Размещено на http://www.allbest.ru/

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЙ СТРЕПТОКОККОВЫЙ ГЛОМЕРУЛОНЕФРИТ И МИОКАРДИТ: РОЛЬ IgG Fc-СВЯЗЫВАЮЩИХ БЕЛКОВ В ИХ ИНДУКЦИИ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

ГАВРИЛОВА Елена Анатольевна

Санкт-Петербург 2007

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН.

Научный руководитель: доктор медицинских наук Бурова Лариса Александровна

Научный консультант: доктор биологических наук Пигаревский Петр Валерьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Назаров Петр Григорьевич

доктор медицинских наук, профессор Тотолян Арег Артемович

Ведущая организация: ФГУ «НИИ детских инфекций Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита диссертации состоится «__19__»__февраля___2007 года в « 13 » часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.01 при ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН (197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12).

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН.

Автореферат разослан «_9_»__января___2007 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук Бурова Л.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Стрептококки группы А (Streptococcus pyogenes) относятся к наиболее распространенным возбудителям постинфекционных поражений сердца и почек. Ревматическое поражение сердца и острый постстрептококковый гломерулонефрит - это тяжелые иммунопатологические заболевания, поражающие в основном детский и юношеский контингент. Часто эти нозологические формы протекают остро, но имеет тенденцию к хроническому течению, что может приводить к глубокой инвалидизации больных. Поэтому изучение патогенеза стрептококковых осложнений иммунопатологического характера сохраняет свою актуальность не только для практического здравоохранения, но и для медицинской науки.

Несмотря на многочисленные экспериментальные и клинические исследования, данные о патогенезе указанных заболеваний нельзя считать исчерпывающими (Артем А.Тотолян и Л.А.Бурова, 2001; Stevens D.L., 2000; Cunningham M.W., 2000, 2004). В основе их патогенеза в качестве факторов, инициирующих иммунопатологические поражения, наиболее часто рассматриваются следующие: а) перекрестно-реагирующие антигены микроба (стрептококка группы А) и тканей организма хозяина (почки, сердце); б) поверхностные белки стрептококковой клетки, способные взаимодействовать с Fc фрагментом молекулы IgG хозяина, так называемые стрептококковые IgG Fc-связывающие белки семейства М протеинов. Исследованиями, проведенными в Отделе молекулярной микробиологии ГУ НИИЭМ РАМН, была выявлена биологическая активность IgG Fc-связывающих белков стрептококков группы А, заключающаяся в их способности влиять на вирулентность микроба в опытах in vivo, способствовать устойчивости микроба к фагоцитозу, истощать систему комплемента, индуцировать синтез антииммуноглобулинов при введении экспериментальным животным (Л.А.Бурова, В.А.Нагорнев и др., 1999). Эти данные легли в основу выдвинутой концепции о механизмах развития экспериментального стрептококкового гломерулонефрита и миокардита, нашедшей подтверждение в ряде выполненных впоследствии исследований (Артем А.Тотолян, Л.А.Бурова и др., 2001, 2003). В экспериментах деструктивно-дегенеративный процесс в миокарде и в почечных клубочках обычно развивался между 4-й и 8-й неделями от начала введения кроликам стрептококковых клеток. Вызывался процесс исключительно IgG Fc-позитивными, но не IgG Fc-негативными штаммами стрептококков группы А. При экспериментальном воспроизведении гломерулонефрита микробами, обладающими другими типами IgG Fc - связывающих белков, он развивался крайне редко при использовании стрептококков серологической группы G и отсутствовал при введении кроликам Staphylococcus aureus. Экспериментальные данные позволили оценить IgG Fc-связывающие белки стрептококков группы А в качестве инициирующих факторов, ответственных за иммунное воспаление и деструктивные изменения в сердечной и почечной тканях. Настоящая работа является логическим продолжением проводимых в Отделе молекулярной микробиологии исследований по доказательству способности IgG Fc-связывающих белков индуцировать экспериментальные иммунопатологические процессы в почечной и сердечной тканях для уточнения их патогенетических механизмов.

Цель работы заключалась в получении доказательств патогенетической роли стрептококковых IgG Fc-связывающих М подобных белков в инициации экспериментальных иммунопатологических процессов.

Задачи исследования:

1. Дать сравнительную оценку экспериментальных моделей изучения патогенеза стрептококкового гломерулонефрита, для этого:

- адаптировать на кроликах «мышиную» модель стрептококкового гломерулонефрита с использованием подкожно имплантированных тканевых камер;

- исследовать способность стрептокиназы в опытах in vitro трансформировать плазминоген различной видовой специфичности в плазмин.

2. Исследовать способность изогенных мутантов стрептококка группы А типа М22, дефицитных по генам (emm и mrp), ответственным за синтез стрептококковых IgG Fc - связывающих М подобных белков, индуцировать экспериментальный гломерулонефрит и миокардит у кроликов.

3. Изучить способность стрептококков группы А типа М12 связывать иммунные комплексы и определить роль подобного связывания в индукции экспериментального гломерулонефрита.

4. Исследовать способность Fc фрагментов IgG блокировать развитие у кроликов стрептококкового гломерулонефрита.

5. Определить роль стрептококковых IgG Fc-связывающих М подобных белков в индукции иммунного воспаления в миокарде и развитии экспериментального миокардита.

