18

Размещено на http://www.allbest.ru/

18

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

ФОТОХИМИОТЕРАПИЯ АТОПИЧЕСКОГО ДЕРМАТИТА

Мошнина Зоя Ивановна

14.00.11 - кожные и венерические болезни

03.00.02 - биофизика

Москва - 2007

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении

Высшего профессионального образования

«Российский Государственный Медицинский Университет»

Федерального Агентства по здравоохранению и социальному развитию

Научные руководители:

Доктор медицинских наук, профессор Бутов Юрий Сергеевич

Доктор медицинских наук, доцент Кягова Алла Анатольевна

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Баткаев Эдгем Абдулахатович

(Российская медицинская академия последипломного образования)

Кандидат биологических наук, доцент Деев Анатолий Иванович

(Российский государственный медицинский университет)

Ведущее научное учреждение:

Российский университет дружбы народов.

Защита состоится 17 сентября 2007 г. 14.00 час. на заседании диссертационного Совета К 208.072.03 при Российском государственном медицинском университете по адресу: 117997, г. Москва, ул. Островитянова, д. 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан 2 июля 2007 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

Доктор медицинских наук, профессор Хамаганова И.В.

20

Актуальность проблемы. Лечение тяжелых форм атопического дерматита (АтД) остается одной из актуальных проблем современной медицины. В основе патогенеза АтД лежит гиперактивация не только В-клеток, продуцирующих IgE, но и CD4+ Th1- или Th2-лимфоцитов (хелперов) [Кунгуров Н.В. и соавт., 2000; Сергеев Ю.В., 2002; Thepen Т. et al., 1996; Antunez C. et al., 2004; Leung D.Y.M. et al., 2004; Shimada Y. et al., 2004]. При упорном течении заболевания и резистентности к стандартным методам лечения в комплексной терапии АтД применяют методы системной иммуносупрессии, воздействующие на Т-клеточный иммунитет [Суворова К.Н., 1998; Ellis C. et al., 2003]. К этим методам относят ПУВА-терапию - комбинированное применение УФА-излучения и псораленов (фурокумаринов) [Krutmann J. et al., 2001; Schiener R. et al., 2003; Grossweiner L.I., 2005]. Структурно фурокумарины являются ароматическими трициклическими соединениями. Химическая структура некоторых из них приведена на рис.1.

Рис.1. Химическая структура псораленов.

Фотохимиотерапия (ФХТ) с псораленами может супрессировать Т-клеточный иммунитет посредством угнетения функции антиген-презентирующих клеток кожи [Gruner S. et al.,1992; Ogawa H. and Yoshiike T., 1992; Bergfelt L., 1993; Vink A.A., et al., 1997], ингибирования пролиферации Т-клеток и изменения профиля секретируемых ими цитокинов [Tokura Y. et al., 2001; Klosner G. et al., 2001; Krutmann J. et al., 2001; Uchida T. et al., 2002; Rotsztejn H. et al., 2005], а также индукции апоптоза Т-лимфоцитов [Johnson R. et al., 1996; Coven T.R. et al., 1999].

Клиническую эффективность и механизмы терапевтического воздействия ПУВА-терапии АтД с применением лекарственных препаратов, содержащих 8-метоксипсорален (8-МОП), ранее изучали, что отражено в отечественной и зарубежной литературе [Каламкарян А.А. и соавт., 1983; Скрипкин Ю. К. и соавт., 1984; Качук М.В. и Подобед Ю.И., 1985; Писаренко М.Ф., 1988; Yoshiike T. et al., 1996; Krutmann J. et al., 2001; Schiener R. et al., 2003; Uetsu N. and Horio T., 2003]. В настоящее время убедительные данные о терапевтических возможностях аммифурина - отечественного фотосенсибилизатора, содержащего 5-метоксипсорален (5-МОП), 8-МОП, 5,8-диметоксипсорален (5,8-диМОП), при ПУВА-терапии АтД отсутствуют в научной литературе.

