Закономерности структурной дифференцировки печени и селезенки эмбрионов и плодов человека в ранние сроки беременности в норме и при воздействии на мать факторов шинного производства

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

на соискание ученой степени доктора медицинских наук

Закономерности структурной дифференцировки печени и селезенки эмбрионов и плодов человека в ранние сроки беременности в норме и при воздействии на мать факторов шинного производства

14.03.01 - анатомия человека

Обухова Л.Е.

Барнаул - 2011

Работа выполнена в ГБОУ ВПО «Алтайский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России

Научные консультанты: Доктор медицинских наук, профессор

Высоцкий Юрий Александрович

Доктор медицинских наук, профессор

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Калачев Геннадий Анатольевич

доктор медицинских наук, Майбородин Игорь Валентинович

профессор

доктор медицинских наук, Машак Александр Николаевич

профессор

Ведущая организация: Красноярский государственный медицинский университет

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В настоящее время для антенатальной профилактики смертности и заболеваний плода важное значение имеет раскрытие механизмов взаимосвязи эмбриона и плода с матерью на различных этапах беременности. Наибольшую значимость в эмбриологии имеет изучение механизмов адаптации матери и плода в физиологических и патологических условиях (Л.А. Колейчик, 2002; Н.И. Барсукова, 2010; Б.Л. Пономарев и соавт., 2004; Ю.И. Склянов и соавт., 2005). Ранний онтогенез и особенно становление органов в период эмбриогенеза изучены явно недостаточно. При этом работы по онтогенезу органов посвящены, в основном, анализу характера изменений в органах и системах плода.

Все чаще в акушерской практике наблюдаются различные нарушения беременности, приводящие к преждевременным родам и рождению потомства с функциональными нарушениями различных органов (А.Н. Стрижаков и соавт., 2004; З.З. Токова, 2004; А.В. Островская и соавт., 2008; Г.Т. Сухих и соавт., 2008; М.Л. Сизенко, Г.В. Брюхин, 2009; D.J. Baker, 2000).

Установлена зависимость регуляции эмбриогенеза от комплекса внутренних и внешних факторов (Л.М. Петрова и соавт., 2007).

Изучение гистогенеза паренхиматозных и стромальных структур органов в ранние сроки беременности, их взаимодействия между собой, раскрытие природы этих процессов имеет принципиальное значение в понимании структурных основ функционирования эмбриона и плода в целом. Успешное решение этих вопросов позволит определить подходы к целенаправленной коррекции возможных патологических изменений, возникающих в органах эмбрионов и плодов в условиях патологии.

Особое место в кроветворении у эмбриона и плода занимают печень и селезенка, которые обеспечивают функционирование и стабилизацию системы мать-плацента-плод.

Отсутствие целостной картины складывающихся сосудисто-паренхиматозных взаимоотношений в органах в первом триместре беременности побуждает к более тщательному изучению их становления. Межклеточное взаимодействие стромальной и гемопоэтической ткани осуществляется в результате их регуляторного влияния друг на друга (А.И. Воробьев, 2002; В.Т. Морозова, 2003). Изучение особенностей эмбрио- и фетогенеза печени и селезенки будет способствовать выяснению причин возникновения некоторых патологических состояний у человека, раскрытию особенностей взаимодействия матери и плода.

Цель исследования - выявить закономерности становления стромальных, паренхиматозных элементов и капилляров печени и селезенки эмбрионов и плодов человека в ранние сроки беременности в норме и при воздействии на организм матери комплексного влияния факторов шинного производства.

Задачи исследования:

1. Установить закономерности дифференцировки стромальных и паренхиматозных элементов печени и селезенки эмбрионов и плодов человека в ранние сроки физиологической беременности.

2. Исследовать взаимоотношения клеток паренхимы и стромы с эндотелиальными клетками формирующихся капилляров печени и селезенки в ранние сроки эмбрионального развития, и определить их роль в ангиогенезе.

3. Выявить особенности формирования стенки кровеносных капилляров печени и селезенки в поздние сроки эмбриогенеза и ранние сроки фетогенеза.

4. Изучить особенности формирования паренхиматозных и стромальных элементов печени и селезенки у эмбрионов и плодов в ранние сроки беременности от матерей, испытывающих негативное воздействие факторов шинного производства.

5. Исследовать реакцию ядер клеток печени и селезенки эмбрионов и плодов человека в интерфазе митотического цикла в условиях воздействия на мать факторов шинного производства.

6. Изучить действие факторов шинного производства на митотическую активность клеток печени и селезенки эмбрионов и плодов человека в ранние сроки эмбрионального развития.

Научная новизна исследования

Впервые на электронно-микроскопическом уровне представлены сведения о закономерностях взаимоотношений паренхиматозных и стромальных элементов печени и селезенки с кровеносными капиллярами в раннем периоде внутриутробного развития. Установлено, что дифференцировка клеток стромы влечет за собой созревание капилляров. На ранних этапах внутриутробного развития гистогенез стромы печени и селезенки протекает по единому плану: формирование стенки кровеносных капилляров происходит при взаимодействии эндотелиальных клеток с элементами паренхимы печени и ретикулярными клетками селезенки. Установлено, что структурные механизмы формирования базальной мембраны печени и селезенки эмбрионов и плодов человека являются универсальными.

Определены закономерности формирования капилляров печени и селезенки в ранние сроки беременности. Показано, что основные процессы, характеризующие созревание эндотелиального пласта, выражаются формированием базальной мембраны и усложнением межклеточных коммуникаций. В ходе дифференцировки печени и селезенки на ранних этапах эмбрионального развития происходит смена простых межклеточных контактов на полудесмосомы и десмосомы.

Впервые изучена динамика становления ультраструктурных компонентов цитоплазмы и ядер клеток паренхимы печени и стромы селезенки у плода в ранние сроки беременности. Выявлено, что хроматиновые структуры проявляют высокую лабильность в зависимости от срока внутриутробного развития.

Впервые установлено, что под воздействием факторов шинного производства в цитоплазме клеток печени и селезенки эмбриона и плода происходит вакуолизация митохондрий, расширение эндоплазматического ретикулума, появляются вакуоли, снижается генетически активная фракция хроматина, что ведет к уменьшению их функциональной и митотической активности. Расширения в базальной мембране капилляра делает его более уязвимым для окружающей среды.

