Размещено на http://www.allbest.ru/

Выявление и коррекция нарушений в системе гемостаза в цикле экстракорпорального оплодотворения

14.01.21 - гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Бугай Инна Валерьевна

Барнаул - 2013

Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования "Алтайский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Момот Андрей Павлович

Научный консультант: кандидат медицинских наук

Молчанова Ирина Владимировна

Официальные оппоненты: Федоров Анатолий Васильевич - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой педиатрии ФПК и ППС ГБОУ ВПО "Алтайский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Пикалов Илья Викторович - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО "Новосибирский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение "Гематологический научный центр" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Защита состоится "___"______________ 2013 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.002.01 при ГБОУ ВПО "Алтайский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации по адресу: 656038, г. Барнаул, проспект Ленина, 40.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО "Алтайский государственный медицинский университет" Министерства здравоохранения Российской Федерации.

Автореферат разослан "____"________________ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор медицинских наук, профессор Буевич Евгений Иванович

Общая характеристика работы

Актуальность темы.

Нарушения в системе гемостаза (антифосфолипидный синдром, гипергомоцистеинемия, носительство протромбогенных мутаций фактор V Лейден, протромбина и ряда других полиморфизмов) считаются не только факторами тромбогенного риска, но и причинами неудач наступления беременности в естественном цикле и при вспомогательных репродуктивных технологиях (Баркаган З.С., 2005, Макацария А.Д. и соавт., 2007, 2008; Папаян Л.П., 2003; Сидельникова В.М., Кирющенков П.А., 2004). Соответственно принято считать, что тромбозу и синдрому потери плода предшествует и сопутствует тромбофилия (Bonnar J., 1996; Braekkan S. et al., 2010; Christiansen S. et al., 2005; Geerts W. et al., 2004). Согласно описанию профессора З.С. Баркагана (1996, 2005) под этим состоянием могут пониматься все наследственные (генетически обусловленные) и приобретенные (вторичные, симптоматические) нарушения гемостаза, которым свойственна предрасположенность к раннему появлению и рецидивированию тромбозов, тромбоэмболий, ишемий и инфарктов органов.

Неудачи экстракорпорального оплодотворения (ЭКО) ряд авторов связывает с повышенной склонностью к свертыванию крови (Макацария и соавт, 2008; Охтырская Т.А. и соавт., 2010; Martinez-Zamora M. et al., 2011; Westerlund E. et al., 2012). Последняя обуславливается рядом причин - ятрогенной (тромбогенностью самой медицинской технологии), частым наличием у женщин, нуждающихся в ЭКО, тех или иных факторов тромбогенного риска, склонности к внутрисосудистому свертыванию крови, а также нарушениями в системе фибринолиза (Martinez-Zamora M. et al., 2011; Westerlund E. et al., 2012). Однако, до настоящего времени не определены информативные методы исследования системы гемостаза, выявляющие нарушения гемокоагуляции и фибринолитической активности крови, сопутствующие или предшествующие проведению ЭКО и влияющие на его результаты.

Для снижения тромбогенности крови в цикле ЭКО описано применение низкомолекулярных гепаринов - НМГ (Nelson S., Greer I., 2008; Urman B. et al., 2009). Однако показания для их назначения четко не описаны, в связи с чем, гепаринопрофилактика при гормональной нагрузке в ходе ЭКО, как правило, проводится без объективного обоснования. Для этого в настоящей работе изучена возможность использования теста генерации тромбина (ТГТ), отражающего динамику и интенсивность образования тромбина - ключевого фермента системы свертывания крови (Наместников Ю.А. и совт., 2010, 2011; Hemker H. et al., 2000, 2006).

Имеются данные о связи снижения фибринолитической активности крови с неудачными исходами репродуктивных технологий (Вартанян Э.В. и соавт., 2010; Westerlund E. et al., 2012). Тем не менее, коррекция низкой фибринолитической активности представляет определенные трудности, поскольку в литературе нет описаний успешного применения соответствующей лекарственной терапии. В течение примерно 50 лет известно, что некоторые стимулы (венозная окклюзия, физическая нагрузка, десмопрессин) вызывают ускорение фибринолитических реакций, обусловленное быстрым увеличением тканевого активатора плазминогена (t-PA) в крови в связи с его усиленной секрецией эндотелием кровеносных сосудов. Наше внимание привлекли эффекты перемежающей пневматической компрессии - ППК, используемые для интра - и послеоперационной тромбопрофилактики. О повышении фибринолитической активности крови и t-PA после механического воздействия на сосуды свидетельствуют результаты ряда авторов (Christen Y. et al., 1997; Salzman E. et al., 1987). Между тем данных о динамике активности ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-1) при этом в публикациях мы не нашли. В представленной работе ППК была использована для активации фибринолитических реакций при наличии соответствующих показаний.

Данным проблемным вопросам и была посвящена настоящая работа.

Степень разработанности темы исследования.

До настоящего времени отсутствуют данные о возможных изменениях в системе гемостаза в цикле экстракорпорального оплодотворения, не определены наиболее информативные методы исследования гемостаза при этом виде высокотехнологичной медицинской помощи. Не известна связь результатов таких методов с исходами ЭКО. Научно и практически не обоснованы показания для использования лечебных подходов, призванных корригировать нарушения системы гемостаза и снижать частоту неудачных попыток ЭКО.

Цель исследования

Определить значение диагностики и коррекции нарушений в системе гемостаза для снижения частоты неудачных исходов в стандартном протоколе экстракорпорального оплодотворения.

Задачи исследования

1. Выявить наличие и варианты изменений параметров системы гемостаза в стандартном цикле экстракорпорального оплодотворения.

2. Определить наиболее информативные лабораторные маркеры типовых нарушений гемокоагуляции, предшествующих или возникающих в цикле экстракорпорального оплодотворения.

