Новый способ пластики посттравматических дефектов суставной гиалиновой хрящевой ткани клеточно-тканевыми трансплантатами (экспериментальное исследование)

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.01.15. - Травматология и ортопедия

14.03.02. - Патологическая анатомия

Новый способ пластики посттравматических дефектов суставной гиалиновой хрящевой ткани клеточно-тканевыми трансплантатами (экспериментальное исследование)

Долгушкин Дмитрий Александрович

Самара, 2011

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Самарский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научные руководители:

академик РАМН, доктор медицинских наук, профессор Котельников Геннадий Петрович

доктор медицинских наук, профессор Волова Лариса Теодоровна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Измалков Сергей Николаевич

доктор медицинских наук, профессор Туманов Владимир Павлович

Ведущая организация: Федеральное государственное учреждение «Саратовский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук, профессор Корымасов Е.А.

1. Общая характеристика работы

пластика посттравматический суставной хрящ

Актуальность темы исследования

С каждым годом растет число людей, страдающих посттравматическими и деструктивными поражениями хряща крупных суставов. Наиболее часто встречаются полнослойные хрящевые и костно-хрящевые дефекты, частота которых составляет от 1,5 до 20% от всех видов повреждений суставного гиалинового хряща (Лисицын М.П., Трачук А.П., 2003).

Для оперативного лечения больных применяются разные способы хондропластики, то есть замещение дефектов хряща участками здоровой хрящевой ткани, различными видами трансплантатов и др. (Котельников Г.П., Ларцев Ю.В., 2010). Однако результаты выполняемых операций хондропластики часто не удовлетворяют ни врачей, ни пациентов - полноценного восстановления суставного гиалинового хряща не происходит (Писарев В.Б., Маланин Д.А., 2010). Прогрессирование деструктивных процессов в суставе приводит к инвалидизации больных, что подчеркивает высокую социальную значимость выбора оптимального способа лечения пациентов с данной патологией (Миронов С.П., 2008, Измалков С.Н., 2009).

В последнее время для восстановления тканей стали применять клеточные технологии (Туманов В.П., 2009). Появилась возможность использования клеток с целью регенерации хрящевой ткани при выполнении хондропластики (Омельяненко Н.П. и соавт., 2005). Однако существуют проблемы выбора источника для получения клеточного материала (Barone L., 2007, Angermann P., 2007). Не решен вопрос об оптимальных путях доставки и фиксации клеточного материала в тканях-мишенях. Наиболее предпочтительными в настоящее время являются биологические или искусственные матрицы-носители для клеток (Волова Л.Т., 2010). Однако оптимальной матрицы для клеточного материала, обладающей хондроиндуктивными и хондрокондуктивными свойствами, до сих пор не найдено (Gillogly S., 2008, Mohamed Al-Rubeai, 2004, Brittberg M et al., 2006).

Цель исследования

Разработка и экспериментальное обоснование нового способа пластики посттравматических дефектов суставного хряща комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами на основе бионосителя и аутологичных клеток из рёберной хрящевой ткани.

Задачи исследования:

С помощью клеточно-тканевых технологий разработать новый способ восстановления суставной гиалиновой хрящевой ткани в эксперименте на кроликах.

Дать структурную характеристику созданному клеточно-тканевому трансплантату, используя гистологические методы, а также электронную растровую и конфокальную микроскопию.

С помощью комплекса морфологических методов исследования изучить в эксперименте на животных характер регенераторных процессов и состояние прилежащей к области повреждений гиалиновой хрящевой ткани при пластике дефектов комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами, при замещении их только бионосителем и без применения пластического материала.

Построить математическую модель структурно-функционального состояния задней конечности экспериментального животного на основе системного многофакторного анализа результатов функциональных и морфологических методов исследования и оценить динамику отклонения интегральных показателей.

Изучить эффективность предложенного нового способа восстановления суставных поверхностей комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами с позиции доказательной медицины.

Научная новизна

Впервые для лечения костно-хрящевых повреждений разработан новый способ пластики дефектов комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами (Патент РФ на изобретение № 2383310 от 10.03.2010).

С помощью гистологических методов, а также электронной растровой и конфокальной микроскопии доказана интеграция в бионоситель жизнеспособных аутологичных фибробластоподобных клеток из реберной гиалиновой хрящевой ткани и возможность их пролиферации после трансплантации с последующей хондродифференцировкой.

