инфекцией достоверно чаще выявляются антитела класса IgG к нуклеарным EBNA-1 и капсидным белкам VCA (92% и 88%, соответственно); а антитела IgG к ранним антигенам EA - в 10% случаев. Специфический гуморальный иммунный ответ на хроническую ВЭБ-инфекцию в 71% случаев представлен VCA+EBNA-1; 12% - EBNA-1; 10% - VCA+EBNA-1+EA; 7% - VCA.

2. Использование метода иммуноблоттинга позволило в два раза чаще выявлять антитела к ранним антигенам, по сравнению с традиционным методом ИФА, при этом частота обнаружения ядерных и капсидных белков разными методами анализа была сопоставимой.

3. Методом иммуноблоттинга среди пациентов с профилем антител класса G к VCA в 80% случаев была установлена активация хронической ВЭБ-инфекции, которая характеризовалась наличием антител IgG к gp125 и соотношением gp125/p22>1.

4. Особенностью хронической персистирующей инфекции, характеризующейся специфическим гуморальным иммунным ответом, представленным антителами IgG к VCA+NA, является уменьшение абсолютного и относительного содержания NK-клеток и выраженное снижение продукции IFN-б, имеющие значение для определения тактики иммунотерапии.

5. При обострении хронической ВЭБ-инфекции, когда соотношение вирусных белков VCA gp125/p22>1, наблюдается активация Т-клеточного звена, проявляющаяся в увеличении абсолютного количества зрелых Т-лимфоцитов и спонтанной продукции IFN-.

6. Реактивация хронической ВЭБ-ассоциированной инфекции, которая характеризуется наличием антител класса G к VCA+NA+EA, отличается достоверным снижением в периферической крови клеток с киллерной активностью - CD3+CD8+ и CD3-CD(16+56)+.

7. Частота распространения IgG к ВПГ 1/2 и ЦМВ среди пациентов с хронической инфекцией, обусловленной вирусом Эпштейна-Барр составляет 98% и увеличивается с возрастом. При хронической микстинфекции, вызванной ВЭБ и ЦМВ отмечается значительное снижение индуцированной продукции IFN-.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для получения полноценной информации при клинико-лабораторной диагностике и дифференцировке стадий ХИВЭБ рекомендуется применять следующие подходы:

- на этапе определения наличия инфицирования ВЭБ использовать чувствительные методики (определение IgG к VCA и IgG к EBNA-1 методом ИФА);

- на этапе дифференцировки стадий ХИВЭБ использовать наиболее специфичные методики (IgG к отдельным антигенам ВЭБ методом ИБ).

2. Использование показателей IFN в комбинации (содержание в сыворотке, спонтанная продукция, индуцированная продукция) позволяет оценить напряженность системы интерферонов при ХИВЭБ.

3. На основании выявленных особенностей показателей специфического гуморального и клеточного иммунного ответа при ХИВЭБ, с учетом взаимосвязи различных звеньев иммунитета, а также возможностью использования метода ИБ были выделены наиболее информативные лабораторные показатели, которые вошли в алгоритм диагностики и дифференцировки стадий ХИВЭБ.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в научных изданиях по перечню ВАК Минобрнауки РФ

1. Горейко Т.В. Использование метода иммуноблотинга в диагностике хронической инфекции вируса Эпштейна-Барр / Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Мед.-биол. и соц.-психол. пробл. безопасности в чрезв. ситуациях. - 2010. ? №3. - С. 58-61.

2. Горейко Т.В. Комплексное изучение показателей специфического иммунного ответа и интерферонового статуса у пациентов с длительным субфебрилитетом, обусловленным вирус Эпштейна-Барр инфекцией / Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Российский аллергологический журнал. ? 2010. ? №1, вып.1. - С 51-52.

3. Горейко Т.В. Роль цитокинов в патогенезе хронической инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр / Т.В. Горейко, Н.М. Калинина, Л.Б. Дрыгина // Цитокины и воспаление ?2011. ? №4 - С. 50-54.

Статьи, тезисы докладов и статей

4. Горейко Т.В. Оценка информативности метода иммуноблотинга в диагностике вируса Эпштейна-Барр инфекции // Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сборник тезисов юбилейной научно-практической конференции молодых ученых 22.04.2010 г. - Санкт-Петербург: СПбМАПО, 2010. - С. 203-204.

5. Горейко Т.В. Возможности диагностики инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр / Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Лаборатория. ? № 2. - 2010. - С. 29.

6. Горейко Т.В. Современные представления об иммунопатогенезе инфекции, вызванной вирусом Эпштейна-Барр // Т.В. Горейко, Н.М. Калинина, Л.Б. Дрыгина // Инфекция и иммунитет. - Т.1, №2. - 2011. - С. 121-130.

7. Горейко Т.В. Влияние структуры герпес-вирусного микстинфицирования на показатели иммунного ответа / Т.В. Горейко, Л.Б. Дрыгина // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: сборник тезисов научно-практической конференции молодых ученых 24.05.2011 г. ? Санкт-Петербург: СПбМАПО, 2011. - С. 27-29.

8. Goreyko T.V. Interrelation between the cellular and specific humoral immune response in patients with a chronic Epstein?Barr virus infection / Т.V. Goreyko, L.B. Drygina // Abstract of First European Joint Congress of EFCC and UEMS «Laboratory Medicine in Health Care», 13-16 October 2010, Lisbon, Portugal . -P. 50.

9. Goreyko T.V. Chronic Epstein-Barr Virus infection in association with Herpes Simplex Virus types 1 and 2, Human Cytomagalovirus / Т.V. Goreyko, L.B. Drygina // Abstract of 21st International Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 19th IFCC-EFCC European Congress of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine, 8th Annual Meeting of the German Society of Clinical Chemistry and Laboratory Medicine 15-19 May 2011, Berlin, Germany. - P. 522.

Размещено на Allbest.ru

...