Оптимизация питательной среды для Streptomyces hygroscopicus - продуцента фармацевтической субстанции рапамицина

Размещено на http://www.allbest.ru/

ОПТИМИЗАЦИЯ ПИТАТЕЛЬНОЙ СРЕДЫ ДЛЯ STREPTOMYCES HYGROSCOPICUS - ПРОДУЦЕНТА ФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЙ СУБСТАНЦИИ РАПАМИЦИНА

Савельева В.В., Джавахия В.В., Глаголева Е.В.,

Глаголев В.И., Савушкин В.А.

Аннотация

штамм питательный среда эксперимент

Рапамицин является продуктом метаболизма актиномицета S. hygroscopicus и представляет собой азотсодержащий макролид. В настоящее время рапамицин и его производные имеют широкое клиническое применение в качестве противоопухолевых и иммуносупрессивных агентов.

В данном исследовании проводилась оптимизация питательной среды для штамма S. hygroscopicus R 33-41 при помощи метода математического планирования эксперимента. Оптимизация ферментационной среды совмещала в себе планирование полного факторного эксперимента (ПФЭ 23) с методами крутого восхождения и движения по градиенту концентрации. Параметр оптимизации - количество целевого вещества (рапамицина) по окончанию культивирования. Применение данного метода позволило повысить выход рапамицина на 24,7%.

Ключевые слова: Streptomyces hygroscopicus, рапамицин, питательная среда, оптимизация.

Abstract

Rapamycin is a nitrogen-containing macrolide produced by Streptomyces hygroscopicus. Today rapamycin and its derivatives are widely used as anti-tumor and immunosuppressive agents. In this study the nutrient medium for S. hygroscopicus R 33-41 strain was optimized using design-of-experiments methodology. The performed medium optimization combined the planning of a full factorial design (FFD 2³) with the steepest ascent method and movement along concentration gradient. The amount of a target substance (rapamycin) to the end of fermentation was chosen as the optimization parameter. The application of this method provided a 24.7% increase in the rapamycin output.

Keywords: Streptomyces hygroscopicus, rapamycin, nutrient medium, optimization.

Введение

Со времен открытия стрептомицина в 1943 году [1, C.103-105], было показано, что стрептомицеты (лат. Streptomyces) образуют тысячи соединений (антибиотики, иммуносуппрессанты, противоопухолевые вещества и др.), обладающих большим потенциалом использования в различных отраслях жизнедеятельности человека. Метаболиты, образующиеся в процессе жизнедеятельности актиномицетов, составляют около 2/3 от всех известных антибиотических веществ [2]. Одним из наиболее важных веществ, синтезируемых стрептомицетами, является рапамицин - ингибитор mTOR (от англ. mammalian target of rapamycin), и после циклоспорина, наиболее широко используемый иммуносуппресант микробиологического происхождения [3, C.102-108].

Несмотря на значимость использования и широкий спектр возможностей применения рапамицина в медицине, его получение ограничивается низкой продуцирующей способностью природных штаммов (например, S. hygroscopicus AY-BI1206 [4, C. 436-439], S. hygroscopicus NRRL 5491 [5, C. 727-732]), что увеличивает себестоимость субстанции и снижает возможные объемы его промышленного производства.

Оптимизация питательной среды является главным фактором в повышении выхода продукта, поскольку образование антибиотических веществ регулируется в основном условиями культивирования микроорганизмов [6, C. 56-102]. Традиционно состав питательной среды, оптимальной для выращивания продуцентов, определялся методом длительного эмпирического подбора, в ходе которого устанавливается качественный и количественный состав среды [7, C. 19-23], [8], [9]. В настоящее время при оптимизации питательных сред для микроорганизмов все шире используют математический метод планирования экспериментов, что позволяет обоснованно подходить к конструированию питательных сред, делать их более экономичными [10, C. 111-130]. Планирование эксперимента позволяет варьировать одновременно все факторы и получать количественные оценки, как основных факторов, так и эффектов взаимодействия между ними, причем получаемые результаты характеризуются меньшей ошибкой, чем традиционные методы однофакторного исследования [11], [12, C. 332-344],[13, C. 424-429].

В связи с этим, задачей данного исследования был подбор оптимального состава питательной среды для штамма S. hygroscopicus R 33-41 на основе полного факторного эксперимента с применением методов крутого восхождения и движения по градиенту концентраций для увеличения выхода рапамицина.

