Биомаркеры локального и системного воспаления при хронической крапивнице

Размещено на http://www.allbest.ru/

Биомаркеры локального и системного воспаления при хронической крапивнице

14.03.09 - клиническая иммунология и аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Борзова Eлена Юрьевна

Москва 2012 г.

Диссертация выполнена в ГБОУ ДПО Российской медицинской академии последипломного образования Министерства здравоохранения Российской Федерации и в Университетской больнице Норфолка и Норвича (г. Норвич, Великобритания)

Научные консультанты:

Доктор медицинских наук профессор Ильина Наталья Ивановна

Доктор медицины Граттан Kлайв Eдмунд Hьюм

Официальные оппоненты: Латышева Татьяна Васильевна, доктор медицинских наук, профессор, заведующая отделением иммунопатологии взрослых ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России

Балаболкин Иван Иванович, доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН, главный научный сотрудник отделения пульмонологии и аллергологии Института педиатрии им. Г.Н.Сперанского ФГБУ «Научный центр здоровья детей» РАМН

Фассахов Рустэм Салахович, доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой аллергологии и иммунологии ГБОУ ДПО «Казанская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации

Ведущая организация: Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И.Мечникова РАМН

Защита диссертации состоится « 27 » февраля 2013 г. в 14 часов на заседании Совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 208.071.04 в ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России по адресу: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24, корп.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России.

Автореферат разослан «_____» _______________________ 2013 г.

Ученый секретарь Совета по защите докторских и

кандидатских диссертаций

доктор медицинских наук Сеславина Лия Сергеевна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Изучение хронической крапивницы является одной из актуальных задач современной аллергологии. Хроническая крапивница (ХК) Ї заболевание, характеризующееся возникновением на коже зудящих волдырей на протяжении более 6-ти недель. Распространенность ХК составляет 0.6% у взрослых (Gaig P., 2004) [, #1@@hidden]и 0.1-0.3% у детей (Khakoo G., 2008). Несмотря на то, что дебют ХК возможен в любом возрасте, заболевание встречается преимущественно у лиц в возрасте 20-40 лет (Maurer M., 2011). Снижение качества жизни больных ХК сопоставимо со снижением качества жизни при ишемической болезни сердца (O'Donnell B.F., 1997). По данным фармакоэкономического анализа, прямые и непрямые затраты на лечение больного ХК в США, в среднем, составляют $2047 в год (De Long L.K., 2008). Таким образом, медико-социальное значение ХК определяется pаспространенностью заболевания, преимущественным поражением лиц трудоспособного возраста, значительным снижением качества жизни пациентов, а также высоким уровнем прямых и непрямых затрат на лечение.

Современные принципы ведения больных ХК в клинической практике характеризуются эмпирическими подходами к терапии (Астафьева Н.Г. и др., 2009; Zuberbier T., 2009) и не учитывают особенностей патогенеза заболевания у отдельных групп пациентов. Концепция персонализированной медицины подразумевает выбор адекватной терапии на основании понимания механизмов заболевания и индивидуальных особенностей пациента с целью повышения эффективности и безопасности терапии, минимизации затрат государства и общества на лечение пациентов и рационального использования инновационных технологий (Кукес В.Г., 2008; Соколов А.А., 2010). Одним из направлений персонализированной медицины является интеграция определения биомаркеров в процесс ведения больных различными заболеваниями. Биомаркером является параметр, который можно объективно измерить и оценить как показатель физиологического процесса, патологического процесса или ответа на терапевтическое воздействие (Доклад Рабочей группы по определению биомаркеров Национального Института Здоровья США, 2001). Изучение патогенеза ХК открывает перспективы разработки принципов ведения пациентов с ХК с учетом клинических параметров, патогенетических особенностей и биомаркеров активности воспаления. Изучение системного воспаления при ХК основывается на определении биомаркеров воспаления в сыворотке и в периферической крови пациентов, тогда как локальное воспаление в коже оценивается при кожном тестировании и гистологическом исследовании биоптатов кожи.

Сведения о системном воспалении при ХК противоречивы и отражают гетерогенность патогенетических механизмов ХК. Среди основных патогенетических механизмов ХК выделяют накопление функциональных аутоантител к высоко-аффинному рецептору для IgE и к IgE на поверхности тучных клеток и базофилов (Hide M., 1993) и функциональные нарушения базофилов, обусловленные дефектами в сигнальных механизмах активации (Vonakis B.M., 2007). ХК, опосредованная накоплением функциональных гистамин-либерирующих аутоантител, считается аутоиммунной и встречается у 30-50% больных ХК среди взрослых и детей (Grattan C.E.H., 2004; Brunetti L., 2004). Аутоиммунная ХК диагностируется на основании теста высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров под действием сыворотки больных ХК (Hide M., 1993; Platzer M.H., 2005) и в России выявляется у 32.9% больных ХК (Борзова Е.Ю., 2004). Актуальность изучения аутоиммунной ХК обусловлена тяжестью течения данной формы заболевания, сложностью и малодоступностью методов диагностики в клинических условиях, а также перспективой применения особых методов терапии, включая циклоспорин (Grattan C.E.H., 2000) и омализумаб (Kaplan A.P., 2008). Разногласия о вкладе функциональных аутоантител и нарушений процессов активации и высвобождения гистамина из базофилов пациентов в патогенез ХК обусловлены техническими аспектами используемых методик и подходами к отбору пациентов в исследования (Eckman J.A., 2009; Grattan C.E.H., 2009). Разрешение этих противоречий необходимо для определения возможности применения гистамин-либерирующей активности сыворотки и функциональных нарушений базофилов как биомаркеров системного воспаления при ХК для разработки принципов патогенетического фенотипирования и мониторирования воспаления у больных ХК.