Разработан и внедрен в научно-исследовательский процесс способ оценки структурно-функционального состояния задних конечностей у кроликов в эксперименте (удостоверение на рационализаторское предложение № 132 от 2.03.11).

С помощью макро- и микроскопических методов исследования показано, что после пластики интраоперационных костно-хрящевых дефектов аллогенным бионосителем с аутологичными клетками гиалиновой хрящевой ткани происходит полное замещение дефектов регенератом, визуально не отличимым от окружающей суставной поверхности, представленным органотипичной гиалиновой хрящевой тканью.

На основе системного многофакторного анализа результатов функциональных и морфологических методов исследования построена математическая модель структурно-функционального состояния задней конечности кролика, позволившая оцененить динамику отклонения интегральных показателей у животных экспериментальных групп.

С позиций доказательной медицины обоснована эффективность предложенного нового способа пластики костно-хрящевых дефектов коленного сустава комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами.

Практическая значимость

Результаты применения предложенного нами нового способа восстановления посттравматических повреждений суставного гиалинового хряща путем создания интраоперационных костно-хрящевых дефектов и их пластики комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами на основе деминерализованной спонгиозы и культуры аутологичных клеток из реберной хрящевой ткани свидетельствуют о высокой эффективности данного способа и открывают перспективы для проведения его клинических испытаний.

Внедрение результатов исследования

Результаты проведенных исследований применяют в учебном процессе на кафедре травматологии, ортопедии и экстремальной хирургии, институте экспериментальной медицины и биотехнологий, кафедре травматологии, ортопедии и поликлинической хирургии ИПО, кафедре оперативной хирургии и клинической анатомии с курсом инновационных технологий ГОУ ВПО СамГМУ Минздравсоцразвития России.

Апробация работы

Основные положения диссертационного исследования доложены и обсуждены на итоговой научной конференции молодых ученых Самарского государственного медицинского университета «Аспирантские чтения» (г. Самара, 2009), Приволжском инновационном конвенте в рамках «Зворыкинского проекта» (г. Пермь, 2010).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 9 работ, из них 3 - в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Получен 1 Патент РФ на изобретение, 1 удостоверение на рационализаторское предложение.

Объем и структура работы

Диссертация изложена на 163 страницах (из них текста 135 страниц) и состоит из введения, обзора литературы, 4 глав собственных наблюдений, заключения, выводов, практических рекомендаций и указателя литературы. Библиографический список содержит 92 отечественных и 165 зарубежных источников. Иллюстрации: 17 таблиц и 73 рисунка.

Положения, выносимые на защиту:

1. Новый способ пластики посттравматических повреждений суставной поверхности, заключающийся в создании интраоперационных костно-хрящевых дефектов и заполнении их комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами на основе деминерализованной спонгиозы и культуры аутологичных клеток из реберной хрящевой ткани, приводит к восстановлению структуры субхондральной кости и формированию новой гиалиновой хрящевой ткани.

2. Бионоситель, аллогенная деминерализованная спонгиоза, изготовленная по технологии «Лиопласт», обеспечивает жизнеспособность и пролиферативную активность клеток из реберной гиалиновой хрящевой ткани с последующей их хондродифференцировкой после трансплантации.

3. Результаты выполненного комплекса морфологических и функциональных методов исследования подтверждают полное восстановление структурно-функционального состояния задней конечности экспериментального животного после выполнения пластики дефектов суставной поверхности новым способом.

4. При выполнении пластики интраоперационных дефектов бионосителями на поздних сроках происходит анатомическое восстановление суставной поверхности, заполнение дефектов костно-фиброзными регенератами с очагами остеорезорбции и развитием в прилежащем гиалиновом хряще деструктивно-дистрофических процессов. Без пластики сохраняется деформация суставной поверхности и замещение дефектов волокнистой соединительной тканью, с развитием и прогрессированием деструктивных изменений прилежащих тканей.

2. Содержание работы

Материал и методы исследования

Эксперименты были проведены на базе Института экспериментальной медицины и биотехнологий СамГМУ (директор Л.Т. Волова). Объектом исследования стали 53 разнополых кролика породы «Шиншилла» массой 2,5-3кг, возрастом 1-1,5года.

Все исследования осуществлялись в рамках международных рекомендаций по проведению медико-биологических исследований с использованием животных.

