Разработка и стандартизация комплексного растительного средства, рекомендуемого для профилактики и лечения нарушений микрофлоры кишечника

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

РАЗРАБОТКА И СТАНДАРТИЗАЦИЯ КОМПЛЕКСНОГО РАСТИТЕЛЬНОГО СРЕДСТВА, РЕКОМЕНДУЕМОГО ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И ЛЕЧЕНИЯ НАРУШЕНИЙ МИКРОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА

Клыш Екатерина Александровна

Самара - 2011

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет» Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научный руководитель:

Доктор фармацевтических наук Пупыкина Кира Александровна

Официальные оппоненты:

Доктор фармацевтических наук Лякина Марина Николаевна

Доктор биологических наук,

профессор Шаталаев Иван Федорович

Ведущая организация:

Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН

Защита состоится «17» мая 2011 г. в 10⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета Д 208.085.06 при ГОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации по адресу: 443079, г.Самара, пр. К. Маркса, 165 Б.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России (г. Самара, ул. Арцыбушевская, 171).

Автореферат разослан «___» апреля 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат фармацевтических наук,

доцент И.К. Петрухина

1. Общая характеристика работы

Актуальность темы. В настоящее время наблюдается рост числа заболеваний, связанных с нарушением биологического равновесия между макроорганизмом, то есть человеком, и разнообразными популяциями микробной флоры его отдельных органов и систем, сложившегося в процессе эволюции. Одним из распространенных заболеваний, связанных с нарушением микрофлоры кишечника является дисбактериоз, который выявляется у 75 - 90% пациентов с острыми, хроническими гастроэнтерологическими заболеваниями и практически у всех пациентов с острыми кишечными инфекциями (Парфенов А.И. и др., 2002; Григорьев П.Я. и др., 2004). При длительном дисбактериозе, в результате прогрессирующей потери основных нутриентов, развиваются как общие метаболические расстройства, так и нейрогуморальные нарушения. В патологический процесс вовлекаются пищеварительные органы функционально и топографически связанные с кишечником (желудок, поджелудочная железа, желчные пути), а затем и органы других систем организма, что значительно затрудняет диагностику и лечение дисбактериоза (Барановский А.Ю. и др., 2002). Сформировавшиеся дисбактериозы кишечника трудно поддаются коррекции и для полной нормализации микрофлоры, восстановления эубиоза требуется длительное время.

В терапии заболеваний пищеварительной системы широко используются лекарственные растения, но этого нельзя сказать о дисбактериозах кишечника, часто сопровождающих заболевания данной группы. При этом следует учитывать, что фитотерапия может быть эффективно использована для санации от условно-патогенной микрофлоры, так как лекарственные растения в большинстве своем являются кишечными эубиотиками, уничтожающими патогенную и сохраняющими сапрофитную микрофлору. Недостаточно изучены в клинической практике возможности комплексного лечения нарушений микрофлоры кишечника с применением препаратов растительного происхождения, которые обладают мягкостью действия, низкой токсичностью и могут применяться длительно без существенных побочных явлений. Перспективным является использование многокомпонентных растительных сборов и лекарственных форм на их основе, которые могут повысить надежность ожидаемого лечебного эффекта. Однако, их ограниченный ассортимент среди разрешенных к применению лекарственных растительных средств, ставит актуальным вопрос о разработке и внедрении в практическую медицину новых многокомпонентных растительных средств, обладающих поливалентностью действия.

Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является разработка комплексного растительного средства в виде сбора, экстракта сухого и драже для профилактики и лечения заболеваний, связанных с нарушениями микрофлоры кишечника.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

- обосновать и разработать рациональный состав многокомпонентной растительной композиции;

- провести фармакогностическое изучение сбора, определить показатели подлинности и доброкачественности, разработать методики количественного определения основных групп биологически активных веществ;

- разработать способ получения экстракта сухого из сбора, провести постадийный контроль производства экстракта по действующим и экстрактивным веществам, определить технологические характеристики и показатели качества;

- разработать способ получения кишечнорастворимой лекарственной формы на основе экстракта сухого, определить критерии подлинности и показатели качества;

- провести валидационную оценку методик количественного определения основных групп биологически активных веществ в сборе и лекарственной форме;

- изучить фармакологическую активность разработанных растительных средств при экспериментально моделированном дисбактериозе кишечника;

- разработать нормативную документацию на сбор и лекарственную форму.

Научная новизна. Разработан и обоснован рациональный состав исходной растительной композиции, включающий девять видов лекарственного растительного сырья, разрешенного для применения в медицине, обеспечивающий фармакотерапевтическую активность при экспериментально моделированном дисбактериозе.

С учетом подобранных оптимальных условий и изучения выхода биологически активных веществ на различных стадиях технологического процесса разработан способ получения экстракта сухого и на его основе кишечнорастворимой лекарственной формы в виде драже со стабильными физическими и технологическими показателями.

Изучен качественный состав и количественное содержание биологически активных веществ в растительной композиции, экстракте сухом и лекарственной форме с использованием современных физико-химических методов (хроматографических, хроматомасс- и атомно-адсорбционной спектрометрии). Определены критерии подлинности, показатели качества, необходимые для стандартизации растительной композиции, экстракта сухого, драже и разработаны методики количественного определения в них суммы флавоноидов в пересчете на рутин и дубильных веществ.

Методами фармакологических исследований установлена безопасность и эффективность применения разработанных растительных средств с профилактической и лечебной целью при экспериментально моделированном дисбактериозе кишечника. Приоритет и новизна исследований подтверждены патентом РФ № 2332226 «Сбор лекарственных растений для профилактики и комплексного лечения дисбактериоза кишечника» и заявкой на изобретение №2010123631 «Драже с растительным экстрактом для профилактики и комплексного лечения дисбактериоза кишечника».

Практическая значимость работы. На основании проведенных исследований составлены проекты фармакопейных статей на сбор для профилактики и комплексного лечения дисбактериоза кишечника и драже на основе экстракта сухого из сбора; технические условия на экстракт сухой (ТУ № 9168-007-26795008-2003).

Результаты исследований по определению подлинности многокомпонентной растительной композиции, установлению показателей качества и методик определения содержания основных групп биологически активных веществ внедрены в учебный процесс кафедр фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии; фармацевтической химии с курсами аналитической и токсикологической химии; фармацевтической технологии с курсом биотехнологии Башкирского государственного медицинского университета, а также работу ООО «Травы Башкирии»; методики количественного определения суммы флавоноидов и дубильных веществ в разработанных средствах апробированы в ГУЗ«Республиканский центр контроля качества и сертификации лекарственных средств» Республики Башкортостан (акты внедрения).

