Размещено на http://www.allbest.ru/

Особенности пролиферации клеток в герминативных зонах мозга крыс при экспериментальных патологиях, сопровождающихся нейродегенерацией

ВВЕДЕНИЕ

пролиферация мозг клетка

Актуальность проблемыСПИСОК СОКРАЩЕНИЙ: ГАМК - г-аминомасляная кислота; ЗФ - зубчатая фасция; ПГ - пренатальная гипоксия; ПТЗ - пентилентетразол; ПТЗК - пентилентетразоловый киндлинг; BrdU - 5-бром-2'-дезоксиуридин; NO - оксид азота; nNOS - нейрональная изоформа синтазы оксида азота

Дегенерация и гибель нервных клеток - ключевое звено в патогенезе многих неврологических заболеваний, лежащее в основе двигательных, когнитивных и мнестических нарушений. При неврологических заболеваниях, наряду с гибелью уже имеющихся нейронов мозга, происходит и нарушение процесса образования новых нейронов - нейрогенеза. В мозге взрослых млекопитающих и человека существуют две области, где нейрогенез протекает в течение всей жизни - это субвентрикулярный слой боковых желудочков и зубчатая фасция гиппокампа. С момента своего открытия в середине XX века феномен постнатального нейрогенеза привлекал к себе пристальное внимание ученых всего мира. Было обнаружено, что ход постнатального нейрогенеза может серьезно изменяться при различных патологических состояниях, таких как ишемия, травма мозга, эпилепсия. Поскольку все эти состояния в той или иной степени сопровождаются гибелью нервных клеток, то постнатальный нейрогенез рассматривался в связи с нейродегенерацией как противоположный ей, репаративный процесс (Bengzon et al., 1997). Это породило надежду на то, что, стимулируя нейрогенез, можно восполнить убыль нервных клеток в мозге. Однако в последнее время появляется все больше свидетельств того, что новые клетки, образовавшиеся в патологических условиях, не способны адекватно заменять погибшие нейроны с восстановлением их функций. Атипичное встраивание таких клеток в нервные сети ведет к еще большим нарушениям работы последних, усугубляя тем самым развитие заболевания (Parent et al., 1997; Scharfman et al., 2000; Jessberger et al., 2007). С этой точки зрения изменения постнатального нейрогенеза в патологических условиях рассматриваются как составная часть той или иной патологии.

Одним из первых заболеваний, при котором было обнаружено нарушение постнатального нейрогенеза, была эпилепсия. Эпилепсия входит в число наиболее распространенных заболеваний нервной системы, сопровождается снижением качества жизни и значительными социальными ограничениями. Наиболее яркими проявлениями эпилепсии являются повторяющиеся приступы судорог, возникающие вследствие образования в мозге патологического очага циркуляции возбуждения. Нарушение функционирования мозга при эпилепсии сопровождается дисфункцией и гибелью нейронов. Наряду с этим при развитии судорожной активности происходят изменения в процессе нейрогенеза, которые могут вносить свой вклад в развитие заболевания (Parent et al., 1997; Scharfman et al., 2000; Jessberger et al., 2007). Поэтому одной из актуальных задач является исследование нейродегенерации и нейрогенеза при эпилепсии, а также установление возможной связи между ними. Изучение этого вопроса необходимо и для общего понимания роли новых нейронов во взрослом мозге.

Удобным экспериментальным подходом к исследованию механизмов изменений, связанных с эпилепсией, является пентилентетразоловый киндлинг (ПТЗК). При ПТЗК возникают нарушения, в определенной степени аналогичные таковым при эпилепсии височной доли у человека (McNamara, 1985). У экспериментальных животных развиваются судороги, нарушается поведение, повреждаются нейроны, изменяются процессы образования новых клеток в мозге. ПТЗК широко используют как наиболее адекватную модель эпилептогенеза для изучения нарушений пролиферации при эпилепсии (Park et al., 2006). Поэтому мы также использовали ПТЗК для изучения механизмов пролиферации и дифференцировки клеток в мозге при развитии судорожной активности.