Материалы и методы

Штамм-продуцент

В работе использовали штамм Streptomyces hygroscopicus R 33-41, полученный ранее [14, C.122-124], [15, C. 18-19] при помощи мутагенного воздействия на типовой штамм Streptomyceshygroscopicus АТСС 29253. Продуктивность штамма R 33-41 составляла 937 мг/л рапамицина в культуральной жидкости.

Культивирование S. hygroscopicus

Для выращивания, поддержания, хранения культуры S. hygroscopicus использовали плотную агаризованную среду R1 следующего состава (г/л): агар-агар - 20.0, соевая мука - 1.0, растворимый крахмал - 10.0, сульфат магния - 1.0, калий фосфорнокислый двузамещенный - 0.5, дистиллированная вода - до 1 л. Значение активной кислотности среды (pH) до стерилизации составляло 6.8±0.1. Штаммы культивировали при температуре 29 ⁰С в течение 10-12 суток. Для поддержания культуры проводили периодические пересевы на свежую агаризованную среду. Для длительного хранения культуру лиофилизировали и хранили в запаянных ампулах в холодильнике.

Глубинное культивирование осуществляли в колбах Эрленмейера объемом 50 мл, содержащих 10 мл питательной среды. Культуру выращивали в колбах на качалочной установке “Innova 44” при 250 об/мин (эксцентриситет 5 см) и температуре 29⁰С в течение 9 суток. В качестве питательной среды использовали ранее модифицированную [14] среду F2 следующего состава (г/л): соевая мука (полножировая) - 30.0, лизин - 15.0, дрожжевой экстракт - 5.0, соевой пептон - 5.0, глюкоза - 100.0, хлорид натрия - 5.0, сульфат магния - 1.0, сульфат аммония - 1.0, натрий фосфорнокислый 2-замещенный - 5.0, вода дистиллированная до 1 л (рН 6.8-6.9). Глюкозу вносили в среду после стерилизации, в виде 50% раствора.

Метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Количественное определение рапамицина в культуральной жидкости проводили методом ВЭЖХ на жидкостном хроматографе Agilent 1200 Series (Agilent, США) с использованием колонки Agilent Zorbax SB-C18 250ммЧ4,6мм (сорбент - октадецилсиликагель, 5мкм; мобильная фаза - 75 объемов ацетонитрила и 25 объемов воды; температура колонки - 60єC; скорость потока 1 мл/мин). В качестве контроля для сравнения использовали стандартный образец рапамицина (R0395 SIGMA, чистота более 95%), предварительно растворенный в метаноле. Объем пробы составлял 10 мкл. Спектрофотометрическую детекцию проводили при л=278 нм. Время удерживания пика рапамицина составляет 9 минут.

Результаты

Осуществлен полный факторный эксперимент (ПФЭ 2³) с использованием метода крутого восхождения, позволяющий реализовать все возможные комбинации основных уровней независимых переменных факторов, установить оптимальные концентрации компонентов питательной среды с учетом их совместного влияния на выход рапамицина, найти и обосновать оптимальный состав среды. Параметром оптимизации являлась концентрация рапамицина (Y) в культуральной жидкости по окончанию культивирования.

Ранее [14, C. 122-124] был проведен ряд отсеивающих экспериментов, основанный на использовании однофакторного метода, по подбору регуляторных компонентов питательной среды, оказывающих максимальное влияние на синтез рапамицина. Основываясь на данные из литературных источников [16, C. 949-969], [17, C. 829-840], [18, C.523-531] и ряд проведенных однофакторных экспериментов была установлена группа сильнодействующих факторов и их активные уровни. На основании этого, в данной работе в качестве факторов варьирования Х₁, Х₂ и Х₃ взяты соевая мука, лизин и глюкоза соответственно, как наиболее значимые компоненты. Кроме того, был использован дополнительный нулевой фактор Х₀ (Х₀=1). Интервалы варьирования факторов составили 5; 5 и 10 г/л соответственно (Таблица 1). Содержание остальных компонентов в питательной среде оставалось неизменным на определенном ранее уровне.