Основные положения, выносимые на защиту:

- результаты исследований по разработке и обоснованию растительной композиции, ее фармакогностическому изучению, установлению показателей подлинности и доброкачественности, необходимых для стандартизации;

- результаты исследований по подбору оптимальных условий экстракции сбора, разработке способа получения экстракта сухого и на его основе кишечнорастворимой лекарственной формы в виде драже, определению критериев подлинности и показателей качества;

- результаты разработки методик количественного определения биологически активных веществ в сборе, лекарственной форме и валидации методик анализа;

- результаты изучения фармакологической активности разработанных средств.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены на научно-практических конференциях (Уфа 2006, 2008, 2009, 2010; Пермь 2007,2010); научном конгрессе «Традиционная медицина» (Москва, 2007); VII Международном симпозиуме «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования» (Пущино, 2007); II Российском фитотерапевтическом съезде и международном форуме «Интегративная медицина» (Москва, 2010).

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Башкирского государственного медицинского университета по проблеме «Изыскание и изучение новых лекарственных средств» и является фрагментом исследований кафедры фармакогнозии с курсом ботаники и основ фитотерапии (номер государственной регистрации № 01200707996).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 21 научная работа, из них в журналах, рекомендуемых ВАК - 3 статьи, 1 патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 151 странице машинописного текста, содержит 49 таблиц, 34 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы «Объекты и методы исследования», трех глав экспериментальной части, выводов и списка литературы, включающего 209 библиографических источников, из которых 18 - иностранных и приложений.

Во введении обоснована актуальность темы, сформулированы цель и задачи исследования, представлены научная новизна и практическая значимость работы, а также изложены основные положения, выносимые на защиту.

В первой главе представлен обзор литературы, отражающий современное состояние проблемы восстановления и лечения нарушений микрофлоры кишечника, направленной на коррекцию основной патологии и устранение причин, вызвавших их развитие, возможности применения лекарственных растений для коррекции дисбиотических нарушений кишечника и уровня стандартизации многокомпонентных лекарственных средств растительного происхождения.

Во второй главе (объекты и методы) приведены сведения об объектах изучения, о методах и приборах, используемых в экспериментах.

Третья глава посвящена разработке и обоснованию рационального состава растительной композиции; изучению химического состава, показателей подлинности и качества, разработке методик количественного определения основных групп биологически активных веществ и их валидации.

Четвертая глава включает результаты экспериментальных исследований по изучению условий получения экстракта сухого из сбора, особенностях выхода биологически активных веществ на различных стадиях технологического процесса, разработке способа получения экстракта сухого и на его основе кишечнорастворимой лекарственной формы, установлению критериев подлинности и качества.

В пятой главе представлены результаты фармакологических исследований по обоснованию безопасности и изучению профилактического, лечебного действия разработанных растительных средств при экспериментально моделированном дисбактериозе кишечника.

Диссертация завершается общими выводами по работе, списком литературы и приложениями.

2. Основное содержание работы

1. Разработка, фармакогностическое изучение и стандартизация растительной композиции

При подборе отдельных видов лекарственного растительного сырья для растительной композиции учитывали, что лекарственные растения за счет содержания в них разнообразных групп биологически активных веществ, могут оказывать комплексное воздействие на развитие и течение качественных и количественных изменений в составе нормальной кишечной микрофлоры, проявляющееся в подавлении патогенной микрофлоры, стимуляции роста сапрофитной флоры; положительном влиянии на воспаленную слизистую кишечника за счет свертывания белков и образования плотной пленки; активизации процессов восстановления, регенерации и выработки слизи; нормализации моторно-эвакуаторной функции ЖКТ, процессов всасывания, пищеварения, стимуляции секреторной функции кишечника; снятии спазма гладкомышечных волокон органов ЖКТ; повышении защитных сил организма.

Информационно-литературный поиск, а также собственные предварительные исследования позволили произвести выборку 13 видов лекарственного растительного сырья (ЛРС), при этом рассматривались только разрешенные к применению в РФ лекарственные растения. Из отобранных видов ЛРС составляли различные комбинации сбора, включающие от 2 до 13 компонентов, готовили водные извлечения (1:10) и проверяли их активность. Первоначально изучали антимикробную активность и антигрибковую активность. Эффективность действия настоев лекарственных растений и композиций из них оценивали по зоне задержки роста патогенных микроорганизмов в сравнении со стандартными фагами. Результаты исследования позволили выбрать пять вариантов сбора (табл. 1).

Таблица 1. Антимикробная и антигрибковая активность исследуемых объектов

Исследуемый объект	Зоны задержки роста микроорганизмов, мм
	St. aureus	Kl. pneu-monie	Ps.aeru-ginosa	Pr.vul-garis	E. сoli	Candi da sp.
Антимикробный сбор	10,89 ±0,17	12,53 ±0,21	10,11 ±0,18	11,43 ±0,22	12,12 ±0,20	10,10 ±0,16
Вариант №1: корневища лапчатки, листья мяты, шалфея, трава зверобоя, корн. и кор. девясила -по 2ч	10,02 ±0,15	10,16 ±0,11	9,03 ±0,10	10,02 ±0,18	10,53 ±0,16	9,25 ±0,12
Вариант №2: листья шалфея, трава тысячелистника, зверобоя, корневища лапчатки, листья мяты, корн. и корни девясила - по 2 ч	10,77 ±0,16	11,36 ±0,22	9,74 ±0,18	10,43 ±0,18	11,47 ±0,15	9,45 ±0,16
Вариант №3: трава зверобоя, корн. и корни девясила, корневища лапчатки, листья мяты, шалфея, трава тысячелистника, череды - по 2ч	10,92 ±0,20	12,49 ±0,18	10,03 ±0,16	11,50±0,21	12,32 ±0,22	10,08 ±0,22
Вариант №4: корн. и корни девясила, листья шалфея, мяты, корневища лапчатки, трава зверобоя, тысячелистника, череды, плоды фенхеля - по 2 ч	11,74 ±0,21	13,68 ± 0,28	10,52 ±0,25	12,46 ±0,20	13,55 ±0,20	10,46 ±0,25
Вариант №5: корневища лапчатки, листья шалфея, мяты, трава зверобоя, тысячелистника, череды, корн. и кор. девясила, плоды фенхеля - по 2 ч, кора крушины - 1 ч	12,87 ±0,22	13,95 ±0,31	11,06 ±0,20	13,55 ±0,24	13,95 ±0,25	11,68 ±0,30
Фаг-стандарт	Стафилококковый	11,05 ±0,20	-	-	-	-	-
	Коли-протейный	-	13,10 ±0,25	-	13,12 ±0,20	13,04 ±0,18	-
	Сине-гнойный	-	-	10,08 ±0,18	-	-	-