Кроликов содержали в условиях стационарного вивария на растительном витаминизированном рационе при свободном доступе к воде. Перед проведением эксперимента были определены границы биологической нормы для всех тестируемых показателей у интактных животных (5кроликов). Оперативные вмешательства проводили в стерильных условиях с соблюдением правил асептики и антисептики под наркозом (ксилазин и золетил). Оперированных животных содержали поодиночке. Для выведения кроликов из эксперимента, применяли наркоз (одномоментное внутривенное введение летальной дозы тиопентала натрия).

Всем животным интраоперационно создавали два костно-хрящевых дефекта надколенниковой поверхности мыщелков бедренной кости одной или обеих задних конечностей. С помощью зубоврачебного бора при малых оборотах формировали 2 цилиндрических костно-хрящевых дефекта. Диаметр дефектов был 2,5 мм, глубина - 5 мм (рис. 1).

Рис. 1. Интраоперационные костно-хрящевые дефекты надколенниковой поверхности мыщелков коленного сустава кролика

Кролики были разделены на три экспериментальные группы. В I (контрольную) группу вошли 15 животных (22 сустава), пластику дефектов суставной поверхности которым не выполняли. II группу сформировали 17 кроликов (20 суставов), у которых костно-хрящевые дефекты заполняли только бионосителем- аллогенной деминерализованной лиофилизированной спонгиозой, изготовленной по методике «Лиопласт». В III группу вошли 16 животных (24 сустава), которым проводили пластику дефектов комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами с аутологичными клетками реберной гиалиновой хрящевой ткани. У кроликов III группы предварительно осуществляли забор материала реберного гиалинового хряща для получения культур аутологичных клеток.

Для подтверждения жизнеспособности и пролиферативной активности клеток, иммобилизованных на бионосителе, использовали конфокальную и растровую электронную микроскопию.

Обследование животных проводили до создания костно-хрящевых дефектов и в динамике на сроках 2 недели, 1 месяц, 3 месяца, 6 месяцев после проведения оперативного вмешательства.

Выполняли осмотр животных, пользуясь разработанным нами способом оценки структурно-функционального состояния задней конечности. Проводили реовазографию симметричных сегментов задней конечности, вычисляя основные реографические параметры. Осуществляли термографию области оперированного коленного сустава. Применяли методы лучевой диагностики - рентгенологическое исследование со шкалой оценки рентгенологической картины и компьютерную томографию.

С целью визуализации области пластики дефектов и забора биопсийного материала осуществляли артротомию оперированных коленных суставов. Производили забор дистального эпифиза бедренной кости. Макропрепараты фиксировали в 10% растворе формалина.

Макроскопическую оценку коленных суставов животных в динамике производили с помощью специальной шкалы, разработанной S. О' Driscoll et al. Для микроскопической оценки материала изготавливали серийные срезы толщиной 5-6 мкм на всю глубину блока. Гистологические препараты окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизон, крезиловым фиолетовым. При оценке характера репаративного процесса в динамике использовали морфологическую шкалу оценки заживления поврежденного суставного гиалинового хряща, предложенную Д.А. Маланиным с соавторами (2004).

Полученные результаты анализировали с помощью традиционных методов описательной статистики с использованием регрессионного, дисперсионного и системного многофакторного анализа (Котельников Г.П. с соавт., 2001; Боровиков В.П., 2003; Лосев И.И., 2004). Применяли табличный редактор MS Excel со встроенным модулем для статистического анализа данных AtteStat (Гайдышев И., 2006). Статистические гипотезы проверялись при помощи t-критерия, U-критерия. Различия между исследуемыми группами считали статистически значимыми при вероятности безошибочного прогноза P = 95% и более, p <0,05.

На заключительном этапе строили математическую модель структурно-функционального состояния задней конечности кролика, с помощью которой, рассчитывая интегральные показатели Хвi, обосновывали теоретические положения, выявленные в ходе исследования.

Для обоснованного определения эффективности различных методов лечения мы так же проанализировали полученные результаты с позиции доказательной медицины (Котельников Г.П., Шпигель А.С., 2000).

Основные результаты исследований

Работа представляет собой экспериментальное исследование, выполненное на живых системах с целью оценки на доклиническом этапе эффективности нового способа восстановления посттравматических повреждений суставной гиалиновой хрящевой ткани. Суть способа заключается в создании интраоперационных костно-хрящевых дефектов и заполнении их комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами на основе аллогенной деминерализованной спонгиозы, изготовленной по методике «Лиопласт», и аутологичных клеток из рёберной хрящевой ткани (Патент РФ на изобретение № 2383310 от 10.03.2010).

