Маркеры тромбофилии при цереброваскулярных нарушениях

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Маркеры тромбофилии при цереброваскулярных нарушениях

14.00.46 - клиническая лабораторная диагностика

Ломакина Светлана Валерьевна

Санкт-Петербург - 2009



Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования Санкт-Петербургском государственном медицинском университете имени академика И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию и Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Клинической больнице № 122 имени Л.Г.Соколова Федерального медико-биологического агентства России», Санкт-Петербург

Научный руководитель: доктор медицинских наук профессор ПЕТРИЩЕВ Николай Николаевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор ПАПАЯН Людмила Петровна

доктор биологических наук профессор КРАВЦОВ Вячеслав Юрьевич

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная медицинская академия им. И.И.Мечникова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится «24» декабря 2009 г. в 15 часов на заседании диссертационного совета Д 205.001.01 при Федеральном государственном учреждении здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М.Никифорова» МЧС России по адресу: 194044, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д. 4/2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного учреждения здравоохранения «Всероссийский центр экстренной и радиационной медицины имени А.М. Никифорова» МЧС России.

Автореферат разослан « » ноября 2009 года

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат медицинских наук М.В. Санников



ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы

Сосудистые заболевания головного мозга являются одной из острейших медико-социальных проблем вследствие их большой распространенности, высокого риска развития опасных для жизни осложнений, трудной выявляемости на ранних этапах и малоэффективного лечения [Гусев Е. И., 2003; Воробьева О. В., 2007]. По количеству случаев смертности цереброваскулярные нарушения (ЦВН) занимают 2-е место и являются основной причиной инвалидности среди взрослого населения [Денисова Н.В. с соавт., 2006; Крылова В.Ю. с соавт., 2007]. Большую роль в развитии и течении цереброваскулярных нарушений играет наследственная и приобретенная склонность к тромбозам [Ельчанинов А.П., 2004; Khor B., 2009].

Тромбоз артерий головного мозга чаще всего возникает из-за аномалии сосудистой стенки на фоне атеросклероза и повышения активности тромбоцитов [Colman R., 2006]. Факторами риска венозного тромбоза являются повышенная свертываемость крови и стаз [Akhtar N. et al, 2006]. Нарушения мозгового кровообращения подразделяют на хронические (ХНМК) и острые (ОНМК).

В патогенезе ОНМК придается значение гемодинамическим факторам [Гусев Е. И. с соавт., 2001], морфологическим изменениям сосудов мозга [Скоромец А.А. с соавт., 2007, Folsom A.R., 1999], изменениям реологических свойств крови [Суслина З.А. с соавт., 2001]. Возникновение ХНМК связывают с церебральной микроангиопатией, вызываемой гипертонической болезнью и атеросклерозом [Крылова В.Ю. с соавт., 2007]. При этом обнаруживаются нарушения микроциркуляции, вплоть до развития микроциркуляторного блока [Гусев Е. И. с соавт., 2001], что обусловлено усилением внутрисосудистой агрегации тромбоцитов, повышением вязкости крови и дисфункцией эндотелия [Дамулин И.В., 2005, Ельчанинов А.П., 2004, Мчедлишвили Г.И., 2004].

Клетками-мишенями при артериальной гипертензии и атеросклерозе являются эндотелиоциты, участвующие в поддержании атромбогенности сосудистой стенки, регуляции адгезии и агрегации тромбоцитов и обладающие про-, антикоагулянтной и фибринолитической активностью. Дисфункция эндотелия играет важную роль в патогенезе тромбоза, внутрисосудистой активации тромбоцитов и т.д. [ Лутай М.И., 2004; Петрищев Н.Н.с соавт., 2007; Скоромец А.А. с соавт., 2007], и способствует развитию ЦВН. Особую актуальность в последнее время имеет изучение аннексина V, обладающего антикоагулянтными, противовоспалительными, антиапоптотическими свойствами и ингибирующего агрегацию тромбоцитов [Cederholm A. et al, 2007].

Вместе с тем, до сих пор остается проблемой лабораторная оценка дисфункции эндотелия при цереброваскулярных нарушениях у больных с ЦВН. гемостаз эндотелий мозговой кровообращение

Цель исследования: установить роль изменений в системе гемостаза и функциональной активности эндотелия в механизмах развития острых и хронических нарушений мозгового кровообращения для оптимизации лабораторной диагностики степени тяжести и исхода заболевания.

Задачи исследования:

1. Исследовать функциональную активность тромбоцитов при цереброваскулярных нарушениях. Выявить взаимосвязь функционального состояния тромбоцитов с показателями коагуляционного звена гемостаза и маркерами дисфункции эндотелия.

2. Проанализировать состояние коагуляционного звена гемостаза при цереброваскулярных нарушениях.

3. Определить диагностическое значение тканевого активатора плазминогена, ингибитора тканевого активатора плазминогена и аннексина V при оценке функционального состояния эндотелия у пациентов с ЦВН.

4. Оценить влияние антифосфолипидных антител и гипергомоцистеинемии на состояние тромбоцитарного, коагуляционного звеньев гемостаза и функцию эндотелия у пациентов с ЦВН.

