Василек шероховатый как перспективный источник гепатопротективного средства

Размещено на http://www.allbest.ru/

Василек шероховатый как перспективный источник гепатопротективного средства

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

василек шероховатый гепатопротективный экстракт

Актуальность. Препараты из лекарственных растений, содержащие целый комплекс биологически активных веществ, действуют на различные системы организма, в том числе и на систему антиоксидантной защиты. Это обеспечивает возможность их использования для профилактики и комплексной терапии свободно-радикальных патологий. Ухудшение экологической обстановки, повышенное содержание нежелательных примесей в пище, растущее потребление медикаментов, алкогольная интоксикация - эти и другие факторы привели к увеличению частоты токсических поражений печени, которая является основным органом синтеза и депонирования антиоксидантов и центром детоксикации прооксидантных веществ. Таким образом, подавление процессов активации свободно-радикального окисления, играющих ключевую роль в повреждении липидов мембран гепатоцитов в патогенезе заболеваний органов гепатобилиарной системы, является важным свойством гепатозащитных препаратов.

Среди веществ с гепатозащитными свойствами выделяют сравнительно небольшую группу гепатопротекторов, обладающих терапевтическим влиянием на печень (легалон, карсил, силимар, силибор, катерген, эссенциале и другие) (Оковитый С.В., 2006).

По популярности среди лекарственных средств растительного происхождения, применяемых per os, можно выделить группу препаратов расторопши (карсил, легалон, силибор и силимар), большинство из которых являются импортными. Важно отметить, что получение данных препаратов производится по трудоемкой технологии с использованием токсических и дорогих растворителей (хлороформ, тетрахлорметан и др.), что ведет к удорожанию продукции.

Поэтому актуальна проблема разработки новых отечественных гепатопротективных фитопрепаратов, обладающих антиоксидантным действием, на основе растений Сибири и Дальнего Востока. Перспективным в этом плане является василек шероховатый (Centaurea scabiosa (L.) Maxim., сем. Asteraceae), применяемый в народной медицине при болезнях печени.

Цель работы - на основании фармакогностического изучения обосновать возможность применения василька шероховатого в качестве источника гепатопротективного средства, обладающего антиоксидантным действием.

Для реализации поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. Провести фитохимический анализ надземной части василька шероховатого и изучить компонентный состав доминирующих групп биологически активных соединений.

2. На основании изучения антиоксидантной активности сухих экстрактов из надземной части василька шероховатого обосновать выбор экстракта для исследования гепатопротективной активности.

3. Выделить из фармакологически активного сухого экстракта индивидуальные компоненты и идентифицировать соединения с помощью химических, хроматографических и спектральных методов.

4. Разработать проект нормативной документации на предлагаемый новый вид лекарственного сырья - василька шероховатого траву (Centaurea scabiosa herba).

5. На основе проведенных исследований предложить способ получения сухого экстракта с гепатопротективной и антиоксидантной активностями и определить основные показатели его качества.

Научная новизна. Впервые проведен общий фитохимический анализ надземной части василька шероховатого и изучен компонентный состав доминирующих групп биологически активных соединений (фенольных соединений и полисахаридов). Хроматографией на бумаге в надземной части C. scabiosa L. идентифицировали кофейную, феруловую, коричную, п-кумаровую, галловую и салициловую кислоты, рутин, байкалеин, изокверцитрин.

Впервые из василька шероховатого выделены флавоноиды гиспидулин, апигенин, лютеолин, хризоэриол и сложные эфиры карбоновых кислот, а также выделены скутелляреин, кофейная кислота, -ситостерол, ранее описанные для данного растения.

Разработаны методики качественного обнаружения и количественного определения в надземной части василька шероховатого флавоноидов и гидроксикоричных кислот.

Впервые экспериментально обоснована возможность использования василька шероховатого в качестве источника гепатопротекторного средства, обладающего антиоксидантным действием, и целесообразность его стандартизации по флавоноидам и гидроксикоричным кислотам. Изучена динамика накопления указанных групп биологически активных веществ.

Впервые проведено анатомическое исследование надземной части василька шероховатого и выявлены диагностические микроскопические признаки вида.

На основе проведенных исследований предложен способ получения сухого экстракта с гепатопротективной и антиоксидантной активностями и определены основные показатели его качества.

Практическая значимость. На основании проведенных фармакогностических исследований для медицинской практики предложен новый вид лекарственного растительного сырья в качестве гепатопротекторного средства, обладающего антиоксидантным действием.

Результаты микроскопических и фитохимических исследований использованы для разработки методик диагностики и определения качества надземной части василька шероховатого и заложены в проект Фармакопейной статьи (ФС) «Василька шероховатого трава».

Для углубленных фармакологических исследований в качестве гепатопротективного средства предложен сухой экстракт василька шероховатого, полученный на 70% этаноле.

Получено положительное решение о выдаче патента на изобретение по заявке №2009100195/15(000290) «Гепатопротективное средство, обладающее антиоксидантной активностью, и способ его получения» (18 января 2011 г).

Внедрение. Для студентов и аспирантов кафедр фармацевтической химии и фармакогнозии с курсами ботаники и экологии ГОУ ВПО СибГМУ Минздравсоцразвития России, а также кафедры физиологии растений и биотехнологии Биологического института ГОУ ВПО «Томский государственный университет» разработаны методические рекомендации на тему «Методика последовательного количественного определения флавоноидов и гидроксикоричных кислот в лекарственном растительном сырье», в которых использованы материалы диссертации.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Результаты фитохимического изучения надземной части василька шероховатого.