Клеточный компонент комбинированного трансплантата получали из реберной гиалиновой хрящевой ткани. Через линейный разрез вдоль нижнего пальпируемого ребра вблизи грудино-реберного сочленения с помощью скальпеля выполняли забор фрагмента реберного хряща размером 0,2Ч0,1 см. Дефекты хряща не замещали. Полученный материал использовали для выращивания культур клеток в лаборатории ИЭМБ в течение 3-4 недель.

В качестве матрицы-носителя для клеток была выбрана аллогенная деминерализованная спонгиоза, изготовленная в Самарском банке тканей ИЭМБ по технологии «Лиопласт» из губчатого вещества эпифизов длинных трубчатых костей взрослых кроликов. Данный носитель был выбран благодаря особенностям его гистоархитектоники, хорошей биорезорбируемости и тропности клеток реберной гиалиновой хрящевой ткани к нему. Для создания комбинированного трансплантата аллогенную деминерализованную спонгиозу помещали в чашку Петри и заливали суспензией выращенных культур аутологичных клеток из реберной гиалиновой хрящевой ткани.

Матрица не оказывала на данные клетки какого-либо отрицательного воздействия. При растровой электронной микроскопии через сутки после посадки клеток на поверхности и в порах биоматериала наблюдали расправившиеся удлиненные клетки с 3-5 отростками (рис. 2). К концу седьмых суток поверхность спонгиозы покрывалась равномерным монослоем клеток.

Рис.2. Адгезия клеток на бионосителе. Растровая микрофотограмма. Увеличение 1000

При конфокальной микроскопии обнаруживали светящиеся флуоресцирующие клетки в глубинных слоях бионосителя.

Операцию пластики костно-хрящевых дефектов осуществляли, помещая в сформированные интраоперационно костно-хрящевые дефекты коленных суставов кроликов комбинированные клеточно-тканевые трансплантаты цилиндрической формы, соответствующие по размерам дефекту (рис. 3). После ушивания послеоперационной раны иммобилизацию конечности у кроликов не проводили.

Рис. 3. Комбинированные трансплантаты, помещённые в костно-хрящевые дефекты коленного сустава кролика

Обследование животных в ближайшие сроки наблюдения (спустя 2 недели после операции) показало постепенное снижение интенсивности болевого синдрома, уменьшение отека параартикулярных тканей. Отмечали улучшение опороспособности конечности, увеличение объема движений в суставах. В отдаленные сроки наблюдения (спустя 3 и 6 месяцев после операции) результаты обследования в экспериментальных группах отличались.

В группе животных с замещением дефектов комбинированными трансплантатами на протяжении всего наблюдения сохранялась положительная динамика. Отмечали быстрое купирование местной воспалительной реакции, активизацию животных, прогрессивное увеличение объема движений в суставах. К шести месяцам показатель структурно-функционального состояния конечности возрастал до 25±0,8 баллов, практически не отличаясь от значения у здоровых кроликов (27±0,6 баллов).

При пластике суставных дефектов только бионосителем, в ближайшие сроки наблюдения отмечали достаточно быстрое уменьшение явлений локальной воспалительной реакции, восстановление опороспособности конечности и увеличение объема движений в коленных суставах. Функциональное состояние нижних конечностей спустя 2 и 4 недели оценили в 15± 0,6 баллов и 21±0,5 баллов соответственно. В отдаленные сроки, тем не менее, наблюдали отрицательную динамику, которая выразилась в уменьшении объема движений в суставах и развитии гипотрофии мышц бедра и голени (20±0,5 баллов и 19±0,7 баллов к 3 и 6 месяцу со дня операции).

У кроликов без выполнения пластики суставных дефектов в отдаленные сроки отмечали прогрессирование гипотрофии мыщц бедра и голени, снижение их силы, нарастающее ограничение объема движений в суставе. К 3 месяцу со дня создания дефекта, состояние нижних конечностей животных оценивали в 17±0,7 баллов, а спустя 6 месяцев - всего в 15±0,7 баллов.