Локальное воспаление в коже при ХК характеризуется феноменом кожной аутореактивности. Кожная аутореактивность при ХК выявляется с помощью кожного тестирования с аутологичной сывороткой. ХК, ассоциированная с положительной внутрикожной пробой с аутологичной сывороткой, считается аутореактивной. По данным разных исследователей частота выявления положительной пробы с аутологичной сывороткой составляет 42-67% (Asero R., 2001; Nettis E., 2002; O'Donnell B.F., 2005). В России частота аутореактивной ХК составляет 59.6% среди больных ХК (Борзова Е.Ю., 2004). Гистамин-либерирующие аутоантитела выявляются лишь у половины больных ХК с положительной внутрикожной пробой с аутосывороткой (Sabroe R.A., 1999; Борзова Е.Ю., 2004), тогда как у остальных пациентов механизмы кожной аутореактивности остаются неизвестными. Более тяжелое течение ХК у пациентов с положительной внутрикожной пробой с аутологичной сывороткой свидетельствует о роли кожной аутореактивности как биомаркера локального воспаления при ХК (Metz М., 2009). В последние годы возрос интерес к применению внутрикожной пробы с аутологичной плазмой у больных ХК, учитывая сведения о её возможной высокой диагностической ценности для выявления аутореактивной ХК (Asero R., 2006). Сравнительные исследования результатов внутрикожного тестирования с аутологичными сывороткой и плазмой малочисленны, их результаты противоречивы (Metz M., 2009, Altrich M.L., 2009) и до сих пор неясно, результат какого метода более специфичен как маркер локального воспаления при ХК.

Биомаркеры локального воспаления в коже также применяются для дифференциальной диагностики крапивницы и уртикарного васкулита (УВ). Основным дифференциально-диагностическим методом является гистологическое исследование биоптатов кожи в области уртикарных высыпаний. Ключевым гистологическим отличием УВ от крапивницы является повреждение посткапиллярных венул поверхностного венозного сплетения дермы, сопровождающееся экстравазацией эритроцитов и/или фибриноидными отложениями в сосудистой стенке и в периваскулярном пространстве, а также лейкоцитоклазией, представляющей собой фрагментацию нейтрофилов с образованием нуклеарного детрита (продуктов распада ядер нейтрофилов) [Monroe E.W.,1981].

Различные фазы и степень выраженности процесса определяют трудности гистологической дифференциальной диагностики крапивницы и УВ в клинической практике. Наличие переходных форм заболевания у 15-20% больных ХК [Tosoni C., 2008; Monroe E.W., 1981] свидетельствует о необходимости совершенствования методов выявления биомаркеров локального воспаления в коже для ранней диагностики УВ в связи с особенностями прогноза, сопутствующей патологии и подходов к терапии. В связи с этим, представляется актуальным анализ существующих подходов и поиск новых методов выявления биомаркеров локального воспаления для дифференциальной диагностики крапивницы и УВ. В связи с новыми сведениями о клеточной гибели нейтрофилов с формированием «внеклеточных ловушек» (Steinberg B.E., 2007), представляет интерес изучение особенностей лейкоцитоклазии как биомаркера локального воспаления при дифференциальной диагностике крапивницы и УВ.

Таким образом, изучение патогенеза ХК с целью выявления биомаркеров системного воспаления является перспективным направлением для патогенетического фенотипирования больных ХК и мониторирования активности воспаления при ХК. Поиск и изучение новых методов выявления биомаркеров локального воспаления кожи способствует оптимизации выявления кожной аутореактивности при ХК и совершенствованию дифференциальной диагностики крапивницы и УВ.

Цели исследования

Целью исследования явилось изучение патогенетических механизмов ХК, проведение патогенетического фенотипирования больных ХК, выявление биомаркеров активности системного воспаления при ХК и определение биомаркеров локального воспаления для выявления кожной аутореактивности при ХК и дифференциальной диагностики крапивницы и уртикарного васкулита.

Задачи исследования

1. выявить диагностические биомаркеры патогенетических фенотипов ХК и охарактеризовать патофизиологические фенотипы ХК;

2. изучить клиническую и патогенетическую характеристику аутоиммунной ХК;

3. изучить корреляционные связи между клиническими параметрами оценки тяжести ХК;

4. выявить и охарактеризовать биомаркеры активности воспаления при ХК и провести корреляционный анализ между клиническими параметрами и биомаркерами активности воспаления при ХК;

5. изучить взаимоотношения между биомаркерами активности воспаления при ХК;

6. изучить кожную аутореактивность к аутологичным сыворотке и плазме у больных ХК и оценить конкордантность результатов внутрикожного тестирования с аутологичными сывороткой и плазмой у больных ХК.

7. изучить диагностическую значимость метода иммуногистохимического исследования миелопероксидазы нейтрофилов в биоптатах кожи больных крапивницей и УВ и провести сравнительный анализ иммуногистохимического исследования миелопероксидазы нейтрофилов с традиционным методом окрашивания гематоксилином и эозином для дифференциальной диагностики крапивницы и УВ.

Научная новизна

Впервые применено комплексное обследование больных ХК с использованием теста высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров под действием сыворотки больных ХК и теста высвобождения гистамина из базофилов больных ХК при анти-IgE-стимуляции.

Впервые разработана классификация патофизиологических фенотипов ХК на основании наличия функциональных аутоантител в сыворотке крови и функциональных характеристик базофилов периферической крови пациентов. хронический крапивница аутоиммунный биомаркер

Впервые выявлены и доказаны корреляционные связи между показателями клинической оценки тяжести ХК на основании дневников самонаблюдения, визуальных аналоговых шкал и оценки количества уртикарных высыпаний при клиническом исследовании.

Впервые установлена отрицательная корреляционная связь между гистамин-либерирующей активностью сыворотки по отношению к базофилам здоровых доноров и количеством базофилов периферической крови у больных ХК.