На экспериментальной модели хронической формы АтД у мышей - реакции контактной чувствительности (КЧ) ранее было показано, что ПУВА-терапия с 8-МОП супрессирует реакцию КЧ [Kripke M.L. et al., 1983]. Однако аммифурин содержит и 5-МОП, для которого эффекты на КЧ не были изучены.

Существует предположение, что иммуносупрессия, обусловленная ПУВА-воздействием, может возникать при участии продуктов фотоокисления псораленов, образующихся в ходе фотохимической реакции [Кягова А.А., 2003; Potapenko A.Ya. et al. 1994; Kyagova А.А. et al., 1996, 1997]. Данных о биологических эффектах продуктов фотоокисления 5-МОП и 8-МОП на реакцию КЧ в литературе нет.

Указанные предпосылки определили цель и задачи настоящего исследования.

Цель работы - определить роль продуктов фотоокисления псораленов в индукции иммуносупрессорных эффектов ПУВА-воздействия и оценить клиническую эффективность аммифурина при ПУВА-терапии АтД.

Задачи исследования

1. Изучить количественный состав псораленов и их соотношение в лекарственном препарате аммифурин.

2. Исследовать в эксперименте эффект ПУВА-воздействия с 5-МОП и 8-МОП на Т-клеточный иммунный ответ in vivo в модели КЧ к 2,4-динитрофтор-бензолу (ДНФБ) у мышей.

3. Оценить влияние предварительно фотоокисленных растворов псоралена, 5-МОП и 8-МОП на реакцию КЧ к ДНФБ у мышей.

4. Изучить особенности течения АтД и оценить клиническую эффективность аммифурина при ПУВА-терапии больных со среднетяжелым и тяжелым течением АтД в разных возрастных группах.

5. Сравнить терапевтический эффект и переносимость аммифурина и оксорален-ультра при ПУВА-терапии больных АтД.

Научная новизна работы

1. Установлено, что в составе аммифурина содержится 55% 5,8-диМОП, 30% 8-МОП и 15% 5-МОП.

2. На модели КЧ у мышей впервые показано супрессорное действие ПУВА-терапии с 5-МОП и 8-МОП. Выявлено, что за супрессорное действие ПУВА-терапии могут отвечать продукты фотоокисления псораленов.

3. Показано статистически достоверное снижение индекса SCORAD после курса ПУВА-терапии с аммифурином у больных АтД. Выявлена линейная зависимость терапевтического эффекта от числа процедур. Разработанная технология проведения ПУВА-терапии с аммифурином при АтД оказалась эффективной у 89% больных. Обнаружено, что, не уступая по клинической эффективности оксорален-ультра, аммифурин обладает лучшей переносимостью при лечении больных АтД.

Практическая ценность работы. На основании результатов клинических и экспериментальных исследований разработана методика фотохимиотерапии с аммифурином больных АтД, направленная на оптимизацию терапии через супрессию Т-клеточного звена иммунитета. Быстрое развитие клинического эффекта позволило отказаться от применения системных и топических кортикостероидов в течение всего курса ПУВА-терапии с аммифурином, значительно уменьшить потребность в использовании антигистаминных препаратов и добиться продолжительной ремиссии заболевания до 6,1±1,2 мес.

Положения, выносимые на защиту

1. ПУВА-терапия с 5-МОП обеспечивает более эффективное супрессорное действие на Т-клеточный иммунный ответ in vivo, чем ПУВА-терапия с 8-МОП.

2. Иммуносупрессорный эффект ПУВА-терапии реализуется при участии продуктов фотоокисления псораленов, образующихся в ходе фотохимических реакций.

3. ПУВА-терапия с аммифурином эффективна при лечении больных АтД и значительно лучше переносится, чем таковая с 8-МОП.