У всех животных после выполнения оперативного вмешательства наблюдали местный воспалительный процесс, проявляющийся в локальном повышении абсолютной температуры, регистрируемом при термографии (37,6±0,02 Сє). Длительность воспалительного процесса не имела значимых отличий в исследуемых группах животных. Также на ранних сроках во всех экспериментальных группах после операции наблюдалось повышение реографического индекса (0,94±0,02) и амплитудно-частотного показателя(1,3±0,05), что отражало увеличение величины и скорости притока крови к области оперативного вмешательства, а также увеличение объемного кровотока.

Показатели регионарной гемодинамики при пластике дефектов комбинированными трансплантатами, после увеличения на ранних сроках наблюдения имели тенденцию к снижению к первому месяцу после операции. Позже наблюдалась положительная динамика с увеличением реографического индекса (0,82± 0,02) и амплитудно-частотного показателя(0,96±0,05) и приближением их к нормальным показателям к концу наблюдения. На рентгенограммах и компьютерных томограммах коленных суставов в группе животных с пластикой дефектов комбинированными трансплантатами признаков развития и прогрессирования деструктивно-дистрофических процессов в суставе не наблюдали.

При исследовании регионарной гемодинамики на поздних сроках в группах животных без замещения дефектов и с выполнением пластики только бионосителем отмечалось снижение величины и скорости притока крови, а также объемного кровотока в области коленных суставов. При этом в группе без выполнения пластики дефектов показатели регионарной гемодинамики были особенно низкими (РИ=0,75±0,07, АЧП=0,8±0,04). На контрольных рентгенограммах и компьютерных томограммах животных этих групп отмечались признаки прогрессирующего остеоартроза- сужение суставной щели, образование остеофитов.

При макроскопическом исследовании области пластики дефектов комбинированными трансплантатами область операции, начиная с 3 месяца, не отличалась от окружающей суставной поверхности и гиалинового хряща здоровых животных. Ткань регенерата полностью восполняла дефекты, была блестящей, бело-голубого цвета. Спустя 6 месяцев в области операции имелась ровная суставная поверхность без видимых изъянов. В суставах кроликов этой группы не отмечали развития деструктивно-дистрофических процессов.

После пластики только бионосителем, макроскопически наблюдали анатомическое восстановление суставной поверхности. Однако регенераты этих зон визуально отличались от окружающей суставной поверхности - были шероховатыми, мутными, серого цвета с костной плотностью при пальпации инструментом. На поздних сроках наблюдения в суставах животных этой группы прогрессировал спаечный процесс, отмечали единичные случаи развития синовита.

Макроскопическое исследование коленных суставов животных без хондропластики в течение всего динамического наблюдения показало сохранение деформации суставной поверхности. Сформированные регенераты не достигали уровня окружающего гиалинового хряща, были тусклыми, серо-розовыми. Регенераты были значительно менее плотными, чем прилежащая гиалиновая хрящевая ткань. На поздних сроках наблюдения в суставах отмечали развитие спаечного процесса, избыточное образование жировой ткани, частые явления синовита.

При микроскопических исследованиях у кроликов, которым выполнялась пластика дефектов комбинированными трансплантатами, через 1 неделю в серийных срезах определяли пористый трансплантируемый материал, тесно спаянный с окружающими тканями. Прослеживали контуры трабекул пересаженной деминерализованной спонгиозы, все пространство которых было заполнено большим количеством активно пролиферирующих фибробластоподобных клеток. Клетки были продолговатой формы с двумя -тремя отростками, с центрально расположенным округлым ядром и ярко розовой цитоплазмой (рис.4 а,б).

Через 2 недели отмечали полиморфную картину в месте пластики. Область дефекта полностью выполняла ткань регенерата, представленная большим количеством пролиферирующих клеток, между которыми располагались небольшие фрагменты балок рассасывающегося трансплантата. Отмечали появление круглых клеток с центрально расположенным ядром, находящихся в состоянии спонтанной хондродифференцировки. В глубоких зонах регенерата наблюдали активную остеобластическую реакцию.