Затем, для оценки биологической активности отобранных видов сырья и различных комбинаций сбора, был использован метод биологического тестирования на одноклеточном организме парамеции (Paramecium caudatum). В ходе эксперимента фиксировали время, в течение которого наблюдалось замедление движения (пороговая концентрация) и время обездвиживания почти всех парамеций в пробе (остановочная концентрация). При этом было установлено, что среди исследуемых пяти вариантов сбора более активно происходило обездвиживание парамеций при применении композиции №5. Кроме того, была изучена антиоксидантная активность и в качестве оптимальной также была отмечена композиция №5.

Однако было установлено, что у некоторых видов сырья (лапчатки, шалфея, зверобоя) на отдельных тестах активность была выше, чем в композициях, то есть наблюдалось явление взаимодействия свойств растительных компонентов между собой, когда некоторые виды растений, проявляющие более выраженную активность в отдельности, в смеси изменяли ее, или потенцируя или снижая действие совместно присутствующих компонентов. Поэтому, предпочтение нами отдавалось многокомпонентным растительным композициям, так как именно они могут реализовать все основные направления лечения дисбиотических нарушений микрофлоры кишечника. Таким образом, разработан рациональный состав многокомпонентной растительной композиции, включающий: корневище лапчатки, листья шалфея, листья мяты перечной, корневища с корнями девясила, траву зверобоя, траву тысячелистника, траву череды, плоды фенхеля по 1 части, кору крушины - Ѕ часть.

Для определения критериев подлинности сбора методами макро- и микроскопического анализа были изучены внешние и анатомо-диагностические признаки. При визуальном осмотре c помощью лупы и стереомикроскопа установлено, что растительная композиция представляет собой смесь неоднородных по размеру и окраске частиц зеленовато-серого цвета с бурыми, красно-бурыми, желтоватыми, кремовыми, беловато-розовыми вкраплениями, проходящих сквозь сито d=5 мм. Запах ароматный, своеобразный. Вкус горьковатый, вяжущий. Все компоненты сбора достаточно хорошо дифференцируются по внешним признакам. В ходе исследования нами дано детальное описание внешних характеристик каждого компонента сбора.

Микроскопические исследования позволили установить диагностические признаки компонентов сбора, которые соответствовали описанию в ГФ-XI. При последовательном просмотре микропрепаратов идентифицировались все составляющие сбора, выявлялись и подсчитывались диагностически значимые признаки, позволяющие определить подлинность сбора.

Товароведческий анализ сбора позволил установить числовые показатели качества: влажность - не более 14%, золы общей - не более 11%, золы, нерастворимой в 10% растворе HCl, - не более 3%, частиц, не проходящих сквозь сито с d=5 мм, - не более 10%, частиц, проходящих сквозь сито с d=0,18 мм, - не более 8%, органической примеси - не более 2%, минеральной - не более 1%, определена также микробиологическая и радиологическая чистота сбора.

Химический состав сбора изучали с помощью качественных реакций и с использованием методов хроматографического анализа водного и спиртового извлечения (рис.1). Качественными реакциями в сборе установлено присутствие: полисахаридов, аминокислот, дубильных веществ, флавоноидов, сапонинов, антраценпроизводных. Хроматографические методы исследования (БХ, ТСХ) проводили в различных системах растворителей с применением достоверных образцов свидетелей (табл. 2).

Для идентификации выделенных с помощью хроматографии веществ использовали данные УФ-, ИК-спектрометрии. В результате по форме УФ-спектров поглощения, наличию максимумов поглощения и характерным сдвигам максимумов при использовании диагностических добавок, наличию характеристических полос в ИК-спектрах, соответствующих валентным колебаниям определенных функциональных групп подтвердили присутствие в сборе рутина, кверцетина, лютеолин-7-глюкозида, апигенина, галловой, хлорогеновой и кофейной кислот.

Таблица 2. Результаты хроматографического анализа отдельных групп БАВ

Группа, фракция	Условия	Анализ хроматограмм
Каротиноиды Липофильная фракция ТСХ: пластинка «Kiezelgel 60F254»	Система: гексан - эфир ди-этиловый 80:20; детектор: 10% сп. р-р к-ты фосфорномолибденовой,t=60-800С	В УФ-свете пятна синего цвета на желто-зеленом фоне; Rf~0,61 - зона б - каротина; Rf~0,82 - зона в - каротина
Аскорбиновая к-та Водная фракция; ТСХ: пластинка «Kiezelgel 60F254»	Система: этилацетат- кис-лота уксусная 80:20;детек- тор:0,04% р-р 2,6-дихлор- фенолиндофенолят Na	При просмотре в видимом и УФ-свете белое пятно на розовом фоне; Rf~0,89 - зона аскорбиновой кислоты
Флавоноиды Этилацетатная фракция БХ: «Filtrak № 11» ТСХ: пластинка «Kiezelgel 60F254» Этилацетатная фракция Эфирная фракция	Системы: I - н-бутанол- кислота уксусная-вода 4:1:2; II - 15% кислота ук-сусная; детекторы: пары NH3, 5% р-р Na2СО3, 5% сп. р-р AlCl3	Окраска в видимом (бледно-желтая),УФ-свете от желтой, желто-зеленой до коричневой; обнаружены зоны (I): лютеолин-7-глюкозид (Rf~0,43), рутин (Rf~0,45), изокверцитрин (Rf~0,64), кверцетин (Rf~0,78), изорамнетин (Rf~0,74), апигенин (Rf~0,90)
	Системы: I - этилацетат-к-та уксусная - вода 5:1:1; II хл/ф-метанол-вода 62:32:7	Обнаружены зоны (I): рутин (Rf~0,27), гиперозида (Rf~0,42), лютеолин-7-глюкозида (Rf~0,57)
	Система: этилацетат - к-та уксусная - вода 5:1:1	Обнаружены зоны: кверцетин (Rf~0,85), мирицетин (Rf~0,87), апигенин (Rf~0,95), кемпферол (Rf~0,88)
ФКК и оксикорич-ные кислоты Этилацетатная фракция БХ: «Filtrak № 11» Этилацетатная фракция ТСХ: пластинка «Kiezelgel 60F254»	Системы: I - н-бутанол - кислота уксусная - вода 4: 1:2 и II - 2% кислота уксус- ная; детекторы: пары ам-миака, 3% спирт.р-р FeCl3	Флюоресцеция в УФ-свете ярко-голубая, зеленовато-голубая, фиолетовая; обнару-жены зоны кислот (I): галловой (Rf~0,66), хлорогеновой (Rf~0,68) и кофейной (Rf~0,80)
	Системы: I - н-бутанол- к- та уксусная - вода 4:1:2; II хл/ф-метанол-вода 62:32:7	Обнаружены зоны кислот (I): хлоро-геновой (Rf~0,36), галловой (Rf~ 0,64), кофейной (Rf~0,73)
Кумарины Хлороформная фракц. ТСХ: пластинка «Kiezelgel 60F254»	Система: этилацетат - бензол 1:2 детектор: 10% спирт. р-р КОН, t=110-1200С, опрыскив. свежепр. диазореактивом	Флюоресценция в УФ-свете ярко-голубая до обработки и от кирпично-красной до сине-фиолетовой после проявления; обнаружены зоны: эскулетина (Rf~ 0,09), умбелиферона (Rf~ 0,28), скополетина (Rf~0,53)