3. Установить корреляционную связь избыточной генерации тромбина и низкой фибринолитической активности сосудистой стенки с неудачными исходами экстракорпорального оплодотворения.

4. Изучить значение проведения коррекции нарушений в системе гемостаза и фибринолитической активности крови для исходов экстракорпорального оплодотворения.

Научная новизна

Впервые определены типовые сдвиги в системе гемостаза - сопутствующие и развивающиеся в цикле экстракорпорального оплодотворения. Выявлено, что традиционные методы лабораторного исследования системы гемостаза являются малоинформативными (агрегация тромбоцитов, скрининговые тесты коагулограммы, уровень D-димеров, активность физиологических антикоагулянтов). Установлено, что наибольшей диагностической ценностью обладают методы оценки избыточного образования тромбина в плазме крови (по тесту генерации тромбина) и учета фибринолитической активности сосудистой стенки (по индексу АФСЭ). Высокая генерация тромбина проявляет себя в цикле экстракорпорального оплодотворения в 31,2% наблюдений (подана заявка на изобретение "Способ определения у беременных высокого тромбогенного риска при проведении процедуры экстракорпорального оплодотворения" № 2012109534/15, приоритет от 13.03.2012 г.).

Низкая фибринолитическая активность предшествует гормональной нагрузке и определяется в 21,7% наблюдений. Сочетанные нарушения, отмеченные выше, выявляются в 24,2% случаев.

Установлена связь между избыточной генерацией тромбина, низкой фибринолитической активностью сосудистой стенки крови и неудачными исходами экстракорпорального оплодотворения. В частности, коэффициент корреляции (Спирмена) не наступления беременности с высокой пиковой концентрацией тромбина (свыше 360 ммоль/л) составил 0,88 (p<0,002), а с индексом АФСЭ (менее 11%) был равен 0,67 (P<0,02).

Найдено, что перемежающая пневматическая компрессия способствует не только увеличению активности в крови тканевого активатора плазминогена (t-PA), но и снижению активности ингибитора активатора плазминогена 1 типа (PAI-1).

Определена возможность не медикаментозной коррекции низкой фибринолитической активности сосудистой стенки в цикле экстракорпорального оплодотворения путем воздействия аппаратной перемежающей компрессии верхних конечностей (положительное решение на выдачу патента "Способ повышения эффективности наступления беременности" по заявке № 2012109294, приоритет от 12.03.2012 г.).

Теоретическая значимость работы

Доказана высокая значимость избыточной генерации тромбина и низкой фибринолитической активности крови и сосудистой стенки для неудачных исходов экстракорпорального оплодотворения.

Практическая значимость

Предложены новые методические подходы для лабораторного исследования системы гемостаза в цикле экстракорпорального оплодотворения, предусматривающие динамическую оценку способности плазмы к генерации тромбина и фибринолитического потенциала крови и сосудистой стенки.

Определены пограничные значения теста генерации тромбина в цикле ЭКО и индекса активирующей фибринолиз способности эндотелия (индекса АФСЭ) для отбора женщин, нуждающихся в гепаринопрофилактике и/или активации системы фибринолиза с целью коррекции ятрогенных и сопутствующих нарушений гемостаза.

Разработана и апробирована методика не медикаментозной коррекции снижения фибринолитической активности крови в цикле ЭКО.

Применение по соответствующим показаниям профилактических доз низкомолекулярного гепарина и/или перемежающей пневматической компрессии способствовало уменьшению числа неудач этой репродуктивной технологии, в среднем, на 33,8% (P=0,00001).

Методология и методы исследования

Для решения поставленных задач проведено лабораторное исследование системы гемостаза и фибринолиза 327 женщин, направленных врачами акушерами-гинекологами Центра сохранения и восстановления репродуктивной функции КГБУЗ "Краевой клинической больницы" г. Барнаула для прохождения программы ЭКО в связи с бесплодием в период с 2011 по 2012 год. Предмет исследования - нарушения в системе гемостаза и фибринолитической активности крови при различных исходах вспомогательных репродуктивных технологий и методы их коррекции. В число методов исследования системы гемостаза включены традиционные и современные интегральные методы, позволившие достичь решения поставленных задач.

Положения, выносимые на защиту

Выявлены типовые динамические изменения ряда параметров системы гемостаза и фибринолиза в цикле экстракорпорального оплодотворения.

Отобраны информативные методы исследования системы гемостаза и фибринолитической активности сосудистой стенки, результаты которых соотносились с исходами ЭКО. Коэффициент корреляции (Спирмена) не наступления беременности с высокой пиковой концентрацией тромбина (свыше 360 ммоль/л) составил 0,88 (p<0,002), а с индексом АФСЭ (менее 11%) был равен 0,67 (P<0,02).

Избыточная генерация тромбина развивается на фоне гормональной нагрузки в цикле ЭКО в 31,2% наблюдений, проявления же низкой фибринолитической активности, встречаются в 21,7% наблюдений и предшествуют проведению данной репродуктивной технологии. Одновременное наличие названных выше нарушений со стороны системы гемостаза и фибринолиза определено у 24,2% пациенток.

Коррекция избыточной генерации тромбина профилактическими дозами низкомолекулярного гепарина и/или низкой фибринолитической активности сосудистой стенки путем пневматической перемежающей компрессии, при наличии показаний, приводит к снижению частоты неудачных исходов ЭКО соответственно на 33,3%, 38,9% и 28,9% (P<0,01).

Степень достоверности результатов

Статистическая обработка полученных данных осуществлена с использованием программ Microsoft Offis Exel 2003, Statistica 6.1 и Medcalc 12.2.1 Достоверность различий между средними величинами определяли с помощью критерия значимости Стьюдента (t). Нормальность распределений в группах оценивали по критерию Шапиро-Уилка. В том случае, когда распределение отклонялось от нормального, использовался непараметрический критерий Манна-Уитни для двух независимых групп, а также ранговый коэффициент корреляции Спирмена. Когда экспериментальные данные были представлены в виде процентов или частот, использовался точный критерий Фишера. Для характеристики точности полученных значений определяли 95% доверительный интервал. Статистически значимыми принимались различия P<0,05.