а б

Рис. 4 (а, б). Пролиферирующие фибробластоподобные клетки (указаны стрелками), заполняющие участки пористого бионосителя, спустя 1 неделю после операции. Окраска гематоксилин и эозин. Увеличение рис. 4а -200, рис. 4б - 400

К 3 месяцу наблюдения отмечали полное восполнение дефекта. Поверхность регенерата была покрыта вытянутыми плоскими клетками, плавно переходящими в поверхностный слой прилежащего гиалинового хряща. В некоторых участках поверхностного слоя наблюдали плотно лежащие группы мелких круглых активно пролиферирующих хондроцитов. В промежуточном слое гиалинового хряща отмечали большое количество хондроцитов, располагающихся в виде столбиков. Изогенные группы клеток были редки. Четкого разделения хряща на некальцинирующийся и кальцинирующийся слои не наблюдали. Пластинка субхондральной кости начинала восстанавливаться. В глубоких слоях обнаруживали зрелую губчатую кость. Через 6 месяцев наблюдения хорошо определяли все слои новообразованного суставного гиалинового хряща. Отмечали большое количество изогенных групп хондроцитов по 2-3 клетки в лакуне. В глубокой зоне четко наблюдали некальцинирующийся и кальцинирующийся слои, разделенные базофильной линией. Продолжалось восстановление субхондральной кости. Гиалиновая хрящевая ткань, прилегающая к месту пластики на протяжении всего эксперимента не была изменена, зональность её структуры всегда была хорошо выражена.

При пластике суставных дефектов только бионосителем на ранних сроках наблюдали участки рассасывающегося трансплантата в виде отдельных фрагментов безъядерной костной ткани губчатой формации. Бионоситель плотно сращивался с подлежащей костной тканью с помощью фиброзных перемычек. В костных балках губчатой кости отмечали расширенные полнокровные кровеносные сосуды и лакуны резорбции, выраженную остеобластическую реакцию. К завершению эксперимента наблюдали полное восполнение дефектов зрелой губчатой костной тканью, в которой отмечали формирование отдельных очагов остеорезорбции. В прилежащей гиалиновой хрящевой ткани на поздних сроках наблюдали явления вакуольной дистрофии хондроцитов, уменьшение количества изогенных групп клеток.

В группе животных без выполнения пластики морфологически костно-хрящевые дефекты в динамике постепенно заполнялись рыхлой волокнистой соединительной тканью, богатой капиллярами и мелкими клеточными элементами. Регенерат на всей глубине дефекта хорошо прорастал в подлежащие гиалиновый хрящ и губчатую костную ткань. С 3 месяца наблюдения в прилежащем к дефектам гиалиновом хряще прогрессировали дистрофические изменения, проявляющиеся в вакуольной дистрофии хондроцитов, их гибели и опустении лакун изогенных групп. К завершению эксперимента поверхность фиброзного регенерата не достигала уровня окружающего гиалинового хряща.

С помощью построенной математической модели структурно-функционального состояния задней конечности животного были получены следующие значения отклонения интегральных показателей.

В III экспериментальной группе животных, которым выполняли пластику дефектов комбинированными трансплантатами, на протяжении всего периода наблюдения в динамике значения отклонений интегральных показателей уменьшались, достигая к 6 месяцу со дня операции Хвi = -0,12±0,002. Это свидетельствовало о прогрессивном улучшении структурно-функционального состояния задних конечностей у животных исследуемой группы.

Во II группе кроликов, костно-хрящевые дефекты которых замещали только бионосителем, на протяжении 4 недель наблюдали уменьшение отклонения интегрального показателя - от Хвi = -0,22±0,003, спустя 2 недели после пластики, до Хвi = -0,17±0,004 на 4 неделе с начала эксперимента. Однако в дальнейшем отклонение интегрального показателя прогрессивно увеличивалось, достигая к 3 месяцу наблюдения Хвi = -0,33±0,003 и Хвi = -0,44±0,004, спустя 6 месяцев, что подтверждало ухудшение структурно-функционального состояния задних конечностей кроликов II группы.

В I группе животных без выполнения пластики, значения отклонений интегральных показателей прогрессивно увеличивались на протяжении всего наблюдения, составив к 6 месяцу Хвi = -0,64±0,003, что свидетельствовало о значительном нарушении структурного состояния и функции задних конечностей кроликов I группы (рис. 5).

Рис. 5 Динамика структурно-функционального состояния нижней конечности у животных разных экспериментальных групп по данным системного многофакторного анализа (значения Хвi)

С целью оценки полученных в эксперименте результатов с позиций доказательной медицины были вычислены следующие показатели (критерий достоверности во всех расчетах принимали как р=0,05):

1. Снижение абсолютного риска (САР). Выполнение пластики суставных костно-хрящевых дефектов только бионосителем (II группа) позволило снизить абсолютный риск развития неблагоприятных исходов на 46,4% по сравнению с отсутствием замещения дефектов суставной поверхности (I группа). Применение пластики костно-хрящевых дефектов комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами по разработанному нами способу (III экспериментальная группа) позволило снизить абсолютный риск на 82,2% по сравнению с группой I.