Впервые применен метод иммуногистохимического исследования миелопероксидазы нейтрофилов в биоптатах кожи для дифференциальной диагностики крапивницы и УВ.

Впервые показано преимущество использования иммуногистохимического исследования миелопероксидазы нейтрофилов в биоптатах кожи для выявления лейкоцитоклазии в сочетании с традиционным окрашиванием гематоксилином и эозином для дифференциальной диагностики крапивницы и УВ.

Научно-практическая значимость

Впервые разработана методическая основа для практического использования диагностических биомаркеров патофизиологических фенотипов ХК. Дана клинико-патогенетическая характеристика наиболее тяжелой формы заболевания - аутоиммунной ХК. Доказана возможность использования в качестве биомаркеров активности системного воспаления при ХК гистамин-либерирующей активности сыворотки больных ХК по отношению базофилов здоровых доноров и количества базофилов периферической крови больных ХК. Охарактеризована кожная аутореактивность у больных ХК и показана возможность практического применения внутрикожных проб с аутологичными сывороткой и плазмой для диагностики аутореактивной ХК. Показана диагностическая значимость иммуногистохимического определения миелопероксидазы нейтрофилов для дифференциальной диагностики крапивницы и УВ и возможность применения данного метода в дополнение к рутинному окрашиванию биоптатов кожи гематоксилином и эозином.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Патофизиологические фенотипы ХК включают фенотип с высвобождением гистамина более 30% от общего содержания гистамина; фенотип с высвобождением гистамина 10-30% от общего содержания гистамина; фенотип с отсутствием высвобождения гистамина (<10% от общего содержания гистамина) и фенотип с неопределяемым уровнем гистамина (ниже чувствительности метода спектрофлюориметрии).

2. Аутоиммунная ХК характеризуется тяжелым течением заболевания, высокой гистамин-либерирующей способностью сыворотки в отношении базофилов здоровых доноров, неопределяемым уровнем гистамина (ниже чувствительности метода спектрофлюориметрии) и базопенией периферической крови.

3. Способность сыворотки больных ХК к высвобождению гистамина из базофилов здоровых доноров и количество базофилов периферической крови являются биомаркерами активности системного воспаления при ХК.

4. Кожная аутореактивность является биомаркером локального воспаления при ХК. Внутрикожное тестирование с аутологичными сывороткой и плазмой является методом выявления кожной аутореактивности при ХК. Результаты кожных проб с аутологичными сывороткой и с плазмой совпадают у 78.8% больных ХК (индекс конкордантности Кендалла W=0.57, p<0.001).

5. Иммуногистохимическое определение миелопероксидазы нейтрофилов в биоптатах кожи является высокочувствительным методом детекции лейкоцитоклазии как биомаркера локального воспаления для дифференциальной диагностики крапивницы и уртикарного васкулита.

Внедрение результатов работы в практику

Результаты диссертационного исследования могут быть использованы в практическом здравоохранении и в образовательном процессе для студентов медицинских ВУЗов, в учебных программах повышения квалификации в системе последипломного образования по вопросам клинической иммунологии и аллергологии.

Количественное определение базофилов периферической крови, внутрикожное тестирование с аутологичными сывороткой и плазмой используется в клинической практике ФГБУ "ГНЦ Института иммунологии" ФМБА России и Университетской больницы Норфолка и Норвича (г. Норвич, Великобритания). Иммуногистохимическое определение миелопероксидазы нейтрофилов в биоптатах кожи используется для дифференциальной диагностики крапивницы и уртикарного васкулита в клинической практике Университетской больницы Норфолка и Норвича (г. Норвич, Великобритания).

Ценность научных работ соискателя подтверждается тем, что экспериментальные данные, полученные в исследовании, включены в международное многоцентровое исследование по проблеме кожной аутореактивности при ХК и вошли в отечественные и международные согласительные документы. Работа по дифференциальной диагностике крапивницы и УВ отмечена грантом British Skin Foundation (Великобритания).

Апробация диссертации.

Основные результаты диссертационной работы были представлены:

– на I Международном Конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии», Москва, Россия, 2005г.;

– на XXVII Конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии, Барселона, Испания, 2008г.;

– на X Международном Конгрессе Российской Ассоциации аллергологов и клинических иммунологов, Казань, Россия, 2009г.;

– на V Российском Конгрессе по детской аллергологии и клинической иммунологии, Москва, Россия, 2009г.;

– на Школе аллергии Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии, Норвич, Великобритания, 2009г.;

– на Семинаре по крапивнице и анафилаксии Академии Аллергии Королевского Колледжа Лондона, Лондон, Великобритания, 2009г.

– на Конференции по аллергии кожи, Венеция, Италия, 2010г.;

– на 90-м Конгрессе Британской Ассоциации Дерматологов, Манчестер, Великобритания, 2010г.;

– на Конгрессе Британского Общества Исследовательской Дерматологии, Эдинбург, Великобритания, 2010г.;

– на XXVIII Конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии, Лондон, Великобритания, 2010г.;

– на XXX Конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии, Стамбул, Турция, 2011г.;

– на XXXI Конгрессе Европейской Академии Аллергологии и Клинической Иммунологии, Женева, Швейцария, 2012г.

– на Межрегиональном Форуме «Клиническая иммунология и аллергология - междисциплинарные проблемы», Казань, Россия, 2012г.;

– на 21-ом Конгрессе Европейской Академии Дерматологии и Венерологии, Прага, Чешская Республика, 2012г.