Апробация материалов диссертации.

Положения диссертационной работы были представлены на XIII научно-практической конференции молодых ученых "Молодежь - Барнаулу" (г. Барнаул, 2011 г.); Дне российской науки в "Алтайском государственном медицинском университете" (г. Барнаул, 2012 г.); V Научно-практической конференции "Современная гематология. Проблемы и решения" (г. Москва, 2011 г.); VI Региональном научном форуме "Мать и дитя" (Москва 2012 г.); Всероссийской научно-практической конференции "Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии" (г. Санкт-Петербург, 2012 г.); Дне российской науки в "Алтайском государственном медицинском университете" (г. Барнаул, 2013 г.); VI Всероссийской конференции "Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечно-сосудистой хирургии" им.А.Н. Бакулева (г. Москва, 2013 г.); XX Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (г. Москва, 2013 г.).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 17 работ, в том числе 6 в журналах из списка ВАК, одна - в рецензированной коллективной монографии, изданной в России и одна - в международном рецензируемом издании.

Внедрение результатов исследования

Научные положения и практические рекомендации, приведенные в диссертации, используются при обучении врачей на тематических циклах повышения квалификации "Гематология с курсом физиологии и патологии гемостаза" ФПК и ППС ГБОУ ВПО АГМУ Минздрава РФ и внедрены в практику работы краевой лаборатории патологии гемостаза и Центра сохранения и восстановления репродуктивной функции КГБУЗ "Краевой клинической больницы" г. Барнаула.

Личный вклад автора

Материал, представленный в работе, получен и проанализирован лично автором. Лабораторное исследование крови пациенток проводилось на базе краевой лаборатории патологии гемостаза (заведующий - д. м. н.А.Н. Мамаев) и лаборатории гематологии ЦНИЛ АГМУ (научный руководитель - д. м. н., проф.А.П. Момот) с личным участием автора. Отбор, направление и ведение женщин в цикле экстракорпорального оплодотворения проводилось акушерами-гинекологами - заведующей отделением сохранения и восстановления репродуктивной функции КГБУЗ "Краевая клиническая больница", к. м. н.О.Г. Борисовой и консультантом акушером-гинекологом Главного управления Алтайского края по здравоохранению и фармацевтической деятельности, к. м. н. И.В. Молчановой. Написан аналитический обзор отечественной и зарубежной литературы по изучаемой проблеме. Проведено обобщение полученных данных, формулировка выводов, практических рекомендаций, написание рукописей к публикациям, оформлена диссертация и автореферат.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 106 страницах машинописного текста, содержит 3 рисунков, 12 таблиц, три клинических примера. Состоит из введения, обзора литературы, одной главы с описанием материалов и методов, двух глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций. Библиография включает 153 источника, из них 51 - отечественных и 102 - зарубежных.

экстракорпоральное оплодотворение гемостаз свертывание кровь

Содержание работы

Материалы и методы исследования

Исследование носило проспективный характер в соответствии с рекомендованными в литературе критериями (Власов В.В., Семернин Е.Н., 2001). В разработку были включены результаты лабораторного исследования системы гемостаза и фибринолитической активности крови и сосудистой стенки 327 женщин, обратившихся в Центр сохранения и восстановления репродуктивной функции КГБУЗ "Краевой клинической больницы" г. Барнаула (КГБУЗ "ККБ") в период с 2011 по 2012 год для прохождения программы ЭКО в связи с бесплодием и в рамках краевых квот по оказанию этого вида высокотехнологичной медицинской помощи. Представленное исследование было одобрено Локальным комитетом по биомедицинской этике Алтайского государственного медицинского университета (протокол № 11 от 05.11.2011 г.), а все пациентки дали на участие в нем свое информированное согласие.

Критерием отбора пациенток в исследование стало бесплодие любой формы, требующее лечение с помощью вспомогательных репродуктивных технологий. Возраст пациенток составил 25-38 лет, все они принадлежали к европеоидной расе и не страдали соматической патологией с системным поражением органов - системной красной волчанкой, артериальной гипертензией, сахарным диабетом. Пациентки с тромбозами и тромбоэмболическим анамнезом, получающие на момент обследования или в анамнезе антикоагулянтную терапию, исключались из данной работы.

Исследование состояло хронологически из двух этапов. На первом из них проведено обследование 163 женщин в цикле ЭКО, отобранных произвольно, методом случайной выборки. По полученным на этом этапе результатам были определены пороговые значения теста генерации тромбина и фибринолитической активности сосудистой стенки, при наличии которых беременность не наступала. На втором этапе исследований обследованы еще 164 женщины, также произвольной выборки, из которых

98 пациенткам проводилась коррекция нарушений в системе гемостаза и фибринолиза при наличии соответствующих показаний - избыточной генерации тромбина (по данным теста калиброванной тромбографии) и/или сниженной фибринолитической активности плазмы крови (группа с терапевтическим воздействием на систему гемостаз и фибринолиз).

Данные о включенных в исследование женщин представлены в таблице 1.

Таблица 1

Клиническая характеристика пациенток

Признак	Всего наблюдений (n = 327)	Первый этап исследования (n=163)	Второй этап исследования (n-164)	P
Возраст, лет (±SD)	33,7 ± 1,3	33,2 ± 0,8	34,4 ± 1,0	> 0,5
Индекс массы тела > 25 кг/м2, n (%)	61 (18,7%)	34 (20,9)	27 (16,5)	0,323
Причины бесплодия:
- трубный фактор, n (%)	119 (36,4%)	61 (37,4)	58 (35,4)	0,730
- мужской фактор, n (%)	138 (42,2%)	59 (36,2)	79 (48,2)	0,033
- эндокринный фактор, n (%)	29 (8,9%)	14 (8,6)	16 (9,8)	0,848
- сочетание женского и мужского факторов, n (%)	41 (12,5%)	23 (14,1)	17 (10,7)	0,316

Формирование групп обследованных женщин приведено на рисунке 1.