2. Снижение относительного риска (СОР). Относительный риск развития неблагоприятных исходов во II группе снижен на 53,7%, а в III группе на 95,1% по сравнению с I группой.

3. Повышение абсолютной пользы (ПАП). Повышение абсолютной пользы при выполнении пластики дефектов суставной поверхности только бионосителем - деминерализованной спонгиозой - составило 46,4% (группа II по сравнению с группой I). А при замещении костно-хрящевых дефектов комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами (группа III по сравнению с I группой) соответствующий показатель составил 82.2%.

4. Повышение относительной пользы (ПОП). Относительная вероятность получения благоприятного исхода в III группе животных по сравнению со II группой составила 59,7%.

Выводы

1. Разработан новый способ восстановления посттравматических повреждений суставной поверхности, заключающийся в создании интраоперационных костно-хрящевых дефектов и заполнении их комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами на основе аллогенной деминерализованной спонгиозы, изготовленной по методике «Лиопласт», и аутологичных клеток из рёберной хрящевой ткани.

2. Комплекс морфологических методов исследования с использованием растровой и конфокальной микроскопии свидетельствуют о том, что аллогенная деминерализованная биорезорбируемая спонгиоза поддерживает жизнеспособность и пролиферативную активность аутологичных фибробластоподобных клеток из реберной гиалиновой хрящевой ткани с последующей их хондродифференцировкой после трансплантации.

3. Результаты макроскопических и микроскопических методов исследования показали, что при заполнении костно-хрящевых дефектов комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами происходит восстановление суставной поверхности, органотипичная регенерация субхондральной кости и гиалиновой хрящевой ткани без деструктивных изменений прилежащего суставного гиалинового хряща.

4. У животных без пластики интраоперационных дефектов сохраняется деформация суставной поверхности и неполное замещение области повреждения волокнистой соединительной тканью, с развитием и прогрессированием дистрофии окружающей гиалиновой хрящевой ткани. При пластике только бионосителями происходит восстановление суставной поверхности с заполнением дефектов костно-фиброзными регенератами с очагами остеорезорбции и развитием в прилежащем гиалиновом хряще деструктивно-дистрофических процессов на поздних сроках.

5. Математическая модель, построенная на основании результатов примененного комплекса морфологических и функциональных методов исследования, позволила выявить, что отклонение интегрального показателя к завершению эксперимента у кроликов без выполнения пластики составило Хвi = -0,64±0,003; с замещением дефектов только бионосителями Хвi = -0,44±0,004. При пластике комбинированными трансплантатами значение Хвi максимально приближалось к показателям у здоровых кроликов и составило Хвi = -0,12±0,002.

6. Новый способ пластики суставных костно-хрящевых дефектов комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами доказал свою эффективность с позиций научно-обоснованной медицинской практики. Его применение позволило предотвратить развитие и прогрессирование в суставах животных вторичных деструктивных изменений, снизить риск развития возможных осложнений с 86,4% до 4,2% и достичь более полного и раннего восстановления функции конечностей.

Практические рекомендации

1. Посттравматические повреждения суставной поверхности необходимо лечить хирургическим путем, создавая интраоперационные костно-хрящевые дефекты и замещая их биопластическими материалами. Это способствует анатомическому восстановлению зоны повреждения и направлено на профилактику развития деструктивно-дистрофических процессов в гиалиновой хрящевой ткани сустава.

2. Для обеспечения репаративного хондрогенеза в области интраоперационных костно-хрящевых дефектов рекомендуется выполнять их пластику комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами на основе биорезорбируемого носителя и культуры аутологичных клеток из гиалиновой хрящевой ткани.

3. Для уменьшения травматичности операции хондропластики и повышения ее эффективности целесообразно осуществлять забор аутологичного материала вне сустава из реберной гиалиновой хрящевой ткани.

4. В качестве бионосителя для клеток рекомендуется использовать аллогенную деминерализованную лиофилизированную биорезорбируемую спонгиозу, созданную по методике «Лиопласт», которая поддерживает жизнеспособность, пролиферативную активность и последующую хондродифференцировку иммобилизованных на ней клеток.