Публикации

Основные результаты диссертации опубликованы в 12 статьях в 8 научных периодических изданиях, которые входят в перечень научных периодических изданий, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации для публикации материалов докторских и кандидатских диссертаций, 3 публикациях в материалах международных научных конгрессов, а также в 1 книге, 1 учебном пособии и 1 руководстве для врачей. Материалы работы вошли в Российский национальный согласительный документ по крапивнице и ангиоотеку (2007 г.) и Европейский консенсус по физическим крапивницам (2009 г.) Исследование дифференциально-диагностических критериев крапивницы и УВ отмечено грантом British Skin Foundation Великобритании.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 270 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, 3 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций, списка литературы и приложения. Работа содержит 32 таблицы и иллюстрирована 43 рисунками. Библиографический указатель содержит 318 литературных источников, из которых 60 отечественных и 258 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Материалом для настоящей работы явились данные клинического обследования 103 пациентов в возрасте от 16 до 80 лет с диагнозом ХК, находившихся на амбулаторном наблюдении в Университетской больнице Норфолка и Норвича (г. Норвич, Великобритания) с 2006 г. по 2012 г.; данные внутрикожного тестирования с аутологичными сывороткой и плазмой у 80 больных ХК, проводимом в Клинике крапивницы в Университетской больнице Норфолка и Норвича (г. Норвич, Великобритания); данные проспективного исследования патофизиологических подтипов и их биомаркеров у 23 больных ХК c 2009г. по 2012г.; данные ретроспективного анализа историй болезни и гистологического материала, полученного от 100 пациентов с крапивницей и УВ, у которых проводилось гистологическое исследование биопсий кожи в Университетской больнице Норфолка и Норвича (г. Норвич, Великобритания) в период с 1989 г. по 2012 г.

Проспективное исследование патофизиологических фенотипов ХК и их биомаркеров

Исследование разработано как проспективное обсервационное продольное исследование с 3-х кратным забором материала на протяжении 6 месяцев. В ходе исследования набор пациентов с ХК проводился во время амбулаторных приемов в Университетской больницы Норфолка и Норвича (г. Норвич, Великобритания) с января 2009 г. по август 2011 г. Исследование одобрено Норфолкским Этическим Комитетом и информированное согласие получено у пациентов перед проведением исследования. Финансовое обеспечение исследования осуществлялось из Фонда клинических исследований E10 дерматологического отделения Университетской больницы Норфолка и Норвича г.Норвич (Великобритания) и за счет спонсорской помощи компании Glaxo Smith Kline (Великобритания).

Критерии включения в исследование:

1. возраст старше 18 лет

2. хроническое непрерывное течение ХК

3. лечение антигистаминными и/или антилейкотриеновыми препаратами.

Критериям исключения в исследование:

1. преобладающие физические крапивницы

2. ХК с установленной причиной инфекционного, аллергического, лекарственного или физического характер

3. гистологически подтвержденный уртикарный васкулит

4. лечение глюкокортикостероидами, циклоспорином или метотрексатом в момент начала исследования или в течение последнего месяца перед исследованием.

Методы исследования в проспективном исследовании патофизиологических фенотипов ХК и их биомаркеров

1. Оценка клинической активности ХК

На каждом визите пациенты измеряли активность симптомов ХК с помощью визульных аналоговых шкал, отражающих интенсивность зуда и интенсивность уртикарных высыпаний на протяжении недели, предшествующей забору крови. Также пациенты ежедневно вели дневники самонаблюдения. Активность ХК измерялась с помощью индекса активности крапивницы, который представляет собой сумму баллов количества высыпаний (0 = высыпания отсутствуют; 1 = 1-10 волдырей (диаметром < 3см); 2 = 11-50 волдырей менее 3см в диаметре или 1-10 крупных волдырей более 3см в диаметре; 3 > 50 волдырей менее 3 см в диаметре или 11-50 крупных волдырей; 4 = волдыри почти полностью покрывают тело пациента) и баллов интенсивности зуда (0=отсутствует, 1= легкий, 2=средней тяжести, 3=тяжелый) на основании дневников самонаблюдения пациента. Индекс активности крапивницы -7 представляет собой сумму ежедневных баллов интенсивности зуда и количества высыпаний в течении недели, предшествующей забору крови. Индекс активности крапивницы-7 варьирует от 0 до 49 баллов. Кроме того, оценивалось количество высыпаний во время визита в день забора крови.

2. Тест высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров под действием сыворотки больных ХК

Тест высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров под действием сыворотки больных ХК использовался для выявления функциональных аутоантител с целью диагностики аутоиммунной ХК. Для теста высвобождения гистамина из базофилов под действием сыворотки больных ХК, базофилы здоровых доноров инкубировались с 40мкл сыворотки пациентов в разведении 1:4 и 1:8 в течении 60 мин при 37°С. После удаления супернатанта клетки лизировали 20мкл 7% (пер)хлорной кислотой. После клеточного лизиса и добавления 200мкл буфера PIPES, образцы центрифугировали при 2000g в течение 10 мин. Содержание гистамина в фильтрованном образце определяли с использованием стекловолокнистого материала. Высвобождение гистамина выражали как процент от общего содержания гистамина в образце. Тест высвобождения гистамина из базофилов доноров под действием сыворотки больных ХК выполнялся в лаборатории RefLab Университета Копенгагена в Дании под руководством профессора Per Stahl Skov.

3. Выделение базофилов периферической крови и тесты высвобождения гистамина из базофилов больных ХК

Выделение базофилов периферической крови у больных ХК производили путем центрифугирования в градиенте плотности Ficoll. Содержание базофилов определяли с помощью окрашивания альциановым синим. Базофилы помещали в раствор Тироде, забуференный HEPES (400µл в каждой пробирке) и содержащий 1 ммоль/л CaCl₂. После короткой инкубации (15 мин при 37°C) клетки стимулировали серией разведений анти-IgE-антителами и fMLP. Отрицательный контроль включал инкубацию клеток только буфером, при этом определялось спонтанное высвобождение гистамина базофилами больных ХК. Стимуляцию базофилов осуществляли в течение 15 мин, реакцию останавливали добавлением ледяного HEPES-буфера без кальция. После центрифугирования образцов супернатанты немедленно переносили в новые пробирки. Клеточный осадок лизировали 4% перхлорной кислотой. Содержание гистамина в супернатантах и в клеточном осадке определяли с помощью спектрофлюориметрии. Высвобождение гистамина определяли по отношению к общему содержанию гистамина как сумме его содержания в супернатанте и клеточном осадке. Тестирование высвобождения гистамина из базофилов больных ХК выполнено доктором Bernhard Gibbs Мэдвей в Школе Фармакологии Университета Кента и Гринвич в Великобритании.