Внедрение результатов исследования. Данные, полученные в ходе исследования, внедрены в исследовательскую деятельность кафедры медицинской и биологической физики РГМУ, лечебную работу дерматологической клиники НИИ медицинской биофизики МИФИ. На материале сравнительного анализа клинического эффекта ПУВА-воздействия с фотосенсибилизаторами псораленового ряда, разработан «Способ лечения атопического дерматита» (решение о выдаче патента РФ от 22.12.06, приоритетная справка от 16.03.06, заявка на изобретение № 2006108070/14 (008777)). Патент РФ по лечению АтД методом системной ПУВАтерапии с аммифурином является пособием для дерматологов.

Апробация работы. Результаты проведенных исследований доложены на 8, 9-м междисциплинарных симпозиумах «Новое в дерматовенерологии, андрологии, акушерстве-гинекологии: Наука и практика» (Москва, 20-21 марта 2003г., 18-19 марта 2004г.); научной сессии МИФИ (Москва, 24-28 января 2005г., 23-27 января 2006г.); ЙЧ Всероссийском съезде дерматовенерологов (Москва, 7-10 июня 2005г.); ЙY съезде фотобиологов России (Саратов, 26-30 сентября 2005г.); Международной научно-практической конференции, посвященной 70-летию основания НИИ кожных и венерических заболеваний Грузии (Тбилиси, 30 сентября - 1 октября 2005г.); 11-м конгрессе Европейского фотобиологического общества (Франция, 3-8 сентября 2005г.); Четвертой Московской ассамблее «Здоровье столицы» (Москва, 15-16 декабря 2005г.); обсуждены на Московском научном обществе дерматовенерологов, 1002-е заседание (20 октября 2005г.); Ученом совете НЦЗД РАМН (23 ноября 2006г.); научно-практической конференции кафедры кожных и венерических болезней ФУВ ГОУ ВПО РГМУ (11 декабря 2006г.); объединенной научно-практической конференции сотрудников кафедры медицинской и биологической физики, кафедры кожных и венерических болезней ФУВ ГОУ ВПО РГМУ (12 марта 2007г.).

Публикации. По теме диссертации опубликована 21 научная работа в центральных академических, медицинских и международных изданиях, в том числе 2 патента Российской Федерации, Методические указания для врачей Минздрава России.

Объем и структура работы. Диссертация изложена на 150 страницах машинописного текста, включает 4 схемы, 16 таблиц, 22 рисунка. Работа состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», 5 глав с результатами и обсуждением собственных исследований, раздела «Выводы». Список литературы содержит 208 цитированных источников литературы, из них 51 отечественный и 157 зарубежных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

фотохимиотерапия атопический дерматит лекарственный

Работа состоит из экспериментальных и клинических исследований. На первом этапе мы определили количественный состав псораленов в лекарственных препаратах аммифурин и оксорален-ультра, изучили действие ПУВА-те-рапии с 5-МОП и 8-МОП на Т-клеточный иммунный ответ in vivo у мышей. Экспериментальные исследования проводили на кафедрах медицинской и биологической физики и биофизики с курсом лабораторной диагностики МБФ ГОУ ВПО РГМУ.

Второй этап работы включал клиническое обследование, лечение методом ПУВА-терапии и оценку терапевтической эффективности у больных АтД, находившихся на амбулаторном лечении в дерматологической клинике «Псориаз-центр» медико-санаторного отдела Московского инженерно-физического института в период с 2001 по 2005 г.

Материалы и методы исследования

Реактивы и лекарственные препараты. В работе использовали кристаллические 8-МОП (8-метоксипсорален) («Sigma», США), 5-МОП (5-метоксипсорален) и 5,8-диМОП (5,8-диметоксипсорален) (Институт ботаники РАН, Санкт-Петербург); 2,4-динитрофторбензол (ДНФБ) («Sigma», США); таблетки аммифурина («ВИЛАР», Россия) и капсулы оксорален-ультра (ICN Pharmaceuticals, Inc., США).

Методы исследования. Спектрофотометрия, реакция КЧ к ДНФБ у мышей.

В опытах на КЧ использовали мышей линии BALB/C (самцы массой тела 18 - 20 г., возраст 8 - 10 нед.), полученных из питомника РАМН.