5. Выявить взаимосвязь лабораторных показателей тромбоцитарного, коагуляционного звеньев гемостаза и дисфункции эндотелия с клиническими проявлениями ЦВН.

Научная новизна работы

В данной работе впервые проведено комплексное сравнительное исследование системы гемостаза - тромбоцитарного и коагуляционного звеньев, и маркеров дисфункции эндотелия в остром и хроническом периоде нарушений мозгового кровообращения. Установлено, что уровень аннексина V является диагностически значимым показателем дисфункции эндотелия у пациентов с ЦВН.

Впервые показано, что у пациентов с ОНМК и ХНМК существует взаимосвязь между уровнем тканевого активатора плазминогена, ингибитора тканевого активатора плазминогена и аннексина V и тяжестью клинического течения заболевания, что, повышает эффективность лабораторной оценки дисфункции эндотелия. Получены новые данные об однонаправленном изменении уровня гомоцистеина и содержания аннексина V, свидетельствующие об активации антикоагулянтных механизмов при повреждающем действии на эндотелий гомоцистеина у пациентов с ЦВН.

Научно-практическая значимость

В качестве прогностических лабораторных показателей исхода заболевания у пациентов с ОНМК в первые 24 часа острейшего периода показана целесообразность определения уровня аннексина V, тканевого активатора плазминогена и ингибитора тканевого активатора плазминогена.

У пациентов с ХНМК определение повышенного уровня аннексина V и концентрации D-димера позволяет дифференцировать степень тяжести дисциркуляторной энцефалопатии.

При ЦВН подтверждена низкая значимость скринингового теста активированного парциального тромбопластинового времени (АПТВ) для выявления гиперкоагуляционного состояния.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При ОНМК (по ишемическому типу) и ХНМК (по типу дисциркуляторной энцефалопатии) отмечается усиление внутрисосудистой активации тромбоцитов, увеличение концентрации D-димера и маркеров эндотелиальной дисфункции.

2. Значимые изменения в функциональном состоянии эндотелия у пациентов с ЦВН проявляются в повышении уровня тканевого активатора плазминогена, ингибитора тканевого активатора плазминогена 1 типа и, главным образом, аннексина V.

3. Повышенное содержание гомоцистеина в крови приводит к активации тромбоцитарного, коагуляционного звеньев гемостаза и дисфункции эндотелия.

Апробация работы

Результаты исследования были доложены на VI национальной конференции «Атеротромбоз и артериальная гипертензия» (Москва, 2001), научно-практической конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины» (Санкт-Петербург, 2005), XI межвузовской конференции молодых ученых «Актуальные проблемы патофизиологии» (Санкт-Петербург, 2005).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 научных работ, из них 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК Минобразования и науки РФ, остальные - в научно-практических журналах, материалах конференций.

Внедрение результатов в практику

Результаты диссертационной работы внедрены в учебный процесс на кафедре патофизиологии с курсом клинической патофизиологии СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова, используются в работе клинико-диагностической лаборатории ФГУЗ Клинической больницы № 122 им. Л.Г. Соколова ФМБА России г. Санкт-Петербурга.

Личный вклад автора

Автором самостоятельно выполнены лабораторные исследования системы гемостаза и функциональной активности эндотелия у пациентов с ЦВН, обработка и анализ полученных данных, сформулированы основные положения диссертации.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 190 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, выводов и практических рекомендаций. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 11 таблицами. Список литературы содержит 303 источника (56 отечественных и 247 зарубежных авторов).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материал и методы исследования

В ходе работы нами было обследовано 76 пациентов с цереброваскулярными нарушениями, находившихся на стационарном лечении в отделении неврологии ФГУЗ КБ N 122 им. Л.Г.Соколова ФМБА России. Больные были разделены на две группы - 1 группу составили пациенты с острым нарушением мозгового кровообращения - ОНМК по типу ишемического инсульта (ИИ), во вторую группу вошли больные с хроническим нарушением мозгового кровообращения - ХНМК по типу дисциркуляторной энцефалопатии (ДЭ) с артериальной гипертензией или без неё. Возраст обследуемых больных составил от 17 до 68 лет. Критериями исключения были: возраст старше 70 лет, наличие сахарного диабета, легочно-сердечная недостаточность с клиникой вторичной венозной энцефалопатии, либо кардиоцеребральной гипоксии. Диагноз основывался на данных клинического обследования, результатах компьютерной томографии и ультразвуковой допплерографии сосудов шеи и головного мозга в режиме дуплексного сканирования, лабораторных показателях. Лабораторное обследование больных с ОНМК проводили не позднее 24 часов после развития острой очаговой неврологической симптоматики.

Группа больных с ОНМК включала в себя 36 человек (24 мужчины и 12 женщин, средний возраст которых составил 55,3±10,6 лет) с атеротромботическим подтипом ИИ. Впервые ИИ перенесли 28 больных (77,7 %), а 8 пациентов (22,3 %) - повторный. Артериальная гипертензия на момент исследования выявлена у 20 пациентов (56%), церебральный атеросклероз - у 19 пациентов (53%). До госпитализации 25 пациентов (70%) принимали вазоактивные средства с ноотропным эффектом (кавинтон, инстенон, фезам и др.).

