Asp299Gly поліморфізм гена TLR-4 та антиендотоксиновий імунітет у хворих з різними запальними фенотипами бронхіальної астми в популяції Автономної Республіки Крим

Размещено на http: //www. allbest. ru/

Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця

Asp299Gly поліморфізм гена TLR-4 та антиендотоксиновий імунітет у хворих з різними запальними фенотипами бронхіальної астми в популяції Автономної Республіки Крим

Ю.А. Бісюк, кандидат медичних наук,

доцент кафедри клінічної імунології та алергології

Науковий рецензент доктор медичних наук,

професор Заруцький Я.Л.

Резюме

Вивчено поліморфізм Asp299Gly гену TLR-4 у 331 пацієнта з бронхіальною астмою. Контрольну групу склали 285 практично здорових осіб АР Крим. Для аналізу поліморфізму Asp299Gly гена TLR-4 був використаний метод алель-специфічної полімеразної ланцюгової реакції з електрофоретичної детекцією. Ризик розвитку еозинофільної бронхіальної астми в популяції АР Крим пов'язаний з превалюванням генотипів AG і GG поліморфної ділянки Asp299Gly гену TLR-4. У пацієнтів з бронхіальною астмою спостерігається гіперпродукція антиендотоксінових антитіл класів М, G і sCD14 в індукованому мокротинні. Для малогранулоцитарного фенотипу БА і AG + GG генотипу характерно збільшення рівня sCD14 в сироватці в порівнянні з АА.

Ключові слова: бронхіальна астма, ендотоксин, Asp299Gly поліморфізм TLR-4.

Бронхіальна астма (БА) є гетерогенним захворюванням дихальних шляхів, у патогенезі якого чільне місце посідає хронічне запалення [6]. Існують переконливі докази, що розподіл астми на запальні фенотипи дозволить більш ефективно призначити лікування, наприклад, тільки у пацієнтів з еозинофільною астмою доказана ефективність моноклональних антитіл, які блокують ІЛ-5 [11].

Хронічне запалення при нейтрофільній і еозинофільній астмі тісно пов'язано з дією ендотоксину грам негативних бактерій [3].

Відомо, що надмірна експозиція ендотоксину має проективний ефект на розвиток бронхіальної астми [4], хоча інші автори вказують на протилежний ефект [8], що, можливо, пов'язано з поліморфізмом генів, що кодують рецептори до ендотоксину.

Ген рецептора Toll like receptor 4 (TLR-4) до ендотоксину розташований у хромосомі 9q32-33. Поліморфна ділянка Asp299Gly (rs4986790) гену TLR4 є однонуклеотидною заміною аденіну (А) на гуанін (G) у положенні +896 экзона 3, що призводить до амінокислотної заміни аспарагінової кислоти (Asp) на гліцин (Gly) в 299 положенні поліпептидного ланцюга рецептора [12].

У мета-аналізі, що був заснований на 12 дослідженнях випадок-контроль із залученням 1838 пацієнтів з БА та 1764 контролю, не вдалося віднайти значної гетерогенності між дослідженнями та визначити істотний зв'язок між Asp299Gly поліморфізмом і астмою [13].

Необхідно зазначити, що при проведенні численних мета-аналізів аналізується лише загальний пул хворих на астму і практично не вивчаються можливі зв'язки з урахуванням розподілу пацієнтів на клінічні фенотипи або патофізіологічні ендотипи.

У популяції АР Крим дослідження з вивчення поліморфізму Asp299Gly гену TLR-4 та його зв'язку із станом антиендотоксинового імунітету у пацієнтів з різними запальними фенотипами БА не проводилося.

Мета дослідження - вивчити поліморфізм Asp299Gly гену TLR-4 та стан антиендотоксинового імунітету у пацієнтів з різними запальними фенотипами БА в популяції АР Крим.

Матеріали та методи дослідження. Для дослідження поліморфізму Asp299Gly гену рецептора TLR-4 у популяції Криму брали участь тільки пацієнти та добровольці, які народилися в даному регіоні.

У дослідженні брав участь 331 хворий на БА. Діагноз та лікування БА проводили відповідно до критеріїв діючого наказу МОЗ України № 128 від 19.03.2007 р.

Запальні фенотипи визначали за допомогою підрахунку процентного співвідношення клітин (макрофаги, еозинофіли, нейтрофіли, епітеліоцити) в індукованому мокротинні. Критерії запальних фенотипів: нейтрофільний - кількість нейтрофілів більше 76%, еозинофілів менше 3%; еозинофільний - кількість нейтрофілів менше 76%, еозинофілів більше 3%; малогранулоцитарний - кількість нейтрофілів менше 76%, еозинофілів менше 3% [10].

Рівні антиендотоксинових антитіл класів А, М, G (відповідно анти-ЭТ-IgA, анти-ЭТ-IgM і анти-ЭТ-IgG) у сироватці та секреторного антиендотоксинового імуноглобуліна А (анти- ЭТ-sIgA) в індукованому мокротинні визначали методом твердо фазного імуноферментного аналізу за протоколами, розробленими в лабораторії клінічної імунології ЦНДІ ДУ «Кримський державний медичний університет імені С .1. Георгієвського» [1, 2]. Рівні анти-ЭТ- sIgA, анти-ЭТ-IgM і анти-ЭТ-IgG виразили в умовних одиницях оптичної щільності кінцевого продукту ферментативної реакції.