Реакцию КЧ к ДНФБ у мышей инициировали, как в работах [Kim T. H. et al., 1998; Уее G. K. et al., 1990], с незначительными модификациями. Эксперименты по действию ПУВА-терапии и фотоокисленных псораленов у мышей проводили на фазе разрешения реакции КЧ, т.е. после сенсибилизации животных (рис. 2).

Мышей сенсибилизировали 0,3% ДНФБ накожно. Через 120 ч. после этого животные получали или ПУВА-терапию (А), или фотоокисленные псоралены (Б). Разрешающую дозу 0,2% ДНФБ на ухо наносили через 144 ч. после сенсибилизации. Интенсивность реакции КЧ оценивали через сутки по отеку уха.



20

Рис. 2. Влияние ПУВА-терапии и фотоокисленных псораленов на реакцию КЧ у мышей

Интенсивность супрессии реакции КЧ в процентах рассчитывали по формуле: Супрессuя (в %) = [l- (Е - К?) / (К? - К?)] х l00, где Е, К? и К? отек уха у мышей в опытной группе, группах положительного и отрицательного контроля соответственно.

В клиническую группу включили 86 пациентов с АтД в возрасте от 16 до 44 лет (35 мужчин и 51 женщина).

Диагностику АтД проводили по критериям M. Hanifin, G. RaJka (1980). Критерии включения в исследования: возраст старше 16 лет, упорное персистирующее и тяжелое течение АтД, неэффективность стандартной терапии. Критерии исключения из исследования: обострение АтД в течение 3 нед., предшествующих включению в исследование, наличием стандартных противопоказаний к проведению ПУВА-терапии.

Тяжесть заболевания оценивали по шкале SCORAD. Индекс SCORAD определяли по формуле:

S=A/5+7B/2+C,

где А - распространенность кожных высыпаний; В - интенсивность каждого из 6 объективных симптомов (от 0 до 3 баллов);

С - выраженность симптомов зуда и нарушения сна (каждый 0 - 10 баллов). При числовом значении индекса SCORAD до 30 баллов клинические проявления условно считали легкими, от 30 до 60 - среднетяжелыми и более 60 - тяжелыми. Снижение индекса SCORAD от исходного до 10-12 баллов и менее расценивали как клиническое выздоровление, на 75% и более - как значительное клиническое улучшение, от 50-75% - как улучшение, менее 50% - неэффективное лечение.

У всех больных анализировали анамнез, включая аллергологический, проводили дерматологический осмотр, при необходимости назначали консультации аллерголога, терапевта, гастроэнтеролога, эндокринолога, гинеколога, для выяснения противопоказаний к проведению ПУВА-терапии. На каждого больного заполняли разработанную нами стандартизированную карту, в которую вносили фактические данные, полученные из амбулаторных карт больных, а также путем опроса пациентов. В клинико-лабораторное обследование включали общеклинические исследования - общий анализ крови и мочи, кровь на сахар, биохимические исследования гепатограммы сыворотки крови; аллергологические методы исследования - определение общего и аллергенспецифических иммуноглобулинов Е (АС-IgE); при необходимости использовали ультразвуковое исследование органов брюшной полости, исследование микробиоциноза кишечника, кала на гельминты и патогенные простейшие.

Процедуры ПУВА-терапии проводили 3 раза в неделю через день в установке УУД-1А (Россия) с использованием фотосенсибилизаторов аммифурина или оксорален-ультра для приема внутрь. Аммифурин назначали в дозе 1-1,2 мг/кг за 3 ч. до процедуры, оксорален-ультра - по 0,6-0,8 мг/кг за 2 ч. до процедуры УФА-облучения. Время облучения рассчитывали с учетом интенсивности света на поверхности тела, измеренное калиброванным фотодиодом «Waldman-UV-Meter», (Германия). ФХТ с аммифурином начинали с дозы облучения 1 Дж/см2 с последующим увеличением разовой дозы каждый сеанс на 1 Дж/см2 до максимального значения 4-5 Дж/см2 в зависимости от типа кожи. ФХТ с оксорален-ультра начинали с дозы облучения 0,6 Дж/см2 с последующим увеличением разовой дозы каждый сеанс на 0,6 Дж/см2 до максимального значения 3-3,6 Дж/см2в зависимости от типа кожи.

