Разработка панели псевдовирусных частиц, экспонирующих гликопротеин вируса Марбург

Размещено на http://www.allbest.ru/

Разработка панели псевдовирусных частиц, экспонирующих гликопротеин вируса Марбург

Полежаева О.А.

Щербаков Д.Н.²

¹ORCID: 0000-0002-4256-5064, аспирантка, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора в р.п. Кольцово, ²ORCID: 0000-0001-8023-4453, Кандидат биологических наук, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора в р.п. Кольцово

Аннотация

В этой статье рассматривается научно-исследовательская работа по созданию панели псевдовирусных частиц, экспонирующих на поверхности гликопротеин трех штаммов вируса Марбург. Каждый представлен в двух вариантах - полноразмерный и с делецией муциноподобного домена, муциноподобный домен был удален для повышения точности выявления мишеней гуморального ответа. В результате была получена полная панель, составленная из шести вариантов вируса Марбург. В ходе работы была показана высокая инфекционность полученных псевдовирусных частиц на культуре чувствительных клетках TZM-bl.

Ключевые слова: вирус Марбург, псевдовирусы, гликопротеин, плазмиды.

Abstract

This paper presents the results on the research work on the development of a panel of pseudovirus particles that expose three strains of the Marburg virus on the glycoprotein surface. Each of them is presented in two versions - full-length and with a deletion of the mucin-like domain, the mucin-like domain was removed to improve the accuracy of detection of humoral response targets. As a result, a complete panel is prepared, composed of six options of the Marburg virus. During the work, high infectivity of the obtained pseudovirus particles on the culture of sensitive TZM-bl cells was demonstrated.

Keywords: Marburg virus, pseudoviruses, glycoprotein, plasmids.

Согласно международной классификации, вирус Марбург (ВМ) относится к семейству филовирусов отряд Mononegavirales [4]. Вирус Марбург вызывает тяжелую геморрагическую лихорадку у людей. Уровень смертности в очагах лихорадки Марбург варьируется от 24 до 88% [5]. Лихорадка Марбург была впервые обнаружена в 1967 году, после одновременных вспышек заболевания в Марбурге, от названия которого болезнь берет свое название, Франкфурте в Германии и в Белграде, Сербии [3]. Вспышка была связана с лабораторной работой с африканскими зелеными мартышками (Cercopithecus aethiops), вывезенными из Уганды [2]. Впоследствии, вспышки и спорадические случаи лихорадки были зарегистрированы в Анголе, Демократической Республике Конго, Кении [1], Южной Африке и Уганде. В 2008 году были зарегистрированы два независимых случая заражения путешественников, посетивших пещеру, населенную рукокрылыми в Уганде. Развитие международной торговли и туризма, импорт животных для проведения биомедицинских исследований и в зоопарки, высокая патогенность - создают реальную угрозу контакта человека с этим возбудителем. Вирус Марбург передается людям от летучих мышей и распространяется от человека к человеку [6]. В настоящее время нет клинически одобренных препаратов против вируса Марбург для человека [9]. Разработку препаратов задерживают, в том числе и строгие правила работы с натуральным вирусом. Однако, в последнее время разработан ряд методов, позволяющих изучать особенности гуморального иммунного ответа с использованием псевдотипированных вирусов одного цикла. Эта технология безопасна и показывает высокую эффективность. С использованием этой методики получают псевдовирусные частицы, имитирующие молекулярные особенности поверхности натурального вируса. Однако подобные частицы не способны к репликации, что обеспечивает высокую степень безопасности работы. На сегодняшний день подобные системы разработаны для ВИЧ-1 [1], гриппа [7], клещевого энцефалита [8] и других вирусов.

Цель работы - создание панели псевдовирусов Марбург.

Работа направлена на получение функциональных лентивирусных вирусоподобных частиц (ВПЧ) псеводитипированных поверхностным гликопротеином (GP) вируса Марбург. На первом этапе был проведен анализ доступных геномов вируса, представленных на сайте GenBank, и были выбраны последовательности, кодирующие поверхностный гликопротеин трех штаммов: Popp, Musoke и MARV/H.sapience-tc/COD/2000/22DRC. Синтез нуклеотидных последовательностей осуществлен коммерческой фирмой (ДНК-синтез, Москва). Соответствие нуклеотидной последовательности заданной было подтверждено секвенированием. Полученные последовательности были клонированы в составе коммерчески доступного вектора phMGFP. После трансформации компетентных клеток E. coli было проведено секвенирование рекомбинантных векторов, для подтверждения вставки последовательности, кодирующей GP. Следующим шагом стало получение вариантов GP вируса Марбург с делецией муциноподобного домена. Поскольку муциноподобный домен играет роль в уходе от иммунных реакций организма, его наличие мешает точному выявлению мишеней гуморального ответа. Последовательность, соответствующая муциноподобному домену была удалена при помощи сайт-направленного мутагенеза.