2. Данные изучения антиоксидантной активности экстрактов и фракций василька шероховатого.

3. Результаты исследований гепатопротективной активности сухого экстракта василька шероховатого, полученного на 70% этаноле.

4. Результаты исследований по выделению, идентификации и установлению структуры соединений из василька шероховатого.

5. Методики стандартизации надземной части и сухого экстракта василька шероховатого, полученного на 70% этаноле.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на 63-й и 65-ой Международной студенческой научной конференции им Н.И. Пирогова (Томск, 2004, 2006), IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006), II Международной научной конференции «Химия, технология и медицинские аспекты природных соединений (Алматы, 2007), V Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Уфа, 2008), «Конгрессе молодых ученых» (Томск, 2008), IV Всероссийской научной конференции «Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья» (Барнаул, 2009).

Работа выполнена в соответствии с планом научных исследований ГОУ ВПО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (№ государственной регистрации 01200602076 от 14. 02. 2006 г.).

Публикации. По результатам работы опубликовано 15 печатных работ, в том числе 4 статьи в периодических изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Экспериментальные исследования по теме диссертации выполнены на кафедре фармацевтической химии СибГМУ (г. Томск), а также в сотрудничестве с коллективами следующих научных организаций: Центральная научно-исследовательская лаборатория (ЦНИЛ) СибГМУ (отделение биохимии), НИИ органической химии СО РАН (г. Новосибирск), НИИ Фармакологии ТНЦ СО РАМН (г. Томск), Томский политехнический университет (кафедра аналитической химии, г. Томск).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 147 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, пяти глав экспериментальных исследований, выводов, списка литературы и приложений на 37 страницах. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 31 рисунками. Библиографический указатель включает 267 источников литературы, из которых 85 зарубежных.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследования

Объектом исследования служила надземная часть василька шероховатого (ВШ) (Centaurea scabiosa L.), собранная в 2006-2007 гг. в Томской и Кемеровской областях.

Обнаружение основных групп биологически активных веществ и изучение компонентного состава фенольных соединений и полисахаридов надземной части ВШ проводили с помощью общепринятых методов и приемов фитохимического анализа. Для разделения сложных смесей веществ и выделения индивидуальных соединений применяли избирательную жидкостную экстракцию, колоночную хроматографию. Строение выделенных веществ устанавливали с привлечением УФ-, ИК- спектроскопии, ВЭЖХ, масс- и хромато-масс-спектрометрии, ¹Н-ЯМР-спектроскопиии.

Антиоксидантную активность (АОА) изучали вольтамперометрическим методом, антирадикальную активность (АРА) - спектрофотометрическим методом.

Изучение гепатопротекторной активности исследуемого экстракта проводили на 56 беспородных крысах-самцах массой 180-220 г с острым токсическим поражением печени тетрахлорметаном. Гепатит вызывали введением 50% раствора тетрахлорметана на растительном масле в дозе 1 мл/кг массы крысы в течение 4 дней. В последующие шесть дней вводили животным экстракт ВШ, полученный на 70% этаноле, в дозах 100, 200 и 400 мг/кг и препарат сравнения (карсил) в дозе 100 мг/кг массы крысы внутрижелудочно в виде суспензии на 1% крахмальной слизи, а также эквиобъемное количество растворителей.

Острую токсичность экстракта ВШ определяли по методике Е. Buchby на крысах массой 200-250 г при внутрижелудочном способе введения.

Стандартизацию цельного и измельченного сырья проводили согласно методикам ГФ XI. При разработке проекта ФС на сырье руководствовались ОСТ 91500.05.001-00 «Стандарты качества ЛС. Основные положения».

Микроскопические признаки устанавливали на основании анатомического исследования частей растения. Просмотр и фотографирование препаратов выполняли с помощью микроскопа Carl Zeiss (увеличения 7х1,5х4,5; 7х1,5х8; 7х1,5х20; 7х1,5х40), цифрового фотоаппарата «Olympus Camedia» digital compact camera C-4000 zoom и оптико-механического согласователя. Снимки обрабатывали на компьютере в программе «Adobe Photoshop 5,5».

Статистическую обработку полученных результатов проводили, используя пакет программ StatSoft Statistica v 6.0 с определением средней арифметической (М) и ее ошибки (m). Достоверность различий оценивалась с использованием параметрического (t-критерий Стьюдента) и непараметрического (критерия Вилкоксона) методов. Различия считались достоверными при р < 0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Фитохимическое исследование надземной части василька шероховатого

В результате проведенных исследований было выявлено, что в надземной части ВШ присутствуют флавоноиды (ФЛ), гидроксикоричные кислоты (ГКК), дубильные вещества, кумарины, полисахариды (ПС), сесквитерпеновые лактоны, аскорбиновая кислота, каротиноиды и аминокислоты и отсутствуют алкалоиды, иридоиды и экдистероиды (табл. 2).

Нами проведено более подробное исследование фенольных соединений и полисахаридов василька шероховатого.

Изучение фенольного комплекса василька шероховатого

Анализ хроматографических данных водного экстракта и экстрактов, полученных на 40% и 70% этаноле, показал, что в состав экстрактов входят 20 - 25 фенольных соединений, из них 10 - 13 являются ФЛ, 10 - 12 - кумаринами, фенолокислотами и ГКК. Для количественного определения ФЛ использовали метод дифференциальной спектрофотометрии, основанный на их способности образовывать с алюминия хлоридом комплексы, устойчивые в кислой среде (содержание флавоноидов - 2,85±0,19% в пересчете на рутин) (табл. 2).