Статистический анализ полученных результатов проводили с использованием пакета программы «STATISTICA 6.0» для Windows XP. Достоверность различий результатов исследований между группами пациентов оценивали по ранговому критерию Вилкоксона, у мышей - по критерию Стьюдента. Различия между группами считали статистически достоверными при уровне значимости р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение состава псораленов в лекарственных препаратах аммифурин и оксорален-ультра. Известно, что в лекарственном препарате оксорален-ультра содержится 8-МОП (инструкция к препарату). В состав лекарственного препарата аммифурин входит 3 вида фурокумаринов: 8-МОП, 5-МОП, 5,8-диМОП. Однако в инструкции к аммифурину отсутствует информация о количественном содержании этих псораленов. Поэтому оценить удельный вклад каждого из них в терапевтический эффект при ПУВА-терапии не представляется возможным.

В настоящей работе изучен качественный и количественный состав псораленов в лекарственных препаратах оксорален-ультра и аммифурин. Для этого использовали метод спектрофотометрического анализа спиртовых экстрактов аммифурина, оксорален-ультра и спиртовых растворов 8-МОП, 5-МОП, 5,8-диМОП, в концентрации 10-5 М. Обнаружено, что основным и единственным хромофором, обеспечивающим поглощение препарата оксорален-ультра в ультрафиолетовой области спектра, является 8-МОП.

Результаты исследования аммифурина представлены на рис.3.



Рис. 3. Спектры поглощения этанольных растворов 5-МОП, 8-МОП, 5,8-диМОП и этанольного экстракта аммифурина.

1-Аммифурин; 2 - 5-МОП; 3 - 8-МОП; 4 - 5,8-диМОП.

Концентрации 8-МОП, 5-МОП, 5,8-диМОП в составе аммифурина рассчитывали путем решения системы уравнений с тремя неизвестными, учитывая данные спектров поглощения и значения молярных коэффициентов поглощения перечисленных псораленов (см. рис. 3).

Система уравнений:

D A 250 = 1250С1 + 2250С2+ 3250С3

D A 276 = 1276С1 + 2276С2 + 3276С3

D A 320 = 1320С1+ 2320С2+ 3320С3

где D - оптическая плотность спиртового экстракта аммифурина при 250, 276 и 320 нм соответственно; - молярный коэффициент поглощения; С - концентрация псоралена в экстракте (в молях/л), величины с индексом 1, 2 и 3 - 8-МОП, 5-МОП и 5,8-диМОП соответственно.

По нашим расчетам в аммифурине содержится 5-МОП (15%), 8-МОП (30%) и 5,8-диМОП (55%). Можно заключить, что сумма псораленов 5-МОП и 8-МОП в 1 таблетке аммифурина (20 мг) составляет 9 мг (45%). Согласно данным литературы, 5,8-диМОП не является фототоксичным по отношению к коже [Ivie G.W. and Beier R.C., 1996], 5-МОП обладает слабой фототоксичностью [McNeely W. and Goa K.L., 1998], 8-МОП оказывает ярко выраженное фототоксическое действие [Krutmann J., 2001, Grossweiner, L.I., 2005].

Таким образом, нами показано, что 70% аммифурина содержит фотосенсибилизаторы, дающие слабый фототоксический эффект.