Для сравнения в работе был использован биологический материал, полученный на модели пренатальной гипоксии (ПГ). ПГ приводит к дегенерации нейронов и снижению нейрональной плотности в коре и гиппокампе молодых животных (Журавин и соавт., 2001, 2003). Это позволяет исследовать соотношение нейродегенерации и нейрогенеза в принципиально иных условиях, нежели при ПТЗК, и попытаться найти общие закономерности в соотношении нейродегенерации и нейрогенеза на разных моделях.

Цель работы и основные задачи исследования.

Основной целью работы было изучение влияния состояний, сопровождающихся дегенерацией и гибелью нейронов, на пролиферацию и нейрональную дифференцировку клеток в мозге крыс, а также исследование возможных механизмов, лежащих в основе этих изменений. Для этого были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать пролиферацию и дифференцировку клеток в мозге крыс при пентилентетразоловом киндлинге (ПТЗК), эпилептическом статусе, перенесенной ПГ.

2. Выяснить, как изменяется функционирование нитрергической системы при этих экспериментальных патологиях.

3. Оценить изменения в поведении животных на начальных этапах ПТЗК и выяснить связь этих изменений со сдвигами в процессах пролиферации и дифференцировки клеток в гиппокампе.

Научная новизна

В настоящей работе было впервые обнаружено резкое угнетение пролиферации клеток в герминативных зонах мозга крысы после однократного введения ПТЗ в субконвульсивной дозе. Продемонстрированный анксиогенный эффект субконвульсивной дозы ПТЗ, по-видимому, связан с угнетением пролиферации клеток в мозге за счет включения стресс-реализующих механизмов. В этот период еще не развиваются ни судорожные реакции, ни нейродегенеративные изменения, с которыми традиционно связывают изменения пролиферации клеток при введении ПТЗ. Кроме того, однонаправленные реакции пролиферативных популяций разных герминативных зон предполагают наличие общего регуляторного фактора.

При ПТЗК впервые было продемонстрировано уменьшение числа нитрергических клеток в мозге, а также разнонаправленные изменения в нитрергической системе в разных отделах мозга.

Впервые было установлено, что результатом ПГ может быть уменьшение пролиферации клеток в гиппокампе и увеличение числа нитрергических нейронов.

Было также впервые установлено, что изменения пролиферации клеток в гиппокампе при исследованных патологических состояниях сопровождаются противоположными по направлению изменениями экспрессии нейрональной изоформы синтазы оксида азота (nNOS).

Теоретическая ценность и практическая значимость

В работе было проведено комплексное исследование пролиферации и дифференцировки клеток в мозге крыс в ходе развития ПТЗК. Исследование, проведенное в динамике ПТЗК, позволило составить детальное представление о последовательности изменений процессов пролиферации клеток. Выявленные существенные нарушения пролиферации на ранних этапах ПТЗК, ранее не исследованные, очевидно, играют важную роль в последующих нарушениях процессов нейрогенеза, которые составляют основу развития феномена аберрантной пластичности, характерного для эпилептических состояний. Обнаруженные масштабные изменения в нитрергической системе позволили высказать гипотезу о ее регуляторной роли в долгосрочных изменениях пролиферации и дифференцировки в герминативных зонах.

Получены подтверждения высказанной ранее гипотезы о рострокаудальной гетерогенности пролиферативной популяции гиппокампа. Этот результат, наряду с его важным теоретическим значением, принципиален и с методологической точки зрения, так как почти все современные исследования производятся без учета этой особенности. Выделение функционально неоднородных областей внутри гиппокампа может являться ключом к пониманию происходящих в нем процессов.

Полученные результаты имеют и существенное практическое значение, поскольку позволяют значительно расширить наши представления о патогенезе эпилепсии. Нарушения пролиферации клеток в герминативных зонах могут быть одним из ключевых звеньев патогенеза эпилепсии. При этом как усиление, так и угнетение клеточной пролиферации в гиппокампе может иметь негативные последствия, в частности, составляя основу феномена аберрантной пластичности мозга. Полученные данные открывают перспективы разработки инновационных подходов к лечению эпилепсии и коррекции эпилептических состояний. Важным компонентом такой патогенетически обоснованной терапии эпилепсии должна стать нормализация процессов клеточной пролиферации в гиппокампе. На основании полученных результатов можно наметить один из возможных путей регуляции интенсивности пролиферации в гиппокампе путем воздействия на нитрергическую систему.