Количественное определение ГКК проводили с использованием двух методов: 1) по собственному поглощению ГКК в УФ-области и 2) экстракционно-спектрофотометрическим. Найдено, что содержание ГКК в надземной части ВШ в пересчете на кофейную кислоту составило первым методом 3,65±0,07% и вторым методом 1,60±0,13%. Полученные данные позволяют сделать вывод о рациональности количественного определения суммы ГКК в надземной части ВШ вторым методом.

Исследование полисахаридного комплекса василька шероховатого

Фракционное разделение полисахаридного комплекса на фракции (табл. 2) показало наличие значительных количеств фракций ПС (в сумме около 35%), что свидетельствует о перспективности использования надземной части ВШ в качестве источника ПС.

Для определения количественного содержания ВРПС использовали два метода: гравиметрический (ГФ XI) и антроновый метод, подобрав рациональные условия для исследуемого растения. Определение количественного содержания ПВ гравиметрическим методом было проведено из шрота, оставшегося после определения ВРСП.

При исследовании влияния различных факторов на полноту извлечения ВРПС и ПВ установлено, что максимальное их извлечение достигается при 3-х кратной экстракции на кипящей водяной бане сырья с размером частиц 2 мм (соотношении сырье экстрагент 1:20, 1:20, 1:10 соответственно) в течение 30 мин. Содержание ВРПС в надземной части ВШ составило 6,07±0,12% и ПВ 10,10±0,15%.

По модифицированной нами методике определения ВРПС антроновым методом найдено, что содержание ВРПС в надземной части в пересчете на глюкозу составило 5,03±0,12%.

Результаты исследования содержания ВРПС и ПВ по органам растения показали наибольшее содержание их в листьях (табл. 1).

Таблица 1 Результаты количественного содержания ВРПС и ПВ в васильке шероховатом, определенные гравиметрическим методом

Исходное сырьё	Содержание ВРПС	Содержание ПВ
	в пересчете на воздушно-сухое сырье, %
Надземная часть	6,70±0,12	10,10±0,15
Листья	8,35±0,11	14,77±0,09
Цветочные корзинки	4,29±0,08	6,24±0,10
Стебли	менее 0,5	6,50±0,10

Таблица 2 Химический состав василька шероховатого

Название группы БАВ	Содержание	Представители	Количественное содержание в пересчете на воздушно-сухое сырье
Флавоноиды	+++	Рутин, байкалеин, лютеолин, апигенин, апиин*, скутелляреин и его глюкуронид*, хризин*, изокверцитрин	2,85±0,19% в пересчете на рутин
Фенолокислоты и ГКК	+++	Кофейная, хлорогеновая*, феруловая, салициловая, коричная, галловая, п-кумаровая кислоты	Сумма ГКК - 1,60±0,3% в пересчете на кофейную кислоту
Кумарины	+	Скополетин*, умбеллиферон*	-
Дубильные вещества	+++	Гидролизуемые и конденсированные	3,36±0,40% гидролизуемые; 3,77±0,40% конденсированные
Сесквитерпеновые лактоны	+++	Гроссгемин*, цинаропикрин*,скабиолид*	-
Полисахариды	+++	Водорастворимые полисахариды (ВРПС) (в гидролизате - галактоза, глюкоза, арабиноза, рамноза)	6,70±0,71%
		Пектиновые вещества (ПВ)** 9,98±0,37% Гемицеллюлоза А (ГЦ А)** 18,77±0,30% Гемицеллюлоза Б (ГЦ Б)** 6,07±0,31% ** (в гидролизате - галактоза, глюкоза, арабиноза, рамноза, глюкуроновая и галактуроновая кислоты)
Каротиноиды	+++	Я-каротин	116,5±28,0 мг %
Аскорбиновая кислота	+++	-	53,5±2,6мг%
Аминокислоты	+++	-	-
Хлорофилл	++	-	31,4±0,4мг%
Алкалоиды	-	-	-
Иридоиды	-	-	-
Экдистероиды	-	-	-

Примечание: * - отмечены литературные данные.

Изучение антиоксидантной и гепатопротективной активностей ВШ

Учитывая, что в надземной части ВШ содержится значительное количество фенольных соединений, аскорбиновой кислоты и каротиноидов, была изучена антиоксидантная активность экстрактов (АОА) двумя методами.

В спектрофотометрическом методе на основе реакции с дифенилпикрилгидразилом (ДФПГ) антирадикальные свойства исследуемых экстрактов оценивали по радикалсвязывающей активности, выраженной в процентах, которая показывает уровень снижения оптической плотности ДФПГ относительно исходной. Полученные кинетические кривые, отражающие зависимость радикалсвязывающей активности экстрактов от времени (рис. 1), свидетельствуют о наиболее выраженных антирадикальных свойствах у экстракта, полученного на 70% этаноле, интенсивность радикалсвязывающей активности которого приближается к препарату сравнения - дигидрокверцетину.

