В России сохраняется неблагоприятный прогноз по заболеваемости сальмонеллезом, поэтому своевременное выявление возбудителя заболевания представляет собой актуальную санитарно-гигиеническую задачу. По данным Роспотребнадзора три серовара S. enteritidis, S. typhimurium, S. infantis в 2014 г. составляли от 83,9 до 93% от общего числа выявленных сальмонелл [1].

Иммунохроматографические тесты (далее тесты) занимают самостоятельное место в обширном перечне методов выявления сальмонелл и, как правило, используются совместно с культуральным методом их выявления и идентификации. В большей части тестов для выявления сальмонелл применяют конъюгаты наночастиц коллоидного золота (НКЗ) с антителами [2-5].

Тесты представляют собой полоску мультимембранного композита, помещенную в пластиковую оправу. Мультимембранный композит состоит из нитроцеллюлозной мембраны, мембраны пропитанной конъюгированными НКЗ со специфическими антителами против сальмонелл и впитывающих подложек, соединенных между собой для обеспечения движения тока жидкости. На нитроцеллюлозной мембране в аналитической зоне нанесены антитела к сальмонеллам, а в контрольной зоне - антивидовые по отношению к антителам конъюгата антитела. Клетки сальмонелл, содержащиеся в жидкой пробе, под действием капиллярных сил взаимодействуют с конъюгатом и антителами, нанесенными на мембрану, образуя иммобилизованные на мембране иммунные комплексы, которые визуализируются благодаря метке использованной в конъюгате.

Известно, что иммунохроматографический анализ (ИХА) с применением люминесцентных меток имеет более высокую чувствительность по сравнению с другими, например, колориметрическими, метками [6]. Целью работы было сравнение эффективности различных по конструкции тестов, по выявлению клеток сальмонелл.

Материалы и методы

Для изготовления тестов применяли материалы компании Millipore, США: нитроцеллюлозную мембрану HF120, закрепленную на основе из полистирола, стекловолоконную GFCP и целлюлозную CFSP мембраны.

Для получения конъюгатов и формирования аналитической зоны мембраны применяли иммунокомпоненты, указанные в таблице 1.

Для конструирования тестов с визуальной регистрацией использовали конъюгаты НКЗ со специфическими антителами. НКЗ средним диаметром 25 и 40 нм получали по методу Frens [7] восстановлением 0,01% HAuCl₄ раствором 1% цитрата натрия. Конъюгаты НКЗ с антителами получали по методике, описанной в [8].

Таблица 1 - Иммунокомпоненты, применявшиеся для разработки тестов

Для тестов с приборной регистрацией применяли конъюгаты антител с карбоксилированными люминесцентными микрочастицами FluoSpheres^® (Molecular Probes, США) диаметром 0,1 мкм. Длины волны возбуждения люминесценции и эмиссии л_возб / л_эмисс = 350/435 нм (голубая область спектра). Конъюгаты антител с микрочастицами получали используя N- (3-диметиламинопропил) - N^/-этилкарбодиимид гидрохлорид (EDAC) по методике [9]. Массовое соотношение антител и микрочастиц в полученных нами конъюгатах было равно 0,05, 0,1 и 0,2.

Тесты получали следующим образом. Для тестов с визуальной регистрацией на стекловолоконную подложку наносили конъюгаты НКЗ, разведенные в 50 мМ буфере трис- (гидроксиметил) - аминометана, рН 8,5, содержащем 10% сахарозы и 0,25% БСА до А⁵²⁵ = 3,0 (для НКЗ диаметром 25 нм) и А⁵³⁰ = 3,0 (для НКЗ диаметром 40 нм). Для тестов с приборной регистрацией на стекловолоконную подложку наносили предварительно трижды обработанные ультразвуком конъюгаты люминесцентных микрочастиц в концентрациях 0,015% и 0,03%. На нитроцеллюлозную мембрану диспенсером в виде линий наносили антитела, разведенные в 10мМ К-Na фосфатном буфере с рН 7,4. В аналитическую зону теста наносили антитела к сальмонеллам: баранью сыворотку "Петсал", либо Ig фракцию, выделенную из нее в концентрациях 10 мг/мл или 19 мг/мл, либо энтероклоны в концентрации 2 мг/мл, либо кроличьи поликлональные антитела ABIN286030. В контрольную зону теста наносили антивидовые антитела по отношению к антителам конъюгата в концентрации 2 мг/мл. Мультимембранные композиты высушивали, нарезали на полоски шириной 5 мм и помещали в пластиковые оправы. Готовые тесты хранили в герметичных пакетах с силикагелем.