Теоретическое и практическое значение

Установлены этапы становления паренхимы печени и стромы селезенки, как в позднем эмбриональном, так и в раннем плодном периодах органогенеза. Установленная взаимосвязь паренхиматозных и стромальных структур с кровеносными капиллярами углубляет представление о закономерностях развития печени и селезенки, их роли в формировании организма в антенатальный период.

Выявленные особенности развития кровеносных капилляров в печени и селезенке плодов человека могут служить предпосылкой для уточнения механизмов формирования микроциркуляторного русла в раннем онтогенезе человека. Новые данные о закономерностях становления ультраструктурных компонентов печени и селезенки в антенатальном периоде развивают концепцию о взаимосвязи различных структурных элементов внутри органа.

Данные об особенностях эмбриогенеза печени и селезенки в ранние сроки беременности у женщин - жителей промышленных городов могут быть использованы при разработке мер профилактики таких патологических состояний, как потеря беременности, преждевременные роды, задержка внутриутробного развития. Сведения об особенностях эмбрионального развития печени и селезенки представляют интерес для гистологов, эмбриологов, иммунологов, педиатров и эндокринологов.

Основные положения, выносимые на защиту:

В ранние сроки беременности в процессе трансформации малодифференцированных клеток печени и селезенки эмбрионов и плодов человека в дифференцированные происходит созревание ядер и формирование внутриклеточных органелл.

В процессе генеза стенка формирующегося кровеносного капилляра и клетки окружающей ткани печени и селезенки эмбрионов и плодов образуют систему, элементы которой усложняются, дифференцируются, взаимодействуя и влияя друг на друга.

На ранних этапах внутриутробного развития человека, формирующиеся капилляры печени и селезенки проходят три стадии: от незрелых до дефинитивных.

Воздействие факторов шинного производства на организм матери в ранние сроки беременности приводит к изменениям ультраструктуры мембранных органелл формирующихся клеток печени и селезенки эмбрионов и плодов, выражающихся в вакуолизации митохондрий, расширением гранулярной эндоплазматической сети, увеличением в цитоплазме клеток печени и селезенки числа вакуолей.

Факторы шинного производства, опосредованно воздействуя на фракции ядерного хроматина клеток печени и селезенки эмбрионов и плодов в раннем эмбриогенезе, снижают долю эухроматина.

Неблагоприятные факторы шинного производства, действуя на систему мать-плод, угнетают митотическую активность клеток печени и селезенки эмбрионов и плодов.

Установленные изменения в результате комплексного влияния агентов шинного производства на формирование капилляров могут быть одной из причин нарушения микроциркуляторного русла и морфогенеза печени и селезенки.

Внедрение результатов исследования в практику

Результаты диссертационного исследования внедрены в учебный процесс кафедр биологии с экологией, нормальной анатомии человека и гистологии Алтайского государственного медицинского университета, используются в лекционном курсе и на практических занятиях со студентами лечебного, педиатрического, стоматологического, фармацевтического и медико- профилактического факультетов.

Апробация работы

Основные положения работы доложены на: конференции по актуальным вопросам лабораторной диагностики (Барнаул, 2001), международной научной конференции «Медико-биологические и экологические проблемы здоровья человека на севере» (Сургут, 2004), на научно-практической конференции с международным участием «Совершенствование онкологической помощи в современных условиях» (Барнаул, 2008), на 1-й международной телеконференции (Томск, 2010), 5-й международной телеконференции (Томск, 2011), межкафедральном заседании в Алтайском государственном медицинском университете (Барнаул, 2011).

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием материалов и методов, двух глав с результатами собственных исследований и их обсуждения, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиографический указатель содержит 165 отечественных и 134 иностранных источников. Иллюстрированный материал представлен 11 таблицами и 49 рисунками (из них 35 фотографий).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объект исследования

Материалом для исследования послужили препараты печени и селезенки 240 эмбрионов и плодов человека в период от 7 до 14 недель внутриутробного развития, полученные при прерывании физиологической беременности по социальным показаниям (в соответствии с Постановлениями Правительства РФ от 8 мая 1996 года № 567 и от 11 августа 2003 года № 485). В ходе исследования были соблюдены этические принципы проведения исследований согласно Хельсинской декларации - редакция 2000 г. и получено разрешение локального этического комитета. Забор материала производился при медицинских абортах у практически здоровых матерей в возрасте от 23 до 38 лет, работающих в основных цехах шинного производства не менее 5 лет (основная группа). Работающие в этих цехах подвергались комплексному воздействию факторов шинного производства, не превышающих предельно допустимых норм. В рабочих зонах атмосфера содержала углеводородные соединения (бутадиен, изопрен и др.) в сочетании с высокой температурой, влажностью и шумом. Наиболее распространенной среди работниц на всех этапах производства являлась профессия аппаратчика соответствующего технологического участка. Основная работа заключалась в следующем: контроль за ведением технологического процесса, регистрация соответствующих параметров в журналах и картах, отбор проб, подготовка и уборка рабочего места и других помещений. В качестве группы сравнения использовалась препараты печени плодов, взятые при аборте в те же возрастные сроки от матерей, не работающих в химическом производстве (группа сравнения).

Печень и селезенка, взятые у 240 эмбрионов и плодов, распределены по четырем возрастным группам (таб. 1): 7-8 недель, 9-10 недель, 11-12 и 13-14 недель внутриутробного развития. Возраст плодов и эмбрионов определяли с учетом схем, представленных в работах Б. Пэттена (1959), Э. Поттера (1971), Л.И. Фалина (1976), а также с учетом акушерского анамнеза и данных ультразвукового исследования.

Методы исследования

Полученный материал фиксировали параформом на буфере Миллонига. Для световой микроскопии материал после обезвоживания заливали в парафин. Фотографирование необходимых участков производилось с помощью светового микроскопа Leica ДМЕ, с использованием камеры Leica ЕС 3.

Для электронной микроскопии кусочки органов дофиксировали в 1% растворе осмиевой кислоты. Обезвоживание проводили этанолом, начиная с 30⁰ до абсолютного, затем материал заключали в аралдит. С парафиновых блоков на ротационном микротоме готовили срезы толщиной 7-10 мкм. На срезах, окрашенных общегистологическими методиками: гематоксилин-эозином, световым зеленым, полихромным методом Маллори, по Ван-Гизон, изучалась общая морфология печени и селезенки. Фотографирование необходимых участков производилось с помощью фотонасадки МНФ-8.