Рисунок 1. Группы женщин, включенных в исследование

При первом врачебном приеме женщины были опрошены акушерами-гинекологами Центра сохранения и восстановления репродуктивной функции КГБУЗ "Краевой клинической больницы" г. Барнаула по поводу семейного и личного тромботического анамнеза, отягощенного акушерско-гинекологического анамнеза, принимаемых лекарственных препаратов. Кроме того, проводились общеклиническое и лабораторное исследование, проводимое в соответствии с приказом Министерства здравоохранения Российской Федерации от № 556н "Об утверждении стандарта медицинской помощи при бесплодии с использованием вспомогательных репродуктивных технологий".

С целью углубленного анализа системы гемостаза проводилось изучение результатов скрининговых коагуляционных тестов, активности фактора VIII, оценки уровня растворимых фибрин-мономерных комплексов в плазме орто-фенантролиновым тестом, выполнялся скрининг нарушений в системе протеина С, иммуноферментными методами - определение количества D-димеров, активности тканевого активатора плазминогена (t-PA) и ингибитора тканевого активатора плазминогена I типа (PAI I). Амидолитически устанавливались уровень плазминогена и активность антитромбина III. Оценка агрегации тромбоцитов проводилась на агрегометре Chronolog 490-4D с использованием в качестве индукторов агрегации АДФ (2 мкМ и 0,1 мкМ), адреналина и коллагена. Для интегрального исследования системы гемостаза был использован тест генерации тромбина (ТГТ) с концентрацией тканевого фактора 5 пМ. Носительство протромбогенных ДНК-полиморфизмов изучалось на оборудовании Real-Time.

Для индукции суперовуляции в цикле ЭКО акушерами-гинекологами Центра сохранения и восстановления репродуктивной функции КГБУЗ "Краевой клинической больницы" г. Барнаула использовался стандартный протокол: пациенткам с 21-го дня менструального цикла назначался агонист гонадотропин-релизинг-гормона трипторелин дейли формы по 0,1 мг подкожно в сутки (диферелин Ипсен, Франция, декапептил ФЕРРИНГ, Германия). Стимуляция яичников осуществлялась рекомбинантным фолликулостимулирующим гормоном человека (гонал-ф Мерк Сероно, Швецария) или фоллитропин бета (пурегон 600 МЕ/0,72 мл Н.В. Органон, Нидерланды), в дозе от 150 до 300 МЕ ежедневно, в зависимости от индекса массы тела и овариального резерва. При созревании фолликулов до 18 - 20 мм в диаметре женщинам вводился рекомбинантный хорионический гонодатотропин (овитрель Мерк Сероно, Италия) в дозе 6500 МЕ. Через 34-36 часов после использования триггера овуляции проводилась трансвагинальная пункция фолликулов под контролем ультразвукового исследования. Наряду с этим выполнялась поддержка лютеиновой фазы дидрогестероном (утрожестан Безен, Бельгия) в дозе 40 мг в сутки. Перенос эмбрионов осуществлялся на 3-5 сутки в количестве 1-2, увеличивая дозу прогестерона за счет введения 8% прогестерон-геля (крайнон, Мерк Сероно, Италия) вагинально 1 раз в день.

Исследование системы гемостаза у каждой из женщин проводилось трижды. Первая точка наблюдений соответствовала времени до вступления в цикл ЭКО, 2-я точка в середине цикла - за 2-3 дня до пункции фолликулов, 3-я точка - 12-14 дню после переноса эмбрионов, когда исход в части наступления беременности был определен на основе данных о содержании b-хорионического гонадотропина человека.

Результаты исследования и их обсуждение

Первоначально был предпринят динамический анализ результатов всего комплекса использованных и приведенных выше методов исследования системы гемостаза и фибринолитической активности крови и сосудистой стенки у 229 женщин в цикле ЭКО, которые не проходили тот или иной вид терапевтического воздействия на гемокоагуляцию и фибринолиз (рисунок 1). Показано, что традиционные и широко распространенные методы исследования гемостаза значимо не реагируют на гормональные воздействия в цикле ЭКО и находятся в диапазоне нормальных колебаний, установленных для практически здоровых людей (Consultative Hemostasis and Thrombosis / C. S. Kithens, B. M. Alving, C. M. Kessler, 2007) (таблица 2). В их число вошли способы оценки сосудисто-тромбоцитарного гемостаза, скрининговые коагуляционные тесты (АПТВ и протромбиновый тест), определение активности фактора VIII, активности антитромбина III и скрининга нарушений в системе протеина С, а также концентрации плазминогена. Следует отметить, что такой молекулярный маркер активации свертывания крови как РФМК, также не изменялся. Тем не менее, концентрация фибриногена и уровень классического маркера внутрисосудистого свертывания крови и активации фибринолиза - D-димеров имели тенденцию к увеличению в динамике наблюдений, однако отличий между этими параметрами в группе забеременевших и не забеременевших женщин установлено не было.