Кроме того, для подтверждения состава фенольного комплекса проведено изучение методом ВЭЖХ 70% спиртового извлечения из сбора при длине волны 254 нм и 360 нм (рис. 2 и 3).

В результате исследования при длине волны 254 нм было обнаружено 29 веществ фенольной природы, а при 360 нм - 34 вещества, из которых 7 идентифицированы как флавоноиды (рутин, кверцетин, изокверцитрин, гесперидин, лютеолин-7-глюкозид, гиперозид, апигенин) и 3, как фенолкарбоновые и оксикоричные кислоты (галловая, хлорогеновая и кофейная). Количественное содержание идентифицированных компонентов рассчитывали по площади пиков; установлено, что наибольшее количество среди флавоноидов в процентном соотношении приходится на рутин (при л=254 нм - 8,61%, а при 360 нм - 14,63%), среди фенолкарбоновых и оксикоричных кислот - на кислоту галловую (при л=254 нм - 29,11%, а при 360 нм - 4,92%).

Для подтверждения данных хроматографии (БХ, ТСХ, ВЭЖХ) провели выделение фенольных соединений в индивидуальном состоянии по схеме (рис. 1). Компоненты этилацетатной фракции разделяли методом препаративной хроматографии, используя колоночную хроматографию с полиамидом. Элюирование веществ с колонки проводили смесью хлороформа с метанолом, этанолом с возрастающей концентрацией спиртов или спиртоводными смесями (гликозиды). Индивидуальные вещества очищали рехроматографией и многократной кристаллизацией из соответствующих растворителей. При исследовании выделенных веществ использовали их физико-химические свойства: определение температуры плавления, сравнение УФ-, ИК-, ЯМР-спектров со спектрами известных образцов свидетелей, что позволило идентифицировать и охарактеризовать некоторые соединения (табл. 3).

Следующим этапом исследования было определение количественного содержания биологически активных веществ. Поскольку многие растения, входящие в состав сбора, по литературным данным содержат эфирные масла, для нас представляло интерес определение этой группы веществ. Количественное содержания эфирных масел в сборе определяли методом перегонки с водяным паром с подбором оптимальных условий: навеска - 25,0 г; измельченность сырья - 3 мм; время перегонки - 2 часа (1,140±0,025%). Полученное эфирное масло было подвергнуто качественному анализу хроматомасс-спектрометрическим методом. Разделение и идентификацию компонентов проводили по масс-спектрам электронного удара и их интерпретации на основании спектро-структурных корреляций. В результате удалось идентифицировать компонентный состав эфирного масла, выделенного из сбора, который представлен 33 веществами, а к соединениям монотерпеновой и сесквитерпеновой природы относятся 22 и в максимальном количестве содержатся: п-аллил-анизол (30,68%), эудесма-5,11(13)-диен-8,12-олид (8,36%), цис-5-метил-2-(1-метилэтил)-циклогексанон (7,33%), азулен (4,71%), ментол (3,41%), пулегон (2,78%), камфора (2,74%), туйон (2,04%), эвкалиптол (1,73%), в меньшем количестве кариофиллен, кадинол, копаен, спатуленол, б-бисаболен.

Определение содержания макро- и микроэлементов в растительном сборе представляет интерес в связи с высокой биологической ролью отдельных химических элементов. В результате исследования в сборе установлено содержание некоторых макро- (K 1,14%, Na 0,20%, Ca 1,29%, P 0,18%) и микроэлементов (Zn 0,076%, Fe 0,298%, Mn 0,526%, Cu 0,002%, J 0,0002%), в тоже время соединения Pb, Hg, Al обнаружены не были, что характеризует экологическую чистоту сырья.

Кроме того, в сборе проведено изучение содержания аминокислот, которое показало присутствие 14 аминокислот, из которых восемь незаменимых и шесть заменимых, их суммарное содержание 6,15%, с преобладанием в количественном отношении пролина, глицина, валина, цистеина, аргинина (рис. 4).

Определение содержания свободных органических кислот в сборе проводили после предварительного анализа водного извлечения методом ВЭЖХ на присутствие органических кислот, чтобы выбрать компонент, преобладающий в смеси (рис. 5). На основании проведенных исследований было установлено, что в смеси преобладает лимонная кислота, на которую вели пересчет.



Количественное определение других групп биологически активных веществ в сборе проводили с использованием различных методов: спектрофотометрии (каротиноиды в пересчете на в-каротин, аскорбиновой кислоты, полисахариды, сапонины в пересчете на олеаноловую кислоту, кумарины в пересчете на экскулетин; хроматоспектрофотометрии - оксикоричные кислоты в пересчете на хлорогеновую; фотоколориметрии - антраценпроизводные в пересчете на истизин; титриметрии - органические кислоты в пересечете на лимонную кислоту (табл. 4).