Изучение кожной аутореактивности у больных ХК

Критерии включения в исследование:

1. Возраст больных: 16-80 лет

2. Продолжительность крапивницы более 6 недель

Критерии исключения из исследования:

1. ХК с установленной причиной (аллергическая, физические и др.)

2. Изолированные ангиоотеки

3. Уртикарный васкулит

4. Постоянный прием пероральных системных глюкокортикостероидов, циклоспорина и метотрексата по поводу ХК и сопутствующих заболеваний

5. Беременность, лактация

6. Вирусоносительство гепатитов В и С

7. Психические заболевания, низкий уровень кооперации, склонность к антагонизму, нежелание участвовать в исследовании.

Методы исследования при амбулаторном обследовании больных ХК в клинике крапивницы Университетской больницы (г. Норвич, Великобритания)

1. Клинические параметры

При объективном обследовании и с помощью дневников самонаблюдения оценивали тяжесть ХК согласно критериям, установленным в 2001г. международным консенсусом по определению, классификации и диагностике крапивницы, при этом симптомы ХК (зуд, количество высыпаний, диаметр высыпаний) оценивались по 4-х бальной шкале [Zuberbier T., 2001].

2. Внутрикожное тестирование с аутологичными сывороткой и плазмой

При внутрикожном тестировании с аутологичными сывороткой и плазмой антигистаминные препараты отменяли у всех больных ХК за 72 часа до постановки пробы, доксепин и другие трициклические антидепрессанты - за 14 дней до исследования. Для получения аутологичной сыворотки забор крови в объеме 5 мл осуществляли пунктированием кубитальной вены у больных ХК натощак в утренние часы с помощью пластиковых вакуумных пробирок без антикоагулянта (Вакутейнер, Beckton Dickenson, Великобритания). Для получения аутологичной плазмы забор крови проводили в объеме 3 мл с использованием вакутейнера с цитратом натрия в качестве антикоагулянта. После седиментации образцов крови в течении 30 мин при комнатной температуре проводили центрифугирование при 300g в течении 8 мин. Свежую сыворотку и плазму использовали для внутрикожного тестирования в день забора крови. Внутрикожное тестирование осуществляли путем введения 50 мкл неразведенной аутологичной сыворотки и 50 мкл неразведенной аутологичной плазмы. Положительным контролем внутрикожной пробы с аутологичной сывороткой и аутологичной плазмой являлось внутрикожное или прик-тестирование раствором гистамина (Allergopharma, Швеция) согласно рекомендациям международного консенсуса по внутрикожной пробе с аутологичной сывороткой при ХК [Konstantinou G., 2009]. Отрицательный контрольный тест выполнялся с помощью внутрикожного тестирования 50 мкл 0.9% раствора NaCl. Внутрикожное тестирование проводили в области предплечья. Расстояние между каждой внутрикожной инъекцией составляло не менее 5 см. Оценку реакции проводили через 30 мин. Внутрикожная проба с аутологичными сывороткой или плазмой расценивалась как положительная при возникновении в месте инъекции гиперемии и волдыря диаметром на 2 мм больше, чем в отрицательном контроле.

3. Тестирование с помощью дермографометра для диагностики симптоматического дермографизма и замедленной крапивницы от давления

Для кожного тестирования с целью диагностики симптоматического дермографизма металлическим аппликатором проводили три параллельные линии (длиною 10см), соответствующие значениям дермографометра 20, 36 и 60 г/мм³. Формирование волдыря в ответ на применение давления менее 36 г/мм³ считалось диагностическим для симптоматического дермографизма. Для диагностики замедленной крапивницы от давления с помощью дермографометра моделировали статическое давление, равное 100 г/мм³ в области лопатки под прямым углом в течении 70 секунд. Результаты тестирования оценивались через 2-6 часов и на следующее утро. Образование отечной папулы в диаметре 3мм и более через 2-24 часа считалось положительным результатом кожного тестирования с помощью дермографометра для диагностики замедленной крапивницы от давления.

4. Исследование тиреоидных аутоантетел

Исследование уровня антител к тиреоидной пероксидазе проводили методом радиоиммунного анализа. Нормальные показатели уровня антител к тиреоидной пероксидазе - 0-30 кЕд/л.

Пересмотр диагностических критериев УВ: ретроспективное исследование клинического и гистологического материала, полученного от больных крапивницей и УВ

Для ретроспективного анализа клинического и гистологического материала больных крапивницей и УВ за период с 1989г. по 2012г., проведен анализ диагностической базы данных отделения патоморфологии Университетской больницы Норфолка и Норвича для выявления пациентов с гистологическим диагнозом «крапивница» или «уртикарный васкулит». Затем, проведен анализ историй болезни этих больных для отбора пациентов с клиническим диагнозом крапивницы или УВ.

Критерии включения для больных крапивницей:

1. Диагноз острой или хронической крапивницы

2. Описание уртикарных высыпаний в истории болезни

Критерии исключения для больных крапивницей:

1. Изолированные физические крапивницы

Критерии включения для больных УВ:

1. Клинический диагноз УВ в истории болезни

2. Описание уртикарных высыпаний, характерных для УВ

Критерии исключения для больных УВ:

1. Другие формы васкулитов

Исследование одобрено Норфолкским Этическим Комитетом и отмечено грантом British Skin Foundation (Великобритания).