Лентивирусные псевдовирусы Марбург представляют собой вирусные частицы, включающие капсидные белки лентивирусного происхождения псевдотипированные GP вируса Марбург. Такие псевдовирусы содержат дефектный лентивирусный геном, который не способен обеспечить формирование инфекционных дочерних вирионов. Для получения таких вирусных частиц проводят котрансфекции эукариотических клеток двумя плазмидами, в том числе плазмиды, содержащей ген поверхностного белка GP, и пакующей плазмиды (рис. 1). Последняя, кодирует все белки лентивируса, за исключением поверхностного гликопротеина. В работе, была использована пакующая плазмида pSG3ДEnv, на основе дефектного генома ВИЧ-1. Для получения псевдовирусов нами была проведена магнитная котрансфекция эукариотических клеток 293Т плазмидами содержащими ген, кодирующий либо полноразмерный белок GP, либо GP с делецией муциноподобного домена трех штаммов Popp, Musoke, MARV/H.sapience-tc/COD/2000/22DRC и пакующей плазмидой pSG3ДEnv. Спустя двое суток после котрансфекции производили сбор урожая псевдовирусов.

Рис. 1 - Схема трансфекции и функционального анализа

Функциональную активность псевдовирусных частиц определяли на чувствительных клетках TZM-bl - генетически модифицированной клеточной линии HeLa, которая презентирует на своей поверхности большое число рецепторов с которыми способен связываться гликопротеин вируса Марбург и содержит репортерные гены люциферазы светлячка под контролем Tat-индуцируемого промотора (рис. 1). Уровень вирусной инфекции определяется по величине сигнала люминесценции вследствие экспрессии Tat-индуцируемого гена люциферазы в клетках. После, в лунки с монослоем клеток TZM-bl добавляют псевдовирусы и помещают планшет в термостат на три дня. Затем проводят лизис клеток и регистрацию значений люминесценции. Сигнал свечения прямо пропорционален количеству зараженных клеток и определяется в относительных люциферазных единицах. В качестве отрицательного контроля выступали неинфицированные клетки, а в качестве положительного псевдовирус ВИЧ-1, SF162.LS (таблица 1). вирус марбург гликопротеин делеция

Таблица 1 - Результаты функционального анализа полученных вариантов псевдовирусов (голубым - отмечены варианты ВПЧ вошедшие в финальную версию панели)

Таким образом, в результате проделанной работы нами была получена панель псевдовирусных частиц, экспонирующих на своей поверхности GP, принадлежащих к трем штаммам вируса Марбург. Также были получены варианты псевдовирусов, содержащие GP с делецией муциноподобного домена. Введение такого варианта в панель позволяет точнее выявлять мишени гуморального иммунного ответа. Для получения псевовирусов использовалась лентивирусная система первого поколения. Способность псевдовирусов проникать в клетки мишени была подтверждена при помощи функционального анализа. Варианты псевдовирусов псевдотипированные GP с делецией муциноподобного домена показывают, в среднем, более высокий уровень трансдукции. Полученная панель псевдовирусов Марбург может быть использована для изучения особенностей гуморального иммунного ответа в ходе разработки новых иммунотерапевтических и профилактических препаратов, а также поиска антивирусных соединений способных блокировать проникновение вируса в клетку.

Список литературы

1. Brauburger K. et al. Forty-five years of Marburg virus research /K. Brauburger, A. J. Hume, E. Muhlberger, et al. // Viruses. - 2012. - Т. 4. - №. 10. - P. 1878-1927.

2. D'Aoust M. A.The production of hemagglutinin-based virus-like particles in plants: a rapid, efficient and safe response to pandemic influenza / M. A. D'Aoust, M. M.-J. Couture, N. Charland, et al.//Plant biotechnology journal. - 2010. - T. 8. - №. 5. - P. 607-619.

3. Feldmann H, et al. Marburg virus, a filovirus: messenger RNAs, gene order, and regulatory elements of the replication cycle / H. Feldmann, E. Mьhlberger, A. Randolf, et al.//Virus Res - 1992. - vol. 24. - P. 1-19.

4. Kissling R.E., et al. Agent of disease contracted from green monkeys / R. E. Kissling, R. Q. Robinson, F. A. Murphy, et al.//Science - 1968. - vol. 160. -P. 888-890.