Изучение влияния ПУВА-воздействия на реакцию КЧ к ДНФБ у мышей. Известно, что реакция КЧ протекает непосредственно в коже [Girolomoni G. и et al., 2001; Watanabe H. et al., 2002], и объектом воздействия ФХТ являются иммунокомпетентные клетки эпидермиса [Bergfelt L., 1993; Horio T., 2000], дермального инфильтрата [Владимиров В.В., 1985; Ogawa H., 1992] и периферической крови [Kraemer K. H., 1977]. Известно, что ПУВА-терапия с 8-МОП супрессирует стадию сенсибилизации (афферентную) реакции КЧ у мышей [Kripke M.L., 1983]. Может ли 5-МОП, входящий в состав аммифурина, приводить к супрессии КЧ при ПУВА-воздействии остается неясным. В этой связи мы изучили действие ПУВА-терапии с 5-МОП на КЧ у мышей и сравнили его с таковым для 8-МОП. В экспериментах (см. рис. 2) процедуры ПУВА проводили мышам на эффекторной фазе (разрешения) реакции КЧ, т.е. через 120 ч. после сенсибилизации ДНФБ.

Результаты исследований приведены на рис. 4.

Мышам за 2,5 ч. до облучения кожи спины разными дозами УФА-света (365нм,17 Вт/м2) вводили per os по 0.5 мл: а - 5-МОП (10-4М); УФА-контроль - облучали дозой 4 и 8 кДж/м2 без введения 5-МОП; б - 8-МОП (10-4М); УФА-контроль - облучали дозой 4 кДж/м2 без введения 8-МОП.

К+ (положительный контроль) и К- (отрицательный контроль) - сенсибилизированные и интактные мыши, соответственно получившие per os по 0,5 мл фосфатно-буферного раствора (PBS) с 2% этанолом. Каждый столбец - среднее для 5 животных ± SEM.



Рис. 4. Влияние ПУВА-терапия с 5-МОП (а) и 8-МОП (б) на КЧ у мышей

Обнаружено, что УФА-свет без псораленов в дозе 4 кДж/м2 ингибирует реакцию КЧ на 21%, в дозе 8 кДж/м2 - на 59%. Пероральное введение мышам 8-МОП и 5-МОП без УФА-облучения (0 кДж/м2) не влияет на уровень реакции КЧ (р>0,05 по сравнению с К+). Комбинация УФА-света как с 8-МОП, так и с 5-МОП вызывает супрессию реакции КЧ, интенсивность которой зависит от дозы облучения. При ПУВА-воздействии с 5-МОП (см. рис. 4, а) в дозе 0,5 кДж/м2 реакция КЧ ингибируется примерно на 64% (р<0,01 и р<0,05 по сравнению с К+ и группой 5-МОП (без облучения). Эффект полной супрессии КЧ вызывается уже при дозе облучения, равной 1 кДж/м2. ПУВА-воздействие с 8-МОП (см. рис. 4, б) в дозе 2 кДж/м2 также приводило к супрессии реакции КЧ, тогда как ингибирование КЧ при дозе 4 кДж/м2 составляло только 59% по сравнению с положительным контролем (р<0,05).

Таким образом, установлено, что для получения полной супрессии КЧ при ПУВА-воздействии с 5-МОП требуются в 8 раз меньшие дозы облучения по сравнению с 8-МОП. 8-МОП при дозе 4 кДж/м2 давал такой же эффект, как и 5-МОП при дозе 0,5 кДж/м2, т. е. ПУВА-воздействие с 5-МОП оказывает более выраженное иммуносупрессивное действие.

Изучение влияния фотоокисленных псораленов на реакцию КЧ к ДНФБ у мышей. Известно, что при облучении растворов псораленов in vitro УФА-светом образуются фотопродукты, которые обладают иммуносупрессивным действием in vivo [Кягова А.А., 2003]. Такой эффект был показан на реакции КЧ для предоблученных растворов псоралена и 8-МОП при их внутривенном введении животным. Неясно, обладают ли фотоокисленные 5-МОП и 8-МОП супрессорной активностью на реакцию КЧ при их пероральном введении мышам. Для ответа на этот вопрос мышам вводили per os растворы псоралена, 5-МОП, 8-МОП, облученные разными дозами УФА-света, на эффекторной фазе реакции КЧ (см. рис. 2). В ходе приготовления проб предоблученных растворов псоралена, 5-МОП, 8-МОП для введения мышам фотолиз псораленов контролировали спектрофотометрически.

Рис. 5. Супрессия реакции КЧ к ДНФБ у мышей предоблученными псораленом (Пс), 5-МОП, 8-МОП.