Таблица 4. Результаты количественного определения БАВ в сборе

Группа БАВ	f		S	S	Р,%	t (P,f)	Д	е,%
Каротиноиды	8	0,035	0,00127	0,00043	95	2,36	0,001	±2,86
Аскорбиновая к-та	8	0,043	0,00254	0,00085	95	2,36	0,002	±4,65
Полисахариды	8	3,08	0,15254	0,05085	95	2,36	0,12	±3,90
Органические к-ты	8	4,07	0,16525	0,05508	95	2,36	0,13	±3,19
Сапонины	8	1,18	0,03814	0,01271	95	2,36	0,03	±2,54
Оксикоричные к-ты	8	1,26	0,05085	0,01695	95	2,36	0,04	±3,17
Кумарины	8	0,32	0,01271	0,00423	95	2,36	0,01	±3,13
Антраценпроизводные	8	0,96	0,02542	0,00847	95	2,36	0,02	±2,08

Кроме вышеуказанных биологически активных веществ, особое внимание было уделено определению флавоноидов и дубильных веществ, поскольку мы считаем, что именно их присутствие обусловливает специфическую активность сбора и имеет наибольшее значение в оказании терапевтического эффекта при лечении нарушений микрофлоры кишечника. Для этого необходимо было подобрать оптимальные условия их определения и разработать методики, что и явилось следующим этапом наших исследований.

Для выбора аналитического метода определения содержания дубильных веществ проведено исследование следующими тремя методами: метод 1 - фармакопейный метод перманганатометрии; метод 2 - спектрофотометрическое определение суммы полифенолов в пересчете на галловую кислоту в 50% спиртовом извлечении из сбора в среде боратного буфера (рН=9,0); метод 3 - спектрофотометрическое определение окрашенных продуктов взаимодействия катехинов с железотартратным реактивом в среде 0,1 М фосфатного буфера (рН=8,2).

В ходе исследования проводили изучение спектров поглощения растворов сбора и сопоставляли их со спектром поглощения стандартного раствора кислоты галловой, при этом было отмечено, что по методу 2, максимум наблюдался при длине волны 270 нм, а по методу 3 - при длине волны 545 нм.

Также были подобраны оптимальные условия экстракции дубильных веществ, при определении по методу 2 и 3: тип экстрагента, измельченность сырья, соотношение сырья и экстрагента, время экстрагирования в условиях кипящей водяной бани. Результаты количественного определения дубильных веществ в сборе тремя методами представлены в таблице 5.

Таблица 5. Метрологические характеристики методики определения дубильных веществ

№ метода	f		S	S	Р,%	t(P,f)	Д	е,%
Метод 1	8	12,34	0,66102	0,22034	95	2,36	0,52	±4,21
Метод 2	8	4,28	0,19067	0,06356	95	2,36	0,15	±3,50
Метод 3	8	9,15	0,44492	0,14831	95	2,36	0,35	±3,83

Обобщая полученные результаты можно отметить, что фармакопейный метод 1 имеет некоторые недостатки: дает завышенные результаты определения, так как при титровании окисляются не только дубильные вещества, но и другие вещества, коэффициент пересчета на танин достаточно условен и трудно уловить конец титрования. Метод 2 также недостаточно точен, так как при экстракции в спиртовое извлечение могут переходить и другие соединения, например, флавоноиды. Поэтому, считаем наиболее целесообразным применение метода 3, так как с железо-тартратным реактивом взаимодействует в основном сумма катехинов, что дает более точные результаты.

Относительная ошибка в опытах с добавками кислоты галловой не превышает относительной ошибки среднего результата, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки и правильности методики (табл. 6). На основании полученных результатов предлагаем ввести в проект ФС для сбора норму показателя «содержание дубильных веществ» - не менее 9%.

Таблица 6. Результаты количественного определения дубильных веществ в сборе с использованием метода добавок кислоты галловой

Содержание дубильных в-в в аликвоте, мкг	Добавлено к-ты галловой, мкг	Ожидаемое содержание, мкг	Полученное содержание, мкг	Ошибка
				абс., мкг	отн., %
4575	1000	5575	5672	97	1,71
4575	2000	6575	6481	- 94	1,45
4575	3000	7575	7673	98	1,28

Для разработки методики количественного определения флавоноидов был выбран метод дифференциальной спектрофотометрии. В ходе исследования были изучены спектральные характеристики спиртового извлечения из сбора, стандартных образцов свидетелей флавоноидов и было установлено, что спектры извлечения сбора не совпадали с таковыми у свидетелей флавоноидов. Поэтому, чтобы исключить влияние сопутствующих веществ, к спиртовому раствору извлечения из сбора и стандартных растворов флавоноидов добавляли раствор AlCl₃ и вновь снимали спектры (рис. 6). При этом установили, что дифференциальный спектр извлечения из сбора имел более близкий максимум поглощения к спектру рутина (410 нм), поэтому он и был выбран в качестве основного в сумме на который вести пересчет.

Для количественного определения флавоноидов в сборе были подобраны оптимальные условия экстракции: экстрагент - 70% спирт этиловый; измельченность сырья - 3 мм; соотношение сырье - экстрагент 1:100, время экстракции - 30 минут нагревания на кипящей водяной бане и трехкратная экстракция обеспечивала наиболее полное извлечение флавоноидов; комплексообразователь - 5% спиртовый раствор AlCl₃ в количестве 1 мл; реакция комплексообразования развивается в течение 30 мин и комплексы остаются стабильны в течение 1 часа (табл. 7).

Таблица 7. Метрологические характеристики методики определения флавоноидов

f		S	S	Р,%	t(P,f)	Д	е,%
8	1,48	0,05085	0,01695	95	2,36	0,04	± 2,70

Опыты с добавками рутина показали отсутствие систематической ошибки и правильность методики (табл. 8). На основании полученных результатов предлагаем норму показателя «содержание флавоноидов в пересчете на рутин» - не менее 1,4%.