Положения, выносимые на защиту:

1. При развитии ПТЗК в гиппокампе крыс развивается нейродегенерация, нарушаются процессы пролиферации и дифференцировки.

2. Пролиферативная популяция гиппокампа в патологических состояниях приобретает гетерогенность в рострокаудальном направлении.

3. Пролиферация клеток в гиппокампе и экспрессия синтазы оксида азота изменяются реципрокно.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены на 6-м Европейском Форуме по нейронаукам (Женева, 2008), Конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (С.-Пб., 2008), Конференции с международным участием «Эпилептология в медицине ХХI века» (Москва-Казань, 2009), 4-й конференции ESN «Достижения в исследовании молекулярных механизмов неврологических заболеваний» (Лейпциг, 2009), Всероссийской конференции с международным участием «Гиппокамп и память: норма и патология» (Пущино, 2009), Международной конференции «Иммунная система мозга: нейрохимические и нейроэндокринные аспекты» (Ереван, 2009), конференции «Ломоносов-2008» (Москва), на научных конференциях молодых ученых ИВНД и НФ РАН (Москва, 2007, 2008, 2009) и апробированы на межлабораторной конференции ИВНД и НФ РАН (Москва, 2009).

Объем и структура диссертации

Диссертация содержит следующие основные разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты исследования и обсуждение, заключение, выводы и библиографический указатель, включающий работы на русском языке (14) и иностранных (214) языках. Диссертация изложена на 153 страницах машинописного текста и содержит 19 иллюстраций и 2 таблицы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

Работа с животными. В работе было использовано 96 крыс-самцов линии Вистар массой 200-250 г. Животных содержали по пять особей в пластмассовых клетках в условиях вивария при комнатной температуре и свободном доступе к воде и пище. В виварии поддерживали искусственный световой режим (день 8:00-20:00). Проведение экспериментов было согласовано с этической комиссией Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН. В ходе работы были предприняты все усилия, чтобы свести к минимуму страдание животных. Для формирования ПТЗК мы использовали 55 животных в 5 группах, которым вводили изотонический раствор (контрольная группа) или ПТЗ (37,5 мг/кг) 1, 3, 5 или 13 раз. Введение ПТЗ осуществляли три раза в неделю. После инъекции ПТЗ в течение 20 мин оценивали судорожную активность животных по шкале Franke, Kittner (2001). При моделировании эпилептического статуса однократно вводили сублетальную дозу ПТЗ (80 мг/кг), приводившую к развитию генерализованных клонико-тонических судорог с потерей позы. Для оценки тревожности через 5 мин после введения одной субконвульсивной дозы ПТЗ животных на 5 мин помещали в приподнятый крестообразный лабиринт, а их поведение записывали на видеокамеру. На следующий день после введения ПТЗ или изотонического раствора в моделях ПТЗК и эпилептического статуса проводили мечение пролиферирующих клеток (4 инъекции BrdU в дозе 50 мг/кг с интервалами 2 ч) и декапитировали животных.

Для сравнения был использован биологический материал, полученный на модели пренатальной гипоксии в лаборатории сравнительной физиологии и патологии ЦНС к.б.н. Д.С.Васильевым под руководством д.б.н. И.А. Журавина (ИЭФБ РАН). ПГ осуществляли на 14-е сутки внутриутробного развития согласно методике, описанной в работах И.А. Журавина и соавт. (2001, 2003). В день забора материала животным вводили BrdU для мечения пролиферирующих клеток по описанной выше методике.

Иммуногистохимия. В работе использовали непрямой пероксидазный иммуногистохимический метод с визуализацией пероксидазной реакции 3, 3'-диаминобензидином. В качестве первичных антител использовали: IgG мыши к BrdU (1:2000, BD Pharmingen, USA), IgG кролика к nNOS (1:4000, Chemicon, USA). В качестве вторичных антител использовали биотинилированные иммуноглобулины козы к константному фрагменту IgG мыши (1:200, Sigma, USA) или кролика (1:800; Sigma, USA).