Научная новизна и теоретическая значимость работы. Впервые получены данные по сравнительной характеристике двух экспериментальных моделей стрептококкового гломерулонефрита. С этой целью «мышиная» модель с подкожно имплантированными тканевыми камерами была адаптирована к использованию на кроликах. Было установлено, что:

- высокая летальность кроликов при введении им «живых» клеток высоко вирулентного стрептококка типа М1 ограничивает использование более широкого набора штаммов стрептококков в экспериментах по исследованию их «нефритогенной» потенции;

- создание локального очага инфекции в подкожно имплантированных тканевых камерах позволяет делать акцент в основном на роли экстрацеллюлярных продуктов микробной клетки, и не оценивает роль основных факторов патогенности стрептококков, к которым в первую очередь следует отнести IgG Fc-связывающие М подобные белки.

Таким образом, модель экспериментального гломерулонефрита, разработанную в Отделе молекулярной микробиологии, можно считать более адекватной патологии человека.

Введение стрептококков группы А типов М1 и М22 и их ska^- изогенных мутантов в тканевые камеры не выявило роли стрептокиназы в индукции гломерулонефрита у кроликов, так как: а) не было установлено разницы в «нефритогенной» активности между исходными штаммами и их ska^- изогенными мутантами; б) стрептокиназа из указанных штаммов стрептококков не обладала способностью трансформировать плазминоген кролика в плазмин.

Впервые исследована способность стрептококков группы А типа М12, референс-штамма и клинических изолятов, выделенных от больных с острым постстрептококковым гломерулонефритом, взаимодействовать с искусственно-образованными иммунными комплексами. Только клинический изолят, также как и референс-штамм, связывающие в опытах in vitro иммунные комплексы, были способны при введении кроликам индуцировать деструктивно-дегенеративные изменения в почечной ткани, характерные для мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита.

Впервые показана способность Fc фрагментов IgG кролика и человека, но не Fab фрагментов IgG, введенных животным на начальной стадии экспериментального гломерулонефрита, блокировать его дальнейшее развитие. стрептококковый миокард белок воспаление

Впервые получены генетические доказательства роли IgG Fc-связывающих М подобных белков Emm22 и Mrp22 в инициации и развитии поражений почечных гломерул и миокарда.

Работа носит экспериментально-теоретический характер. Проведенные исследования являются вкладом в изучение общих патогенетических механизмов иммунопатологических процессов стрептококковой этиологии. Полученные данные доказывают ведущую роль IgG Fc-связывающих М подобных белков в патогенезе экспериментальных гломерулонефрита и миокардита.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Исследование патогенетических механизмов развития иммунопатологических процессов стрептококковой этиологии зависит от выбора оптимальной экспериментальной модели, наиболее адекватной патологии человека.

2. «Нефритогенная» активность IgG Fc-негативных стрептококков группы А типа М12 обусловлена их способностью связывать иммунные комплексы. Только штаммы, связывающие иммунные комплексы, были способны индуцировать гломерулонефрит у кроликов.

3. Введение кроликам Fc фрагментов гомологичного или гетерологичного IgG на ранних этапах развития патологического процесса в почечной ткани, обусловленного стрептококком группы А, приводило к подавлению проявлений деструктивно-дегенеративных изменений в почечных гломерулах.

4. Использование изогенных мутантов стрептококка группы А типа М22, дефицитных по генам, ответственным за экспрессию IgG Fc-связывающих М подобных белков, показало, что для индукции экспериментального гломерулонефрита и миокардита у кроликов достаточно наличия одного из двух генов (emm или mrp), контролирующих синтез соответствующих IgG Fc-связывающих белков. Изогенный мутант, полностью лишенный обоих указанных генов, был не способен индуцировать патологический процесс в почечной и сердечной тканях.

Личный вклад автора в проведение исследований: все препараты, их очистка, схемы введения, а также работа с экспериментальными животными были выполнены лично автором. Иммуноморфологические исследования были выполнены в сотрудничестве с гистологами. Вклад остальных соавторов состоял в предоставлении ряда необходимых реактивов и финансовой поддержке при выполнении экспериментального раздела данной работы.

В работе были использованы штаммы стрептококков группы А из коллекции WHO Streptococcal reference laboratory (National Institute of Public Health, Прага, Чешская республика); 21 штамм стрептококка типа М12 из коллекции д-ра J. Sramek (National Institute of Public Health, Прага, Чешская республика); штамм типа Т27 (SF40) из коллекции Department of Medical Microbiology, Dermatology and Infection (Lund University, Лунд, Швеция). Штамм типа М22 AL168, выделенный от больного острым фарингитом, и его изогенные мутанты: AL168 emm^- mrp^-, AL168 emm^-mrp⁺, AL168 mrp^-emm⁺ были получены от Dr. A.Thern (Department of Laboratory Medicine, Lund University, Лунд, Швеция). Изогенные мутанты ska^- стрептококков группы А типов М1, М12 и М22 были получены от д-ра U.Sjobring (Department of Medical Microbiology, Dermatology and Infection, Lund University, Лунд, Швеция).

Стрептококковые штаммы хранили в замороженном состоянии в среде Todd-Hewitt с 20% эмбриональной телячьей сыворотки при -70⁰С. Для культивирования микробов использовали среду Todd-Hewitt (фирмы Difco, США и фирмы Hi-Media, Индия).