Рис. 1. Кинетические кривые реакции ДФПГ с исследуемыми образцами и препаратом сравнения (1 - сухой экстракт (экстрагент - вода); 2 - сухой экстракт, полученный на 40% этаноле; 3 - сухой экстракт, полученный на 95% этаноле; 4 - сухой экстракт, полученный на 70% этаноле; 5 - дигидрокверцетин)

Методом катодной вольтамперометрии АОА сухих экстрактов ВШ и фракций экстракта, полученного на 70% этаноле, оценивали по кинетическому критерию (К, мкмоль/л·мин), который отражает количество прореагировавших с экстрактами кислородных форм. Полученные данные (табл. 3) показали, что наиболее высокой АОА обладает сухой экстракт, полученный на 70% этаноле, кинетический критерий которого превосходит критерии дигидрокверцетина и аскорбиновой кислоты. Разделение активного экстракта на фракции нецелесообразно, так как не приводит к увеличению АОА.

Таблица 3 АОА экстрактов и фракций ВШ

Исследуемые экстракты и фракции	С=0,001 г/мл
	Kср	S2	S	ДХ
Экстракт на 40% этаноле	1,29	0,0042	0,065	0,16
Экстракт на 96% этаноле	0,94	0,0021	0,046	0,11
Экстракт на 70% этаноле	1,43	0,0038	0,062	0,15
Бутанольная фракция	1,06	0,0027	0,052	0,13
Хлороформная фракция	1,12	0,0020	0,045	0,11
Этилацетатная фракция	1,18	0,0016	0,040	0,10
Аскорбиновая кислота	1,15
Дигидрокверцетин	0,78

Данные о содержании ФЛ, ГКК и аскорбиновой кислоты в сухих экстрактах ВШ, свидетельствуют о том, что степень выраженности антиоксидантных свойств, вероятно, связана с присутствием в них ГКК.

Таблица 4 Количественное содержание групп БАВ в сухих экстрактах ВШ

Название группы БАВ (Название метода)	Количественное содержание, % в пересчете на сухой экстракт
	Водный экстракт	40% экстракт	70% экстракт	95% экстракт
ФЛ (Спектрофотометрический метод (в пересчете на рутин))	5,13±0,12	7,85±0,20	7,80±0,14	8,21±0,11
ГКК (Экстракционно-спектрофотометрический метод (в пересчете на кофейную кислоту))	3,40±0,13	5,65±0,12	8,76±0,32	6,01±0,24
Аскорбиновая кислота (Титриметрический)	0,55±0,14	0,51±0,15	0,35± 0,13	0,10± 0,12

Учитывая высокую АОА in vitro сухого экстракта, полученного на 70% этаноле, а также применение ВШ в народной медицине при лечении болезней печени, мы предположили наличие гепатопротективных и антиоксидантных свойств у экстракта и изучили их на модели острого токсического поражения печени крыс тетрахлорметаном. Гепатопротективную активность оценивали по морфологическим, биохимическим показателям, антиоксидантную - по влиянию экстракта на процесс ПОЛ в печени и сыворотке крови.

Морфологические показатели свидетельствуют, что применение экстракта ВШ в исследуемых дозах привело к снижению содержания некротизированных клеток, гепатоцитов с дистрофией, плотности клеточного инфильтрата. В то же время, количество двуъядерных гепатоцитов возросло по сравнению с животными с гепатитом, что свидетельствует о благоприятном воздействии экстракта, направленном на стимуляцию регенераторной способности и пролиферативных возможностей гепатоцитов.

Применение экстракта сопровождалось регрессом биохимических показателей - статистически достоверно уменьшались активность в сыворотке АЛаТ (2,0 раза), АСаТ (1,5раза), а также содержание общего и конъюгированного билирубина, щелочной фосфатазы (ЩФ) и уровень тимоловой пробы.

Также экстракт ВШ в дозах 100 и 200 мг/кг оказывает положительный эффект на процессы ПОЛ, уменьшая уровень токсических перекисных соединений - ДК и ТБК-активных продуктов в печени и сыворотке крови. Полученные результаты, вероятно, обусловлены активацией антиоксидантной системы на фоне действия экстракта ВШ, о чем свидетельствует повышение активности каталазы и радикалсвязывающей активности липидорастворимых компонентов клеточных мембран по сравнению с крысами с гепатитом.

Таким образом, установлено, что сухой экстракт, полученный на 70% этаноле, обладает выраженными гепатопротективными и антиоксидантными свойствами и по активности не уступает препарату сравнения - карсилу.

Испытания на острую токсичность показало, что исследуемый экстракт в дозе 10 г/кг массы животного обладает малой острой токсичностью, что соответствует IV классу «Вещества малоопасные».

Исследование химического состава экстракта, полученного на 70% этаноле

Для разделения сложных смесей веществ полученного экстракта применяли методы избирательной экстракции, используя в качестве экстрагентов хлороформ, этилацетат и н-бутанол.

Хроматографическое изучение фракций в сравнении со стандартными образцами веществ-свидетелей (СОВС) показало присутствие в хлороформной фракции преимущественно фенолокислот и ГКК (феруловой, кофейной, п-кумаровой и салициловой); в этилацетатной и бутанольной фракциях - флавоноидов, фенолокислот и ГКК (лютеолина, байкалеина, апигенина, рутина, изокверцитрина, феруловой, кофейной, п-кумаровой и салициловой кислот); в водной - следовые количества вышеперечисленных веществ-свидетелей, дубильные вещества, моносахара, полисахариды и аминокислоты.