Растворы Пс, 5-МОП и 8-МОП (0,1мМ в PBS с 1% этанола) облучали разными дозами УФА-света (365 нм, 23 Вт/мІ) и вводили мышам per os по 0,5 мл через 120 ч. после сенсибилизации ДНФБ. В группах положительного (К+) и отрицательного (К-) контроля животным вводили по 0,5 мл PBS с 1% этанола. Каждая точка - среднее для 5 мышей ± SEM. *p<0,001 по сравнению с К+.

На рис. 5 видно, что предварительно облученные УФА-светом в диапазоне доз от 0 до 45 кДж/м2 растворы псоралена, 8-МОП и 5-МОП вызывали супрессию реакции КЧ к ДНФБ у животных, тогда как, необлученные растворы псоралена, 8-МОП и 5-МОП (0 кДж/м2) не приводили к достоверному изменению уровня реакции КЧ по сравнению с положительным контролем (р>0,05).

Интенсивность супрессии реакции КЧ зависела от дозы облучения растворов псораленов. Так, предварительно фотоокисленный псорален вызывал подавление реакции КЧ в интервале доз облучения от 27 до 45 кДж/м2. В тоже время, фотоокисленные 5-МОП и 8-МОП ингибировали реакцию КЧ уже на малых дозах предоблучения (7-9 кДж/м2).

Таким образом, выявлено, что продукты фотоокисления 5-МОП, 8-МОП и псоралена оказывают супрессорное действием на КЧ, при этом глубина супрессии КЧ зависит от количества введенных фотопродуктов. Продукты фотоокисления с иммуносупрессорными свойствами образуются быстрее в растворах 5-МОП и 8-МОП, чем таковые у псоралена, хотя фотодеградация 5-МОП и 8-МОП происходит гораздо медленнее, чем у псоралена.

Результаты исследований, приведенные на рис. 4, 5 указывают на то, что действие ПУВА-терапии с 5-МОП и 8-МОП и фотоокисленных 5-МОП и 8-МОП на эффекторную фазу реакции КЧ к ДНФБ сходно. На основании этого мы предположили, что подавление иммунного воспаления в коже при ПУВА-терапии может быть следствием протекания фотохимических реакций псораленов, осуществляющихся при участии их продуктов фотоокисления.

Клиническая характеристика пациентов. Анализ анамнеза, особенностей течения, клинических проявлений заболевания проведен у 86 больных с тяжелым и рецидивирующим течением АтД, резистентным к стандартной противоаллергической терапии. Большинство пациентов (52%) было в возрасте от 19 до 30 лет, наиболее редко (15%) заболевание встречалось у лиц старше 30 лет. Среди 28 подростков в возрасте от 16 до18 лет лиц мужского и женского пола было поровну. Наследственная отягощенность, учитывающая атопические заболевания только у родителей, выявлена у 47 (54,7%) пациентов. Дебют АтД наблюдался у 57 (66%) пациентов на 1-м году жизни, у 16 (19%) на 1-4-м году, у 13 (15%) на 10-14-м году. Период ремиссии у 62 (72%) больных составлял от 10 дней до 1 мес., у 24 (28%) - от 1 до 1,5 мес. Ухудшение состояния 60 (70%) пациентов связывали с влиянием метеоусловий (сезонность, изменение погодных условий), 42 (49%) - с погрешностями питания (употребление рыбы, шоколада, орехов, некоторых фруктов и др.), 34 (40%) - стрессами, 21 (24%) - ингаляционными факторами (контакт с пылью и/или в период цветения растений).

У всех больных диагностирована лихеноидная форма АтД. У 28 (32,5%) больных клинические проявления оценивались как тяжелые (индекс SCORAD 72,1±9,2 балла), у 58 (67,5%) - как среднетяжелые. Обширное поражение кожи было у 76 (88%) больных, ограниченное - у 10 (12%). Тяжесть поражения кожи усугублялась у 16 % больных образованием трещин, у 20% - присоединением вторичной инфекции. Поражение кожи век и хейлит отмечали у каждого 2-го больного, у каждого 3-го - застойную эритему или бледность лица. Шелушение волосистой части головы и заушные трещины встречались одинаково часто (16,3 и 15,1% соответственно). Симптомы «атопического лица» в 2 раза чаще присутствовали при тяжелом течении дерматоза.