В исследованиях по конструированию иммунных комплексов были использованы высокоочищенная пероксидаза из корня хрена (тип 1, Sigma, США) и кроличий IgG против пероксидазы, выделенный из соответствующей иммунной сыворотки (Dako, Дания); столбнячный токсоид (SBL Vaccin, Швеция) и антистолбнячный IgG человека (Tetagam, Behrindwerke AG, Marburg, Германия).

Для выделения Fc и Fab фрагментов IgG кролика и человека использовали переваривание IgG папаином с последующей очисткой на аффинной колонке с Sepharose-4B-протеин G и гельфильтрацией на колонках с Superdex -75 (H.Friemel, 1987). Очищенные миеломные препараты IgG и его подклассов, IgA, IgМ, IgD человека были получены от д-ра А.Grubb (Лундский Университет, Швеция).

Нормальный IgG кролика был приготовлен из пула сывороток от здоровых животных очисткой гельфильтрацией на колонке с Sephacryl S-300 и аффинной хроматографией на колонке с Sepharose 4B-протеин G (Pharmacia, Швеция).

В опытах по моделированию стрептококкового иммунопатологического процесса использовали кроликов весом 2,0-2,5 кг, которые были получены из питомника лабораторных животных РАМН «Рапполово». ГУ НИИЭМ РАМН имеет разрешение на работу с животными (Animal Welfare Assurance # A5243-01). Инкубация стрептококков, температурная обработка и отмывание клеток проводились по ранее разработанной методике (L.A.Burova et al., 1992). Окончательная концентрация клеток составляла 10⁹ колониеформирующих единиц (КФЕ) в 1 мл.

Для тестирования IgG Fc-связывающей активности стрептококков применяли:

- радиоиммунологический метод (Burova L.A. et al., 1992), при постановке которого IgG Fc-связывающую активность бактериальных клеток определяли по их способности связывать поликлональный IgG человека (фирмы Kabi (Швеция), меченый ¹²⁵I. Йодирование препаратов IgG человека проводили с использованием ¹²⁵I производства радиохимического центра Amersham (Англия) и объединения «Изотоп» (Россия) по методу Greenwood F.C. с соавторами (1963);

- иммуноферментный анализ (колоние-блотинг) проводили с использованием нитроцеллюлозных мембран, на которые переносили исследуемые колонии стрептококков. После отмывания мембраны в блокирующем буфере с добавлением 0,1% Tween-20 нитроцеллюлозную мембрану разрезали на полоски и каждую из полосок инкубировали с соответствующими иммунными комплексами, антителами и антигенами, входящими в состав комплекса или с использованием пероксидаза-антипероксидаза (PAP) системой производства Dako (Дания). В качестве субстрата применяли 4-chloro-1-naphtol с добавлением 0,018% Н2О2.

Уровень антииммуноглобулинов в сыворотках животных определяли в реакции пассивной гемагглютинации с эритроцитами человека (группа 0, Rh+), сенсибилизированными анти-резусной (анти-Rh) сывороткой (R.Grubb et al., 1984). Полиспецифическая анти-Rh сыворотка (Ripley) была получена от д-ра R. Grubb (Department of Medical Microbiology, Dermatology and Infection, Lund University, Лунд, Швеция), а также из Центра по изосеродиагностике (Нижний Новгород, Россия).

Подготовку тканевых срезов к иммуноморфологическому анализу и электронной микроскопии^* проводили в соответствии с рекомендациями Угрюмова М.В. (1991). Тканевые срезы анализировали в микроскопе Axiomat (Opton) при увеличениях от 100 до 1100 и в электронном микроскопе JEM 100B при 75 µV.

В иммуноморфологических исследованиях использовали: кроличью сыворотку к С3 компоненту комплемента человека, перекрестно-реагирующую с С3 кролика, (Dako, Дания); поликлональные козьи антитела к TNF- кролика (AMS Biotechnology, США); поликлональные мышиные антитела к IL-1 кролика и поликлональные козьи антитела к IL-6 человека (Biosource Internetional, США); моноспецифические антисыворотки к IgG кролика, к IgG козы и к IgG мыши, меченые пероксидазой, (Sigma, США).

Для получения плазминогена использовали свежевыделенную плазму человека, кролика или мыши с добавлением ингибиторов (1М benzamidin chloride и 0,5M trasolyl фирмы Sigma, CША). Отцентрифугированную в течение 1 часа при 4⁰С и 20000 х g плазму смешивали с Lysine-Sepharose- 4B (Amersham Pharmacia Biotech) и смесь инкубировали при 4⁰С в течение двух часов. Затем смесь переносили на колонку, которую обрабатывали согласно рекомендациям производителя. В качестве элюанта использовали 0,2 М раствор е-аминокаприловой кислоты (Sigma, США). Фракции, содержащие плазминоген, идентифицировали в 10% SDS электрофорезе в полиакриламидном геле.

Тест по определению функциональной активности стрептокиназы проводили следующим

образом: к 2 мкл препарата коммерческой стрептокиназы С (Streptase, Sigma) в концентрации 1

мг/мл добавляли 10 мкг выделенного очищенного плазминогена человека, кролика или мыши.

Смесь инкубировали в течение 1 часа при 37⁰С. К концу срока инкубации в смесь добавляли

^*Подготовка, обработка и микроскопия тканевых срезов были проведены в лаборатории атеросклероза им. Н.Н.Аничкова Отдела биохимии ГУ НИИЭМ РАМН под руководством доктора биологических наук П.В.Пигаревского и при участии кандидата биологических наук В.Г.Селиверстовой.