Рівень sCD14 в сироватці та індукованому мокротинні визначали методом твердофазниго імуноферментного аналізу з використанням тест-системи «Hbt Human sCD14 ELISA Kit, Product Number: HK320» виробництва «Hycult biotechnology» (Нідерланди). Оптичну щільність визначали аналізатором «StatFax 2100» на довжині хвилі 450 нм. Вміст sCD14 в сироватці виражали у мкг/мл, в індукованому мокротинні - унг/мл.

Для аналіза поліморфізму гену TLR-4 (Asp299Gly) було застосовано метод аллель-специфічної полімеразної ланцюгової реакції з електрофоретичною детекцією. Виділення ДНК здійснювалося із цільної крові пацієнтів з БА і здорових добровольців за допомогою набору «ДНК-експрес кров» («Литех», РФ) згідно з інструкцією виробника. Постановка аллель - специфічної ПЦР здійснювалась за допомогою наборів «Мутаія толл-подібного рецептора 4 Asp299Gly, rs4986790» («Литех», РФ) згідно з інструкцією виробника.

Групу контроля для генетичного дослідження склали 285, а для оцінки антиендотоксинового імунітету 92 практично здорових осіб АР Крим. Усі волонтери досліджувалися на предмет алергічної патології шляхом вивчення анамнезу і проведення шкірних алерготестів. Для проведення шкірних «прик» тестів застосовували алергени виробництва «Імунолог», м. Вінниця.

Всі отримані результати були статистично оброблені для параметричних і непараметричних критеріїв з використанням програми «Minitab 16». При аналізі перевірки розподілу на нормальність застосовували тест Колмогорова-Смірнова, порівняння центральних тенденцій двух незалежних виборок з використанням U-критерія Манна-Уітні та порівняння середніх двох незалежних виборок за критерієм Ст'юдента. Кількісні змінні представлені у вигляді середніх значень та середньоквадратичних відхилень для параметричних методів і медіани з 1 і 3 квартилем для непараметричних. Для встановлення розподілу генотипів відповідно до закону Харді-Вайнберга застосовували точковий тест Фішера і ч2. Для визначення різниці у частоті генотипів і аллелей контроля і хворих на БА була використана логічна регресія за допомогою on-line калькулятора.

У нашій роботі ризик за аллелю G мали на увазі домінантну модель G, коли частота генотипу AG об'єднується з генотипом GG і порівнюється з генотипом АА. Підрахунок частоти аллеля А проводили за наступною формулою: частота аллеля

A = nAAx2+nAG,

де nAA - кількість досліджених з генотипом АА, nAG- кількість досліджених з генотипом AG; для аллеля G використовувалась аналогічна формула: : частота аллеля

G = nGGx2+nAG,

где nGG -- кількість досліджених з генотипом GG, nAG - кількість досліджених з генотипом AG.

Для всіх пацієнтів і волонтерів отримана письмова згода на участь у науковому дослідженні, на яке є дозвіл комісії з біоетики ДУ «КДМУ імені С.І. Георгієвського».

Результати дослідження та їх обговорення. За результатами підрахунку клітин в індукованому мокротинні у 60 пацієнтів було встановлено нейтрофільний, у 143 -- еозинофільний і у 128 паучигранулоцитарний запальний фенотип БА. Данні за розподілом частоти генотипів (Asp299Gly) у пацієнтів з нейтрофільною БА і здорових волонтерів представлені в таблиці 1.

Таблиця 1 Частота розподілу генотипів TLR-4 (Asp299Gly) у пацієнтів з нейтрофільною БА і здорових волонтерів

У контрольній групі (таблиця 1) частота розподілу генотипів (AA -- 242 (85 %), AG -- 40 (14 %), GG -- 3 (1%)) достовірно не відрізнялась від нейтрофільної БА (AA -- 51 (85%), AG -- 9 (15%), GG -- 0, ч2 = 0,664, Р = 0,717). Порівняння досліджуваних груп з використанням моделі «Ризик по аллелю G», а також різниці частот аллелей не виявило достовірних розбіжностей (p>0,05), що вказує на відсутність зв'язку поліморфізму Asp299Gly з ризиком розвитку нейтрофільної БА.Данні про розподіл частоти генотипів еозинофільною БА і здорових волонтерів TLR-4 (Asp299Gly) у пацієнтів з представлені в таблиці 2.

Таблиця 2 Частота розподілу генотипів TLR-4 (Asp299Gly) рецептора у пацієнтів з еозинофільною БА і здорових волонтерів

Частота розподілу генотипів (табл. 2) у пацієнтів з еозинофільною БА (AA - 108 (76 %), AG - 32 (22 %), GG - 3 (2%)) мала тенденцію до достовірної відмінності порівняно з контрольною групою (AA - 242 (85 %), AG - 40 (14 %), GG- 3 (1%), ч2 = 5,708, Р = 0,058). Ризик по аллелю G виявив, що у пацієнтів з еозинофільною БА частота зустрічаємості генотипу AG+GG (24 %) достовірно вище (ВШ = 1,824, ДІ = [1,106-3,009] ч2 = 5,63, p = 0,018) контролю (15 %). Для даного фенотипу БА (табл. 2) порівняно з контролем також були встановлені достовірні розбіжності (ВШ = 1,745, ДІ = [1,107-2,752] ч2 = 5,86, p = 0,016) у різниці частоти аллелей. Розподіл частоти генотипів TLR-4 (Asp299Gly) у пацієнтів з малогранулоцитарною БА і здорових волонтерів представлені в табл. 3.

Таблиця 3 Частота розподілу генотипів TLR-4 (Asp299Gly) рецептора у пациєнтів з малогранулоцитарною БА і здорових волонтерів