Методы исследования при изучении диагностических критериев УВ

2. Исследование биоптатов кожи с помощью окрашивания гематоксилином и эозином и иммуногистохимического определения миелопероксидазы нейтрофилов

Окрашивание биоптатов кожи гематоксилином и эозином проводили по стандартной методике. Для иммуногистохимического исследования парафиновые срезы биоптатов кожи подвергали депарафинизации в ксилоле и регидратации в спиртах нисходящей концентрации по стандартной методике. Для теплового демаскирования антигена проведена термическая обработка парафиновых срезов в EDTA буфере с повышением температуры до 100°С в течении 20 мин и с последующим охлаждением до комнатной температуры. Двойное иммуногистохимическое окрашивание проводилось с антителами к фактору фон Виллебранда - маркеру эндотелия - для визуализации сосудов и к миелопероксидазе нейтрофилов для выявления лейкоцитоклазии. Визуализация активности щелочной фосфатазы проводилась при помощи быстрого красного, активности пероксидазы хрена - с помощью диаминобензидина.

Статистический анализ результатов исследований проводили с помощью программного обеспечения Minitab 16.2.2 с использованием параметрических и непараметрических методов. Данные представлены в формате средние значения ± стандартное отклонение. Корреляционные связи изучены с помощью коэффициента корреляции Пирсона. Для парных сравнений использован метод парных сравнений Тьюки. Для изучения согласованности результатов между двумя методами исследований использован анализ конкордантности с помощью индекса конкордантности Кендалла.

Результаты исследования и их обсуждение

1. Проспективное исследование патогенетических фенотипов ХК и их биомаркеров

Прогресс в понимании патофизиологии, генетики и молекулярной биологии способствует интеграции определения биомаркеров в процесс принятия клинических решений и определения тактики ведения больных. Внедрение определения биомаркеров в клиническую практику существенно оптимизировало ведение больных с сахарным диабетом, остеопорозом, раком молочной железы и т.д. Изучение биомаркеров системного воспаления при ХК открывает перспективы патогенетического фенотипирования пациентов с ХК и выбора адекватной терапии на основании патогенетических особенностей и уровня биомаркеров активности воспаления согласно принципам персонализированной медицины.

Согласно критериям включения и исключения в исследование включены 23 пациента с ХК (18 женщин и 5 мужчин) для проспективного наблюдения и мониторирования воспаления при трехкратном заборе периферической крови на протяжении периода наблюдения. Всего 19 пациентов закончили исследование (4 пациента прекратили участие в исследовании, из них 3 пациента по личным обстоятельствам и 1 пациентка по беременности). В среднем, период наблюдения пациентов в ходе исследования составил 180 дней. Средний возраст пациентов составил 49.17 лет (19-68 лет). Продолжительность заболевания составила 8.2 года (5 мес - 42 лет). У 16 пациентов отмечалось непрерывное течение ХК, у 7 пациентов - рецидивирующее течение ХК.

Среди сопутствующих заболеваний у двух пациентов выявлено ограниченное витилиго, у одной пациентки рассеянный склероз. При обследовании у 4 пациентов выявлено повышение антитиреоидных аутоантител. Внутрикожная проба с аутологичной сывороткой положительна у 18 (78%) пациентов.

Антигистаминная терапия ХК у 13 пациентов проводилась фексофенадином, у 9 пациентов - цетиризином и у одного пациента - левоцитиризином. У 7 пациентов антигистаминная терапия проводилась в стандартных дозах, у 16 пациентов - в дозах, превышающих в 2-4 раза стандартные. У 5 пациентов терапия антигистаминными препаратами сочеталась с Н2-блокаторами гистамина (ранитидин, циметидин), у 4 пациентов - с антилейкотриеновыми препаратами (монтелукаст), у 2 пациентов - с доксепином.

Взаимосвязь клинических параметров оценки активности ХК

Согласно международным согласительным документам по диагностике крапивницы (Zuberbier T., 2009), объективная оценка тяжести ХК проводится на основании суммы баллов интенсивности зуда и уртикарных высыпаний. Индекс активности крапивницы является валидированным и специфическим для ХК методом оценки тяжести заболевания (Baiardini, 2011). Применение индекса активности крапивницы рекомендовано для рутинной клинической практики согласительными документами Европейской Академии аллергологии и клинической иммунологии (Baiardini, 2011). Установлено, что важным является использование индекса активности крапивницы для оценки тяжести ХК на протяжении не менее 4 дней, а оптимально в течении 7 дней (Mlynek A., 2008, Baiardini I., 2011). Индекс активности крапивницы-7 представляет собой сумму баллов интенсивности зуда и уртикарных высыпаний на основании дневников самонаблюдения пациентов на протяжении 7 дней [Mlynek A., 2008]. Рекомендовано применение индекса активности крапивницы для оценки тяжести заболевания, а также для оценки изменений тяжести ХК в ходе лечения или естественного течения заболевания (например, развития спонтанной ремиссии и т.д.). Кроме того, в некоторых клинических исследованиях использованы визуальные аналоговые шкалы для оценки интенсивности зуда и интенсивности уртикарных высыпаний на протяжении недели, предшествующей клиническому обследованию (Grattan C.E.H., 1997). Во время клинического осмотра возможна оценка количества высыпаний у больных ХК, однако, ценность этого метода для объективной оценки тяжести заболевания неизвестна в виду выраженной суточной вариабельности интенсивности высыпаний при ХК. Сравнительный анализ оценки тяжести ХК с помощью индекса активности крапивницы 7, визуальных аналоговых шкал и оценки количества уртикарных элементов во время осмотра не проводился. Изучение ценности данных клинических параметров для оценки тяжести ХК имеет важное практическое значение и требует уточнения.