хроматогенный субстрат S-2251 (Chromogenix). Инкубацию смеси продолжали дополнительно еще 1 час, после чего определяли оптическую плотность раствора при л=405 нm. При тестировании образцов стрептокиназы с Hi-Trap аффинной колонки к элюатам стрептокиназы в объеме 5, 10 или20 мкл добавляли 10 мкг плазминогена человека, кролика или мыши. Остальные этапы были аналогичны описанным выше.

Для выделения стрептокиназы из стрептококков типов М1, М12 или М22 использовали пролонгированную инкубацию микробов в среде Todd-Hewitt c 2% дрожжевого экстракта. Сконцентрированный с помощью РМ-10 мембран (Amicon) культуральный супернатант был нанесен на Hi-Trap NHS-активированную аффинную колонку, конъюгированную с плазминогеном человека, согласно рекомендациям производителя (Amersham Pharmacia Biotech). Для элюции использовали 0,1 М раствор глицина рH 2,0. Каждая фракция с наивысшим показателем оптической плотности при л=280 нм была исследована в вестерн-блотинге на наличие стрептокиназы. Продукцию стрептокиназы в культуральном супернатанте определяли ее осаждением 10% раствором трихлоруксусной кислоты. После центрифугирования и перемешивания образцы исследовали в 10% SDS электрофорезе в полиакриламидном геле.

Вестерн-блотинг по выявлению стрептокиназы включал следующие этапы: SDS электрофорез в полиакриламидном геле осуществляли по методике, описанной D.M. Nerville (1971). Для электропереноса использовали polyvinyl difluoride (PVDF) мембраны согласно методике H.Tombin с соавторами (1979). После электропереноса PVDF мембраны помещали в блокирующий буфер, содержащий 0,25% Tween-20 и 0,25% желатины. Затем мембраны инкубировали с моноклональными антителами к стрептокиназе, разведенными 1:1000 в блокирующем буфере. После отмывания к мембране добавляли ¹²⁵I-протеин G в концентрации 200000 cpm/мл. Отмытую и высушенную мембрану помещали в phospho-imager кассету. Радиоактивность определяли с помощью компьютерной программы STORM840 Phosphor Screen. При исследовании фракций с аффинной Hi-Trap колонки на наличие стрептокиназы образцы после их нейтрализации до рН 7,0-7,2 наносили в лунки 10% SDS-полиакриламидного геля.Статистическая обработка данных. Результаты экспериментов выражали как среднее ошибка среднего. Статистическую обработку данных проводили с помощью программы STATISTICA 6.0. Сравнение групп проводили тестом кси-квадрат.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Сравнительная оценка экспериментальных моделей изучения патогенеза острого стрептококкового гломерулонефрита

На сегодняшний день общепризнанными можно считать две модели экспериментального стрептококкового гломерулонефрита, используемые для исследования его патогенетических механизмов: «мышиную» модель, основанную на ведущей роли стрептокиназы в индукции почечных поражений с использованием подкожно имплантированных тканевых камер (S.E.Holm, 1990, A. Nordstrand et al., 1996, 1998, 1999), и «кроличью» модель, разработанную в Отделе молекулярной микробиологии ГУ НИИЭМ РАМН и основанную на инициирующей роли стрептококковых IgG Fc-связывающих М подобных белков в развитии патологического процесса в почечной ткани животных (Артем А.Тотолян и Л.А.Бурова, 2001, L.A.Burova et al., 1998).

На мышах была разработана модель с имплантированными подкожно тканевыми камерами, куда вводили «живую» культуру стрептококков группы А, способных продуцировать стрептокиназу. У кроликов для инициации гломерулонефрита использовали многократные внутривенные инъекции суспензии убитых микробных клеток, сохранивших поверхностные IgG Fc-связывающие белки. Но поскольку стрептококки группы А не обладают способностью связывать мышиный IgG (E.Myhre, 1977, 1981), было решено, что более целесообразно адаптировать «мышиную» модель экспериментального гломерулонефрита к кроликам. В последнем случае сохранялась как активность стрептококковых IgG Fc -связывающих белков, так и биологическая активность продуцируемой клетками стрептокиназы.

Сетчатые стальные камеры цилиндрической формы были изготовлены в мастерской Университета Умео (Швеция) по аналогии с камерами, используемыми для имплантации мышам. Операции по подкожному имплантированию четырех камер каждому кролику весом 3,5 - 4,0 кг с соблюдением условий обезболивания животных и стерильности были проведены под контролем и с участием специалиста - ветеринара, научного сотрудника ГУ НИИЭМ РАМН Восканьянц А.Н. Через 4 недели после операции, снятия швов и при условии полного заживления кожных разрезов, а также отсутствия какого-либо воспалительного процесса в области имплантата, в камеры были инъецированы суспензии стрептококков группы А типов М1, М22 и их ska^- мутантов, лишенных способности продуцировать стрептокиназу. Характеристика вводимых штаммов стрептококков представлена в таблице 1. Как следует из таблицы, исходные штаммы стрептококков, также как и их ska^- мутанты, использованные для введения кроликам, связывали IgG человека и кролика и практически не связывали IgG мыши.