Подсчет клеток, окрашенных позитивно на BrdU или nNOS, проводили на микроскопе Olympus CX-41 (Olympus Optical, Japan) при увеличении Ч200. Нейрональную плотность в полях гиппокампа определяли на окрашенных крезилвиолетом срезах по методике, описанной в работах (Stepanichev et al., 2004, 2006) в полях СА1, СА2+СА3, СА4 и в ЗФ. Клетки, позитивно окрашенные на включение BrdU, подсчитывали в ЗФ гиппокампа и поле СА4. Подсчет клеток, позитивно окрашенных на nNOS, проводили в поле СА1 и СА4 гиппокампа, в его радиальном слое, а также в ЗФ.

Биохимические и молекулярно-биологические методы. Гиппокамп, мозжечок и кору больших полушарий выделяли и гомогенизировали в Тризоле. Из гомогената выделяли фракцию белка и РНК методом фенол-хлороформной экстракции. Образцы РНК выравнивали по концентрации и подвергали обратной транскрипции, после чего проводили ПЦР для определения уровня мРНК nNOS, нормируя его по уровню мРНК б-актина в пробах. Образцы белка выравнивали по концентрации общего белка и использовали в процедуре Western-blot для определения уровня белка nNOS и даблкортина, нормируя их по уровню б-тубулина в пробах. Результаты ПЦР и Western-blot фотографировали и оцифровывали в программной среде Total Lab (Total Lab Systems, Ltd., New Zealand).

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программы Statistica 7.0 (StatSoft, USA). Данные представлены в виде M ± S.E.M., если не оговорено иное.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ОБСУЖДЕНИЕ

Рис. 3. Снижение числа нейронов в полях гиппокампа крыс во время развития ПТЗК. А - Г, по мере увеличения числа инъекций ПТЗ в различных полях гиппокампа уменьшалось число нейронов (А - CA1, Б - CA2+СА3, В - CA4, Г - ЗФ). Это уменьшение было достоверным (p<0,05; one-way ANOVA) в CA2+CA3 (F=5.85), CA 4 (F=6.85) и ЗФ (F=3.67). В ЗФ число нейронов после 13 инъекций ПТЗ также было достоверно ниже по сравнению с контрольными животными (* p<0,05; post-hoc ANOVA, Neuman-Keuls test), в то время как в CA2+CA3 и CA4 имелась только тенденция к такому снижению (p<0,1; post-hoc ANOVA, Neuman-Keuls test). Д - снижение нейрональной плотности в ЗФ при увеличении числа инъекций ПТЗ.

Пролиферация клеток в герминативных зонах мозга крыс при ПТЗК. При иммуногистохимическом окрашивании препаратов головного мозга контрольных крыс BrdU-позитивные клетки были обнаружены в стенке боковых желудочков, а также в гиппокампе (в ЗФ и поле СА4). В обеих герминативных зонах мозга крыс (как в субвентрикулярной, так и в гиппокампальной) после 1 введения ПТЗ отмечалось выраженное уменьшение числа BrdU-позитивных клеток (рис. 4, 5). По мере увеличения числа инъекций ПТЗ число BrdU+ клеток снова росло и после 13 инъекций ПТЗ заметно не отличалось от контрольного уровня.

Рис. 4. Окрашивание ядер клеток, меченых BrdU, в герминативных зонах мозга крысы

Многочисленные скопления BrdU+ клеток присутствовали в норме в субвентрикулярной области (A). В гиппокампе BrdU+ клетки встречались гораздо реже (B), преимущественно на границе ЗФ и поля СА4 (стрелки). После 1 введения ПТЗ в обеих областях число BrdU+ клеток существенно уменьшалось (C, D); в ЗФ и поле СА4 они практически отсутствовали. После 13 инъекций ПТЗ интенсивность пролиферации восстанавливалась как в субвентрикулярной области, так и в гиппокампе (E, F). Увеличение Ч100. Шкала 100 мкм.