Выделение индивидуальных соединений из этилацетатной фракции проводили методом адсорбционной колоночной хроматографии на силикагеле. (L 40/100). Элюирование проводили хлороформом, смесью хлороформ-этилацетат, постепенно повышая градиент последнего, затем этилацетатом, смесью этилацетат-этанол, этанолом. В результате из этилацетатной фракции были выделены шесть образцов (1 - 6). На основании качественных реакций и хроматографических исследований было установлено, что образец 1 представляет собой смесь сложных эфиров карбоновых кислот, образец 2 - индивидуальное фенольное соединение (кофейная кислота), образцы 3, 4 и 5 содержали по два вещества флавоноидной природы, образец 6 - соединение стероидного ряда.

Идентификация выделенных образцов

Образец 1. Для дальнейшего разделения и установления структуры образец 1 анализировали на приборе хромато-масс-спектрометр Finnigan Trace DSQ (США). Хроматограмма образца 1 свидетельствует о наличии в нем 3 основных соединений: 1/1 (время удерживание - 26,21 мин), 1/2 (время удерживание - 29,27 мин) и 1/3 (время удерживание - 29,72 мин) (рис. 2).

Рис. 2. ГЖ хроматограмма образца 1

Соединение 1/1. Согласно данным масс-спектра (рис. 3) молекулярная масса соединения равна 310 а.е.м. ((М)⁺ 310 (С₂₀Н₃₈О₂)). В масс-спектре присутствуют пики осколочных ионов, характерные для неразветвленной углеводородной цепи (m/z (I, %) 43 (37), 55 (23), 57 (15), 88 (100), 143 (3), 157 (12), 239 (7)) и эфиров одноосновных карбоновых кислот с алифатическими заместителями (m/z (I, %) 73 (15) и 101 (55)). Таким образом, соединение 1/1 по структуре относится к алифатическим сложным эфирам неразветвленного строения. Данные масс-спектра вещества по базе данных Databaze/wiley7n.L совпадают со степенью вероятности около 95% со спектром этилового эфира гексадекановой (пальмитиновой) кислоты.

Рис. 3. Масс-спектр соединения 1/1

Соединение 1/2. Согласно данным масс-спектра (рис. 4) молекулярная масса соединения равна 310 а.е.м. ((М)⁺ 310 (С₂₀Н₃₈О₂)). Масс-спектр соединения 1/2 имеет пики осколочных ионов, присутствующие в масс-спектре соединения 1/1, что характерно для алифатического сложного эфира неразветвленного строения, кроме того ионы с m/z (I, %) 83 (43) и 110 (13) соответствуют ионам алкеновой серии. Данные масс-спектра вещества по базе данных Databaze/ wiley7n.L совпадают со степенью вероятности около 96% со спектром этилового эфира октадецен-9-овой кислоты.



Рис. 4. Масс-спектр соединения 1/2

Соединение 1/3. Данные масс-спектра вещества (рис. 5) по базе данных Databaze/wiley7n.L совпадают с невысокой степенью вероятности (около 20%) 1-(гидроксиметил)-1,2-этандиоловым эфиром гексадекановой кислоты - пальмитином (молекулярная масса - 568 а.е.м.).

Рис. 5. Масс-спектр соединения 1/3

Для детального изучения состава и химического строения образцы 3, 4 и 5 анализировали методом ВЭЖХ с УФ- и масс-детекторами и ¹Н-ЯМР спектроскопии.

По данным ВЭЖХ образцы 3 (рис. 6) и 4 содержат по два вещества: флавоноид 1 (время удерживания - 39,908 мин и л max, нм: 268 и 336), присутствующий в обоих образцах, флавоноид 2 (40,362 мин и л max, нм: 212, 234, 272, 336) и флавоноид 3 (40,389 мин и л max, нм: 214, 270, 336) соответственно.



Рис. 6. ВЭЖ хроматограмма образца 3

ESI-масс-спектры флавоноида 1, полученные электроспрей-методом, характеризуются основными ионами типа [М+Н]⁺ с m/z 271 и [М-Н]^- с m/z 269. Таким образом, молекулярная масса флавоноида 1 равна 270 а.е.м., что соответствует флавоноиду, содержащему три гидроксильные группы. ESI-масс-спектры флавоноидов 2 и 3 имеют основные пики ионов типа [М+Н]⁺ с m/z 301 и [М-Н]^- с m/z 299, следовательно, молекулярные массы флавоноидов 2 и 3 одинаковы и равны 300 а. е. м., что соответствует флавоноидам, содержащим три гидроксильные и одну метокси- группы.

Рис. 7. ¹Н-ЯМР-спектр образца 3

Примечание: сигналы с химическими сдвигами 3,36 и 2,5 м.д. принадлежат растворителю.

Для установления структуры флавоноидов 1 и 2 был получен ¹Н-ЯМР-спектр образца 3 (300 МГц, ДМСО, д, м.д.), в котором мы выделили три группы сигналов протонов флавоноидов, поскольку образец 3 является смесью двух флавоноидов и, следовательно, некоторые сигналы образованы при наложении сигналов протонов одного типа флавоноидов 1 и 2, либо сигналы могут принадлежать протонам только флавоноида 1 или 2 (рис. 7).

Первая группа сигналов с низкой интенсивностью - два плохо разрешенных дублета с величинами химических сдвигов 6,51 и 6,20 м.д. относится к протонам Н-6 и Н-8 кольца А флавоноида 1 соответственно, который в образце 3 по сравнению с флавоноидом 2 присутствует в меньшем количестве.