В камеры вводили стрептококки, инкубированные в жидкой питательной среде до экспоненциальной фазы роста, в разведении: 10⁷ КФЕ/мл для исходных штаммов и 10⁸ КФЕ/мл для мутантных штаммов. Высокая концентрация мутантных штаммов по сравнению с исходными штаммами обусловлена их более длительной инициальной фазой роста. Стрептококки высевали из тканевых камер до 11-го дня с момента инфицирования кроликов с максимумом на 3-ий день от начала введения микробов. В этот период была зафиксирована наибольшая летальность кроликов, не зависящая от вида введенного стрептококка: исходный штамм М1 или М22 или их изогенные ska^- мутанты. На 14-ый день от начала инфекции из тканевых камер выживших

Таблица 1

Характеристика штаммов стрептококков группы А, использованных в экспериментах на кроликах с имплантированными тканевыми камерами

^а наличие стрептокиназы выявляли в культуральных супернатантах, осажденных 10% трихлоруксусной кислотой, с помощью вестерн-блотинга.

животных стрептококк не высевался. На 16-ый день после инъекции микробов всем кроликам был введен внутримышечно бензилпенициллин в количестве 10 мг на 1 кг веса кролика. На 21-ый день после инициации инфекции все опытные кролики были обескровлены и у них были взяты почки для иммуноморфологического и гистологического анализа. Всего были прооперированы для подкожной имплантации тканевых камер 30 кроликов. Суммарные результаты по трем сериям экспериментов представлены в таблице 2. Как следует из таблицы, при моделировании экспериментального гломерулонефрита у кроликов с имплантированными тканевыми камерами отмечена высокая летальность животных, связанная как с невозможностью по условиям эксперимента использовать антибиотики до тех пор, пока стрептококки высевались из камер, так и, по-видимому, с вирулентными и токсическими свойствами вводимых стрептококков, более выраженными у стрептококков типа М1. И хотя «мышиная» модель стрептококкового гломерулонефрита может быть воспроизведена на кроликах, однако, данными опытами не удалось подтвердить концепцию о ведущей роли стрептокиназы в индукции экспериментального гломерулонефрита, так как не было выявлено разницы в инициации гломерулонефрита исходными штаммами и их ska^- изогенными мутантами. Мутантные штаммы, дефицитные по гену, ответственному за экспрессию стрептокиназы, но сохранившие способность связывать IgG кролика и человека, обладали способностью вызывать деструктивно-дегенеративные изменения в почечной ткани, характерные для мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита.

Основу концепции о ведущей роли стрептокиназы в патогенезе гломерулонефрита (согласно работам S.Holm с соавторами, 1990, 1998, 1999) составляет способность данного фермента трансформировать плазминоген в плазмин, активирующий систему комплемента и приводящий к депозиции С3 компонента комплемента в почечных клубочках и, в сочетании с продукцией провоспалительных цитокинов, - к формированию иммуновоспалительной реакции в почечной ткани. Исходя из этого, в данном исследовании была предпринята попытка исследовать

Таблица 2

Индукция экспериментального гломерулонефрита у кроликов при введении стрептококков типа М1 или М22 и их ska^- мутантов в имплантированные подкожно тканевые камеры

^а Кролики, у которых при гистологическом и иммуноморфологическом анализе почечной ткани были выявлены четкие морфологические изменения, характеризующие развитие иммунного воспаления и мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита.

способность стрептокиназы, выделенной из стрептококков группы А, трансформировать плазминоген различного видового происхождения (человека, кролика и мыши) в плазмин.

Для выделения стрептокиназы использовали стрептококки типов М1, М12 или М22. Все три М типа стрептококков были активными в отношении продукции стрептокиназы, но наибольшей активностью обладали стрептококки типов М1 и М22. Стрептокиназа, выделенная из стрептококков этих М типов, в опытах in vitro показала четко выраженную функциональную активность в отношении только плазминогена человека, трансформируя его в плазмин (показатели оптической плотности при л=405 нм составляли 0,4-0,7 в сравнении с отрицательным контролем: < 0,001). Стрептокиназа не способна была активировать мышиный плазминоген (показатели оптической плотности равнялись 0,001). В отношении кроличьего плазминогена можно было отметить лишь незначительное превышении показателей оптической плотности (0,002), что было оценено как тенденция к активации кроличьего плазминогена в плазмин.

На основании полученных данных трудно объяснить механизм индукции стрептокиназой экспериментального гломерулонефрита у мышей и кроликов. Вопрос о роли стрептокиназы в патогенезе гломерулонефрита у мышей нельзя считать полностью решенным, на что указывают и S.Holm с соавторами.

Таким образом, полученные в данном исследовании результаты свидетельствуют в пользу второй, «кроличьей» модели экспериментального стрептококкового гломерулонефрита как более адекватной по своим конечным проявлениям патологии человека. Следует отметить, что в этой модели используются микробные клетки, сохранившие основные поверхностно локализованные факторы патогенности микроба - IgG Fc-связывающие белки, а дробные и длительные их инъекции способствуют накоплению и генерализации данных белков в организме кролика.

2. Роль стрептококковых IgG Fc-связывающих М подобных белков (Emm22 и Mrp22) в инициации экспериментального гломерулонефрита

Целью данного исследования было изучение способности изогенных мутантов стрептококка группы А, лишенных генов, ответственных за синтез IgG Fc-связывающих М подобных белков, индуцировать экспериментальный гломерулонефрит у кроликов. В экспериментах были использованы клинический изолят стрептококка типа М22 (штамм AL168) и его изогенные мутанты, дефектные по двум или одному из fcr-генам, ответственным, соответственно, за экспрессию Mrp и Emm белков (AL168 emm^- mrp⁺, AL168 mrp^- emm⁺ и AL168 emm^-mrp^-).