5. Для оценки состояния задней конечности кролика при проведении экспериментальных исследований целесообразно применять, разработанную балльную шкалу структурно-функциональных характеристик.

6. Результаты, полученные в доклинических испытаниях нового способа восстановления посттравматических повреждений суставной поверхности комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами, подтверждают его эффективность и позволяют рекомендовать его для проведения клинических испытаний.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Котельников, Г.П. Использование аллогенных носителей для культуры клеток хрящевой ткани при хондропластике / Г.П. Котельников, Л.Т. Волова, Ю.В. Ларцев, В.В. Россинская, Д.С. Кудашев, Д.А. Долгушкин, М.А. Тер-Терян // «Инновационные технологии в трансплантации органов, тканей и клеток»: материалы Всероссийской конференции с международным участием. - Самара, 2008. - С. 191-193.

2. Котельников, Г.П. Применение комбинированного клеточно-тканевого трансплантата для лечения деструктивно-дистрофических заболеваний коленного сустава / Г.П. Котельников, Л.Т. Волова, В.В. Россинская, Д.А. Долгушкин, М.А. Тертерян // Материалы 18 международного конгресса европейской ассоциации клеточных банков. - Польша, Краков, 2009. - С. 249.

3. Долгушкин, Д.А. Новый способ пластики дефектов суставного гиалинового хряща комбинированным клеточно-тканевым трансплантатом / Д.А. Долгушкин // Аспирантские чтения - 2009 (приложение к межвузовскому журналу «Аспирантский вестник Поволжья»). - Самара, 2009. - С. 20-25.

4. Котельников, Г.П. Применение нового комбинированного клеточно-тканевого трансплантата при пластике дефектов суставного гиалинового хряща у кроликов / Г.П. Котельников, Л.Т. Волова, Д.А. Долгушкин, М.А. Тертерян // «Актуальные вопросы тканевой и клеточной трансплантологии»: материалы IV Всероссийского симпозиума с международным участием. - С.-Петербург, 2010. - С. 81.

5. Котельников, Г.П. Новый способ пластики дефектов суставного гиалинового хряща комбинированным клеточно-тканевым трансплантатом / Г.П. Котельников, Л.Т. Волова, Ю.Д. Ларцев, Д.А. Долгушкин, М.А. Тертерян // Травматология и ортопедия России. - С.-Петербург, 2010.- № 1.- С. 150-155.

6. Котельников, Г.П. Экспериментальное обоснование применения бионосителя клеток гиалиновой хрящевой ткани деминерализованной спонгиозы «Лиопласт®» для пластики дефектов суставного хряща у кроликов» / Г.П. Котельников, Л.Т. Волова, Ю.Д. Ларцев, Д.А. Долгушкин, М.А. Тертерян // Сборник тезисов IХ съезда травматологов-ортопедов. - Саратов, 2010. - том III. - С. 1114.

7. Котельников, Г.П. Применение аллогенного трехмерного наноструктурированного бионосителя в составе комбинированного клеточно-тканевого трансплантата для хондропластики у кроликов / Г.П. Котельников, Л.Т. Волова, Д.А. Долгушкин, М.А. Тертерян // Материалы 19 международного конгресса европейской ассоциации клеточных банков. - Германия, Берлин, 2010. - С. 46.

8. Долгушкин Д.А. Морфо-функциональная характеристика хондрорегенераторного процесса при пластике суставных костно-хрящевых дефектов комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами / Фундаментальные исследования. - Москва, 2011. - № 2. - С. 60-67.

9. Долгушкин Д.А. Структурная характеристика и рентгенологическая картина области суставных костно-хрящевых дефектов при их пластике комбинированными клеточно-тканевыми трансплантатами / Аспирантский вестник Поволжья. - Самара, 2011. - № 1-2. - С. 151-155.

10. Патент РФ на изобретение № 2383310 от 10.03.10 по заявке № 2008149207; Приоритет от 12.12.2008 г. (Россия). Способ восполнения дефектов суставного хряща / Г.П. Котельников, Л.Т. Волова, Ю.В. Ларцев, В.В. Россинская, Д.А. Долгушкин; Опубликовано 10.03.2010 г. Бюллетень № 7.

11. Способ оценки структурно-функционального состояния задних конечностей у кроликов в эксперименте. Удостоверение на рационализаторское предложение № 132 от 2.03.2011, выданное БРИЗ Самарского государственного медицинского университета.

Размещено на Allbest.ru