Для электронной микроскопии ультратонкие срезы толщиной 40-60 нм изготавливались на ультрамикротоме УМТП-6. Срезы на сетках контрастировали свинцом по Рейнольдсу (Г. Гайер, 1974). Готовые срезы изучались в электронном микроскопе ПЭМ-100 с ускоряющим напряжением 50 и 75 киловольт. Фотографирование необходимых участков производилось при увеличениях на экране микроскопа от 5000-х до 35000-х.

Полученные в процессе работы полутонкие срезы толщиной от 0,5 до 1 мк окрашивали метиленовым синим, изучали и фотографировали с помощью светового микроскопа «Биолар», Leica ДМЕ, с использованием камеры Leica ЕС 3. Данные, полученные в ходе светооптического и ультраструктурного исследования, позволили определить степень функциональной активности органа или всей системы в целом. Одним из методов оценки функционального состояния органа и процессов эмбриогенеза является определение митотической активности клеток.

Подсчет митотического индекса проводили на клетках селезенки и печени. Митотический индекс рассчитывали на 1000 клеток, исходя из данных полученных на 30 эмбрионах и плодах в каждой группе. При подсчете митотически делящихся клеток регистрировали все стадии митоза: профазу, метафазу, анафазу и телофазу (Г.Г. Автандилов и соавт., 1973). Всего было подсчитано 1 650 000 клеток. Митотический индекс вычисляли в промилле.

Для определения средних параметров площади ядра (мкм²), цитоплазмы (мкм²), ядерно-цитоплазматического индекса применяли следующее оборудование: БИМАМ Р-13-1 проходящего света с подсоединенной видеокамерой JVC. Фотометрические исследования проводили при помощи программы анализа изображения «Motis images». Препараты изучали при увеличении в 400 раз, изображение вводили в компьютер непосредственно с микроскопа с помощью карты захвата видео. Размер файла изображения составлял 640х480 пикселей.

Изучали клеточный состав печени. Определяли процентное соотношение гепатоцитов разной степени дифференцировки: малодифференцированные, переходные и дифференцированные. Для подсчета использовали окулярную сетку из 25 квадратов со стороной 9 мкм в десяти полях зрениях (2025 мкм²). Исследование проводили на 7 срезах каждого объекта исследования.

Эухроматин и гетерохроматин в ядрах печени и селезенки определяли с помощью планиметрического метода по Г.Г. Автандилову (1990). Производили съемку ядер клеток печени и селезенки, после чего их изображение с помощью фотоувеличителя приводилось к единому увеличению в 20000. В качестве измерительного инструмента служила тестовая сетка с шагом в 1 см. Объемную плотность гетерохроматина и эухроматина в ядрах клеток вычисляли в процентах. Для каждого случая использовали не менее 10 препаратов.

Статистическая обработка полученных данных проводилась на основе классических методов анализа с предварительным определением соответствия выборки закона нормального распределения с помощью программ «Statistica 6,0» и «Exel 5,0». Нормальность распределения проверялась с помощью критерия Шапиро-Уилка. Результаты работы представлены в виде значений М (средняя арифметическая) ±m (стандартная ошибка среднего). Оценку межгрупповых различий проводили при помощи критерия Стьюдента. За статистически значимые различия показателей принималось значение p<0,05. Для определения расхождения двух эмпирических распределений использовали ² критерий Пирсона.

Обработка полученных данных и построение графиков производились в редакторе Microsoft Word (Ver. 7.0).

Результаты исследования

При исследовании дифференцировки гепатоцитов на протяжении эмбриогенеза был установлен ряд закономерностей, характерных для печени. В таблице 1 представлен клеточный состав печени эмбрионов и плодов человека с 7-ой по 14-ю недели эмбрио- и фетогенеза. Во все сроки исследования в контрольной группе снижалась доля малодифференцированных гепатоцитов и увеличивалась доля дифференцированных гепатоцитов. На 13-14 неделе фетогенеза малодифференцированных гепатоцитов в 10 раз меньше, чем на 7-8 неделе эмбриогенеза. Доля дифференцированных гепатоцитов на 13-14 неделе в 7, 7 раза больше, чем на 7-8 неделе. В дифференцированных гепатоцитах наблюдалось последовательное укрупнение специализированных органелл, что можно рассматривать как становление углеводной и белковообразующей функции печени. Установленной закономерностью является цикличность изменения доли переходных гепатоцитов в изучаемы сроки. С 7-й по 12-ю недели онтогенеза доля этих клеток увеличивалась и достигала максимального значения на 11-12 неделе, на 13-14 неделе фетогенеза происходило достоверное снижение доли переходных гепатоцитов по сравнению с предыдущим сроком исследования.

Таблица 1

Клеточный состав печени эмбрионов и плодов человека контрольной группы

Количество гепатоцитов на 2025 мкм2	Возраст эмбрионов и плодов человека в неделях
	7-8	9-10	11-12	13-14
	1 группа	2 группа	3 группа	4 группа
	51,18 ±1,43	59,03 ±1,82	65,42 ±1,89	69,76 ±1,88
Доля, в %	Малодифференцированные	68,49 ±2,05	36,28 ±0,79#	19,1 ±0,53#	6,84 ±0,17#
	Переходные	24,07 ±0,62	48,5 ±1,35#	50,33 ±1,5	35,63 ±1,01#
	Дифференцированные	7,44 ±0,24	15,22 ±0,39#	30,57 ±0,91#	57,53 ±1,05#

Примечание: М±m; р<0,05 - статистическая значимость различий показателей в парных сравнениях по горизонтали между группами (1-й и 2-й; 2-й и 3-й; 3-й и 4-й).

Изменения соотношения относительной площади ядра и цитоплазмы гепатоцитов эмбрионов и плодов человека в разные сроки онтогенеза свидетельствуют о цитоморфологической дифференцировке клеток. Ядра клеток печени, их цитоплазма увеличиваются в размерах, а ядерно-цитоплазматический индекс гепатоцитов с увеличением срока эмбриогенеза уменьшается. Увеличение объёма цитоплазмы имеет в своей основе укрупнение её специализированных элементов - митохондрий, рост числа структур аппарата синтеза: рибосом, полисом, эндоплазматической сети, комплекса Гольджи.