Почечная ткань от экспериментальных кроликов была исследована на депозицию IgG и С3 компонента комплемента. У большинства кроликов (у 16 из 19 животных), инъецированных исходным штаммом стрептококка М22 (AL168) и изогенными мутантами (AL168 mrp^-emm⁺ или AL168 mrp⁺emm^-) констатировали депозицию на базальной мембране клубочков IgG и С3 компонента комплемента. У этих же кроликов была отмечена продукция мезангиальными и эндотелиальными клетками провоспалительных цитокинов: TNF-б, IL-1Я и IL-6. В то же время, ни у одного из 4-х кроликов, получивших инъекции двойного мутанта (AL168 mrp^-emm^-), не было выявлено продукции цитокинов и депозиции IgG и С3 компонента комплемента (таблица 3).

У всех четырех кроликов, получивших инъекции исходного штамма AL168, были выявлены выраженные деструктивно-дегенеративные клубочковые изменения, затрагивающие базальную мембрану и интракапиллярные структуры. Наблюдаемые локальные утолщения клубочковой базальной мембраны и интенсивную пролиферацию мезангиальных клеток можно было классифицировать как мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит. Аналогичные патологические изменения отмечались и в почечной ткани кроликов, получивших инъекции изогенных мутантов AL168 mrp^-emm⁺ или AL168 mrp⁺emm^-. Ни у одного из кроликов, получивших инъекции изогенного мутанта AL168 mrp^-emm^-, не было обнаружено дегенеративных изменений в почечной ткани на различных сроках забора тканевого материала. В процессе инъекций у 16 из 19 кроликов, получивших инъекции штаммов AL168, AL168 mrp^-emm⁺ или AL168 mrp⁺emm^-, но ни у одного из 4-х кроликов, инъецированных двойным мутантом AL168 mrp^-emm^-, были выявлены циркулирующие анти-IgG. Следует отметить, что анти-IgG не были обнаружены у двух кроликов после 6-ти недель и у одного кролика после 8-ми недель инъекций изогенного мутанта AL168 mrp⁺ emm^-. Возможно, это связано с разной специфичностью связывания Emm и Mrp белков, продуцируемых соответствующими изогенными мутантами.Была отмечена выраженная статистически достоверная корреляция между выявляемыми титрами анти-IgG и развитием стрептококкового гломерулонефрита. Картина мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита была отмечена только у тех кроликов, у которых титры анти-IgG в реакции пассивной гемагглютинации были равны или превышали разведение 1:80.

Таблица 3

Способность стрептококка группы А типа М22 и его изогенных мутантов индуцировать гломерулонефрит у кроликов

^a mrp: ген, кодирующий IgG Fc-связывающий белок для IgG 1, 2, 4;

emm: ген, кодирующий IgG Fc-связывающий белок для IgG 1, 2, 3, 4.

^б мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит не был выявлен у двух кроликов, обескровленных после 6-ти недель, и у одного кролика, обескровленного после 8-ми недель инъекций.

Таким образом, получены генетические доказательства роли стрептококковых IgG Fc-связывающих белков в инициации и развитии у кроликов поражений почечных клубочков, классифицируемых как мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит. Было установлено, что для индукции патологического процесса в почечных клубочках достаточно экспрессии одного из двух поверхностных IgG Fc-связывающих белков. И хотя IgG Fc-связывающая активность каждого из мутантов: AL168 mrp^-emm⁺ или AL168 mrp+emm^- была ниже IgG Fc-связывающей активности родительского штамма AL168, деструктивные изменения, вызываемые каждым из выше перечисленных мутантов, в почечной ткани были сопоставимы с изменениями, индуцированными родительским штаммом. Разница в индукции экспериментального гломерулонефрита Emm или Mrp белками была установлена только на ранних сроках (6-ти неделях) введения соответствующих мутантов и нивелировалась к концу срока инъекций. Изогенный мутант по всем fcr-генам оказался отрицательным по «нефритогенной» потенции, так как не индуцировал синтез анти-IgG, не приводил к депозиции иммунных комплексов и С3 компонента комплемента и к продукции провоспалительных цитокинов.

Итак, данные результаты указывают на способность IgG Fc-связывающих М подобных белков - основных факторов патогенности стрептококков группы А инициировать поражение в основном за счет создания базовых условий для развития иммунного воспаления в ткани почечных клубочков. Окончательный ответ, на наш взгляд, могут дать эксперименты с очищенными IgG Fc-связывающими белками, выделенными из указанных микробов.

3. Способность стрептококков группы А типа М12 связывать иммунные комплексы и роль подобного связывания в индукции экспериментального гломерулонефрита

В последнее время от больных с острым постстрептококковым гломерулонефритом и от носителей часто выделяются штаммы стрептококка типа М12 (R.Creti, 2006; J.Papaparaskevas et al., 2006). Следует подчеркнуть, что стрептококки данного М типа способны взаимодействовать с агрегированным, но не с мономерным IgG человека (C. Schalen et al.,1986). В то же время, ранее проведенными работами было показано, что референс-штамм стрептококка типа М12 (1800) при введении кроликам индуцировал синтез анти-IgG, вызывал депозицию IgG и C3 компонента комплемента аналогично штаммам стрептококков серологической группы А, обладающих способностью связывать IgG человека (L.A.Burova et al., 1992). Авторы объясняли этот эффект связыванием стрептококками циркулирующих микроагрегатов аутологичного IgG, хотя допущение о значительной температурной или химической агрегации аутологичного IgG in vivo является достаточно дискуссионным. Не исключалась и способность стрептококков типа М12 связывать циркулирующие в крови иммунные комплексы.