В отличие от этого, при гормональной нагрузке в цикле ЭКО определено существенное нарастание значений показателей теста генерации тромбина (ТГТ) - таблица 3. В частности, в сравнении с 1-й точкой наблюдений, у не забеременевших женщин показатель ЭТП увеличился на 34,8%, P<0001 (2-я точка) и 26,3%, P<0,001 (3-я точка). При наступлении же беременности прирост был меньшим и составил, соответственно, 15,1% (P<0001) и 17,6% (P<0001). Схожая тенденция была определена и при анализе второго показателя ТГТ - ПКТ. С начала наблюдений величина этого параметра увеличилась соответственно на 19,5% (P<0001) и 17,5% (P<0001) - при неудаче цикла ЭКО, а при удаче - соответственно на 4,0% (P=0,30) и 6,1% (P=0,79). Мы обратили внимание также на то, что разница в ТГТ в середине цикла ЭКО (2-я точка) при сравнении результатов в случае разных исходов ЭКО составила по ЭТП 24,8% (P<0,01), а по ПКТ - 23,2% (P<0,01). Следовательно, показания ТГТ зависят не только от наличия гормональной нагрузки в цикле ЭКО, но они существенно выше при неудачных результатах этой вспомогательной репродуктивной технологии.

Таблица 2. Данные исследования различных звеньев системы гемостаза (М±SD) у женщин в цикле ЭКО без применения терапевтического воздействия на систему гемокоагуляции и фибринолиз (n=229)

Показатель *	При неудаче в цикле ЭКО (n=147)	При наступлении беременности (n=82)
	1 точка наблюдений	2 точка наблюдений	3 точка наблюдений	1 точка наблюдений	2 точка наблюдений	3 точка наблюдений
Агрегация тромбоцитов: с АДФ (в дозе 0,1 мкМ), % с АДФ (в дозе 2 мкМ), % с адреналином, % с коллагеном, %	25,3±1,48 70,6±1,74 58,6±1,49 70,4±1,09	23,5±1,50 69,9±1,78 59,2±1,50 69,8±1,05	25,6±1,69 72,9±1,70 63,9±1,44 76,1±1,91	26,9±2,72 71,2±1,10 60,6±2,37 73,6±1,85	24,6±2,86 68,5±1,38 58,9±2,63 73,7±1,62	28,2±3,23 73,3±1, 20 64,8±2,62 74,2±1,35
Протромбиновый тест, отношение	1,01±0,07	1,01±0,06	1,00±0,05	1,00±0,06	1,04±0,04	1,01±0,06
Протромбиновый тест, МНО	1,00±0,06	0,94±0,07	1,03±0,06	0,95±0,04	0,97±0,06	1,03±0,08
АПТВ, отношение	1,0±0,07	0,91±0,04	1,00±0,06	1,01±0,06	1,03±0,08	1,01±0,08
Тромбиновый тест, отношение	1,03±0,08	0,94±0,04	1,02±0,08	1,00±0,06	0,98±0,06	1,00±0,07
Концентрация фибриногена в плазме, г/л	2,96±0,89	3,11±0,78	3,70±0,811-3	2,92±0,77	3, 20±0,73	3,50±0,841-3
Активность фактора VIII, %	101,27±6,30	103,8±7,31	106,5±5,45	101,6±4,12	100,6±6,76	109,8±5,30
Активность антитромбина III, %	109,6±30,7	109,7±26,8	112,1±29,8	106,1±32,1	109,5±22,1	107,4±29,6
Скрининг нарушений в системе протеина С, НО	1,00±0,06	1,01±0,07	0,98±0,04	1,02±0,05	1,00±0,06	0,95±0,06
Уровень D-димеров, нг/мл	200,3±48,61-2	257,1±59,7	293,4±51,31-3	193,2±44,91-2	260,3±52,4	269,8±49,31-3
Уровень РФМК, мг/100 мл	9,22±1,42	10,35±1,38	9,62±1,43	9,69±1,54	10,62±1,62	9,35±1,55

Примечание: * - здесь и в таблице 3 достоверность различий P<0,05 между группами с различными исходами в одни и те же сроки наблюдений в цикле ЭКО; ** - то же, P<0,01; цифры в надстрочном положении - достоверность различий P<0,05 между точками наблюдений

Таблица 3. Результаты оценки тромбинового потенциала и показателей фибринолитической активности крови (М±SD) у женщин в цикле ЭКО без применения терапевтического воздействия на систему гемокоагуляции и фибринолиз (n=229)

Показатель *	При неудаче в цикле ЭКО (n=147)	При наступлении беременности (n=82)
	1 точка наблюдений	2 точка наблюдений	3 точка наблюдений	1 точка наблюдений	2 точка наблюдений	3 точка наблюдений
Показатели теста генерации тромбина: эндогенный тромбиновый потенциал (ЭТП), нмольЧмин пик тромбина (ПКТ), нмоль/л	1535,8±50,21-2 322,7±25,51-2	2070,8±55,1** 385,8±23,5	1940,5±48,6**1-3 379,3±23,8**1-3	1441,1±53,91-2 313,1±29,9	1659,2±43,0 325,7±26,9	1694,4±50,31-3 345,6±28,7
Уровень плазминогена, %	96,1±23,8	99,5±24,8	107,7±24,9	101,6±26,5	95,4±23,5	107,3±28,9
Время лизиса сгустка, мин	14,1±5,43**	15,7±6,09**	15,4±4,65**	10,3±4,51	9,92±5,57	10,4±6,62
t-PA, активность, ед/мл	0,29±0,16	0,37±0,15	0,32±0,016	0,29±0,15	0,33±0,16	0,32±0,15
PAI 1, активность, ед/мл	3,11±2,30	3,67±2,33*	3,22±2,47	2,13±2,46	2,22±2,43	2,28±2,33
Индекс АФСЭ, %	9,32±4,61**	10,8±3,75**	9,93±3,08**	13,6±3,42	14,8±4, 19	13,4±3,75

Проведенные расчеты показали, что границы диапазона показателей ЭТП при неудаче или успешном исходе ЭКО в середине цикла не пересекались даже при допущении соответствующего интервала значений M±2SD - 1960,6-2181,0 нмольмин против 1573,2-1745,2 нмольмин. Показатель пиковой концентрации тромбина (ПКТ), также различался при разных исходах ЭКО, но его значения не пересекались лишь в интервале M±SD - 368,5-419,7 нмоль/л против 313,8-363,8 нмоль/л (рисунки 2 и 3). Соответственно, значения показателя ЭТП свыше 1900 нмольмин и/или ПКТ более 360 нмоль/л рассматривались нами в качестве критерия наличия избыточной генерации тромбина. Частота встречаемости такой патологии у женщин, обратившихся по поводу прохождения цикла ЭКО (102 из 327 пациенток), составила 31,2%.