Установлено, что относительная площадь ядра гепатоцитов с 7-8-й недели внутриутробного периода увеличилась к 13-14 неделям в контрольной группе в 1,6 раза, площадь цитоплазмы гепатоцитов в эти же сроки возросла в 2,3 раза. В результате с увеличением срока эмбрионального развития происходило уменьшение ядерно-цитоплазматического отношения. Изменения соотношения относительной площади ядра и цитоплазмы гепатоцитов эмбрионов и плодов человека в разные сроки онтогенеза свидетельствуют о дифференцировки клеток.

В селезенке плода становление ретикулярной стромы также имеет свои закономерности. Вначале клетки ретикулярной стромы селезенки незначительно отличались от мезенхимных клеток. Они характеризовались малым числом внутриклеточных органелл и узким ободком цитоплазмы вокруг ядра. Первые изменения возникали в ретикулярных клетках при контакте с новообразующимися капиллярами, отмеченные на 7-8 неделе онтогенеза. Механизм преобразований в клетках селезенки эмбрионов и плодов сходен с процессами, происходящими в печени: происходит дифференцировка внутриклеточных органелл - митохондрий, эндоплазматической сети, комплекса Гольджи, изменяется соотношение фракций ядерного хроматина.

При исследовании эухроматина гепатоцитов и ретикулярных клеток селезенки нами было отмечено, что хроматиновые структуры проявляют высокую мобильность в зависимости от срока внутриутробного развития (таб. 2).

Соотношение эухроматина и гетерохроматина в ядрах гепатоцитов и ретикулярных клетках селезенки отражает сложные процессы, происходящие в органах. В контрольной группе в гепатоцитах эмбрионов наибольшая доля эухроматина обнаружена в ядрах гепатоцитов на 7-8 неделе эмбриогенеза. На 9-10 неделе происходило ее резкое снижение, после чего начиналось постепенное увеличение к 13-14 неделе.

Такая динамика колебаний содержания эухроматина связана с особенностями эмбрионального развития печени. Внедрение кровеносных

Таблица 2

Эухроматин в гепатоцитах и ретикулярных клетках селезенки эмбрионов и плодов человека контрольной группы

Объект исследования (доля, в %)	Возраст эмбрионов и плодов человека (в неделях)
	7-8 1 группа	9-10 2 группа	11-12 3 группа	13-14 4 группа
Гепатоциты	72,33,8	34,31,6#	53,22,8#	62,42,9
Ретикулярные клетки	72,51,9	68,43,1	60,92,7	62,63,2

Примечание: ^#р<0,05 - статистическая значимость различий показателей в парных сравнениях по горизонтали между группами (1-й и 2-й; 2-й и 3-й; 3-й и 4-й).

сосудов в паренхиму печени на 9-10 неделе эмбриогенеза приводит к перестройке питания клеточных элементов органа. Учитывая, что эухроматин по мнению ряда авторов, является генетически активной фракцией ядра, он интенсивно включается в процесс саморегуляции, так необходимый клетке при выборе нового пути развития.

В селезенке плодов установлено некоторое снижение содержания эухроматина в ядрах ретикулярных клеток на 9-14 неделе внутриутробного развития. На 7-8 неделе эмбриогенеза доля эухроматина была максимальной в ретикулярных клетках (72,57±2,6 %).

Наши данные показали, что в изучаемые периоды онтогенеза меняется митотическая активность клеток печени и селезенки (таб. 3). При нормальном развитии плода у матерей контрольной группы максимальная митотическая активность отмечалась в печени на 11-12 неделе онтогенеза (91,5 1,9 ‰), а минимальная на 13-14 неделе (66,32,4 ‰). Резкое снижение митотического индекса в печени плодов на 13-14 неделе внутриутробного развития объясняется тем, что в это время начинается период морфо-функциональной перестройки, сопровождающийся изменением характера метаболизма и характеризущийся повышенной чувствительностью органа к любому виду воздействия.

Таблица 3

Митотический индекс в клетках печени и селезенки эмбрионов и плодов человека (‰) в контрольной группе

Объект исследования	Возраст эмбрионов и плодов человека (в неделях)
	7-8 1 группа	9-10 2 группа	11-12 3 группа	13-14 4 группа
Печень	76,22,4	72,42,9	91,51,9#	66,32,4#
Селезенка	51,32,1	50,42,2	49,41,9	47,71,9

Примечание: ^#р<0,05 - статистическая значимость различий показателей в парных сравнениях по горизонтали между группами (1-й и 2-й; 2-й и 3-й; 3-й и 4-й).

В селезенке эмбрионов и плодов человека в контрольной группе наблюдалось постепенное снижение способности клеток к делению во все сроки исследования. И все же, несмотря на снижение на 13-14-й неделе фетогенеза, митотическая активность оставалась достаточно высокой. Снижение количества митозов обусловлено продолжающейся дифференцировкой органа.

Важное значение в сосудисто-тканевых взаимоотношениях в эмбриональном периоде принадлежит формирующимся капиллярам. По нашим данным, в печени и селезенке плодов капилляр в своем развитии проходит три стадии. На первой стадии развития у капилляра формируется стенка, состоящая из одного слоя клеток, соединенных между собой с помощью плотных контактов. Клетки, участвующие в формировании такого сосуда, имеют кубическую форму. В них отсутствуют признаки, присущие эндотелиоцитам зрелых капилляров. Известно, что у зрелых капилляров эндотелиальный слой состоит из плоских клеток, имеющих на апикальной поверхности цитоплазматические выросты, а под апикальной мембраной пиноцитозные пузырьки.

Продолжающаяся дифференцировка органа влечет за собой созревание новообразованных капилляров. Это проявляется, прежде всего, в формировании базальной мембраны, изменении межклеточных связей эндотелиальных клеток и видоизменении самих эндотелиоцитов.

Вторая стадия развития капилляров характеризуется формированием фрагментов базальной мембраны. Проследить за деталями её становления можно, ориентируясь на осмиофильный слой. В формировании базальной мембраны капилляров прослеживаются определенные закономерности. Отложение осмиофильного материала, зачатка будущей базальной мембраны, отмечалось впервые там, где осуществлялся контакт базальной плазмолеммы эндотелиальной клетки с участком цитоплазмы гепатоцита или ретикулярной клетки. Об участии этих клеток в формировании фрагментов базальной мембраны может свидетельствовать наличие осмиофильного вещества на внутренней поверхности клеточной плазмолеммы, а затем на внешней. Осмиофильное вещество в ретикулоэпителиальной клетке по цвету и структуре соответствует формирующемуся осмиофильному слою базальной мембраны. Затем слой осмиофильного материала начинал распространяться в стороны и располагался уже под основанием эндотелиоцитов, оставляя свободными зоны их соприкосновения.