Группа пациентов с ХНМК составила 40 человек (18 мужчин и 22 женщины, средний возраст - 48,8±11,0 лет) с длительностью заболевания от 1 до 13 лет. Число больных с 1 стадией ДЭ составило 10 (25%) пациентов, 2 стадией - 30 (75%). Клиническая картина начальной стадии заболевания характеризовалась стойкой неврозоподобной симптоматикой, не исчезающей после полноценного отдыха, а для умеренно выраженной (2 стадии) - синдромом вертебро-базилярной недостаточности с цефалгиями, вертиго, мозжечковыми расстройствами, парестезиями в области лица, зрительными нарушениями, преходящей дизартрией. Артериальная гипертензия наблюдалась у 11 больных (28%), последствия ишемического инсульта - у 7 пациентов (18%). На момент включения в исследование все пациенты со 2-й стадией ДЭ принимали вазоактивные средства с ноотропным эффектом (кавинтон, инстенон, винпотропил и т.д.).

В группу контроля вошло 25 человек без цереброваскулярных нарушений, сопоставимых по возрасту и полу с обследуемыми больными. Для исключения структурного повреждения головного мозга у лиц контрольной группы была выполнена церебральная компьютерная томография.

Лабораторное обследование больных и пациентов контрольной группы проводили на базе ФГУЗ Клинической больницы N 122 им. Л.Г. Соколова ФМБА России г. Санкт-Петербурга. Объектом исследования явилась периферическая кровь, взятая из локтевой вены в утренние часы, натощак. У каждого пациента было получено информированное согласие на забор крови для исследования. Всего было проведено 1313 исследований, изучено 13 параметров.

Тромбоцитарное звено гемостаза оценивалось при помощи теста-агрескрин (экспресс-оценка с использованием универсального индуктора агрегации) и определения внутрисосудистой активации тромбоцитов (ВАТ) по методу А.С.Шитиковой (1992) - данная методика характеризует прижизненную морфологию тромбоцитов, определяемую с помощью фазово-контрастного микроскопа. При этом оценивается процент активных форм тромбоцитов - дискоэхиноцитов, сфероцитов и сфероэхиноцитов (референтные значения - до 18 % от общего числа тромбоцитов), количество тромбоцитов в агрегатах (до 7,4 %), число малых агрегатов (включающих 2-3 тромбоцита) и больших (по 4 и более тромбоцита) на 100 свободных тромбоцитов.

Для оценки коагуляционного звена гемостаза определялось активированное парциальное тромбопластиновое время (АПТВ), концентрация фибриногена - на коагулометре «Coag-A-Mate» фирмы «Organon Teknika», Голландия, использовали реактивы этой же фирмы. Количество D-димера исследовали иммуноферментным методом (набор «TECHNOZYM D-dimer ELISA», фирма «Technoclone») с помощью микропланшетного ридера ELx800, фирмы «BIO-TEK INSTRUMENTS», США; качественно определяли растворимые фибрин-мономерные комплексы («РФМК-тест», фирма «Технология-Стандарт», Барнаул).

Маркеры функционального состояния эндотелия (тканевой активатор плазминогена (t-PA) и аннексин V были исследованы при помощи иммуноферментного метода (тест-системы «Asserachrom t-PA» фирмы «Diagnostica Stago» и «human Annexin V» фирмы «Bender MedSystems», Австрия). Определение уровня ингибитора активатора плазминогена 1 типа - PAI-1 проводили колориметрическим методом с использованием хромогенных субстратов («PAI - Сhromogen», фирма «Diagnostica Stago», Австрия).

Для определения антифосфолипидных антител (АФА) волчаночного типа (ВА) применяли реагенты фирмы “Органон Техника” (Голландия): для скрининга ВА применяли тест «Viperquik LA-Test» с разведенным ядом гадюки Рассела (dRVVT), в качестве подтверждающего теста - «Viperquik LA-Check».

Антитела к кардиолипину (АКЛ) и аннексину V выявляли при помощи тест-систем для ИФА («Anti-Cardiolipin Screen» и «Anti-Annexin V» соответственно), фирма «Orgentec», Германия. Данные исследования проводили с помощью микропланшетного ридера ELx800, фирмы «BIO-TEK INSTRUMENTS», США.

Для определения уровня гомоцистеина в крови использовали метод иммунохемилюминесценции («Homocysteine», фирма «Bayer») и автоанализатор ACS 180, фирмы «Bayer», Германия.

Статистический анализ

Статистическая обработка результатов проведена с применением компьютерной программы Statistica 6.0 for Windows. Выявление связей между различными параметрами осуществляли на основе линейного корреляционного анализа - коэффициент корреляции Пирсона (r). Статистическая достоверность полученных результатов оценивалась с использованием непараметрического критерия Вилкоксона и Манна-Уитни. Характеристики выборок были представлены в виде среднего значения М ± стандартная ошибка m. Критический уровень достоверности нулевой статистической гипотезы р (об отсутствии значимых различий) принимали равным 0,05.