Таблица 8. Результаты количественного определения суммы флавоноидов в сборе с использованием метода добавок ГСО рутина

Содержание суммы флавоноидов в аликвоте, мкг	Добавлено ГСО рути-на, мкг	Ожидаемое содержание, мкг	Полученное содержание, мкг	Ошибка
				абс., мкг	отн.,%
218,45	50	268,45	271,90	3,45	1,27
218,45	100	318,45	313,57	- 4,88	1,56
218,45	150	368,45	374,67	6,22	1,66

Разработанные методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин и дубильных веществ оценены по критериям правильность, прецизионность, линейность и специфичность.

Результаты фармакогностических исследований легли в основу разработки проекта фармакопейной статьи на сбор для профилактики и лечения нарушений микрофлоры кишечника, в котором предложены основные критерии подлинности и показатели качества сбора, необходимые для стандартизации, рекомендуемый срок годности сбора - 2 года.

2. Разработка технологии получения лекарственной формы на основе экстракта сухого из растительной композиции

Несмотря на то, что многокомпонентные растительные сборы являются наиболее широко используемой формой переработки растительного сырья, они имеют ряд недостатков: незавершенность лекарственной формы, неточность дозирования, короткий срок хранения. Разработка сухих экстрактов является наиболее приемлемым вариантом решения данного вопроса, а сами экстракты могут служить субстанцией для создания рациональных лекарственных форм. Основной задачей на данном этапе было подобрать оптимальные условия получения экстракта сухого из сбора, с учетом влияния различных факторов на выход действующих веществ. Контроль на различных стадиях технологического процесса вели по содержанию действующих (дубильных) и экстрактивных веществ. Экспериментально установлено, что оптимальным является проведение трехкратной экстракции (60, 30, 30 мин) сбора с размером частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями d=5 мм, в соотношении 1:10 при использовании в качестве экстрагента воды очищенной (80-85єС). Подобранные в ходе эксперимента условия экстракции были положены в основу схемы получения экстракта сухого из сбора (рис. 7).

Контроль выхода биологически активных веществ осуществляли на различных стадиях технологического процесса и в конечном продукте. Для расчета эффективности экстракции определяли выход дубильных и экстрактивных веществ на каждой ступени экстракции. Выход готового конечного продукта составил 22,48%. Таким образом, экстракт сухой из сбора представляет собой темно-коричневый аморфный порошок со специфическим запахом горьковатого вкуса, гигроскопичный, хорошо растворим в горячей воде (60-80⁰С) и спирте этиловом 10-30%.

Сравнительное изучение химического состава экстракта сухого, проведенное с использованием качественных реакций, хроматографических методов исследования (ТСХ, ВЭЖХ) подтвердило наличие в экстракте тех же групп БАВ, что и водном извлечении из сбора. Стандартизацию экстракта проводили по содержанию флавоноидов в пересчете на рутин и дубильных веществ, используя методики, разработанные для сбора (табл. 9).

Таблица 9. Метрологические характеристики методик определения флавоноидов и дубильных веществ в экстракте сухом

Группа БАВ	f		S	S	Р,%	t(P,f)	Д	е,%
Флавоноиды	8	4,12	0,20338	0,06779	95	2,36	0,16	± 3,88
Дубильные в-ва	8	18,34	0,92797	0,30932	95	2,36	0,73	± 3,98

Для проверки отсутствия систематической ошибки методик были проведены опыты с добавками рутина и кислоты галловой в навеску экстракта. При этом относительная ошибка результатов не превышала относительную ошибку единичного определения и имела отклонения в сторону как положительных, так и отрицательных значений.

Для экстракта сухого из сбора установлены технологические характеристики и показатели качества: влажность не более 5%, насыпная масса при свободном падении 0,48±0,04 г/смі и при уплотнении 0,65±0,04 г/смі, угол естественного откоса 36,0±1,0є, объемная плотность 0,54±0,02 г/смі, сыпучесть 1,27±0,21 г/сек и нормы содержания суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее 3,5%; дубильных веществ не менее 18%, рекомендуемый срок годности - 2 года.

В результате исследования технологических свойств экстракта сухого, было установлено, что он обладает довольно низкой сыпучестью и гигроскопичен. Этим продиктована необходимость разработки рациональной лекарственной формы в виде драже, у которых за счет наслоения вспомогательных веществ можно достичь различного времени высвобождения действующих веществ в толстом и тонком отделе кишечника. Для этого использовали различные вспомогательные вещества и их комбинации в разных соотношениях с целью получения удовлетворительной лекарственной формы, качество драже оценивали по времени их распадаемости в искусственном кишечном соке. При этом было установлено, что необходимое время растворимости драже в течение 5 часов было достигнуто при соотношении 1:3 смеси растительного экстракта и вспомогательных веществ (крахмала, желатина, глюкозы 1:1:1). Далее было изучено влияние связывающих веществ и их концентрации на качество драже, которое оценивали по показателям: скорость распадаемости в искусственных пищеварительных соках, прочность и целостность. Для этих целей использовали растворы этилцеллюлозы, ацетилфталилцеллюлозы и метилфталилцеллюлозы в диапазоне концентраций 1-10%, приготовленные в спирто-ацетоновом растворе (1:9). При этом драже, полученные на основе АФЦ при концентрации 5%, обладали большей прочностью и целостностью. С целью пролонгирования времени распадаемости драже в кишечном соке изучали возможность использования коллидона. Получение драже с растворением в течение заданного времени (5 часов) достигалось двухслойной обработкой 10% раствором коллидона. В качестве защитного и корригирующего покрытия наносили один-два слоя сиропа сахарного 64%. Таким образом, был подобран оптимальный состав соотношения растительного экстракта, смеси вспомогательных веществ и разработана технологическая схема получения драже: Растительный экстракт 0,1

Смесь вспомогательных веществ (картофельный крахмал, желатин, глюкоза 1:1:1 (1:3) до массы 0,45±0,04

Спирто-ацетоновый раствор ацетилфталилцеллюлозы, масс. % 5

Раствор коллидона в гексане 10% 2 слоя

Сироп сахарный 64% 1-2 слоя.

Полученные драже правильной шарообразной формы, диаметром 9 мм, массой 0,45±0,04 г с гладкой и ровной поверхностью однородного коричневого цвета со светло-коричневыми вкраплениями. С помощью качественных реакций и хроматографических методов исследования в лекарственной форме подтверждено присутствие основных групп БАВ. Стандартизацию драже проводили по содержанию суммы флавоноидов в пересчете на рутин (табл. 10).