При корреляционном анализе выявлены выраженная корреляционная связь между активностью ХК на основании визуальной шкалы оценки интенсивности зуда за последнюю неделю и индекса активности крапивницы-7 (коэффициент корреляции Пирсона - 0.77, p<0.001), визуальной шкалы интенсивности высыпаний за последнюю неделю и индекса активности крапивницы-7 (коэффициент корреляции Пирсона - 0.905, р<0.001), количества высыпаний во время визита и индекса активности крапивницы-7 (коэффициент корреляция Пирсона - 0.675, р<0.001).



Выявленные корреляционные взаимосвязи позволяют заключить, что исследуемые клинические параметры (индекс активности крапивницы - 7, интенсивность зуда и уртикарных высыпаний на основании визуальных аналоговых шкал, количество уртикарных высыпаний при клиническом осмотре) являются сопоставимыми и информативными методами оценки тяжести ХК. Поскольку индекс активности крапивницы рекомендован как «золотой стандарт» для оценки тяжести ХК международным консенсусом по обследованию больных ХК (Zuberbier T., 2009), то сравнение результатов оценки тяжести ХК с помощью визуальных шкал и при клиническом осмотре с индексом активности крапивницы позволяет судить об информативности и клиническом значении этих методов. Установлено, что результаты оценки интенсивности зуда и уртикарных высыпаний при ХК с помощью визуальных шкал характеризуются выраженной корреляционной связью с индексом активности крапивницы, особенно оценка интенсивности уртикарных высыпаний с помощью визуальных шкалы. В связи с этим, использование визуальных шкал для оценки интенсивности зуда и уртикарных высыпаний за предшествующую неделю является удобной альтернативой для клинической оценки тяжести заболевания при первичном осмотре больных ХК при отсутствии дневников самонаблюдения. При дальнейшем наблюдении, пациентам с ХК должно быть рекомендовано ведение дневников самонаблюдения для оценки тяжести ХК с помощью индекса активности крапивницы. Умеренная корреляционная связь между количеством высыпаний на момент осмотра и индексом активности крапивницы-7, по-видимому, обусловлена суточной вариабельностью уртикарных высыпаний. В связи с этим можно заключить, что количество высыпаний у больных ХК на момент осмотра может не полностью отражать тяжесть течения заболевания у больных ХК и требует использования индекса активности крапивницы при ведении больных ХК.

Патогенетическое фенотипирование больных ХК

Попытки патогенетического фенотипирования больных ХК предпринимались различными исследователями на основании разных классификационных принципов. В 2002г. проведена классификация больных ХК на основании наличия или отсутствия функциональных анти-FcеRIб-аутоантител при ХК (Sabroe R.A., 2002). Установлено, что аутоиммунная ХК, ассоциированная с накоплением гистамин-либерирующих анти-FcеRIб-аутоантител характеризуется более тяжелым течением болезни (Sabroe R.A., 2002). В 2007г. новые сведения о нарушениях сигнальных каскадов активации базофилов позволили классифицировать больных ХК на основании наличия или отсутствия высвобождения гистамина из базофилов периферической крови пациентов с ХК при стимуляции анти-IgE-антителами (Vonakis B.M., 2007). При изучении клинической характеристики фенотипов ХК с различными характером высвобождения гистамина из базофилов оказалось, что ХК, ассоциированная с высвобождением гистамина из базофилов в ответ на анти-IgE-стимуляцию, характеризуется более высокими индексами зуда (Baker R., 2008).

При проспективном исследовании высвобождения гистамина из базофилов пациентов при анти-IgE-стимуляции и уровня анти-FcеRIб-аутоантител у больных ХК, установлено, что степень высвобождения гистамина из базофилов пациентов при анти-IgE-стимуляции нарастает по мере снижения тяжести заболевания у пациентов (Eckman J.A., 2007). Однако, в данном исследовании отсутствовали изменения уровня анти-FcеRIб-аутоантител в обострение и в ремиссию ХК. С связи с этим, возникли противоречия в мнениях о патогенетической роли анти-FcеRIб-аутоантител при ХК (Grattan C.E.H., 2009).

Данное исследование возобновило научные споры о методических подходах к определению функциональных аутоантител при ХК. Существуют несколько способов определения анти-FcеRIб-аутоантител при ХК. Тест высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров под действием сыворотки больных ХК используется для определения гистамин-либерирующей активности сыворотки больных ХК в отношении базофилов здоровых доноров, которая опосредованно свидетельствует о наличии функциональных аутоантител при ХК как показано в исследованиях высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров с фракцией иммуноглобулинов G, и в экспериментах нейтрализации высвобождения гистамина с помощью б-цепей высоко-аффинного рецептора к IgE (Hide M., 1993). В клинической практике тест высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров под действием сыворотки больных ХК используется для диагностики аутоиммунной ХК. В клинической практике диагностическая ценность теста высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров под действием сыворотки больных ХК валидирована на большой популяции больных ХК (873 пациента) (Platzer M., 2005). Ограничениями данного метода являются отсутствие информации о специфичности аутоантител к б-цепям высокоаффинного рецептора к IgE или к иммуноглобулину Е на поверхности тучных клеток и базофилов. Для получения данной информации используют Вестерн-блоттинг и иммуноферментный анализ. Результаты исследований сывороток крови больных ХК с помощью теста высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров под действием сыворотки больных ХК и Вестерн-блоттинга и иммуноферментного анализа не совпадают в сравнительных исследованиях (Ferrer M., 1998; Eckman J.A., 2009) в связи с присутствием естественных гистамин-нелиберирующих анти-FcеRIб-аутоантител. Отсутствие изменений уровня анти-FcеRIб-аутоантител в ремиссию и в обострение ХК в проспективном исследовании может объясняться использованием иммуноферментного анализа для определения анти-FcеRIб-аутоантител, не учитывающего функциональную активность антител в отношении клеток-мишеней.