Для оценки чувствительности тестов готовили взвеси сальмонелл в концентрации 5х10⁴ - 1х10⁸м. к. /мл в буфере для проведения иммунохроматографического анализа (ФГУП "ГосНИИБП", Россия). Все бактериальные препараты были предварительно инактивированы кипячением. S. paratyphi A штамм 225, S. typhimurium, S. paratyphi B, S. heidelberg штамм 1150, S. newport, S. choleraesuis, S. enteritidis штамм 17, S. typhi штамм 33, S. anatum штамм 161 были получены из коллекции НИИ вакцин и сывороток (г. Санкт-Петербург). S. typhimurium штамм VGNK, S. infantis штамм 517, S. enteritidis штамм 29/1, S. enteritidis штамм 899, S. dublin штамм 412, S. anatum штамм 33/36 были получены из коллекции ВНИИВСГЭ (г. Москва). Объем анализируемого образца не превышал 150 мкл, регистрацию результата анализа проводили через 15 мин и 30 мин. Визуальная регистрация результатов анализа заключалась в наблюдении окрашенных НКЗ полос на аналитической мембране. Две полосы - результат анализа положительный; одна полоса в контрольной зоне - результат анализа отрицательный, если окрашенных полос не наблюдали, то результат анализа не учитывали. Приборную регистрацию проводили на регистраторе люминесценции видеоцифровом "РЛВ-1" (разработка ФГУП "ГосНИИБП", Россия). Принцип работы прибора основан на видеоцифровой регистрации люминесценции [6]. Излучающие светодиоды и светофильтры регистратора позволяли возбуждать люминесценцию в диапазоне длин волн 340-400 нм, и регистрировать люминесценцию при длинах волн более 400 нм. Отношение интенсивности люминесценции аналитической и контрольной зон тестов (Q=I_a/I_c) измеряли в условных единицах. Если Q > 0, то результат анализа поло

Обсуждение результатов

Подбор иммунокомпонентов для конъюгата и аналитической зоны проводили на тестах с визуальной регистрацией с конъюгатами со средним размером наночастиц 25 нм. Комбинировали конъюгаты антител и антитела наносимые в аналитическую зону мембраны.

Было выявлено, что тесты с энтероклонами в конъюгате или аналитической зоне выявляли только S. typhimurium. Как видно из таблицы 2, если в составе теста присутствовали оба энтероклона, то чувствительность выявления S. typhimurium составляла 5х10⁶ м. к. /мл. Повысить чувствительность выявления S. typhimurium в 10 раз удалось заменой энтероклона А-67 на кроличьи поликлональные антитела. Энтероклоны для выявления других сальмонелл основных групп A, B, C, D, E иммунохроматографическим методом оказались малопригодны.

Таблица 2 - Выявление S. typhymurium экспресс-тестами с энтероклонами

Поскольку баранья сыворотка "Петсал" и ее Ig фракция помимо специфических иммуноглобулинов содержали другие белки, конъюгаты НКЗ получили с нагрузкой, равной пятикратной стабилизирующей концентрации. Различное комбинирование конъюгатов бараньей сыворотки, конъюгатов кроличьих антител с аналитическими мембранами, содержащими баранью сыворотку или Ig фракцию бараньей сыворотки, или кроличьи антитела, не привело к выявлению сальмонелл. Был сделан вывод, что агглютинирующую поливалентную сыворотку "Петсал" невозможно использовать в ИХА.

Основные группы сальмонелл A, B, C, D, E возможно было выявлять, если в конъюгате и аналитической зоне находились кроличьи поликлональные антитела. Время анализа составило 15 мин, увеличение времени анализа до 30 мин приводило к появлению окрашивания аналитической зоны теста (положительный результат) при анализе "холостой пробы". Как видно из таблицы 3, наибольшая чувствительность наблюдалась при выявлении сальмонелл группы В. Возможно, это объясняется тем, что в качестве иммуногена применяли смесь клеток S. typhimurium, S. heidelberg, S. enteritidis. S. typhimurium, S. heidelberg имеют три общих О-антигена (4, 5 и 12), а S. enteritidis - два общих О-антигена с S. typhimurium (1 и 12) и один с S. heidelberg (12). S. paratyphi A и S. typhi имели только один общий О-антиген (1 и 12 соответственно) с S. typhimurium, S. heidelberg, S. enteritidis. Остальные сальмонеллы общих антигенов не имели.

Таблица 3 - Чувствительность выявления сальмонелл экспресс-тестом на основе кроличьих поликлональных антител

Увеличение размера НКЗ для получения конъюгатов с кроличьими поликлональными антителами с 25 до 40 нм не привели к увеличению чувствительности выявления сальмонелл, хотя для белковых антигенов такой эффект наблюдался ранее [8]. Указанный тест был специфичен по отношению к микробным клеткам кишечной палочки, протея и шигелл в концентрациях в 10…100 раз превышающих чувствительность теста.

сальмонелла иммунохроматографический тест наночастица

Поскольку наибольшим разнообразием выявляемых сальмонелл и чувствительностью обладал тест с кроличьими поликлональными антителами в конъюгате НКЗ и аналитической зоне, то именно с ними получили конъюгаты с люминесцентными микрочастицами. Конъюгаты отличались нагрузкой указанными антителами и концентрацией микрочастиц. Вначале сконструированные тесты на основе люминесцентных микрочастиц были испытаны "холостой" пробой. Были отобраны для дальнейших экспериментов тесты, проявившие яркую люминесценцию контрольной зоны (не менее 3000 усл. ед.) и отсутствие фоновой люминесценции аналитической зоны. Таким условиям удовлетворял тест с конъюгатом с концентрацией микросфер 0,015% и нагрузкой 0,2 мг кроличьих антител на 1 мг микросфер. Тестом, построенный на основе такого конъюгата, выявляли сальмонеллы, относящиеся к группам В, С и D.

При регистрации результата анализа через 15 мин чувствительность выявления сальмонелл S. typhimurium составила 5х10⁶ м. к. /мл, S. enteritidis 5х10⁷ м. к. /мл, S. heidelberg 1х10⁶ м. к. /мл. Для повышения чувствительности время анализа увеличили до 30 мин, тогда чувствительность выявления S. typhimurium стала 1х10⁵ м. к. /мл, S. enteritidis 1х10⁶ м. к. /мл, S. heidelberg 1х10⁵м. к. /мл.

Заключение