На третьей стадии становления капилляра свободные промежутки между эндотелиальными клетками исчезали, и осмиофильный слой базальной мембраны становился сплошным под эндотелиоцитами. Одновременно эндотелий по строению приближался к таковому в капиллярах взрослого. Формирование базальной мембраны является той основой, благодаря которой сосуд приобретает черты, характерные для капилляров взрослого организма. При этом сосудисто-тканевые взаимоотношения становятся качественно иными, так как обмен различными соединениями между кровью и тканями происходит уже с участием базальной мембраны капилляров.

Выявлено, что с 7 по 12 недели эмбриогенеза капилляр в печени и селезенке в своем становлении проходит преимущественно первые две стадии. У плодов человека на 9-10 неделе происходит активное внедрение кровеносных сосудов в паренхиму печени и строму селезенки. На 13-14 неделе в изучаемых органах плода имеются капилляры, находящиеся на различных стадиях формирования. Установлено, что структура ядер эндотелиоцитов печени и селезенки во все сроки исследования не является однородной и меняется на протяжении интерфазы митотического цикла.

В ходе исследования межклеточных взаимодействий в печени и селезенке человека на ранних этапах эмбрионального развития установлено, что в процессе эмбрио- и фетогенеза печени и селезенки происходит смена типа контактов.

В печени и селезёнке на 7-8 неделе внутриутробного развития в клетках стромы обнаруживается неполный набор клеточных органелл: единичные митохондрии и лизосомы, короткие канальцы гранулярного ретикулума.

Межклеточные взаимодействия осуществляются, в основном, с помощью простых контактов, в отдельных случаях их заменяют плотные замыкающие контакты. По-видимому, это связано это с тем, что в эмбриональный период эти органы достаточно однородны, компактны и не имеют больших межклеточных промежутков. Кроме того, плотные соединения клеток эмбриональной ткани в этот период обеспечивают обмен информацией между ними в виде молекул химического вещества. Плотные контакты участвуют в поддержании полярности эпителиальных клеток и препятствуют проникновению макромолекул и ионов в межклеточные пространства. В этот период эмбриогенеза межклеточные контакты необходимы в формирующихся тканях в большей степени для механического соединения соседних клеток, им принадлежит функция формообразования органа.

На 9-10 неделе в ультраструктурных элементах клеток печени и селезенки появляются признаки, свидетельствующие о возникновении функциональной активности органелл. В первую очередь, это относится к внутриклеточным органеллам, увеличиваются участки гранулярного ретикулума, в просвете которого содержимое отличается высокой электронной плотностью. Менее плотное содержимое появляется в просвете цистерн пластинчатого комплекса. Матрикс митохондрий начинает просветляться, а сами они увеличиваются в размерах. В цитоплазме клеток появляются небольшие вакуоли, хаотично расположенные по всей площади цитоплазмы. Что же касается внеклеточных структур, то на 9-10 неделе внутриутробного развития отмечается увеличение плотных замыкающих контактов между клетками. Продолжающаяся дифференцировка органов по мере увеличения срока развития приводит не только к усложнению межклеточных коммуникаций но и к постепенной смене одной формы межклеточных контактов на другую. После образования кровеносных капилляров в печени и селезенке, плотные контакты сменяются на десмосомы и полудесмосомы. На ранних этапах эмбрионального развития их количество в паренхиме печени и селезенки не велико. Единственным местом, где еще остаются плотные соединения, являются апикальные части клеток. Наличие плотных контактов в этих участках, во-первых, является замком для латеральных межклеточных щелей, во-вторых, плотные соединения отделяют апикальную часть плазматической мембраны от базально-латеральной.

Для остальных клеток стромы селезенки и гепатоцитов с 11 по 14 недели фетогенеза основными соединениями остаются десмосомы и щелевые контакты. Необходимость таких контактов обусловлена функциональными особенностями клеток. Через щелевые контакты осуществляются межклеточные коммуникации. Обмен ионами и молекулами между клетками создает предпосылки для одновременной реакции группы клеток на раздражитель, а также обусловливает упорядоченное течение процессов дифференцировки части или всего органа. Десмосомы же, главным образом, осуществляют механическую связь между клетками. По мере развития печени и селезенки, происходит увеличение межклеточных промежутков и отделение клеток друг от друга с образованием своеобразной сетчатой структуры. Одновременно происходит количественное увеличение десмосом, основных структур межклеточных соединений, характерных для взрослого организма (Де Дюв К., 1987).

Таким образом, гистогенез печени и селезенки на ранних этапах эмбрионального развития характеризуется сменой межклеточных взаимодействий в зависимости от срока эмбрио- и фетогенеза. Становление печени и селезенки сопровождается заменой простых и плотных замыкающих контактов на десмосомы и полудесмосомы, которые обеспечивают паракринные влияния, действующие на короткие дистанции.

По мере усложнения контактов между эндотелиоцитами формирующихся капилляров, происходит уплощение самих эндотелиальных клеток, изменение органелл, дифференцировка цитоплазмы. Апикальная мембрана эндотелиоцитов приобретает тонкие цитоплазматические выросты, а в цитоплазме появляются фенестры. Установившееся взаимодействие между двумя соседними клетками - стромы и эндотелиоцитом показывает, что между ними в процессе эмбриогенеза возникают прямая и обратная связи. При этом активация одной клетки рождает целый комплекс взаимодействий, проявляющихся на ультраструктурном уровне.

Реакция, лежащая в основе сосудисто-тканевых взаимоотношений, имеет специфические черты в печени и селезенке. Менее выраженная реакция в развивающейся селезенке обусловлена тем, что, во-первых, формирование капилляров начинается в селезенке плода значительно позже, чем в печени, поэтому структурные изменения стромы органа не носят такого генерализованного характера, как в печени. Во-вторых, основой паренхимы печени, в отличие от селезенки, являются эпителиальные клетки. А эпителий, по мнению ряда исследователей (А.Г. Пугасов, 1990; Г.Г. Черепанов, 1993), обладает наиболее сильным индуктивным влиянием на формирующиеся элементы, по сравнению с другими тканями.