Другой возможной причиной для противоречий о роли функциональных аутоантител при ХК и функциональных нарушений базофилов является отбор пациентов с ХК с достаточным количеством базофилов в периферической крови для проведения функциональных тестов со стимуляцией анти-IgE антителами с базофилами пациентов, при этом больные ХК с базопенией исключались из-за технических ограничений используемых методик (Vonakis B.M., 2007; Eckman J.A., 2007; Luquin E., 2005). Однако, известно, что пациенты с ХК характеризуются выраженной базопенией периферической крови. Для разрешения противоречий о вкладе функциональных аутоантител и функциональных нарушений базофилов периферической крови и проведения патогенетического фенотипирования пациентов выполнено проспективное исследование больных ХК с применением теста высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров под действием сыворотки больных ХК для определения гистамин-высвобождающей активности сыворотки больных ХК и теста высвобождения гистамина из базофилов пациентов при стимуляции анти-IgE-антителами для оценки функционального статуса базофилов пациентов.

На основании особенностей высвобождения гистамина из базофилов больных ХК при стимуляции анти-IgE-антителами выделено четыре группы пациентов (Таб.1.):

§ С высвобождением гистамина более 30% от общего содержания гистамина при стимуляции анти-IgE-антителами;

§ C высвобождением гистамина 10-30% от общего содержания гистамина при стимуляции анти-IgE-антителами;

§ C высвобождением гистамина менее 10% от общего содержания гистамина;

§ неопределяемым уровнем общего содержания гистамина (ниже уровня чувствительности метода спектрофлюориметрии).

Клинико-патогенетическая характеристика выделенных фенотипов представлена в табл. 2.

При анализе функционального статуса базофилов больных ХК установлено, что при стимуляции базофилов анти-IgE-антителами наблюдается три варианта высвобождения гистамина: более 30%, 10-30% и менее 10% от общего содержания гистамина. В исследовании Vonakis B.M. с соавторами (2007) установлены две группы пациентов на основании функционального статуса базофилов периферической крови в зависимости от наличия или отсутствия высвобождения гистамина в ответ на анти-IgE-стимуляцию. Наши данные уточняют и дополняют эти сведения, указывая на разделение группы пациентов с высвобождением гистамина на анти-IgE-стимуляцию в зависимости от степени гистаминолиберации: более 30% или 10-30% от общего содержания гистамина. Высвобождение гистамина более 30% от общего гистамина свидетельствует о повышенной активации базофилов у данной группы пациентов с ХК. В литературе имеются сведения о повышенной активации базофилов периферической крови у больных ХК по данным проточной цитофлоуметрии (Gober L., 2006).

При анализе результатов теста высвобождения гистамина базофилами здоровых доноров под действием сыворотки больных ХК установлено, что высвобождение гистамина базофилами здоровых доноров под действием сыворотки больных ХК достоверно выше в группе больных ХК с неопределяемым уровнем гистамина (тест парных сравнений Тьюки, p<0.05). Эти данные свидетельствуют о высокой гистамин-либерирующей активности сыворотки в отношении базофилов здоровых доноров в данной группе пациентов, что свидетельствует о наличии функциональных аутоантител и, соответственно, об аутоиммунных механизмах ХК у пациентов с неопределяемым уровнем гистамина по результатам спектрофлюориметрического анализа.



При анализе клинических характеристики выделенных патофизиологических фенотипов установлено, что тяжесть заболевания по результатам оценки индекса активности крапивницы - 7 достоверно выше у пациентов с неопределяемым уровнем гистамина (аутоиммунной ХК) и у пациентов с гистаминолиберацией базофилов 10-30% в ответ на стимуляцию анти-IgE-антителами (тест парных сравнений Тьюки, p<0.05). Эти данные соответствуют данным литературы, указывающим на более тяжелое течение заболевания у пациентов с аутоиммунной ХК (Sabroe RA., 2002) и у пациентов c ХК, базофилы которых высвобождают более 10% гистамина при анти-IgE-стимуляции (Baker R., 2008).

Исследование количества базофилов периферической крови у пациентов с выделенными патогенетическими фенотипами показало, что у больных ХК с неопределяемым уровнем гистамина (ниже порога чувствительности спектрофлюориметрии) количество базофилов периферической крови достоверно ниже по сравнению с другими группами пациентов (тест парных сравнений Тьюки, p<0.05). Таким образом, неопределяемый уровень общего гистамина с помощью спектрофлюориметрии обусловлен наличием базопении периферической крови у пациентов с аутоиммунной ХК. Эти данные соответствуют литературным сведениям, указывающих на выраженную базопению у больных аутоиммунной ХК (Grattan C.E.H., 1997). Таким образом, результаты данного исследования свидетельствуют о спектре паттернов ответа базофилов периферической крови больных ХК на анти-IgE-стимуляцию, включая состояние гиперактивации базофилов (высвобождение более 30% от общего содержания гистамина), активацию базофилов в пределах нормы (10-30% от общего содержания гистамина) и отсутствие высвобождения гистамина из базофилов здоровых доноров (менее 10% от общего содержания гистамина). Аутоиммунная ХК, опосредованная функциональными аутоантителами, характеризуется выраженной базопенией. При определении уровня гистамина при проведении функциональных тестов базофилов больные аутоиммунной ХК характеризуются уровнем гистамина ниже порога чувствительности метода спектрофлюориметрии. Таким образом, исключение больных ХК с базопенией из исследований функционального статуса базофилов периферической крови повышает вероятность исключения из исследований больных аутоиммунной ХК, поэтому комплексное исследование значения функциональных аутоантител в таких выборках больных объясняет возникшие противоречения о вкладе функциональных аутоантител в патогенез заболевания. Данные, полученные в нашем исследовании, указывают на комплиментарность аутоиммунных механизмов и функциональных дефектов базофилов при ХК, в связи с этим, комплексное исследование гистамин-либерирующей активности сыворотки больных ХК и функционального статуса базофилов ХК является принципиальным для патогенетического фенотипирования больных ХК

...