Количественный анализ помог также установить, что в передней части ЗФ (ростральнее уровня -4,3 мм от брегмы) динамика изменений пролиферации клеток при ПТЗК была отличной от других областей гиппокампа. В частности, в передней части ЗФ число BrdU+ клеток не снижалось после 1 инъекции ПТЗ, зато уже после 5 инъекций ПТЗ начинался достоверный рост числа BrdU+ клеток относительно контрольного уровня (Рис. 6).

Рис. 5. Плотность BrdU+ клеток в герминативных зонах мозга крысы при ПТЗК. А - субвентрикулярная область, Б - зубчатая фасция гиппокампа. В - поле СА4 гиппокампа. * - отличие от контроля, # - отличие от группы ПТЗ 1, ‡ - отличие от группы ПТЗ 3 (p<0,05, M-W test).

Рис. 6. Плотность BrdU+ клеток в переднем отделе ЗФ (ростральнее уровня -4,3 мм от брегмы) при ПТЗК. * - отличие от контроля, # - отличие от группы ПТЗ 1 (p<0,05; M-W test).

Пролиферация клеток в герминативных зонах мозга крыс при эпилептическом статусе, вызванном ПТЗ. После инъекции ПТЗ в дозе 80 мг/кг плотность BrdU+ клеток увеличивалась относительно контрольного уровня как в стенке боковых желудочков, так и в ЗФ (рис. 7). Таким образом, интенсивность клеточной пролиферации в герминативных зонах мозга проявляла четкую зависимость от силы судорожной активности.

Рис. 7. Плотность BrdU+ клеток в герминативных зонах мозга крысы после введения ПТЗ в разных дозах. А - субвентрикулярная область, Б - зубчатая фасция гиппокампа. После введения ПТЗ в дозе 37,5 мг/кг плотность пролиферирующих клеток падает как в субвентрикулярной области, так и в ЗФ. Напротив, введение ПТЗ в дозе 80 мг/кг приводит к усилению пролиферации в обеих герминативных зонах. * - отличие от контроля, # - отличие от группы ПТЗ 37,5 мг/кг (p<0,05; M-W test).

Изменение дифференцировки клеток в гиппокампе крыс при ПТЗК.

Вступление клетки на путь нейрональной дифференцировки сопровождается появлением наиболее раннего маркера нейрональной дифференцировки - даблкортина, экспрессирующегося в нейробластах и незрелых нейронах примерно с 4-х по 26-е сутки развития (Abrous et al., 2005). Содержание даблкортина в гиппокампе повышалось после 13 инъекций ПТЗ примерно в 1,5 раза по сравнению с контрольными животными (p<0,05, M-W test). При этом на более ранних стадиях развития ПТЗК (после 1, 3 и 5 инъекций ПТЗ) не было отмечено каких-либо изменений уровня даблкортина (рис. 8). Известно, что усиленное образование молодых нейронов наблюдается после однократного (Jiang et al., 2003) и хронического (Yin et al., 2007) введения ПТЗ.

Рис. 8. Экспрессия даблкортина в гиппокампе крыс на разных стадиях ПТЗК. Денситометрический анализ содержания даблкортина в гиппокампе крыс на разных стадиях ПТЗК (отн. ед.). Оптическая плотность даблкортина нормирована по б-тубулину. * - отличие от контроля, ‡ - отличие от ПТЗ 3 (p<0,05; M-W test).

Изменения в нитрергической системе мозга крыс при ПТЗК. Одним из факторов, который может усиливать нейрогенез во взрослом мозге, является оксид азота (NO). Известно также, что развитие ПТЗК сопровождается серьезными изменениями в продукции NO (Bashkatova et al., 2000; Han et al., 2000; Kaneko et al., 2002). В представленной работе наблюдалось уменьшение числа нитрергических клеток после 13 инъекций ПТЗ в гиппокампе (в поле СА1 и радиальном слое, в переднем отделе поля СА4, рис 9) и в неокортексе (рис. 10). В гиппокампе, кроме того, снижался уровень мРНК nNOS (после 5 инъекций ПТЗ), в неокортексе - уровень белка nNOS (после 3 инъекций ПТЗ). В мозжечке, напротив, сразу после 1 инъекции ПТЗ наблюдалось значительное повышение экспрессии мРНК nNOS (рис. 11). Различная направленность изменений нитрергической системы в мозжечке с одной стороны и в неокортексе и гиппокампе - с другой могут быть обусловлены противоположной ролью этих структур в эпилептогенезе (Крыжановский и соавт., 1992).