Для уточнения механизма «нефритогенной» потенции стрептококков группы А типа М12 было выполнено исследование по изучению их способности связывать искусственные иммунные комплексы. Для этого были изучены: референс-штамм М12(1800) и 21 клинический изолят того же М типа, выделенные от больных острым постстрептококковым гломерулонефритом. Были отработаны модельные опыты по конструированию искусственных иммунных комплексов и условия их связывания микробами. Такими комплексами были: 1) пероксидаза - кроличий IgG против пероксидазы (PAP иммунные комплексы) и 2) столбнячный токсоид - антистолбнячный IgG (TAT иммунные комплексы).

Для образования растворимого PAP комплекса антитела и антиген смешивали в разных соотношениях: 1:1, 1:2, 1:4 и 2:3, используя 22,7 М растворы IgG и антигена. После осторожного перемешивания смесь для формирования иммунных комплексов оставляли на 18-20 часов при 4^оС. Для разведения иммунных комплексов использовали 0.02М цитратно-фосфатный буфер для получения рН растворов 4.0, 4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0 и 7.5. Аналогично готовили растворимые TAT комплексы с учетом молекулярного веса столбнячного токсоида и IgG человека. Для выявления способности интактных клеток стрептококков группы А связывать PAP комплексы использовали колоние-блотинг. Для выявления связывания ТАТ комплексов стрептококками использовали радиоиммунный метод с меченным ¹²⁵I столбнячным токсоидом.

В модельных опытах с использованием референс-штамма М12/1800 было установлено, что оптимальными соотношениями антител и антигена в PAP комплексах являются 1:2 и 2:3, a оптимальным для связывания комплексов является рН 5.5. Из 21 исследованного клинического изолята типа М12 только два штамма оказались отрицательными по связыванию PAP комплексов.

Для связывания ¹²⁵I-ТАТ комплексов референс-штаммом оптимальными оказались соотношение антител и антигена 1:1 и pH буфера 6.0. Большинство исследованных клинических изолятов (19 из 21) были способны связывать 30-40% ТАТ комплексов. Только один штамм 12/305 был негативным по способности связывать оба вида иммунных комплексов. Все клинические изоляты и референс-штамм не связывали нативные IgG человека и кролика (процент связывания добавленного ¹²⁵I-IgG не превышал 3.7-5.9).

Для последующих опытов по индукции экспериментального гломерулонефрита были выбраны референс-штамм М12/1800 и штамм 12/257 - положительные по связыванию PAP и ТАТ комплексов и 12/305 - отрицательный по связыванию PAP и ТАТ комплексов.

Почечная ткань от шести кроликов, которым были введены стрептококки М12/1800, М12/257 и М12/305, была подвергнута иммуноморфологическому и гистологическому исследованию. Суммарные данные по способности стрептококков типа М12 индуцировать гломерулонефрит у кроликов представлены в таблице 4. Как следует из таблицы, депозиция IgG и С3 была выявлена на базальной мембране почечных клубочков у четырех кроликов, инъецированных стрептококками М12/1800 и М12/257. У этих же кроликов отмечалась продукция мезангиальными и эндотелиальными клетками провоспалительных цитокинов: IL-1в, IL-6 и TNF-б. При трансмиссионно-электронной микроскопии почечной ткани, полученной от указанных кроликов, были выявлены интенсивные деструктивно-дегенеративные изменения, характерные для мембранозно-пролиферативного гломерулонефрита.

Таким образом, только штаммы стрептококков типа М12, обладающие способностью связывать иммунные комплексы, проявляли «нефритогенную» потенцию, вызывая развитие гломерулонефрита у подопытных кроликов. Инъекции кроликам клинического штамма М12/305, неспособного связывать иммунные комплексы, не вызывали поражений почечных клубочков. «Нефритогенная» активность стрептококковых штаммов не зависела от природы иммунных комплексов, так как в наших экспериментах для исследования связывающей активности были использованы как бактериальные (ТАТ), так и небактериальные иммунные комплексы (PAP). По-видимому, в условиях in vivo для инициации стрептококкового гломерулонефрита достаточно присутствия в организме хозяина различных иммунных комплексов, способных связываться с микробной клеткой данного М типа. По данным А.Я.Кульберга (1978), подобные иммунные комплексы и микроагрегаты IgG всегда обнаруживаются в организме человека, и их количество может повышаться как при инфекции, независимо от ее природы, так и при развитии патологического процесса, связанного с усиленной продукцией иммуноглобулинов.