Рисунок 2. Определение пограничных значений эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП) (полученных на 2-й точке наблюдений) при различных исходах ЭКО в первой (наблюдательной) группе

Второй находкой в предпринятом исследовании оказалась характеристика фибринолитической активности крови, связанная с реакцией сосудистой стенки (таблица 3). Определено, что индекс АФСЭ, предложенный нами и рассчитываемый по отношению активностей t-PA и PAI 1, был стабильно низким при неудаче в цикле экстракорпорального оплодотворения (в диапазоне от 9,32% до 10,8%) и постоянно высоким при успешном исходе данной репродуктивной технологии (от 13,4% до 14,8%), без достоверных различий получаемых результатов, в динамике, на разных этапах исследования. Эти наблюдения свидетельствовали об отсутствии связи между фибринолитической активностью сосудистой стенки с гормональной нагрузкой у женщин при прохождении цикла ЭКО.

Рисунок 3. Определение пограничных значений показателя пик тромбина (ПКТ) (полученных на 2-й точке наблюдений) при различных исходах ЭКО в первой (наблюдательной) группе

Из таблицы 3 также видно, что при неудаче ЭКО индекс АФСЭ, по средним данным, не превышал 10,8%, в то время, как у женщин с благоприятным исходом он был не ниже 13,4% (P<0,01). Кроме того мы учли, что средние показатели индекса АФСЭ, определенные в нашем центре у 10 практически здоровых добровольцев женского пола (в возрасте от 20 до 23 лет), оказались равными (М±SD) 11,0±3,3%.

В связи с этим значения индекса АФСЭ, полученные на 1-й точке наблюдений менее 11% учитывались в работе как критерий низкой фибринолитической активности сосудистой стенки и непосредственно крови (учитывая показатели времени лизиса эуглобулинового сгустка, активированного каолином). Частота встречаемости такого отклонения у женщин, обратившихся по поводу прохождения цикла ЭКО (71 из 327 пациенток), составила 21,7%.

Необходимо отметить, что у части взятых в исследование пациенток были обнаружены сочетанные нарушения, в виде избыточной генерации тромбина и гипофибринолиза (79 из 327 пациенток или в 24,2%).

В подтверждение описанных выше закономерностей был проведен корреляционный анализ связи сдвигов в различных звеньях системы гемостаза и фибринолитической активности с неудачными исходами ЭКО (таблицы 4 и 5). В результате была установлена достоверно выраженная корреляционная связь показателей теста генерации тромбина (ЕТП и ПКТ) и группы показателей, характеризующих фибринолитическую активность крови и сосудистой стенки (время лизиса сгустка фибрина, активность t-PA и PAI 1, индекс АФСЭ) с не наступлением беременности. В то же время результаты традиционных методов исследования коагуляционного и антикоагулянтного звеньев гемостаза, оценки уровня маркеров тромбинемии не показали достоверно выраженной связи с результатами ЭКО.

Таблица 4. Корреляционная связь различных параметров системы гемостаза (полученных на 2-й точке наблюдений) с неудачными исходами ЭКО

Показатель	Коэффициент корреляции (P - достоверность)
Агрегация тромбоцитов: с АДФ (в дозе 0,1 мкМ), % с АДФ (в дозе 2 мкМ), % с адреналином, % с коллагеном, %	0,23 (0,54) 0,19 (0,64) 0,10 (0,80) 0,24 (0,56)
Протромбиновый тест, отношение	0,06 (0,88)
Протромбиновый тест, МНО	0,13 (0, 19)
АПТВ, отношение	0,21 (0,54)
Тромбиновый тест, отношение	0,04 (0,58)
Концентрация фибриногена в плазме, г/л	- 0,28 (0,33)
Активность фактора VIII, %	0,07 (0,53)
Активность антитромбина III, %	0,33 (0,47)
Скрининг нарушений в системе протеина С, НО	- 0,28 (0,39)
Уровень D-димеров, нг/мл	0,21 (0,36)
Уровень РФМК, мг/100 мл	0,37 (0,41)
Показатели теста генерации тромбина: эндогенный тромбиновый потенциал (ЭТП), нмольЧмин пик тромбина (ПКТ), нмоль/л	0,79 (0,001) 0,88 (0,002)

Высокая и достоверно выраженная связь с проблемными исходами ЭКО была выявлена также с большинством показателей оценки фибринолитической активности крови/сосудистой стенки на начальных и средних сроках предпринятых наблюдений (таблица 5).

Таблица 5. Корреляционная связь параметров фибринолитической активности крови с неудачными исходами ЭКО

Показатель	Коэффициент корреляции (P - достоверность)
	на 1-й точке наблюдений	на 2-й точке наблюдений
Уровень плазминогена, %	- 0,31 (0,23)	- 0,24 (0,31)
Время лизиса сгустка, мин	0,71 (0,01)	0,66 (0,02)
t-PA, активность, ед/мл	0,60 (0,02)	0,52 (0,01)
PAI 1, активность, ед/мл	0,51 (0,01)	0,47 (0,02)
Индекс АФСЭ, %	0,67 (0,02)	0,53 (0,01)

Подводя итоги этому разделу работы можно отметить, что на основе полученных данных были определены сверхпороговые значения ряда лабораторных параметров, позволяющих не только отслеживать повышенную склонность к свертыванию крови и/или гипофибринолизу, но и на их основе отбирать пациенток с высоким риском неудачи ЭКО для проведения медикаментозной и не медикаментозной коррекции выявленных нарушений.