Рис. 9. Изменения в нитрергической системе в гиппокампе крыс при ПТЗК. А -В, число нитрергических клеток. А - поле СА1, Б - радиальный слой, В - передняя часть поля СА4. Г - содержание мРНК nNOS в гиппокампе (оптическая плотность), отн. ед. (* - отличие от контроля, p<0,05; M-W test).

Рис. 10. Изменения в нитрергической системе в мозжечке крыс при ПТЗК. Содержание мРНК nNOS в мозжечке (оптическая плотность), нормированное по оптической плотности полосы б-актина. * - отличие от контрольной группы, ‡ - отличие от группы ПТЗ 3 (p<0,05; M-W test).

Рис. 11. Изменения в нитрергической системе в коре больших полушарий при ПТЗК. А - число nNOS-позитивных клеток на мм², Б - содержание белка nNOS (оптическая плотность). * - отличие от контрольной группы, # - отличие от группы ПТЗ 1, * - отличие от группы ПТЗ 5 (p<0,05; M-W test).

Пролиферация клеток в герминативных зонах мозга крыс после перенесенной нормобарической гипоксии в пренатальном периоде. В субвентрикулярной области число BrdU+ клеток не отличалось достоверно у контрольных животных и животных, перенесших ПГ. В ЗФ число BrdU+ клеток было меньше у животных, перенесших ПГ. В поле СА4 наблюдалась лишь тенденция к такому снижению (рис. 12).

Рис. 12. Плотность пролиферирующих клеток, меченых BrdU, в различных герминативных зонах молодых крыс, подвергнутых ПГ. А - субвентрикулярная область, Б - ЗФ, В - поле СА4. * отличие от контроля (p<0,05; M-W test).

Рис. 13. Сравнение плотности BrdU+ клеток в ростральной и каудальной части гиппокампа. Слева - животные контрольной группы, справа - животные, подвергнутые ПГ. Сравнение проводили внутри каждой группы в ЗФ и поле СА4. * - различие между ростральной и каудальной частью одного и того же поля (ЗФ или СА4) у животных одной группы (p<0,05; M-W test), & - тенденция к различию (p<0,1; M-W test).

Раздельный анализ переднего и заднего отделов гиппокампа (с границей между ними на уровне -4,3 мм от брегмы) позволил выявить преимущественное снижение числа BrdU+ клеток в задних отделах. Если в переднем гиппокампе не было достоверных отличий между двумя группами по плотности BrdU+ клеток ни в ЗФ, ни в поле СА4, то в заднем гиппокампе число BrdU+ клеток у животных, подвергнутых ПГ, было достоверно меньше как в ЗФ, так и в поле СА4. Более того, после ПГ появлялись различия в плотности BrdU+ клеток между ростральной и каудальной частями ЗФ (p<0,05; M-W test). Похожая тенденция наблюдалась и в поле СА4 (рис. 13).

Изменения в нитрергической системе мозга крыс, перенесших пренатальную нормобарическую гипоксию. Воздействие нормобарической гипоксии на 14-е сутки внутриутробного развития приводило у молодых крыс к достоверному увеличению плотности nNOS+ клеток в поле СА4 гиппокампа (рис. 14), причем в его передней части оно было наиболее выраженным. В ЗФ наблюдалась только тенденция к увеличению числа nNOS+ клеток у животных после ПГ. В стриатуме плотность nNOS+ клеток не различалась между двумя группами (p>0,1; M-W test).

Рис. 14. Число нитрергических клеток в гиппокампе контрольных животных и животных, подвергнутых пренатальной гипоксии. А - ЗФ, Б - поле СА4. В ЗФ наблюдается только статистическая тенденция к увеличению плотности nNOS+ клеток после гипоксии (p<0,1; M-W test). В поле СА4 повшение плотности nNOS+ клеток после гипоксии статистически достоверно (*p<0,05; M-W test).