Таблица 4

Способность стрептококков типа М12, референс-штамма (1800) и клинических изолятов индуцировать гломерулонефрит у кроликов

* связывания PAP комплексов: +, отсутствие связывания: -

** процент связывания ТАТ комплексов в РИА.

4. Способность Fc фрагментов IgG блокировать развитие экспериментального гломерулонефрита

В настоящем исследовании был изучен эффект подавления экспериментального гломерулонефрита у кроликов очищенными Fc фрагментами гомологичного и гетерологичного IgG. Для индукции экспериментального гломерулонефрита были использованы стрептококки группы А типа М1 (40/58). В качестве негативного контроля был использован стрептококк группы А тип T27 (SF40). В эксперименте были задействованы 20 кроликов весом 2,5-3,0 кг. Животным вводили внутривенно 10⁹ КФЕ стрептококков типа М1 в 1 мл PBS 3 раза в неделю в течение 4-х недель. Этот срок являлся стартовой точкой, когда у кроликов в результате инъекций стрептококковых клеток отмечались первые патологические изменения в почечной ткани. На этом сроке кролики были разделены на четыре группы по 4-5 животных в каждой группе (таблица 5) и начиная с 5-ой недели, кроликам на фоне инъекций стрептококка типа М1 внутривенно вводили препараты очищенных Fc, Fab фрагментов IgG в концентрации 2мг/мл или PBS (контроль) три раза в неделю в течение следующих 4-х недель. При этом одна инъекция препаратов и PBS предшествовала инъекции стрептококков, две инъекции препаратов осуществляли совместно с введением микробов. По окончании инъекций кролики были обескровлены, и почечная ткань была подвергнута гистологическому и иммуноморфологическому исследованию.

Ни у одного из кроликов, получивших инъекции стрептококка типа Т27 (SF40), не были обнаружены патологические изменения в почечной ткани (таблица 5). Напротив, у всех пяти кроликов, инъецированных стрептококком типа М1 (40/58) + PBS, были выявлены деструктивно-дегенеративные изменения, классифицируемые как мембранозно-пролиферативный гломерулонефрит. У этих же кроликов была выявлена депозиция на базальной мембране клубочков IgG и C3 компонента комплемента, а также секреция мезангиальными и эндотелиальными клетками провоспалительных цитокинов IL-1в, IL-6, TNF-б. Из пяти кроликов, получивших инъекции стрептококков М1 (40/58) и Fab фрагменты IgG кролика, у 4-х были выявлены сходные с описанными выше деструктивно-дегенеративные изменения в почечной ткани, в то время как ни у одного кролика, инъецированного Fc фрагментами IgG человека, и у 3-ех из 4-х кроликов, инъецированных Fc фрагментами IgG кролика, в комбинации с введением стрептококков типа М1 (40/58) не были обнаружены дегенеративные изменения в почечной ткани, характеризующие развитие гломерулонефрита.

Таблица 5

Влияние препаратов Fc фрагментов IgG человека или кролика на развитие экспериментального стрептококкового гломерулонефрита

У кроликов, получивших стрептококк М1 (40/58) + PBS, были обнаружены анти-IgG в титрах 1:320 - 1:640. У кроликов, получивших инъекции стрептококков М1 (40/58) + Fc и М1 (40/58) + Fab фрагменты гомологичного или гетерологичного IgG, титры анти-IgG оказались значительно выше: 1:5000 - 1:20000. Анализ специфичности данных антител в опытах абсорбции препаратами Fc, Fab фрагментами IgG и нативным IgG позволил установить, что антииммуноглобулины, выявляемые у кроликов, иммунизированных стрептококками М1 (40/58) с Fc фрагментами гомологичного или гетерологичного IgG, а также с Fab фрагментами IgG, представляли собой «смесь» анти-IgG к Fc или Fab фрагментам IgG и к полной молекуле IgG. Ни у одного из кроликов, получивших инъекции стрептококка типа Т27 (SF40), не были выявлены анти-IgG. Таким образом, данными экспериментами показано, что введение Fc фрагментов IgG человека или кролика экспериментальным животным на начальных этапах развития патологического процесса в почечной ткани, связанного с инъекциями стрептококков типа М1 (40/58), способно предупреждать дальнейшее развитие гломерулонефрита. Теоретически допустимыми являются три возможных механизма подавления деструктивных процессов в почечной ткани, обусловленных стрептококком группы А, а именно:

а) Fc фрагменты IgG блокируют IgG Fc-связывающую активность вводимых стрептококков и тем самым ингибируют синтез анти-IgG;

б) Fc фрагменты IgG связывают циркулирующие анти-IgG и тем самым препятствуют образованию иммунных комплексов и их депозиции в почечной ткани;

в) Fc фрагменты IgG блокируют тканевые и клеточные Fcг-рецепторы, препятствуя развитию иммунного воспаления и экспрессии провоспалительных цитокинов.

Инъекции препаратов Fc фрагментов IgG одновременно с введением стрептококков могут блокировать стрептококковые IgG Fc-связывающие белки, а инъекции этих фрагментов перед введением стрептококков могут приводить к нейтрализации активности анти-IgG. Определение конкретных механизмов процесса подавления стрептококкового гломерулонефрита Fc фрагментами IgG позволит разработать новый подход к профилактике и лечению данной патологии. Полученные результаты являются также и дополнительным доказательством роли стрептококковых IgG Fc-связывающих М подобных белков в индукции экспериментального гломерулонефрита.

5. Индукция миокардита у кроликов при введении им IgG Fc-положительного стрептококка группы А типа М1

При иммуноморфологических исследованиях в опытах с индукцией экспериментального стрептококкового гломерулонефрита параллельно с анализом почечной ткани исследовали и ткань миокарда. У кроликов была обнаружена депозиция IgG и С3 комплемента в сарколемме и межфибриллярных пространствах (L.A.Burova et al., 1992). Эти «находки» заставили провести более тщательный анализ сердечной ткани кроликов при различных условиях экспериментов.