Влияние на систему гемостаза при чрезмерной генерации тромбина предусматривала проведение гепаринопрофилактики путем подкожного введения надропарина кальция по 0,3 мл два раза в сутки (или бемипарина по 3500 ед) один раз в сутки на протяжении 12-14 дней. Решение о начале такой терапии основывалось на установлении факта увеличения ЭТП свыше 1900 нмоль/мин и/или ПКТ более 360 нмоль/л, определенных на 2-й точке наблюдений.

Таблица 6. Исходы ЭКО у женщин в зависимости от наличия или отсутствия нарушений в системе гемостаза и фибринолиза и предпринятых методов терапевтической коррекции

Подгруппы женщин	Всего женщин (n=327)	Женщины с неудачами в цикле ЭКО (n=203)
	Количество	%	Количество	%
1. Без искомых признаков патологии гемостаза и фибринолиза	75	22,9	7 из 75	9,3
2. С нарушениями гемостаза и фибринолиза	252	77,1	196 из 252	77,8
2.1 Не прошедшие терапевтического вмешательства	154	47,1	140 из 154	90,9
- в том числе с увеличением ЭТП свыше 1900 нмольмин и/или повышением ПКТ более 360 нмоль/л	64	19,6	60 из 64	93,7
- в том числе со снижением индекса АФСЭ менее 11%	48	14,7	41 из 48	85,4
- в том числе с увеличением ЭТП свыше 1900 нмольмин и/или повышением ПКТ более 360 нмоль/л и снижением индекса АФСЭ менее 11%	42	12,8	39 из 42	92,9
2.2 После терапевтического вмешательства в связи с высокой генерацией тромбина или гипофибринолиза	98	30,0	56 из 98	57,1
- в том числе после гепаринопрофилактики	38	11,6	23 из 38	60,4
- в том числе после курса ППК	23	7,0	13 из 23	56,5
- в том числе после проведения комбинированной терапии	37	11,3	20 из 37	54,0

Воздействие на стенку кровеносных сосудов с целью повышения активности фибринолитической активности проводилось с помощью перемежающей пневматической компрессии (ППК). В работе был использован прибор "Пневмомассажёр ПМ-01" (Россия), с наложением 7-камерной компрессионной шины на верхнюю конечность в режиме волновой компрессии со следующими характеристиками: время поддержания давления в камерах манжеты от 5 до 90 сек; давление сжатого воздуха, подаваемого в камеры от 30 мм. рт. ст. до 150 мм. рт. ст.; 45 циклов волновой компрессии с запоминанием на протяжении 30 мин. Компрессия выполнялась в виде курса из 8 сеансов (два раза в неделю) с 30-минутным наложением манжеты аппарата на левую или правую руку. Основанием для начала такой терапии являлось снижение индекса АФСЭ ниже 11%, определенное у пациенток первой группы непосредственно в начале программы ЭКО.

Полученные результаты приведены в таблицах 6 и 7, откуда видно, что число неудачных исходов ЭКО после проведенного лечения уменьшилось при гепаринопрофилактике с 93,7% до 60,4% (на 33,3%) (P<0,0001), в случае применения перемежающей пневматической компрессии с 85,4% до 56,5% (на 28,9%) (P<0,01) и при комбинированной терапии - с 92,9% до 54,0% (на 38,9%) (P<0,0001).

В целом, предпринятое терапевтическое воздействие при избыточной генерации тромбина и/или низкой фибринолитической активности крови было связано с уменьшением количества неблагоприятных исходов экстракорпорального оплодотворения с 90,9% до 57,1% (на 33,8%) ( (P<0,00001).

Таблица 7. Связь использованных методов коррекции гемостатических и фибринолитических реакций с частотой неудач в цикле ЭКО (n=252)

Способы терапевтического воздействия	Нуждающиеся в лечении, но не прошедшие его (n=154)	Нуждающиеся в лечении и пролечившиеся (n=98)
	Общее коли-чество	Число неудачных исходов	%	Общее коли-чество	Число неудачных исходов	%
1. Гепаринопрофилактика	64	60	93,8	38	23	60,5
2. Курс перемежающей пневматической компрессии	48	41	85,4	23	13	56,5
3. Сочетанное воздействие	42	39	92,9	37	20	54,0

Эволюция показателей лабораторных исследований, отражающих дефекты гемостатических и фибринолитических реакций у пациенток, которым была показано терапевтическое воздействие, приведена в таблицах 8, 9 и 10.

При расчетах лабораторных параметров у женщин с высокой генерацией тромбина, нуждающихся в гепаринопрофилактике (таблица 8) было найдено, что введение профилактических доз низкомолекулярного гепарина (надропарина кальция или бемипарина) с середины цикла ЭКО закономерно снижало генерацию тромбина. В частности, на фоне назначения гепаринов показатель эндогенного тромбинового потенциала (ЭТП) между 2-й и 3-й точками наблюдений снизился на 18,1%, по сравнению со снижением на 3,6% у женщин, не получавших эти антикоагулянты. Похожую динамику имела и пиковая концентрация тромбина (ПКТ), которая уменьшилась, соответственно, на 13,2% и 1,8%.