Изучение эмбрионов и плодов человека от матерей, работающих в основных цехах шинного производства, показывает, что на 7-14-й неделе внутриутробного развития клетки, образующие печень и селезенку, были отечными. При электронно-микроскопическом исследовании в клетках изучаемых органов обнаруживали: вакуолизированные митохондрии, расширенные участки гранулярного ретикулума, разнообразные по размерам вакуоли и миелиноподобные тельца. Ядра этих клеток, в основном, неправильной формы, перинуклеарное пространство расширено. В отдельных отростках гепатоцитов наблюдали резкие булавовидные расширения.

Установлено, что у эмбрионов и плодов человека в основной группе на 7-14 неделе внутриутробного развития закономерным процессом является замедление цитодифференцировка гепатоцитов. На 7-8 неделе эмбриогенеза в основной группе доля малодифференцированных гепатоцитов больше, чем в контрольной (рис. 1). На 9-14 неделе онтогенеза переходных гепатоцитов больше в основной группе, чем в контрольной (рис. 2). Во все сроки исследования в основной группе снижается доля дифференцированных гепатоцитов по сравнению с контрольной (рис. 3).

При действии на мать факторов шинного производства во все сроки исследования наблюдалось достоверное уменьшение ядерно-цитоплазматического индекса в основной группе, по сравнению с контрольной, что следует расценивать как проявление функционального напряжения развивающейся печени в неблагоприятных производственных условиях.

Установлено, что доля эухроматина в ядрах гепатоцитов и ретикулярных клетках селезенки в основной группе меньше, чем в контрольной (рис. 4, 5). Связано это с неблагоприятным влиянием факторов шинного производства на организм матери и плода. Снижение эухроматина является показателем нарушения дифференцировки клеток печени и селезенки эмбрионов и плодов в основной группе.

Рис. 1. Динамика изменения доли малодифференцированных гепатоцитов в контрольной и основной группах эмбрионов и плодов человека.

селезенка печень эмбрион беременность

Рис. 2. Динамика изменения доли переходных гепатоцитов в контрольной и основной группах эмбрионов и плодов человека.

Рис. 3. Динамика изменения доли дифференцированных гепатоцитов в контрольной и основной группах эмбрионов и плодов человека.

Рис. 4. Эухроматин в гепатоцитах эмбрионов и плодов человека.

Примечание: ^*p<0,05 - статистическая значимость различий показателей с контрольной группой



Рис. 5. Эухроматина в ретикулярных клетках селезенки эмбрионов и плодов человека.

Примечание: ^*p<0,05 - статистическая значимость различий показателей с контрольной группой

Выявлено негативное влияние факторов шинного производства на митотическую активность клеток печени и селезенки эмбрионов и плодов человека (рис. 6, 7). На 7-8 неделе в печени происходит снижение митотической активности в основной группе, по сравнению, с контрольной группой этого периода онтогенеза, она составляла 70,43,2 ‰. Максимальное снижение числа делящихся клеток в основной группе отмечено на 9-10 неделе эмбриогенеза (68,23,1 ‰). На 11-12 неделе митотическая активность клеток печени основной группы составляла 78,53,5 ‰, что значительно ниже, чем в контрольной группе в аналогичный период эмбриогенеза. В последующую неделю в основной группе отмечено снижение митотической активности, по сравнению, с предыдущей неделей (74,12,4 ‰).

Установлено, что митотический индекс в клетках селезенки эмбрионов и плодов в основной группе несколько ниже, чем в контрольной.

Рис. 6. Митотическая активность клеток печени эмбрионов и плодов человека.

Рис. 7. Митотическая активность клеток селезенки эмбрионов и плодов человека.

Наименьшее число делящихся клеток в основной группе характерно для 11-12-й недели внутриутробного развития.

Полученные данные указывают на то, что в эмбриональный период происходит интенсивное развитие и рост изучаемых органов, но средняя митотическая активность клеток печени эмбрионов и плодов контрольной и основной групп более высокая, чем клеток селезенки. Результаты нашего исследования указывают на различную способность клеток печени и селезенки к пролиферации. Различия, выявленные при сравнении митотической активности клеток печени и селезенки в контрольной и в основной группах, статистически значимы. В контрольной группе на 7-8 неделе эмбриогенеза (² = 3, 841, р < 0, 05) и на 11-12 неделе фетогенеза (² = 6, 635, р < 0, 01). В основной группе на 7-10 неделе (² = 3, 841, р < 0, 05), на 11-14 неделе эмбрионального развития (² = 6, 635, р < 0, 01). Проведенное исследование отражает своеобразную цикличность, протекающих в печени процессов в отличие от таковых в селезенке.

Снижение митотической активности клеток печени и селезенки плодов основной группы, по сравнению с контрольной, обусловлено, на наш взгляд, негативным влиянием комплексного воздействия факторов шинного производства на систему мать-плод.

Ангиогенез у эмбрионов и плодов в печени и селезенке основной группы характеризовался теми же стадиями, что и в контрольной. Установлено достоверное снижение эухроматина в эндотелиоцитах печени эмбрионов и плодов во все сроки исследования в основной группе по сравнению с контрольной (таб. 4), а в клетках селезенке на 7-8 неделе эмбриогенеза (таб. 5). Выявлены отклонения при формировании базальных мембран, эпителиальных структур капилляров в печени и селезенке эмбрионов и плодов человека матерей, подвергшихся воздействию факторов шинного производства. Прежде всего, это касалось внутреннего осмиофильного слоя. Наиболее частыми проявлениями морфологических отклонений являлись разрыхление и раздвоение осмиофильного слоя базальной мембраны, снижение генетически активной фракции хроматина.

Таблица 4

Эухроматина в эндотелиоцитах печени эмбрионов и плодов человека в контрольной и основной группах

Возраст (недели) Группа наблюдения	Эухроматин (%)
	7-8 1 группа	9-10 2 группа	11-12 3 группа	13-14 4 группа
Контрольная группа	73,32,6	58,42,6#	45,72,1#	50,12,7
Основная группа	51,01,6*	42,31,9*	28,61,3*#	44,21,9#

Примечание: ^*p<0,05 - статистическая значимость различий показателей с контрольной группой; ^#р<0,05 - статистическая значимость различий показателей в парных сравнениях по горизонтали между группами (1-й и 2-й; 2-й и 3-й; 3-й и 4-й).