Вторая группа сигналов - это синглет с величиной химического сдвига 6,60 м.д., который относится к Н-8 кольца А флавоноида 2, и синглет с химическим сдвигом 3,74 м.д., относящийся к метокси-группе в положении 6 кольца А флавоноида 2.

Третья группа сигналов - это сигналы протонов колец В и С флавонодов 1 и 2, которые резонируют при одинаковых значениях химических сдвигов, увеличивая интенсивность сигналов пропорционально числу протонов каждого типа и массовой доли каждого флавоноида в образце 3. Исходя из этого, установлено, что в спектре ¹Н-ЯМР сигналы протонов с химическими сдвигами - 6,78 м.д. (1Н, с, Н-3), 6,92 м.д. (2Н, д, Н-3^? и Н-5^?, J=8,7 Гц) и 7,92 м.д. (2Н, д, Н-2^? и Н-6^?, J=8,7 Гц) принадлежат протонам колец В и С как флавоноида 1 так и флавоноида 2.

Следовательно, флавоноид 1 является 5,7,4^'-тригидроксифлавоном (апигенин), содержание которого по данным ¹Н-ЯМР составляет около 30% в смеси с флавоноидом 2 (рис. 8).

В ¹Н-ЯМР-спектре образца 4, помимо сигналов протонов флавоноида 1 (апигенина), который является доминирующем флавоноидом этого образца, четко виден синглет с химическим сдвигом 3,85 м.д., который принадлежит протонам метокси-группы в положении 3? (3Н, с) кольца В флавоноида 3. Также в спектре присутствует синглет низкой интенсивности с химическим сдвигом 7,85 м.д., который можно отнести к протону Н-2^' (1Н, с) кольца С флавоноида 3. Таким образом, метокси-группа флавоноида 3 находиться в положении 3^' кольца С.

Анализируя ¹Н-ЯМР-спектр, следует отметить, что сигналы остальных протонов флавоноида 3 имеют те же значения величин химических сдвигов, что и сигналы протонов флавоноида 1 (апигенина), незначительно увеличивая их интенсивность. Таким образом, сигналы протонов Н-3, Н-6 и Н-8 кольца А флавоноида 3 имеют величины химических сдвигов 6,64 (1Н, с), 6,54 (1Н, д) и 6,25 (1Н, д) м.д. соответственно. Сигналы протонов Н-5^' и Н-6^' резонируют при величинах химических сдвигах 7,03(1Н, с) и 7,95 (1Н, д) м.д.

Следовательно, флавоноид 3, содержание которого в смеси с флавоноидом 1 образца 4 незначительно (около 7%), идентифицирован как 5,7,4?-тригидрокси-3?-метоксифлавона (хризоэриол) (рис. 8).

По данным ВЭЖХ образец 5 также содержит два вещества - флавоноид 4 (31,628 мин и л max, нм: 213, 234, 280, 330) и флавоноид 5 (35,541 мин и л max, нм: 253, 266, 291, 347).

Согласно данным ESI-масс-спектрометрии молекулярные массы флавоноидов 4 и 5 одинаковы и равны 286 а.е.м., что соответствует флавоноидам, содержащим четыре гидроксильные группы.

В спектре ¹Н-ЯМР для образца 5 наблюдаются сигналы протонов с химическими сдвигами - 6,59 м.д. (1Н, с, Н-8), 6,74 м.д. (1Н, с, Н-3), 6,92 м.д. (2Н, д, Н-3? и Н-5?, J=9,0 Гц) и 7,91 м.д. (2Н, д, Н-2? и Н-6?, J=9,0 Гц). Следовательно, флавоноид 4 имеет структуру 5,6,7,4?-тетрагидроксифлавона (скутелляреина) (рис. 8).

Согласно данным литературы максимумы поглощения и вид спектральной кривой УФ-спектра флавоноида 5 совпадают с максимумами поглощения и видом спектральной кривой УФ-спектра лютеолина. Кроме того хроматографическое изучение на бумаге в сравнении с СОВС лютеолина также подтверждает наличие лютеолина в образце 5. Таким образом, флавоноид 5 является 5,7,3?,4?-тетрагидроксифлавоном (лютеолином).

Рис. 8. Структура флавоноидов

Образец 6 - перекристаллизовали из гексана и получили белые игольчатые кристаллы с т. пл. 184-186^оС. В ИК-спектре образца 6 присутствуют валентные колебания гидроксильной группы (3418 см^-1, с., широкая), метильных и метиленовых групп (2959, 2935 и 2869 см^-1), а также деформационные колебания д_(с-н) 1464, 1380, 1103, 1024 см^-1. Таким образом, ИК-спектр указывает на наличие в соединении спиртового гидроксила, метильных групп, отсутствие оксо-группы, ароматического кольца и фенольного гидроксила.

Данные масс-спектра образца 6 по спектрометрической базе данных Databaze/ Wiley7n.L совпадают со спектром -ситостерола.

Разработка параметров стандартизации надземной части василька шероховатого

В результате анатомического изучения надземной части василька шероховатого были определены диагностические микропризнаки надземной части, которыми являются 3 типа волосков: головчатые, очень мелкие, червеобразноизогнутые, имеющие маленькую шаровидную головку и ножку, состоящую из 3 - 4 клеток; простые волоски, состоящие из 3 - 5 клеток, с одноклеточным основанием и состоящие из 5 - 8 клеток, с многоклеточным основанием.