5. Kunz C. et al. Biologische und morphologische Charakteristika des Virus des in Deutschland aufgetretenen ``Hдmorrhagischen Fiebers'' / C. Kunz, H. Hofmann, W. Kovac, et al.//Wien Klin Wochenschr. - 1968. - Т. 80. - P. 161-162.

6. Рудометов А. П. Cоздание env псевдовирусов на основе штаммов ВИЧ-1, циркулирующих в Новосибирской области / А. П. Рудометов, Н. С. Щербакова //Научно-Исследовательский журнал. - 2015. - № 2 (33). - С. 19-21.

7. Smith D. H. et al. Marburg-virus disease in Kenya / D.H. Smith, M. Isaacson, K.M. Johnson, et al.//The Lancet. - 1982. - Т. 319. - №. 8276. - P. 816-820.

8. Slenczka W., Klenk H. D. Forty years of Marburg virus / W. Slenczka, H. D. Klenk //The Journal of infectious diseases. - 2007. - Т. 196. - №. Supplement_2. - P. S131-S135.

9. Siegert R. et al. The aetiology of an unknown human infection transmitted by monkeys (preliminary communication) / R. Siegert, H.L. Slenczka, D. Peters, et al. //German medical monthly. - 1968. - Т. 13. - №. 1. - P. 1-2.

10. Yoshii K. et al. Establishment of a neutralization test involving reporter gene-expressing virus-like particles of tick-borne encephalitis virus / K. Yoshii, A. Ikawa, Y. Chiba, et al. //Journal of virological methods. - 2009. - Т. 161. - №. 1. - P. 173-176.

Список литературы на английском языке / References inEnglish

1. Brauburger K. et al. Forty-five years of Marburg virus research /K. Brauburger, A. J. Hume, E. Muhlberger, et al. // Viruses. - 2012. - Т. 4. - №. 10. - P. 1878-1927.

2. D'Aoust M. A.The production of hemagglutinin-based virus-like particles in plants: a rapid, efficient and safe response to pandemic influenza / M. A. D'Aoust, M. M.-J. Couture, N. Charland, et al.//Plant biotechnology journal. - 2010. - T. 8. - №. 5. - P. 607-619.

3. Feldmann H, et al. Marburg virus, a filovirus: messenger RNAs, gene order, and regulatory elements of the replication cycle / H. Feldmann, E. Mьhlberger, A. Randolf, et al.//Virus Res - 1992. - vol. 24. - P. 1-19.

4. Kissling R.E., et al. Agent of disease contracted from green monkeys / R. E. Kissling, R. Q. Robinson, F. A. Murphy, et al.//Science - 1968. - vol. 160. -P. 888-890.

5. Kunz C. et al. Biologische und morphologische Charakteristika des Virus des in Deutschland aufgetretenen ``Hдmorrhagischen Fiebers'' / C. Kunz, H. Hofmann, W. Kovac, et al.//Wien Klin Wochenschr. - 1968. - Т. 80. - P. 161-162.

6. Rudometov A. P. Cozdanie env psevdovirusov na osnove shtammov VICh-1, cirkulirujushhih v Novosibirskoj oblasti [Production of env pseudoviruses based on HIV-1 strains circulating in the Novosibirsk region]/ A. P. Rudometov, N. S. Shherbakova //Nauchno-Issledovatel'skij zhurnal [Science-research journal]. - 2015. - № 2 (33). - S. 19-21. [in Russian]

7. Smith D. H. et al. Marburg-virus disease in Kenya / D.H. Smith, M. Isaacson, K.M. Johnson, et al.//The Lancet. - 1982. - Т. 319. - №. 8276. - P. 816-820.

8. Slenczka W., Klenk H. D. Forty years of Marburg virus / W. Slenczka, H. D. Klenk //The Journal of infectious diseases. - 2007. - Т. 196. - №. Supplement_2. - P. S131-S135.

9. Siegert R. et al. The aetiology of an unknown human infection transmitted by monkeys (preliminary communication) / R. Siegert, H.L. Slenczka, D. Peters, et al. //German medical monthly. - 1968. - Т. 13. - №. 1. - P. 1-2.

10. Yoshii K. et al. Establishment of a neutralization test involving reporter gene-expressing virus-like particles of tick-borne encephalitis virus / K. Yoshii, A. Ikawa, Y. Chiba, et al. //Journal of virological methods. - 2009. - Т. 161. - №. 1. - P. 173-176.

Размещено на Allbest.ru