Таблица 1

Значение факторов в натуральных переменных, шаг варьирования и концентрации основных компонентов питательной среды

Таблица 2

Матрица планирования эксперимента для ПФЭ типа 2³

Коэффициенты уравнения регрессии, а также коэффициенты двойного и тройного взаимодействия факторов определялись по методу наименьших квадратов в соответствии с данными, полученными при глубинном культивировании штамма S. hygroscopicus R 33-41 в трех повторностях на всех вариантах питательных сред. Этот метод является одним из наиболее распространенных приемов статистической обработки экспериментальных данных, относящихся к различным функциональным зависимостям физических величин друг от друга [19, C. 23-35]. Любой коэффициент уравнения регрессии определяется скалярным произведением столбца Y на соответствующий столбец, отнесенным к числу опытов в матрице планирования N:

где b_i - коэффициент регрессии; x_iu - значение переменной в соответствующем столбце; m - количество повторностей; u = 1, 2…N, k = 1, 2…m; i - номер фактора.

Полученные линейные коэффициенты и коэффициенты парного взаимодействия соответственно равны: b₀=0.80, b₁= 0.08, b₂= 0.03, b₃=-0.13, b₁₂=0.01, b₁₃=-0.03, b₂₃=-0.02, b₁₂₃= -0.01.

Коэффициенты, вычисленные по результатам эксперимента, указывают на силу влияния факторов. Чем больше численное значение коэффициента, тем больше фактор влияет на параметр оптимизации [20, C. 80-92].

Значимость коэффициентов регрессии проверяли по критерию Стьюдента, согласно общепринятой методике [19, C. 30],[21, C.25-30].

Полученное уравнение регрессии имело следующий вид:

У = 0,8+0,08X₁ + 0,03X₂-0,13Х₃+0.01X₁X₂-0.03X₁X₃-0.02X₂X₃-0.01X₁X₂X₃

Проверка адекватности уравнения с использованием F-критерия Фишера [22, C.20-28] показала, что уравнение адекватно описывает процесс.

Построение кривых поверхности отклика показало, что каждый из выбранных нами факторов в той или иной степени влияет на биосинтез рапамицина и, следовательно, является значимым. Кривые поверхности отклика представлены на рисунке 1

Рис. 1 Кривые поверхности отклика, показывающие влияние каждого фактора на биосинтез рапамицина (а)Х₁=1; б)Х₂=1; в)Х₃=1)

На основании результатов проведенного ПФЭ можно предположить, что для дальнейшей оптимизации среды применение метода крутого восхождения будет эффективным, так как полученная линейная модель адекватна и не является резко асимметричной относительно коэффициентов. Для определения оптимального состава питательной среды использовали стандартную методику крутого восхождения Бокса-Уилсона [23]. Полученные данные представлены в таблице.

Таблица 3

Расчет коэффициентов регрессии и шага варьирования для определения оптимального состава питательной среды по методу крутого восхождения

Таблица 4

Матрица планирования эксперимента по методу крутого восхождения

В результате осуществления экспериментов методом крутого восхождения в опыте № 4 был достигнут максимальный выход целевого вещества (1,21 г/л), дальнейшее проведение экспериментов методом движения по градиенту концентрации имело негативное влияние на биосинтез рапамицина.

Выводы

На основании проведенных исследований можно заключить, что оптимизация ферментационной среды для штамма S. hygroscopicus R 33-41, совмещающая планирование полного факторного эксперимента (ПФЭ 2³) с методом крутого восхождения и методом движения по градиенту концентрации, в данном случае является эффективной, поскольку конечный выход рапамицина был увеличен относительно исходного значения на 24,7%. В результате эксперимента по методу крутого восхождения разработана ферментационная среда следующего состава (г/л): соевая мука (полножировая) - 36.2, лизин - 20.4, дрожжевой экстракт - 5.0, соевый пептон - 5.0, глюкоза - 85.2, хлорид натрия - 5.0, сульфат магния - 1.0, сульфат аммония - 1.0, натрий фосфорнокислый 2-замещенный - 5.0.

Список литературы

1. Jones D. Control of Gramnegative bacteria in experimental animals by streptomycin /Jones D., Metzger H.J., Schatz A., Waksman S.A.// Science. 1944. Vol. 100. P.103-105.