Результаты исследования и их обсуждение

Функциональная активность тромбоцитов у больных с цереброваскулярными нарушениями

Активация тромбоцитов, возникающая при контакте с поврежденной стенкой сосуда, при высоком напряжении сдвига циркулирующей крови, под влиянием биологически активных веществ, является одним из факторов риска тромбоза сосудов. Проявлением активации тромбоцитов является изменение их формы и повышение агрегации в циркулирующей крови [Davi G. et. аl., 2007]. При использовании метода морфологической оценки внутрисосудистой активации тромбоцитов у больных с ЦВН обнаружено достоверное увеличение суммы активных форм тромбоцитов, числа тромбоцитов в агрегатах и самих агрегатов (табл.1).

Учитывая однонаправленные изменения внутрисосудистой активации тромбоцитов, можно предположить, что активация кровяных пластинок является характерным изменением в системе гемостаза как при острой, так и при и хронической форме нарушений мозгового кровообращения.

Между показателями активных форм тромбоцитов и уровнем гомоцистеина выявлена прямая корреляционная связь как при ОНМК (r=0,55, р<0,05), так и при ХНМК (r=0,47, р<0,05). Эти данные подтверждают влияние гипергомоцистеинемии (концентрация гомоцистеина выше 15 мкмоль/л) на активацию тромбоцитарного звена системы гемостаза у пациентов с ЦВН. Усиление внутрисосудистой активации тромбоцитов при ОНМК сопровождалось повышением уровня D-димера (r=0,40, p<0,05), что указывает на тромбин-зависимый механизм активации тромбоцитов у данных пациентов.

Таблица 1. Показатели внутрисосудистой активности тромбоцитов в контроле и исследуемых группах, (М±m)

Показатель	Контроль n=25	ОНМК n=36	ХНМК n=40
Сумма активных форм тромбоцитов, (%)	14,8±0,5	21,2 ± 1,2*	23,8 ± 1,8 *
Число тромбоцитов в агрегатах, (%)	6,1 ±0,3	8,1 ±0,3*	10,8 ±0,9*
Число малых агрегатов Число Больших агрегатов	2,5 ±0,2	3,9 ± 0,2*	4,9 ± 0,3*
	0,14 ± 0,03	0,30 ± 0,05*	0,50 ± 0,14*

Таким образом, частота выявления патологических результатов ВАТ при острой и хронической формах нарушения мозгового кровообращения (в 75% и в 63% случаев соответственно) и абсолютные значения сумм активных форм тромбоцитов свидетельствуют о гиперактивации тромбоцитарного звена гемостаза у данных пациентов. Возможно, повышенная активность тромбоцитов являлась фоном, на котором развились нарушения мозгового кровообращения. В то же время нельзя отрицать и вероятность активации тромбоцитов при прохождении крови через ишемизированные участки мозга.

Состояние коагуляционного звена системы гемостаза у больных с цереброваскулярными нарушениями

Определение АПТВ позволяет оценить участие факторов внутреннего пути свёртывания крови в образовании теназного и протромбиназного комплексов. По нашим данным, уровень АПТВ не имел достоверных различий как между группами больных с ОНМК и ХНМК, так и между пациентами с ЦВН и лицами контрольной группы (р>0,05). Таким образом, мы подтвердили низкую значимость данного теста при цереброваскулярных нарушениях.

Гиперфибриногенемия (увеличение концентрации фибриногена свыше 4 г/л) является одним из неспецифических проявлений реакции системы гемостаза при стрессе и, по многочисленным данным, тесно коррелирует с риском развития многих сосудистых заболеваний, в том числе атеросклероза [Зубаиров Д.М., 2000, Dong Q.L. et al., 2004]. Фибриноген является белком острой фазы и повышение его концентрации может отражать степень гиперкоагуляции. Результаты нашего исследования подтверждают зависимость уровня фибриногена от остроты процесса, так как при ОНМК содержание фибриногена в плазме было достоверно выше (4,0±0,19 г/л), чем при ХНМК (3,2±0,14 г/л, р<0,01), что, по-видимому, связано с активацией симпато-адреналовой системы при остром нарушении мозгового кровообращения и увеличением образования провоспалительных цитокинов. Причиной общего невысокого уровня фибриногена и отсутствия статистически значимых отличий у пациентов с ЦВН от контрольного уровня (3,8±0,1 г/л, р>0,05) может быть усиление внутрисосудистого свертывания крови при данном заболевании, что подтверждается повышением в обеих исследуемых группах концентрации D-димера.

Одним из маркеров активации системы гемостаза является D-димер - специфический продукт образования и лизиса фибрина. Концентрация D-димера в плазме крови более 250 нг/мл (при количественном определении иммуноферментным методом) свидетельствует об активации фибринолиза, которому предшествует усиление коагуляционного каскада с избыточным образованием нерастворимого фибрина [Баркаган З.С., Момот А.П., 2001, Папаян Л.П. с соавт., 2002].

По нашим данным, при острой форме нарушений мозгового кровообращения содержание D-димера (600,7±23,7 нг/мл) более чем в два раза превышало уровень, зарегистрированный в контрольной группе (265,2±81,6 нг/мл). Несколько меньший подъем уровня D-димера зафиксирован при ХНМК, однако, и в этом случае его показатели достоверно отличались от контрольных значений (525,9±31,9 нг/мл, р<0,05). Частота выявления повышенной концентрации D-димера составила 100% при ОНМК, и 85% - при ХНМК.