Таблица 5

Эухроматина в эндотелиоцитах селезенки эмбрионов и плодов человекав контрольной и основной группах

Возраст (недели) Группа наблюдения	Эухроматин (%)
	7-8 1 группа	9-10 2 группа	11-12 3 группа	13-14 4 группа
Контрольная группа	79,22,7	64,52,9#	58,72,7	63,42,6
Основная группа	68,53,3*	62,12,9	53,52,4	57,62,2

Примечание: ^*p<0,05 - статистическая значимость различий показателей с контрольной группой; ^#р<0,05 - статистическая значимость различий показателей в парных сравнениях по горизонтали между группами (1-й и 2-й; 2-й и 3-й; 3-й и 4-й).

В разных капиллярах участки раздвоения были от минимальных размеров, до значительных. Иногда осмиофильный слой, кроме расщепления, образовывал расширенные участки, которые имели сетчатый вид. Реже осмиофильный слой резко расширялся, образуя пузырчатые округлые образования. Нарушение процесса формирования базальной мембраны, возможно, ведет к изменениям фильтрационной способности капилляров, и в окружающую ткань могут переходить соединения, которые в норме задерживаются базальной мембраной. Это подтверждалось обнаружением осмиофильного мелкодисперсного содержимого в межклеточном пространстве адвентициальных клеток капилляров основной группы. Изменения базальной мембраны в организме взрослого, возможно, вызывают также нарушение обмена веществ между капилляром и окружающей средой и поражение эндотелиальных клеток. Just, 1994; Ridley, 1994 полагают, что указанные изменения в базальной мембране увеличивают время дифференцировки капилляра, что делает его более уязвимым для воздействия факторов окружающей среды. Измененные капилляры, в свою очередь, ведут к отклонениям в развитии самого органа (Renard и соавт., 1994; Valles и соавт., 1994).

Влияние факторов шинного производства на печень и селезенку плодов происходит опосредованно через организм матери. Если на 7-8 неделе в печени и селезенке плодов основной группы еще можно проследить взаимосвязь внутриклеточных процессов между эндотелиоцитами и паренхиматозными клетками, то, начиная с 9-10 недели, эта взаимосвязь нарушается. Изменения в эндотелиальных клетках более длительны по времени и сильнее выражены. В гепатоцитах подобные изменения менее выражены и проявляются на 11-12 неделе эмбриогенеза. Для гепатоцитов в этот период характерно наличие слабо вакуолизированных митохондрий, расширенных участков гранулированного ретикулума и снижение количества десмосом в межклеточных контактах. В ядрах гепатоцитов преобладает гетерохроматин. Эти изменения прослеживаются вплоть до 13-14 недели эмбриогенеза, в то время как в эндотелиоцитах в этот срок определяется тенденция к нормализации строения органелл.

Взаимодействие между компонентами внеклеточного матрикса и разных клеток, следует рассматривать как первичное звено, играющее ключевую роль в общей реакции всего организма плода. Эта взаимосвязь обеспечивает, в конечном итоге, восстановление гомеостаза в общей системе мать-плацента-плод.

ВЫВОДЫ

1. Закономерным для становления печени является дифференцировка гепатоцитов, в процессе которой изменяется их ультраструктурная организация, связанная со сроком эмбриогенеза. На 7-8 неделе онтогенеза преобладали малодифференцированные гепатоциты. С 7-12 недели фетогенеза возрастало количество переходных гепатоцитов. Во все сроки исследования увеличивалась доля дифференцированных гепатоцитов.

2. Периодами функциональной активности паренхимы печени являются: 7-8 неделя эмбриогенеза и 11-12 неделя фетогенеза, характеризующиеся высоким уровнем эухроматина и повышенной митотической активностью.

3. Закономерным процессом для печени эмбрионов и плодов человека является цикличность изменения соотношения долей эухроматина в гепатоцитах и эндотелиальных клетках в ранние сроки физиологической беременности. Доля эухроматина в гепатоцитах с 9-й по 10-ю недели онтогенеза снижается, а в эндотелиоцитах - увеличивается. С 11-ой по 14-ю недели доля генетически активной фракции в гепатоцитах увеличивается, а в эндотелиоцитах - снижается.

4. Гистогенез печени и селезенки человека на ранних этапах эмбрионального развития характеризуется сменой межклеточных взаимодействий. На 7-10 неделе онтогенеза основными соединениями в печени селезенке являются простые и плотные замыкающие контакты, которые с 11-ой недели заменяются на полудесмосомы и десмосомы.

5. Ангиогенез в печени и селезенке происходит последовательно в три стадии. На первой стадии формируется слой эндотелиальных клеток, на второй стадии, к новообразованному капилляру примыкают клетки паренхимы и стромы органа, формируются фрагменты базальной мембраны, на третьей стадии в области контакта обнаруживается осмиофильная субстанция, образующая средний слой базальной мембраны.

6. Каждая пара клеток (эндотелиоцит и гепатоцит; эндотелиоцит и ретикулярная клетка селезенки) и дифференцирующаяся базальная мембрана являются микросистемой с прямыми и обратными связями, образующая в функциональном плане единое целое. Их общая функция заключается в обеспечении ответной реакции на воздействие какого-либо агента и является пусковым механизмом в общей биологической реакции.

7. Факторы шинного производства оказывают на эмбрион и плод опосредованное влияние через организм матери. Это влияние проявляется на ультраструктурном уровне и выражается вакуолизацией митохондрий, расширением гранулярной эндоплазматической сети, увеличением в цитоплазме клеток печени и селезенки числа вакуолей.

8. Комплексное влияние факторов шинного производства приводит к изменению структуры ядер клеток печени и селезенки эмбрионов и плодов человека. Уменьшение доли эухроматина свидетельствует о сниженной функциональной активности клеток и нарушении их цитодифференцировки.

9. Факторы шинного производства действуют на клеточном и тканевом уровнях, являясь причиной угнетения митотической активности клеток печени и селезенки эмбрионов и плодов человека.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Результаты исследования об изменениях в печени и селезенке эмбрионов и плодов при воздействии на мать отрицательных факторов шинного производства должны учитываться в женских консультациях при постановке на учет беременных женщин и привлекать внимание акушеров-гинекологов, педиатров из-за риска возникновения антенатальной патологии и болезней детского возраста.

2. К неблагоприятным признакам нарушения на клеточном и тканевом уровнях в печени и селезенке эмбрионов и плодов человека следует относить комплексное воздействие негативных факторы шинного производства.