2. Hopwood D.A. Streptomyces in nature and medicine: the antibiotic makers. Oxford University Press. NY. 2007.

3. Trevillian P. Immunosuppressants: clinical applications. Aust Prescr. Vol. 29. P.102-108.

4. Kojima I. Carbon source nutrition of rapamycin biosynthesis in Streptomyces hygroscopicus. /Kojima I., Cheng Y.R., Mohan V. and Demain A.L. //Journal of Industrial Microbiology. 2006. Vol.14. P. 436-439.

5. Sehgal S.N. Rapamycin (AY-22, 989), a new antifungial antibiotic II. Fermentation, isolation and characterization. / Sehgal S.N., Baker H., Vezina C.// Journal of Antibiotics. 1975. Vol. 28. P. 727-732.

6. Егорова Т.А. Основы биотехнологии: учеб. Пособие / Егорова Т.А., Клунова С.М., Живухина Е.М. // М: Академия. 2006. 207 c.

7. Осипов Д.С. Математическая модель биосинтеза L-лейцина./ Осипов Д.С., Гусельникова Т.В. //М: МГУИЭ. 2001. Т№5. C. 19-23.

8. Монтгомери Д. К. Планирование эксперимента и анализ данных./ Монтгомери Д. К., Л.: Судостроение. 1980. 384c.

9. Перт С.Д. Основы культивирования микроорганизмов и клеток. / Перт С.Д., М.: Мир. 1978. 331 c.

10. Арзамасцев А.А. Математические модели кинетики микробного синтеза: возможности использования и новые подходы к разработке /Арзамасцев А.А., Андреев А.А.// Вестник Тамбовского университета. 2000. №5 (1). С. 111-130.

11. Бирюков В.В. Оптимизация периодических процессов микробиологического синтеза / Бирюков В.В. Кантере В.М. // М: Наука. 1985. 296 c.

12. Bajpai R.K. Mechanistic model for penicillin production. / Bajpai R.K., Reuss M. A J.// Chem. Technol. and Biotechnol. 1980. Vol. 30. P. 332-344.

13. Ettler P. Determination of the optimal feeding regime during biosynthesis of erythromycin/ Ettler P. Votruba J. // Folia Microbiol. 1980. Vol-25. P. 424-429.

14. Савельева В.В. Разработка высокоактивного штамма Streptomyces hygroscopicus - продуцента фармацевтической субстанции рапамицина. / Воинова Т.М., Глаголева Е.В., Джавахия В.В.// Сборник тезисов XI Молодежной школы-конференции с международным участием «Актуальные аспекты современной микробиологии». 2016. С. 122-124.

15. Савельева В.В. Создание высокоактивного штамма S. hygroscopicus - продуцента фармацевтической субстанции рапамицина, методом индуцированного ненаправленного мутагенеза. Russian Agricultural Science Review. 2015. №6 (6-2). С. 18-19.

16. Wang B.Comparative metabolic profiling reveals the key role of amino acids metabolism in the Rapamycin overproduction by Streptomyces hygroscopicus /Wang B., Liu J., Liu H., Huang D. and others// Systems Biotechnology. 2015. Vol. 24. P. 949-963.

17. Sinha R. Studies on process optimization methods for rapamycin production using Streptomyces hygroscopicus ATCC 29253 /Sinha R., Singh S., Srivastava P.// Bioprocess Biosyst Eng. 2014. Vol.37. P. 829-840.

18. Dutta S. Kinetics of rapamycin production by Streptomyces hygroscopicus MTCC 4003 / Dutta S., Basak B., Bhunia B., Chakraborty S. and others// Biotechnology. 2014. Vol.4. 523-531.

19. Яворский В.А. Планирование научного эксперимента и обработка экспериментальных данных. /Яворский В.А.. М: Издательство МФТИ. 2006.

20. Адлер Ю.П. Планирование экспериментов при поиске оптимальных условий. / Адлер Ю.П. М: Наука. 1976. С. 80-92.

21. Хамханов К.М. Основы планирования эксперимента. / Хамханов К.М. Методическое пособие. Издательство: ВСГУТУ. 2001. 94 с.

22. Жерносекова И.В. Методы планирования экспериментов при оптимизации питательной среды для стрептомицета. /Жерносекова И.В., Черногор Н.П., Тымчук А.А. Вестник Днепропетровского университета. 2006. №18 (1). С. 20-28.

23. Бочкарев В.В., Троян А.А. Оптимизация химико-технологических процессов. Практикум. Издательство ТПУ. 2016. 160 с.

Размещено на Allbest.ru