Уровень D-димера между исследуемыми группами статистически значимо различался (р<0,05), что свидетельствует о более активном фибринолизе и предшествующей активации коагуляционного каскада при ОНМК по сравнению с ХНМК. Данные различия могут быть связаны с наличием выраженной стресс-реакции при ОНМК и атеротромбозе.

Наличие в плазме растворимых фибрин-мономерных комплексов (РФМК) также рассматривается как показатель тромбинемии. Растворимые фибрин-мономерные комплексы были выявлены у 83% пациентов с ОНМК и у 76% - с ХНМК. В контрольной группе РФМК обнаружены у 2 (8%) пациентов.

Таким образом, наши данные о содержании D-димера и РФМК свидетельствуют об активации свертывания крови у больных с ЦВН, более выраженной при острой форме нарушений мозгового кровообращения, чем при хронической.

Оценка функционального состояния эндотелия

Об изменении функциональной активности эндотелия свидетельствует содержание в крови факторов, образующихся в эндотелии - t-PA, PAI-1 (оба фактора влияют на фибринолиз) и аннексина V [Петрищев Н.Н. с соавт., 2007]. Угнетение фибринолиза рассматривается как независимый фактор риска инсульта [Tanne D., et al, 2006]. В немногочисленных исследованиях также подчеркивается патогенетическая роль нарушения фибринолитической активности и при хронической ишемии мозга [Ельчанинов А.П., 2004].

Основным физиологическим активатором плазминогена является тканевой активатор плазминогена, часть которого находится в свободном (активном) состоянии, а основное количество связано с ингибитором активатора плазминогена и находится в виде неактивного циркулирующего комплекса. В ходе проведенного исследования антигена t-PA значимых отличий его уровней между больными обследуемых групп не выявлено (р>0,05). При этом, повышение уровня антигена t-PA у пациентов с ЦВН отражало степень повреждения эндотелия, достоверно отличаясь от содержания антигена t-PA в плазме крови контрольной группы (р<0,05). (табл. 2). При острой форме ЦВН повышенные значения антигена t-PA (>12 нг/мл) встречались несколько чаще (в 67% случаев), нежели при ХНМК (в 60% случаев). Полученные результаты могут говорить о компенсаторном повышении антигена t-PA в ответ на активацию свертывания крови. В то же время, повышение его уровня свидетельствует об ускоренном внутрисосудистом образовании фибрина из-за тромбинемии, так как t-PA специфически связывается с фибрином [Зубаиров Д.М., 2000].

Так, установленная прямая корреляционная связь между уровнем антигена t-PA и D-димера у пациентов с ОНМК (r=0,45, р<0,05) и с ХНМК (r=0,50, р<0,05) может свидетельствовать о неблагоприятном прогнозе течения ЦВН из-за одновременно происходящих активации свертывания и дисфункции эндотелия. Выявленная прямая корреляционная зависимость между уровнем антигена t-PA и концентрацией гомоцистеина у пациентов с ОНМК (r=0,61, р<0,05) отражает значительные изменения функциональной активности эндотелия в условиях гипергомоцистеинемии.

Наиболее физиологически значимым ингибитором тканевого активатора плазминогена является PAI-1, синтезируемый преимущественно в клетках эндотелия. Увеличение его синтеза и секреции способствует подавлению фибринолитической активности крови и увеличивает риск тромбоза. Повышение данного показателя отмечалось нами у 50% больных при ОНМК и у 55% - при ХНМК. При сравнении показателей ингибитора активатора плазминогена в группах обследуемых больных статистически значимых отличий нами не выявлено - при ОНМК уровень PAI-1 составил 11,0±0,6 Ед/мл; при ХНМК - 10,6±0,5 Ед/мл (р>0,05). Полученные средние значения находятся выше верхней границы референтных показателей (до 10 Ед/мл) и достоверно выше уровня PAI-1 в контрольной группе (6,9±0,3, р<0,05)(табл.2).

Таблица 2. Уровень антигена t-PA и PAI-1 у пациентов с ЦВН и контрольной группе, M±m

Показатель	Контрольная группа n=25	ОНМК n=36	ХНМК n=40
антиген t-PA, нг/мл	7,3±0,3	12,7 ± 0,6*	12,5 ± 0,5*
PAI-1, Ед/мл	6,9±0,3	11,0 ± 0,6*	10,6 ± 0,4*



Таким образом, при ЦВН нами обнаружено повышение уровня антигена t-PA и PAI-1, что указывает на дисфункцию эндотелия, причем этот процесс в равной степени происходит при ОНМК и ХНМК. Вместе с тем известно, что PAI-1 способен ингибировать апоптоз [Макацария А.Д. и соавт., 2006], поэтому его повышение может также являться защитным механизмом, предотвращающим дальнейшее тромбообразование за счет снижения прокоагулянтной активности эндотелия.