Таблица 8

Показатель	Нуждающиеся в лечении, но не прошедшие его (n=64)	При прохождении гепаринопрофилактики (n=38)
	1 точка наблюдений	2 точка наблюдений	3 точка наблюдений	1 точка наблюдений	2 точка наблюдений	3 точка наблюдений
ЭТП, нмольЧмин	1461,2±81,6	1849,3±89,2	1782,4±93,5**	1489,5±85,5	1861,2±94,4	1524,6±88,9
ПКТ, нмоль/л	310,1±23,1	382,4±19,5	375,6±25,2**	321,2±22,3	386,3±23,5	335,2±20,2
t-PA, активность, ед/мл	0,30±0,16	0,33±0,15	0,31±0,15	0,33±0,12	0,41±0,16	0,42±0,17
PAI-1, активность, ед/мл	2,40±1,13	2,50±1,22	2,44±1,98	2,84±1,45	3,61±1,75	3,50±1,71
Индекс АФСЭ, %	12,5±3,1	13,2±4,2	12,7±3,6	11,62±3,2	11,35±4,2	12,0±3,9
Время лизиса сгустка, мин	9,4±3,0	8,7±3,3	10,1±3,5	8,4±3,7	8,7±2,8	9,7±3,2

Динамика показателей гемостаза и фибринолиза (М±SD) у женщин при наличии показаний для гепаринопрофилактики (n=102)

Примечание: * - здесь и в таблицах 9 и 10 достоверность различий P<0,05 между пролеченными и не пролеченными пациентками; ** - то же, P<0,01

Найдено, что при изолированном воздействии перемежающей пневматической компрессии у женщин с исходно низкой, до вхождения в цикл ЭКО, фибринолитической активности крови, имелось резкое нарастание индекса АФСЭ (таблица 9). Отметим, что вазокомпрессионная терапия к концу процедуры ЭКО приводила не только к достоверно выраженному повышению активности t-PA (P<0,05), но и к снижению активности PAI-1 в конце цикла ЭКО в 1,75 раза (P<0,05).

Таблица 9. Динамика показателей гемостаза и фибринолиза (М±SD) у женщин при наличии показаний для проведения курса ППК (n=71)

Показатель	Нуждающиеся в лечении, но не прошедшие его (n=48)	При прохождении курса ППК (n=23)
	1 точка наблюдений	2 точка наблюдений	3 точка наблюдений	1 точка наблюдений	2 точка наблюдений	3 точка наблюдений
ЭТП, нмольЧмин	1534,4±87,2**	1575,7±85,6	1589,6±96,4	1415,1±87,7	1562,3±86,1	1632,3±93,8
ПКТ, нмоль/л	314,2±30,3*	322,4±28,2	327,7±25,7**	294,5±24,4	322,1±31,1	353,3±25,9
t-PA, активность, ед/мл	0,36±0,14	0,39±0,15	0,37±0,14*	0,35±0,16	0,51±0,15	0,48±0,15
PAI-1, активность, ед/мл	3,98±1,67	4,11±2,32	4,05±2,54*	3,55±1,88	2,64±1,06	2,32±1,32
Индекс АФСЭ, %	9,0±3,2	9,5±3,6**	9,1±4,0**	9,9±3,2	19,3±3,4	20,6±4,5
Время лизиса сгустка, мин	13,8±4,3	14,4±4,6*	14,8±3,2**	14,3±4,1	11,4±3,7	9,0±3,3

Сочетанное применение перемежающей пневматической компрессии и низкомолекулярного гепарина оказывало комплексное и наиболее благоприятное воздействие на показатели гемостаза и фибринолиза, что соответствовало максимальному снижению числа неудачных исходов ЭКО (таблица 10).

Таблица 10. Динамика показателей гемостаза и фибринолиза (М±SD) при наличии показаний для комбинированной терапии (n=79)

Показатель	Нуждающиеся в лечении, но не прошедшие его (n=42)	При прохождении гепаринопрофилактики и курса ППК (n=37)
	1 точка наблюдений	2 точка наблюдений	3 точка наблюдений	1 точка наблюдений	2 точка наблюдений	3 точка наблюдений
ЭТП, нмольЧмин	1538,6±78,3	1770,4±85,6	1756,6±95,7**	1566,7±86,3	1764,4±95,7	1542,1±81,3
ПКТ, нмоль/л	322,3±32,4	379,3±29,1	374,5±31,6**	324,7±27,6	371,2±33,8	335,6±30,7
t-PA, активность, ед/мл	0,37±0,17	0,39±0,15	0,36±0,16	0,31±0,16	0,49±0,15	0,46±0,14
PAI-1, активность, ед/мл	3,64±2,05	4,12±1,77	3,45±1,98	3,02±1,69	2,29±1,14	2,09±0,91
Индекс АФСЭ, %	10,2±2,9	9,5±3,1**	10,4±3,3**	10,2±2,6	21,4±4,5	22,0±4,3
Время лизиса сгустка, мин	15,4±3,9	13,2±4,2**	15,7±3,4**	13,8±2,3	10,0±3,8	9,1±3,9

Среди всех обследованных было выявлено только 6 женщин из 327 (1,8%), имеющих редкие мутации - F5 Leiden (G1691>A) и FII (G20210>A), ассоциирующиеся с тромбозами и неудачами беременности. Поэтому в настоящем исследовании мы не смогли определить их роль для исходов ЭКО. Более часто встречающиеся в группе обследованных нами женщин полиморфизмы гена MTHFR (C677>Т) и гена PAI 1 (5G>4G) по сравнению с результатами исследования Coulam C. et Jeyendran D. (2009) не показали своей значимости.

Выводы

1. В число наиболее информативных лабораторных маркеров нарушений гемокоагуляции в стандартном протоколе ЭКО вошли показатели теста генерации тромбина и фибринолитической активности крови и сосудистой стенки. В то же время широкий спектр традиционных способов исследования системы гемостаза, включая определение уровня D-димеров, не проявил своей значимости.

2. В стандартом протоколе ЭКО в 31,2% случаев выявлена избыточная генерация тромбина, в 21,7% - определена низкая фибринолитическая активность сосудистой стенки и в 24,2% - найдены сочетанные нарушения.

3. Установлена высокая корреляционная связь избыточной генерации тромбина и низкой фибринолитической активности сосудистой стенки с неудачными исходами экстракорпорального оплодотворения. Коэффициент корреляции (по Спирмену) составил соответственно 0,88 (P<0,002) и 0,67 (P<0,02).

...