3. Результаты исследования могут служить базой для дальнейшего изучения эмбрио- и фетогенеза печени и селезенки как в норме, так и при различных отклонениях в системе мать-плод.

Материалы диссертации о характере эбриогенеза, фетогенеза, ангиогенеза и васкулогенез печени и селезенки имеют принципиальное значение в понимании структурных основ изучаемых органов. Механизмы развития эмбриона и плода, становление и функционирование его систем являются важными в понимании причин отклонений в развитии печени и селезенки.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

Статьи в ведущих рецензируемых научных журналах и изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ

1. Петрова, Л. М. Действие антропогенных факторов шинного производства на развитие внутренних органов в первом триместре беременности [Текст] / Л. М. Петрова, Н. И. Барсукова, Ю. А. Высоцкий, Б. Л. Пономарев, Л. Е. Обухова // Сибирское медицинское обозрение. - 2008. - № 1 (49). - С. 60-62.

2. Пономарев, Б. Л. Эмбрио- и фетогенез печени человека при воздействии на организм матери антропогенных факторов химического производства / Б. Л. Пономарев, Л. Е. Обухова, Ю. А. Высоцкий, Н. И. Барсукова, Т. М. Черданцева // Мать и дитя в Кузбассе. - 2010. - № 3 (42). - С. 47-49.

3. Пономарев, Б. Л. Формирование структурных элементов стромы селезенки эмбрионов и плодов человека в норме и при воздействии на организм матери антропогенных факторов [Текст] / Б. Л. Пономарев, Л. Е. Обухова, Ю. А. Высоцкий, Н. И. Барсукова, Т. М. Черданцева // Мать и дитя в Кузбассе. - 2010. - № 4 (43). - С. 43-45.

4. Пономарев, Б. Л. Формирование кровеносных капилляров печени и селезенки эмбриона и плода человека в ранние сроки беременности [Текст] / Б. Л. Пономарев, Л. Е. Обухова, Ю. А. Высоцкий, Н. И. Барсукова, Г. Н. Бородина, Т. М. Черданцева, А. А. Болгов // Сибирский медицинский журнал. - 2010. - № 5. - С. 75-77.

5. Пономарев, Б. Л. Влияние антропогенных факторов химического производства на развитие печени эмбрионов и плодов [Текст] / Б. Л. Пономарев, Л. Е. Обухова, Ю. А. Высоцкий, Н. И. Барсукова, Т. М. Черданцева // Бюллетень сибирской медицины. - 2010. - № 6. - С. 67-70.

6. Пономарев, Б. Л. Формирование элементов стромы селезенки человека в ранние периоды онтогенеза человека [Текст] / Б. Л. Пономарев, Л. Е. Обухова, Ю. А. Высоцкий, Н. И. Барсукова, Г. Н. Бородина, Т. М. Черданцева // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. - 2010. - № 6. - С. 84-86.

7. Пономарев, Б. Л. Межклеточные взаимодействия в печени и селезенке человека на ранних этапах эмбрионального развития [Текст] / Б. Л. Пономарев, Л. Е. Обухова, Ю. А. Высоцкий, Н. И. Барсукова, Г. Н. Бородина, Т. М. Черданцева, А. А. Болгов // Сибирский медицинский журнал. - 2010. - № 8. - С. 169-170.

8. Пономарев, Б. Л. Дифференцировка гепатоцитов человека в эмбриогенезе и ранние периоды фетогенеза [Текст] / Б. Л. Пономарев, Л. Е. Обухова,

Ю. А. Высоцкий, Н. И. Барсукова, Т. М. Черданцева // Сибирское медицинское обозрение. - 2011. - Т. 64. - № 1. - С. 28-31.

9. Пономарев, Б. Л. Эмбрио- и фетогенез стромальных и паренхиматозных элементов печени человека [Текст] / Б. Л. Пономарев, Л. Е. Обухова, Ю. А. Высоцкий, Н. И. Барсукова, Г. Н. Бородина, Т. М. Черданцева, А. А. Болгов // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - № 1. - С. 103-105.

10. Пономарев, Б. Л. Морфологическая и функциональная характеристика гепатоцитов эмбрионов и плодов человека в ранние сроки эмбриогенеза [Текст] / Б. Л. Пономарев, Л. Е. Обухова, Ю. А. Высоцкий, Н. И. Барсукова, Г. Н. Бородина, Т. М. Черданцева, А. А. Болгов // Сибирский медицинский журнал. - 2011. - № 2. - С. 88-90.

11. Пономарев, Б. Л. Эмбрио- и фетогенез структурных элементов стромы и эндотелиоцитов селезенки человека [Текст] / Б. Л. Пономарев, Л. Е. Обухова, Ю. А. Высоцкий, Н. И. Барсукова, Т. М. Черданцева // Сибирское медицинское обозрение. - 2011. - Т. 68. - № 2. - С. 39-42.

В других изданиях

12. Пономарев, Б. Л. Ультраструктурные особенности взаимоотношения стромальных элементов паренхиматозных органов в разные периоды онтогенеза [Текст] / Б. Л. Пономарев, Т. М. Черданцева, С. А. Хныкина,

Л. М. Петрова, Л. Е. Обухова // К 100- летию со дня рождения деятеля науки РСФСР профессора В. Г. Елисеева: сб. научн. тр. - Москва, 1999. - С. 162- 163.

13. Пономарев, Б. Л.Формирование плодов человека в условиях влияния на систему мать - плацента - плод антропогенных факторов химической промышленности [Текст] / Б. Л. Пономарев, С. А. Хныкина Т. М. Черданцева, Л. М. Петрова, Н. А. Михеев, С. А. Хабаров, Л. Е. Обухова // Вопросы теоретической и прикладной морфологии: сб. науч. работ. - Барнаул, 2000. - Вып. III. - С. 46-48.

14. Пономарев, Б. Л. Применение электронной микроскопии для диагностики некоторых заболеваний [Текст] / Б. Л. Пономарев, Т. М. Черданцева, А. А. Болгов, С. А. Полежаева, Л. М. Петрова, Л. Е. Обухова, В. А. Бутаков, Н. И. Барсукова, С. А. Терехова // Актуальные вопросы лабораторной диагностики. Проблемы диагностики и лечения нарушений гемостаза: мат. краевой конференции. - Барнаул, 2001. - С. 74-75.

...