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Таким образом, было обнаружено, что при развитии ПТЗК в мозге крыс нарушается пролиферация клеток в герминативных зонах. Это нарушение имеет сложный вид, с угнетением после 1 инъекции ПТЗ и восстановлением по мере развития ПТЗК. В данном случае рост судорожной активности совпадает с усилением пролиферативной активности. Кроме того, еще большая судорожная активность при введении сублетальной дозы ПТЗ (80 мг/кг) провоцирует дальнейшее усиление пролиферации клеток в герминативных зонах, позволяя говорить о прямой связи выраженности моторных судорог и интенсивности деления клеток в герминативных зонах мозга. Неясным, однако, остается механизм угнетения пролиферации после 1 инъекции ПТЗ в субконвульсивной дозе. Результаты нашего исследования позволяют предположить, что в основе этого феномена может лежать анксиогенный эффект ПТЗ, наблюдавшийся после введения субконвульсивной дозы ПТЗ.

Нейродегенерация, развивающаяся в гиппокампе на поздних этапах ПТЗК, совпадает по времени с восстановлением пролиферативной активности в гиппокампе. В это же время в гиппокампе отмечается существенное снижение числа нитрергических клеток. Сопоставление этих фактов позволяет выдвинуть предположение, что дегенеративные изменения преимущественно захватывают нитрергические нейроны, а снижение выброса NO стимулирует пролиферацию в герминативных областях. Возможно также, что уменьшение числа нитрергических нейронов связано с их гибелью вследствие гиперпродукции NO. Это предположение основывается на данных литературы, указывающих на увеличение концентрации NO и его метаболитов при ПТЗК (Bashkatova et al., 2000; Han et al., 2000; Kaneko et al., 2002). В случае, если это предположение верно, то на ранних этапах ПТЗК, когда вследствие увеличения активности нейронов активируется Ca²⁺-зависимая nNOS в нитрергических клетках и происходит гиперпродукция NO, должны возникать сдвиги от пролиферации к дифференцировке в близлежащих активно делящихся клетках. Действительно, в представленной работе был обнаружен такой сдвиг, проявляющийся в увеличении экспрессии маркера незрелых нейронов даблкортина.

Участие нитрергической системы в регулировании пролиферативной активности клеток в мозге подтвердилось при сравнении с изменениями на другой модели - ПГ. В этой модели нами также было обнаружено нарушение пролиферации клеток в гиппокампе, которое сопровождалось противоположными по направленности изменениями в нитрергической системе. Обнаружение подобной антагонистической связи в двух разных моделях позволяет нам более уверенно предполагать участие нитрергических нейронов в создании микроокружения делящихся клеток.

Другим важным выводом из сравнения результатов, полученных на разных моделях, является наличие в гиппокампе определенной гетерогенности при реагировании пролиферативной популяции на патологические факторы. Эта гетерогенность не проявляется в норме, но выявляется после определенных воздействий: в виде ослабления пролиферации преимущественно в каудальных отделах после 1 инъекции ПТЗ и после воздействия ПГ. В настоящее время существует лишь несколько работ, посвященных вопросу гетерогенности пролиферативной популяции гиппокампа. Известно, что нейроны ростральной части гиппокампа преимущественно вовлечены в когнитивные процессы, тогда как нейроны каудального гиппокампа участвуют в реализации эмоций (Bannerman et al., 2004). Височная эпилепсия часто сопровождается эмоциональными нарушениями, преимущественно тревожностью и депрессией. В связи с этим выявленное нами выраженное угнетение нейрогенеза в каудальном гиппокампе существенно дополняет имеющиеся представления о клеточных механизмах возникновения нарушений эмоциональной сферы при эпилепсии. Дальнейшее изучение вопроса тонкой пространственной организации пролиферативной популяции гиппокампа представляется перспективным направлением развития работы. Выделение функционально неоднородных областей внутри гиппокампа может являться ключом к пониманию происходящих в нем процессов. Кроме фундаментального значения, такое исследование позволило бы уточнить наши представления о функциональной роли гиппокампального нейрогенеза, и, следовательно, наметить возможные механизмы воздействия на этот процесс для лечения нейродегенеративных заболеваний, эпилепсии и психических расстройств в клинике.