Подлинность и содержание действующих веществ предложено определять по двум группам веществ - ФЛ и ГКК, так как предполагается, что они имеют наибольшую значимость в проявлении антиоксидантной и гепатопротективной активностей экстракта ВШ. Для этого были разработаны следующие методики.

Для установления подлинности надземной части ВШ предложен метод ТСХ (система: этилацетат муравьиная кислота вода (10:2:3), детекторы фильтрованный УФ-свет до и после обработки хроматограммы 10% этанольным раствором алюминия хлорида). В УФ-свете на хроматограмме должно обнаруживаться не менее трех пятен коричневого цвета, а также пятна голубого и фиолетового цвета. Коричневое пятно с R_f 0,55, принадлежит рутину. При проявлении хроматограммы 10% этанольным раствором алюминия хлорида и последующем нагревании в течение 23 мин при температуре 100105^оС, проявляется не менее трех пятен желтого цвета в видимом и УФ-свете с R_f 0,45; 0,55 и 0,6.

Разработана методика последовательного количественного определения ФЛ и ГКК в надземной части ВШ из одной навески сырья. Для количественного определения ФЛ использовали метод дифференциальной спектрофотометрии на основе реакции с алюминия хлоридом в кислой среде. В качестве стандарта использовали ГСО рутина. Для количественного определения суммы ГКК в надземной части применили экстракционно-спектрофотометрический метод. Валидационную оценку методики проводили по показателям специфичность, повторяемость, правильность и воспроизводимость. Содержание суммы ФЛ в надземной части ВШ должно быть не менее 2,0% и ГКК - не менее 1,2%. При этом значение относительной погрешности не превышает 5% при доверительной вероятности 0,95.

Используя разработанные методики, выявлено, что содержание ГКК и ФЛ максимально в фазу цветения и составляет 1,6±0,3% в пересчете на кофейную кислоту и 2,85±0,19% в пересчете на рутин соответственно.

Установлены показатели определения доброкачественности сырья, включенные в проект ФС: сумма ФЛ в пересчете на рутин - не менее 2,0%; сумма ГКК в пересчете на кофейную кислоту - не менее 1,2%; влажность - не более 9,0%; золы общей - не более 8%; золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной, - не более 1,8%; экстрактивные вещества, извлекаемые 70% этанолом, - 26,1 0,3%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 6 мм, - не более 12%; частиц, проходящих сквозь сито с отверстиями диаметром 0,5 мм, - не более 9%; органических примесей - не более 1%; минеральной примеси - не более 0,5%.

На основании проведенных исследований разработан проект ФС «Василька шероховатого трава».

Разработка способа получения сухого экстракта из надземной части ВШ, полученного на 70% этаноле, и его стандартизация

При разработке рациональной технологии получения сухого экстракта установлены оптимальные параметры экстракционного процесса, позволившие предложить способ получения средства, обладающего гепатопротективным и антиоксидантным свойствами. Экстракцию надземной части ВШ, измельченной до размеров частиц 2-4 мм, предложено проводить 70% этанолом при температуре 80С в течение 60 мин при соотношении сырье-экстрагент 1:20 и кратности экстракции 3 с последующим удалением экстрагента при пониженном давлении и высушиванием досуха полученного экстракта.

Сухой экстракт ВШ представляет собой тёмно-коричневый сыпучий порошок со слабым специфическим запахом. Его стандартизация проведена по методикам ГФ XI издания. Определены потеря в массе при высушивании (3,300,03%) и проведены испытания на тяжелые металлы (не более 0,01%). В основу стандартизации сухого экстракта положены методики определения подлинности и количественного содержания ФЛ и ГКК, описанные ранее для надземной части. Содержание ФЛ в сухом экстракте составило 10,60% (в пересчете на рутин) при относительной ошибке 2,89% и ГКК - 9,16% (в пересчете на кофейную кислоту) при относительной ошибке 1,98%.

ВЫВОДЫ

1. Установлено, что основными группами биологически активных веществ надземной части C. scabiosa L. являются флавоноиды, фенолокислоты, дубильные вещества, полисахариды, сесквитерпеновые лактоны, аскорбиновая кислота и каротиноиды.

2. Хроматографией на бумаге в надземной части C. scabiosa L. идентифицировали кофейную, феруловую, коричную, п-кумаровую, галловую и салициловую кислоты, рутин, байкалеин, изокверцитрин.

3. Впервые из василька шероховатого выделены и идентифицированы физико-химическими методами флавоноиды гиспидулин, апигенин, лютеолин, хризоэриол и сложные эфиры карбоновых кислот, а также выделены скутелляреин, кофейная кислота, -ситостерол, ранее описанные для данного растения.

4. Усовершенствована методика выделения полисахаридного комплекса из надземной части C. scabiosa L. (содержание ВРПС составило 6,70±0,12%, ПВ - 9,98±0,37%, гемицеллюлозы А - 18,77±0,30% и Б - 6,07±0,31%). Моносахаридный состав полисахаридных фракций представлен глюкозой, галактозой, рамнозой, арабинозой, глюкуроновой и галактуроновой кислотами. Предложены методики количественного определения ВРПС гравиметрическим и антроновым методами.

5. Установлено, что сухой экстракт из надземной части василька шероховатого, полученный на 70% этаноле, обладает выраженными антиоксидантными и гепатопротективными свойствами.