Таблица 10. Метрологические характеристики методики определения флавоноидов в драже

f		S	S	Р,%	t(P,f)	Д
8	1,05	0,03813	0,01271	95	2,36	0,03	± 2,86

Для проверки отсутствия систематической ошибки методики были проведены опыты с добавками рутина (табл. 11), которые свидетельствовали об отсутствии систематической ошибки и правильности методики.

Таблица 11. Результаты количественного определения суммы флавоноидов в драже с использованием метода добавок ГСО рутина

Содержание суммы флавоноидов в аликвоте, мкг	Добавлен ГСО рутина, мкг	Ожидаемое содержание, мкг	Полученное содержание, мкг	Ошибка
				абс., мкг	отн.,%
157,5	50	207,5	212,78	5,28	2,49
157,5	100	257,5	255,27	-2,23	0,87
157,5	150	307,5	310,04	2,54	0,82

Предлагаемая методика оценена по критериям правильность, прецизионность, линейность и специфичность. На основании полученных результатов рекомендуется ввести в проект ФС драже норму показателя «содержание флавоноидов» - не менее 1,0%. По результатам проведенных исследований предложены критерии подлинности и технологические показатели качества драже: внешний вид, влажность не более 2%, целостность 99,33±0,17%, прочность 4±1 кг/см², средняя масса 0,45±0,04 г, средний размер драже 9,05±0,07 мм, распадаемость 300±15мин. Изучена стабильность драже в процессе хранения и установлен срок годности - 2 года.

3. Фармакологические исследования

Исследования безопасности разработанных растительных средств (сбора, экстракта сухого и драже) показали что, они относятся к группе практически нетоксических веществ.

Изучение эффективности применения разработанных растительных средств проводили при моделировании дисбактериоза кишечника на животных. Введение канамицина сульфата сопровождалось выраженными дисбиотическими изменения-ми в тонком и толстом кишечнике - резко возрастало содержание E.coli с одновременным снижением важных для микробиоценоза показателей, как количество бифидо- и лактобактерий, появлением значительного количества условно-патогенных микроорганизмов, в частности стафилококка и дрожжеподобных грибов рода Candida sp. При изучении профилактического действия исследуемых растительных средств, которые вводили параллельно с канамицином, было отмечено, что явления дисбактериоза в тонком и толстом кишечнике при их применении были выражены, но в значительно меньшей степени, чем в контрольной группе. Изучение лечебного действия исследуемых препаратов, которые применяли после 5-ти дневного введения канамицина сульфата показало, что под влиянием исследуемых объектов, значительно быстрее происходило восстановление нормальных показателей микробиоценоза. Так, на 7-е сутки эксперимента содержание E.coli и условно-патогенных микроорганизмов еще незначительно отличались от контрольной группы, хотя были ниже, а содержание бифидо - и лактобактерий начинало возрастать. На 14-е сутки восстановление микроэкологии кишечника было уже более выраженным и на 21-е сутки показатели полностью нормализовались.

Выводы

1. На основании анализа литературных данных и результатов собственных исследований по определению биологической активности разработан и обоснован рациональный состав растительной композиции, рекомендуемой для профилактики и лечения нарушений микрофлоры кишечника.

2. Установлены макро - и микродиагностические признаки растительной композиции, позволяющие идентифицировать ее составные компоненты.

3. С помощью качественных реакций, хроматографических методов исследования изучен качественный состав биологически активных веществ сбора; методом ВЭЖХ подтверждено присутствие флавоноидов, фенолкарбоновых, оксикоричных и органических кислот. Выделены и идентифицированы индивидуальные вещества (рутин, кверцетин, гесперидин, лютеолин-7-глюкозид, апигенин, галловая кислота), структура которых установлена на основании УФ-, ИК-, ¹Н-ЯМР-, ¹³С-ЯМР-спектров и физико-химических констант. Методом хроматомасс-спектрометрии изучен компонентный состав эфирного масла сбора.

4. Определено количественное содержание в сборе эфирных масел 1,1400,025%; аскорбиновой кислоты 0,04300,002%; органических кислот 4,070,13%; полисаха-ридов 3,080,12%; оксикоричных кислот 1,260,04%; кумаринов 0,32±0,01%; антра-ценпроизводных 0,96±0,02%; каротиноидов 0,0350,001%, сапонинов 1,18±0,03%, суммарное содержание аминокислот (6,15%). Изучен элементный состав сбора и установлено присутствие макро -(K, Na, Ca, P) и микроэлементов (Zn, Fe, Mn, Cu, J).

5. Разработаны методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин и суммы дубильных веществ; проведена их валидационная оценка, которая показала соответствие критериям правильность, прецизионность, линейность и специфичность.

6. Установлены числовые показатели качества сбора и нормы их содержания: влаж-ность - не более 14%; зола общая - не более 11%; зола, нерастворимая в 10% растворе HCl, - не более 3%; содержание примесей органических - не более 2% и минеральных - не более 1%; содержание частиц, не проходящих сквозь сито с d=5 мм, - не более 10% и частиц, проходящих сквозь сито с d=0,18 мм, - не более 8%; содержание дубильных веществ - не менее 9 %; суммы флавоноидов в пересчете на рутин не менее - 1,4%; показатели микробиологической и радиологической чистоты, рекомендуемый срок годности - 2 года.

7. Разработан способ получения экстракта сухого из сбора с учетом подобранных оптимальных условий экстракции, а также контроля выхода биологически активных веществ на различных стадиях технологического процесса и в конечном продукте; изучены его технологические характеристики и определены показатели качества.

8. Разработан оптимальный состав соотношения кишечнорастворимой лекарственной формы на основе экстракта сухого из сбора в виде драже: растительный экстракт 0,1 г, вспомогательные вещества (желатин, крахмал, глюкоза, ацетилфта-лилцеллюлоза, коллидон, сахарный сироп) до массы 0,45 г; предложена технологическая схема их получения, определены критерии подлинности и качества драже, проведена валидация методики количественного определения флавоноидов.

9. Методами фармакологических исследований доказана безопасность разработанных растительных средств (сбора, экстракта сухого и драже) и эффективность их применения для профилактики и лечения нарушений микрофлоры кишечника при экспериментально моделированном дисбактериозе.

10. Разработаны проекты фармакопейных статей на сбор и лекарственную форму.

лекарственный кишечнорастворимый экстракт сухой

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Влияние растительного сбора на дисбактериоз кишечника / К.А. Пупыкина, Н.Ж. Басченко, … Е.А. Клыш [и др.] // «Фармация». - 2007. - №6. - С. 37-39.