Для оценки функционального состояния эндотелия мы также определяли в плазме крови содержание аннексина V. При повреждении эндотелия и апоптозе происходит высвобождение в кровь внеклеточной формы аннексина V, обладающего антикоагулянтными свойствами [Петрищев Н.Н. с соавт., 2007]. По нашим данным, ни у одного пациента с ОНМК не было выявлено показателей аннексина V, укладывающихся в референтные значения (0,5-1,0 нг/мл), при хронической форме патологии - у 95% пациентов отмечалось повышение уровня аннексина V. При том, что у пациентов с ЦВН выявлено значимое повышение концентрации аннексина V по сравнению с данными контрольной группы (0,84±0,10 нг/мл, р<0,05), нами не обнаружено достоверных различий в его уровне между группами больных - при ОНМК уровень аннексина V в крови составил 3,43±0,10 нг/мл, при ХНМК - 3,24±0,12 нг/мл (р>0,05). Наши результаты определения уровня аннексина V согласуются с данными литературы, свидетельствующими об увеличении его содержания при цереброваскулярных нарушениях [Kaneko N. et al., 2003, Cederholm A. et al., 2007]. Отсутствие статистически значимых отличий в уровне аннексина V при острой и хронической формах нарушения мозгового кровообращения, может говорить об универсальной защитной реакции организма на повреждение эндотелия.

Выявленная прямая корреляционная зависимость между уровнем аннексина V и антигеном t-PA у пациентов с ОНМК (r=0,51, p<0,05) отражает значительное изменение функционального состояния эндотелия у данной группы больных. Прямая корреляция между уровнем аннексина V и содержанием D-димера у пациентов с ОНМК (r=0,42, p<0,05) свидетельствует о связи процессов повреждения эндотелия с активацией свертывания крови.

Следует подчеркнуть, что степень увеличения аннексина V (в среднем, в 3 раза выше верхней границы референтных значений) и то, что увеличение наблюдалось практически у всех больных, в отличие от контрольной группы, свидетельствует о ярко выраженной системной дисфункции эндотелия, проявившейся в равной степени как при острой, так и при хронической форме. При этом значительный подъем уровня аннексина V у пациентов с ЦВН может носить компенсаторный характер, так как аннексин V снижает тромбогенность клеток эндотелия за счет связывания фосфатидилсерина и ингибирования апоптоза.

Принимая во внимание повреждающее воздействие на эндотелий повышенного уровня гомоцистеина, мы исследовали концентрацию аннексина V при гипергомоцистеинемии, и обнаружили значимую прямую связь этих показателей при остром и хроническом нарушении мозгового кровообращения (r=0,59 и r=0,73 соответственно, р<0,05), что подтверждает роль гипергомоцистеинемии в усилении повреждения эндотелия при ЦВН.

Одним из факторов риска ишемических нарушений мозгового кровообращения, связанных с повреждением эндотелия, является наличие в крови антител к отрицательно заряженным мембранным фосфолипидам [Arnoux D. et al., 2000]. Нами было проведено определение наличия волчаночного антикоагулянта (ВА), антител к кардиолипину и аннексину V. По нашим данным, наличие ВА (по результатам скринингового и подтверждающего тестов) отмечалось в 42% случаев при ОНМК и в 38% - при ХНМК. Показатели скринингового теста определения ВА при ОНМК (43,5±1,2 сек.) и ХНМК (42,1±1,1 сек.) были практически одинаковы, при этом достоверно отличались от показателей контрольной группы (40±0,99 сек., р<0,05) (табл. 3). Кроме того, время образования сгустка в скрининговом тесте определения ВА у обследованных пациентов было взаимосвязано с концентрацией D-димера (r=0,44 при ОНМК и r=0,45, p<0,05 при ХНМК), что свидетельствует о влиянии ВА на активацию свертывания.

Как известно, аутоантитела к кардиолипину присутствуют и в крови здоровых людей (в концентрации до 10 МЕ/мл), однако повышение их уровня влечет за собой изменения в системе гемостаза, вызывая повреждение эндотелиальных клеток сосудов и способствуя возникновению тромбозов и тромбоэмболий.

Повышенное содержание АКЛ отмечалось у 17% пациентов с ОНМК и у 15% - с ХНМК, при этом уровень АКЛ у пациентов с ОНМК (6,8± 0,4 МЕ/мл) и ХНМК (7,0±0,5 МЕ/мл) был достоверно выше, чем в контроле (4,7±0,2 МЕ/мл, р<0,05) (табл.3), однако не выходил за верхнюю границу референтных значений. Наши результаты совпадают с данными литературы об отсутствии связи повышенного уровня АКЛ с риском возникновения ишемического инсульта [Ahmed E. et al, 2000, Van Goor M.P. et al., 2004]. В то же время, повышение уровня АКЛ напрямую связано с гипергомоцистеинемией при ОНМК (r=0,54, р<0,05), что говорит о сочетанном повреждении эндотелия данными факторами у больных с ЦВН.

Увеличение концентрации антител к аннексину V может способствовать возникновению тромбоза за счет разрушения «защитного поля» аннексина V на поверхности фосфолипидов [Gaspersic N. et al., 2003]. Частота выявления данного вида антител составила 39% при ОНМК и 55% - при ХНМК. У лиц контрольной группы уровень антител к аннексину V в нашем исследовании составил 7,5±0,4 Ед/мл, что достоверно не отличалось от содержания антител к аннексину V у пациентов с ОНМК и ХНМК (табл.3) и укладывалось в диапазон референтных значений (до 8 Ед/мл).