ВЫВОДЫ

1. Изменения клеточной пролиферации при ПТЗК заключаются в ее резком угнетении во всех герминативных областях мозга сразу после первой субконвульсивной инъекции ПТЗ, а затем в постепенном росте числа пролиферирующих клеток по мере усиления судорожной активности.

2. Нейродегенеративные изменения в гиппокаме крыс наблюдаются лишь на поздних этапах ПТЗК, поэтому нейродегенерация не может быть причиной, влияющей на интенсивность пролиферации клеток в начале ПТЗК.

3. Снижение интенсивности пролиферации в герминативных зонах, наблюдающееся после однократного введения ПТЗ в субконвульсивной дозе, сопровождается выраженными изменениями поведения: повышенной тревожностью, сниженной исследовательской и моторной активностью. Это позволяет предположить участие стрессорных механизмов в подавлении пролиферации клеток в мозге крыс на ранних этапах ПТЗК.

4. Развитие ПТЗК сопровождается усилением нейрогенеза в гиппокампе. С учетом предшествующего уменьшения интенсивности пролиферации это позволяет говорить о сдвиге от пролиферации клеток-предшественников к их нейрональной дифференцировке.

5. При развитии ПТЗК отмечаются долговременные сдвиги в функционировании нитрергической системы в различных отделах мозга, таких как кора больших полушарий, гиппокамп, мозжечок. В гипокампе уменьшение числа нитрергических клеток совпадает по времени с усилением клеточной пролиферации на поздних этапах ПТЗК.

6. Выраженная судорожная активность в модели ПТЗ-индуцированного эпилептического статуса сопровождается усилением клеточной пролиферации во всех герминативных областях мозга крысы.

7. Крысы, перенесшие пренатальную гипоксию, характеризуются сниженной интенсивностью клеточной пролиферации в гиппокампе.

8. Во всех изученных моделях изменения нитрергической системы и клеточной пролиферации в гиппокампе противоположны по направленности, что может свидетельствовать об участии NO в подавлении пролиферации клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аниол В.А., Степаничев М.Ю. Окисд азота (II) и гамма-аминомасляная кислота как регуляторы нейрогенеза в мозге взрослых млекопитающих при моделировании судорожной активности. // Нейрохимия. 2007. Т. 24. № 3. С. 279-289.

2. Aniol V.A., Yakovlev A.A., Stepanichev M.Y., Lazareva N.A., Gulyaeva N.V. Pentylenetetrazole influences cell proliferation rate in the rat brain. // FENS Abstr., 2008. V.4. 150.1.

3. Аниол В.А., Яковлев А.А., Степаничев М.Ю., Лазарева Н.А., Гуляева Н.В. Влияние пентилентетразола на интенсивность пролиферации клеток в мозге крысы. // Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга. Конф. с междунар. участием. Спб. 2008. Тез. докл. С. 9-10.

4. Аниол В.А., Яковлев А.А., Степаничев М.Ю., Лазарева Н.А., Гуляева Н.В. Развитие пентилентетразолового киндлинга у крыс сопровождается увеличением экспрессии даблкортина в гиппокампе. // Нейрохимия. 2009. Т. 26. № 3. С. 1-5.

5. Степаничев М.Ю., Аниол В.А., Гуляева Н.В. Нейрогенез при экспериментальных церебральных патологиях. // Гиппокамп и память: норма и патология. Всероссийская конференция с международным участием. Пущино. 2009. Тез. докл. С. 52-53.

6. Stepanichev M., Aniol V., Popova M., Yakovlev A., Lazareva N., Gulyaeva N. Changes in cell proliferation and differentiation in rat brain during pentylenetetrazole kindling. // J. Neurochem. 2009. V. 110 (Suppl. 1). P. 53-54.

Размещено на Allbest.ru