6. Разработан проект ФС «Василька шероховатого трава», в котором стандартизацию надземной части предложено проводить по содержанию ФЛ и ГКК.

7. Выявлено, что содержание ГКК и ФЛ максимально в фазу цветения и составляет 1,6±0,3% в пересчете на кофейную кислоту и 2,85±0,19% в пересчете на рутин соответственно.

8. Впервые предложен способ получения сухого экстракта из надземной части василька шероховатого, обладающего гепатопротекторной и антиоксидантной активностью, при котором достигается наиболее полное извлечение ФЛ и ГКК (степень измельчения 2-4 мм, соотношение сырье-экстрагент 1:20, время экстракции 60 мин., температура 80C, кратность экстракции - 3) и определены основные показатели его качества.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Ларькина, М.С. Анатомическое строение василька шероховатого / М.С. Ларькина, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова, Е.Н. Сальникова // Фармация. - 2008. - №1. - С. 14-16.

2. Ларькина, М.С. Изучение динамики накопления фенолкарбоновых кислот в надземной части василька шероховатого / М.С. Ларькина, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова // Химия растительного сырья. - 2008. - №3. - С. 71-74.

3. Ларькина, М.С. Количественное определение флавоноидов в надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) / М.С. Ларькина, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова, Е.А. Краснов // Химико-фармацевтический журнал. - 2009. - №4. - С. 14-17.

4. Кадырова, Т.В. Антиоксидантная активность экстрактов из надземной части Centaurea scabiosa L.(Asteraceae) / Т.В. Кадырова, М.С. Ларькина, Е.В. Ермилова, Е.А. Краснов, О.А. Аврамчик // Раст. ресурсы. - 2010. - Вып.1 - С. 102-106.

5. Корнякова, А.В. Химико-фармакологическое исследование василька шероховатого / А.В. Корнякова, М.С. Ларькина // Тез. докл. Всероссийской 63-й итоговой студенч. науч. конф. им. Н.И.Пирогова. - Томск, 2004. - С. 201-202.

6. Ларькина, М.С. Химико-фармакогностическое изучение надземной части василька шероховатого / М.С. Ларькина, И.П. Каминский // Тез. докл. Всероссийской 65-й итоговой студенч. науч. конф. им. Н.И.Пирогова. - Томск, 2006. - С. 244-246.

7. Каминский, И.П. Исследование суммы сесквитерпеновых лактонов василька шероховатого / И.П. Каминский, М.С. Ларькина // Тез. докл. Всероссийской 65-й итоговой студенч. науч. конф. им. Н.И.Пирогова. - Томск, 2006. - С. 243-244.

8. Краснов, Е.А. Химико-фармакологическое исследование надземной части василька шероховатого / Е.А. Краснов, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова, И.П. Каминский, М.С. Ларькина // Тез. докл. Всесоюз. науч. конф.: Химия и технология растительных веществ. - Сыктывкар, 25-30 июня 2006. - С. 106.

9. Краснов, Е.А. Химический состав перспективных растений, их антиоксидантная активность и фармакологическая активность / Е.А. Краснов, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова, И.П. Каминский, М.С. Ларькина, В.В. Дудко // Тез. докл. Всесоюз. науч. Конф.: Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. - Барнаул, 23-27 апреля 2007. - С. 86.

10. Ларькина, М.С. Использование надземной части василька шероховатого в качестве источника полисахаридов / М.С. Ларькина, Е.В. Ермилова, Т.В. Кадырова, Е.А. Краснов // Тез. докл. Всесоюз. науч. конф.: Новые достижения в химии и химической технологии растительного сырья. - Барнаул, 23-27 апреля 2007. - С. 40-41.

11. Ларькина, М.С. Некоторые аспекты изучения химического состава Centaurea scabiosa L. / М.С. Ларькина, Е.В. Ермилова, Т.В. Кадырова // Тез. докл. 2 международную научную конференцию, г. Алматы, 10-13 октября 2007. - Казахстан, 2007. - С. 199.

12. Ларькина, М.С. Разработка способа получения антиоксидантного средства на основе фенольного комплекса василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) / М.С. Ларькина // Науки о человеке: матер. IX конгресса молодых ученых и специалистов. - Томск, май 2008. - С. 113-115.

13. Ларькина, М.С. Разработка методики количественного определения водорастворимых полисахаридов в надземной части василька шероховатого (Centaurea scabiosa L.) / М.С. Ларькина, Е.В. Ермилова, Т.В. Кадырова // Тез. докл. 5 Всероссийской науч. конф. «Химия и технология растительных веществ». - г.Уфа, 2008. - С. 187.

14. Ларькина, М.С. Углеводный состав некоторых представителей рода Сentaurea флоры Сибири / М.С. Ларькина, Е.В. Ермилова, Т.В. Кадырова, Е.А. Краснов // Тез. докл. 4 Всерос. науч. конф.: Новые достижения в химии и химической технологии раст. сырья - Барнаул, апрель 2009. - С. 247-248.

15. Ларькина, М.С. Влияние экстракта василька шероховатого на содержание общих липидов и их отдельных компонентов у крыс с гепатитом / М.С. Ларькина, Э.В. Сапрыкина, Т.В. Кадырова, Е.В. Ермилова // Тез. докл. международн. Научно-практ. конф.: Фармация: современное состояние и перспективы. - Алматы, 2010. - С. 206-207.

Размещено на Allbest.ru

...