Таблица 3. Сравнительная характеристика антифосфолипидных антител у пациентов с ЦВН и лиц контрольной группы, M±m

Показатель	Контрольn=25	ОНМК n=36	ХНМК n=40
Волчаночный антикоагулянт, сек.	40 ± 1,0	43,5 ± 1,2*	42,1 ± 1,1*
Антикардиолипиновые антитела, МЕ/мл	4,7 ± 0,2	6,8 ± 0,4*	7,0 ± 0,5*
Антитела к аннексину V, Ед/мл	7,5 ± 0,4	7,7 ± 0,6	8,1 ± 0,3

Таким образом, результаты определения АКЛ и ВА позволяют предположить их роль в патогенезе ЦВН, как дополнительных факторов риска. Отсутствие статистически значимых отличий в уровне антител к аннексину V между обследованными пациентами и контрольной группой свидетельствует о том, что изменение функционального состояния эндотелия не связано с синтезом данного вида антител.

Одним из факторов, повреждающих эндотелий, является гипергомоцистеинемия [Петрищев Н.Н. с соавт., 2007, Скворцова В.И., 2003, Ridker P.M. et al., 2002]. В то же время, в литературе подчеркивается, что не всегда существует cвязь повышенного уровня гомоцистеина с инсультом и хроническим нарушением мозгового кровообращения [Ельчанинов А.П., 2004, Хунтеев Г.А. и соавт, 2001].

В ходе определения концентрации гомоцистеина у 25% пациентов с ОНМК и у 13% - с ХНМК обнаружены показатели, превышающие верхнюю границу референтных значений (5-15 мкмоль/л). Уровень гомоцистеина у пациентов обеих групп статистически значимо не различался (составив 13,6±0,6 мкмоль/л при ОНМК и 12,5±0,5 мкмоль/л при ХНМК), но был достоверно выше по сравнению с контрольными значениями (9,1±0,3 мкмоль/л, р<0,05). Максимальная концентрация гомоцистеина у пациентов с ОНМК достигала 19 мкмоль/л, а у пациентов с ХНМК - 19,6 мкмоль/л. При этом, у пациентов с ОНМК, имевших уровень гомоцистеина выше 15 мкмоль/л, была выявлена прямая корреляционная взаимосвязь между гипергомоцистеинемией и содержанием D-димера (r=0,68, р<0,05), аннексина V (r=0,59, р<0,05), ВАТ (r=0,59, р<0,05) и tPA (r=0,61, р<0,05), что свидетельствует о влиянии гомоцистеина на продукцию эндотелием данных факторов. У больных с ХНМК данные корреляционные зависимости были выражены слабее.

Был осуществлен мониторинг состояния пациентов по окончании лечения в стационаре. У 8 (22 %) пациентов с ОНМК на 21 сутки после начала заболевания клинические проявления не исчезли (неврологический дефицит регрессировал не полностью), в связи с чем они были направлены на длительное (до 1 месяца) долечивание в специализированные санатории. Уровень аннексина V (3,78±0,12 нг/мл), t-PA (14,2±0,7 нг/мл) и PAI-1 (12,8±0,8 Ед/мл) у таких больных, имевших неблагоприятное течение заболевания, на момент обследования был достоверно повышен (р<0,05) по сравнению с аналогичными параметрами у пациентов, выписанных на амбулаторное лечение (3,33±0,10 нг/мл, 12,3±0,7 нг/мл и 10,0±0,7 Ед/мл соответственно). Полученные данные уровня аннексина V могут быть связаны с его поступлением из очага ишемического поражения, определяющего тяжесть состояния пациентов. Кроме того, при самых высоких уровнях аннексина V (от 4,03 до 4,10 нг/мл) у пациентов с ОНМК отмечалось наиболее длительное пребывание в стационаре (от 23 до 47 койко-дней). Также, у пациентов с неблагоприятным течением ИИ выявлена сильная корреляционная взаимосвязь уровня t-PA и D-димера - 0,65 (р<0,05), что свидетельствует об одновременном изменении функционального состояния эндотелия и активации свертывания.

При ХНМК выявлена сопряженность степени повышения уровня аннексина V и D-димера с тяжестью клинического течения заболевания. При 1 стадии ДЭ уровень аннексина V и D-димера составил 2,81±0,20 нг/мл и 404,5±49,1 нг/мл соответсвенно, тогда как при 2 стадии ДЭ наблюдалось повышение уровня аннексина V до 3,39±0,12 нг/мл и концентрации D-димера до 566,3±36,4 нг/мл.

Также, у пациентов со 2 стадией ДЭ о нарушении функционального состояния эндотелия говорит прямая корреляционная взаимосвязь между содержанием антигена t-PA и уровнем PAI-1 (r=0,42, р<0,05). У пациентов с 1 стадией подобной закономерности не обнаружено.

Выявленные клинико-лабораторные связи у обследованных пациентов могут свидетельствовать о патогенетической роли дисфункции эндотелия как провоцирующего и отягчающего фактора в возникновении и прогрессировании цереброваскулярных нарушений.