2. Сравнительное изучение антиоксидантной активности растительных сборов / С.Р. Хасанова, Т.И. Плеханова, Е.А.Клыш [и др.] // «Вестник ВГУ. Секция Химия. Биология. Фармация». - Вып.1. - 2007. - С.163-166.

3. Клыш, Е.А. Разработка оптимальных условий получения эфирного масла из растительного сбора и изучение его компонентного состава / Е.А.Клыш, К.А.Пупыкина // «Башкирский химический журнал». - Т.16, №4. 2009.-С.129-130.

4. Патент РФ № 2332226 на изобретение «Сбор лекарственных растений для профилактики и комплексного лечения дисбактериоза кишечника» // К.А. Пупыкина, В.А. Лиходед, Г.А. Павлова, Е.А. Клыш // Бюл. № 24 от 27.08.2008г. - 3с.

5. Клыш, Е.А. Оценка влияния экстракта из растительного cбора на восстановление нормального микробиоценоза кишечника / Е.А. Клыш, К.А. Пупыкина // «Традиционная медицина» -2010. - №3 (22) // Сборн. научн. трудов II Рос. фитотерапевт. съезда. - С. 43-44.

6. Фармакогностическое изучение сборов для комплексного лечения язвенной болезни желудка, двенадцатиперстной кишки и дисбактериоза / К.А. Пупыкина, В.А. Лиходед, Е.А. Клыш, Л.В. Рогачева //«Запорожский медицинский журнал». - 2007. - №2. - С.134-136.

7. Пупыкина, К.А. Исследования растительного сбора для комплексного лечения дисбактериоза на содержание макро- и микроэлементов / К.А. Пупыкина, Е.А. Клыш //«Медицинский вестник Башкортостана» (спец. выпуск) «Актуальные вопросы современной фармации и фарм. образования». - Уфа, 2006. - Т.4, №1 - С.135-136.

8. Пупыкина, К.А. Аминокислотный состав растительного сбора для комплексного лечения дисбактериоза / К.А. Пупыкина, Е.А. Клыш // Матер. межвуз. науч.-практ. конф. «Актуальные проблемы технических, естественных и гуманитарных наук». - Уфа, 2006 г.- С.312-314.

9. Изучение острой токсичности сборов для комплексного лечения язвенной болезни желудка, двенадцатиперстной кишки и дисбактериоза /К.А. Пупыкина, Н.Ж. Басченко, …Е.А. Клыш [и др.] // Матер. Всерос. научно-практ. конф. «Новые достижения в создании лекарственных средств растительного происхождения» - Томск, 2006. - С. 287-288.

10. Пупыкина, К.А. Фармакогностическое изучение сбора для комплексного лечения дисбактериоза / К.А. Пупыкина, Е.А. Клыш // Матер. научно-практ конф. «Вопросы теоретической и практической медицины». - Уфа, 2006. С.445-446.

11. Разработка оптимальных условий получения экстрактов из растительных сборов при заболеваниях желудочно-кишечного тракта / К.А. Пупыкина, Л.В. Рогачева, Е.А. Клыш //«Медицинский вестник Башкортостана» (спец. выпуск).-Сборн. научн. трудов юбил. конф. - Уфа, 2006. - Т.4, №1 - С.160-162.

12. Применение фитотерапии в комплексном лечении дисбактериоза кишечника / К.А. Пупыкина, Е.А. Клыш, Г.А. Павлова [и др.]//«Медицинский вестник Башкортостана».-Т.1, №1 (спец. вып.) «Актуальные вопросы современной фитотерапии».- Уфа, 2006.- С. 62-64.

13. Изучение возможности использования лекарственных растительных средств для комплексного лечения заболеваний ЖКТ / К.А. Пупыкина, Е.А. Клыш, Л.В. Рогачева // Матер. респ. конф. «Медицинская наука-2006». - Уфа, 2006. - 120-122.

14. Пупыкина, К.А. Фитотерапия в комплексном лечении дисбактериоза кишечника. / К.А. Пупыкина, Е.А. Клыш // «Практическая фитотерапия», 2006. - №3. - С. 22-25.

15. Комплексное лечение дисбактериоза кишечника с использованием растительного сбора / К.А. Пупыкина, Е.А. Клыш, Г.А. Павлова, О.В. Позолотина // «Традиционная медицина-2007»: Сборн. научн. трудов конгресса. - Москва,2007. - С.81-82.

16. Пути переработки растительных сборов, разработанных для профилактики и комплексного лечения заболеваний ЖКТ / К.А. Пупыкина, Л.В. Старцева, Е.А. Клыш // Сборн. научн. тр. Междунар. симп. «Новые и нетрад. растения и перспективы их использования». - Т. III - Пущино, 2007. - С. 399-401.

17. Разработка методики количественного определения суммы флавоноидов в сборах / К.А. Пупыкина, С.А. Мещерякова, Е.А. Клыш [и др.] // Матер. Рос. науч.-практ.конф., посвящ. 70-летию ПФГА. - Пермь, 2007. - С. 455 - 458.

18. Клыш, Е.А. Разработка условий получения экстракта из растительного сбора / Е.А. Клыш, К.А. Пупыкина //«Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» Сборн. научных трудов. - Пятигорск, 2010. - С. 196 - 198.

19. К вопросу изучения экстракта из сбора для профилактики и комплексного лечения дисбактериоза // А.З.Хасанова, Е.А. Клыш, К.А. Пупыкина [и др.] // Матер. респуб. научн. студ. и мол.уч.«Вопросы теорет. и практ. медицины». -Т.2.-Уфа, 2010.- С. 189 - 190.

20. Разработка состава и технологии получения драже с растительным экстрактом из сбора для комплексного лечения дисбактериоза / Е.А. Клыш, Ю.В. Шикова, К.А. Пупыкина [и др.] // Вестник ПГФА, №7, 2010. - Матер. Рос. науч.-практ.конф. - Пермь, 2010. - С. 88-89.

21. Изучение возможности использования растительного сбора для профилактики и комплексного лечения кишечных инфекций / К.А.Пупыкина, Е.А.Клыш, Д.А.Валишин [и др.] // Сбор.тез.V Междунар. фор. «Интегративная медицина».-Москва, 2010.- С.180-181.

Размещено на Allbest.ru

...