ВЫВОДЫ

1. У пациентов с ЦВН повышение внутрисосудистой активности тромбоцитов свидетельствует о гиперактивации тромбоцитарного звена системы гемостаза, наиболее выраженной при гипергомоцистеинемии. Активация тромбоцитов положительно коррелирует с уровнем D-димера у пациентов с ОНМК, что говорит о более выраженной генерации тромбина у данных больных.

2. Существует связь между патологическими значениями маркеров активации свертывания и нарушениями мозгового кровообращения, при этом выраженность тромбинемии ассоциирована с остротой заболевания. Наличие корреляционной взаимосвязи между концентрацией D-димера и уровнем гомоцистеина отражает участие данного фактора повреждения эндотелия в активации свертывания крови.

3. Проведенные лабораторные методы показали достоверное увеличение уровня антигена t-PA и PAI-1 у больных с ЦВН, что свидетельствует об изменении функционального состояния эндотелия. При ОНМК содержание данных факторов на момент исследования было достоверно повышено у пациентов с последующим неблагоприятным течением болезни.

4. Достоверное повышение уровня аннексина V, отмеченное в обеих группах пациентов с ЦВН, указывает на значительное повреждение эндотелия. Как при ОНМК, так и при ХНМК установлена сопряженность степени повышения уровня аннексина V с тяжестью клинического течения заболевания. Выявленная корреляционная связь между уровнем аннексина V и содержанием tPA у пациентов с ОНМК подтверждает роль аннексина V как маркера дисфункции эндотелия у данных больных.

5. При ЦВН антифосфолипидные антитела являются дополнительным фактором повреждения эндотелия. Роль волчаночного антикоагулянта в механизме активации свертывания подтверждается положительной корреляцией его уровня с содержанием D-димера.

6. Сравнительный анализ проведенных лабораторных тестов свидетельствует о более выраженной активации системы гемостаза и дисфункции эндотелия у пациентов с ОНМК, по сравнению с больными с ХНМК.

Практические рекомендации

Результаты исследования предназначены для использования специалистами в области клинической лабораторной диагностики, врачами неврологами в медицинских учреждениях.

1. У пациентов с ОНМК в первые 24 часа в качестве прогностических лабораторных показателей необходимо определение уровня аннексина V, t-PA и PAI-1, являющихся ранними биохимическими маркерами дисфункции эндотелия.

2. При хроническом нарушении мозгового кровообращения в качестве лабораторного критерия степени тяжести дисциркуляторной энцефалопатии целесообразно определение уровня аннексина V и D-димера.

3. Полученные данные о содержании D-димера у пациентов с острыми и хроническими нарушениями мозгового кровообращения позволяют считать его тестом первой линии для оценки активации свертывания у данных больных.

4. Определение АФА и уровня гомоцистеина можно использовать в качестве дополнительного диагностического показателя для прогнозирования риска возникновения цереброваскулярных нарушений.



СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи в периодических научных изданиях, рекомендованных ВАК

1. Ломакина С.В. Механизмы тромбофилии при цереброваскулярной недостаточности / С.В. Ломакина, А.П. Ельчанинов // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2006. - № 2. - С.12 - 15.

2. Ельчанинов А.П. Сцинтиграфическая картина гепатолиенальной системы у нейрососудистых больных с антифосфолипидной активностью гемостаза / А.П. Ельчанинов, С.В. Ломакина, А.В. Артюшкин // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. - 2009. - № 2(30). - С.34-39.

Другие публикации

3. Ельчанинов А.П. К вопросу тромбогенного эффекта волчаночного антикоагулянта при церебральных проявлениях первичного антифосфолипидного синдрома / А.П. Ельчанинов, С.В. Ломакина // Современные подходы к диагностике и лечению нервных и психических заболеваний: Материалы междунар. конф. - СПб., 2000. - С.291 - 292.

4. Ельчанинов А.П. Генетические полиморфизмы и волчаночный антикоагулянт как факторы риска дисциркуляторной энцефалопатии в молодом возрасте / А.П. Ельчанинов, С.И. Капустин, О.В. Сироткина, С.В. Ломакина, М.Н. Блинов, Е.И. Шварц // Инсульт. - 2002. - №5. - С.37 - 42.

5. Ломакина С.В. Показатели системы гемостаза при дисциркуляторной энцефалопатии / С.В. Ломакина // Актуальные вопросы клинической и экспериментальной медицины: Сб. тез. к науч. - практ. конф. молодых ученых. - СПб., 2005. - С.420 - 421.

6. Ломакина С.В. Аннексин V как маркер сосудистой тромбофилии / С.В. Ломакина // Материалы XI межвуз. конф. молодых ученых. - СПб., 2005. - С.31 - 33.

7. Ломакина С.В. Место волчаночных антикоагулянтов в диагностике антифосфолипидного синдрома / С.В. Ломакина // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2005. - Прил. № 1(13). - С.110 - 111.

8. Ломакина С.В. Эффективность морфофункциональной оценки внутрисосудистой активации тромбоцитов (ВАТ) в диагностике тромбозов и эмболий / С.В. Ломакина // Вестн. Рос. Воен.-мед. акад. - 2005. - Прил.№ 1(13).- С. 111.

Размещено на Allbest.ru

...