Сопутствующая соматическая патология выявлена у 56 (65%) пациентов. Число заболеваний у каждого больного составляло 1 и более. Патология желудочно-кишечного тракта обнаружена у 37 (43%) больных, вегетативной нервной системы - у 24 (28%), дыхательной системы - у 19 (22%). У 8 (9%) пациентов АтД сочетался с псориазом, вульгарным ихтиозом, себорейным дерматитом, хроническим фурункулезом. Каждый 4-й (24%) больной страдал дермореспираторным синдромом: аллергическим ринитом 19 (23%) больных, атопической бронхиальной астмой 7 (8%).

Анализ данных общеклинических исследований выявил эозинофилию у 40% больных, оксалурию у 10%, дизбиоз кишечника у 78%. Уровень общего IgE (М±) в исследуемой группе составил 675,4±408,5 МЕ/л. У 95% (20 человек) пациентов с АтД обнаружены аллергенспецифические IgE в сыворотке крови к одному и более аллергенам. У большинства пациентов (38%) определялись антитела к 5 группам аллергенов, реже (10%) - к 3 и 1 группам. Высокий уровень общего IgE (более 500 МЕ/л) и поливалентная сенсибилизация отмечалась у больных с тяжелым АтД (индекс SCORAD - 60 и более баллов). По данным УЗИ органов брюшной полости 28 обследованных больных диагностирована дискинезия желчевыводящих путей у 19 (68%), реактивный панкреатит у 8 (29%), хронический холецистит и желчекаменная болезнь у 3 (11%). Лямблиоз обнаружен у 36%, гельминтоз - у 14%. При тяжелом течении АтД сопутствующие заболевания были у большинства (82%) пациентов, тогда как при среднетяжелом - у 58%.

Для решения поставленных задач больных распределили на клинические группы: 1-я группа - 22 пациента с тяжелым течением АтД (исходно индекс SCORAD 74,9±10 баллов), 2-я группа - 18 пациентов со среднетяжелым АтД (индекс SCORAD 46,0±7,6 балла). Больным 1-й и 2-й групп назначали системную ПУВА-терапию с аммифурином и антигистаминные препараты. В 3-й группе (12 больных) с исходным состоянием по шкале SCORAD 44,7±8,1 балла проводили моно-ПУВА-терапию аммифурином, в 4-й группе (12 больных) - ПУВА-терапию с оксораленом ультра (индекс SCORAD 54,0±13,3 балла). В контрольную группу вошли 18 пациентов. Больные получали в течение 20 дней стандартную противоаллергическую терапию, которая включала антигистаминный препарат (супрастин по 1 таблетке 2 раза в день и эриус по 1 таблетке в день), энтеросорбент (энтеросгель по 1 столовой ложке 3 раза в день и лактофильтрум 2 таблетки 3 раза в день); наружно использовали пасты и мази, содержащие нафталан; УФА-свет без фотосенсибилизатора 3 раза в неделю.

Лечение проводили на фоне гипоаллергенного режима и диеты, увлажняющих/смягчающих кожу кремов «Атодерм» («Биодерма»), «Липикар» («Ля Роше Позе»). Эффективность лечения оценивали в динамике по шкале SCORAD и раздельно по ее составляющим (интенсивность объективных показателей воспаления и зуда, площадь поражения кожи) на 1-й процедуре, после 5, 10, 15-й процедур ПУВА-терапии.

Терапевтический эффект системной ПУВА-терапии с аммифурином у больных АтД. Результаты лечения методом ПУВА-терапии могут зависеть от переносимости методики лечения, дозы УФА, дозы псораленов и их вида [Налди Л. и Рзани Б. 2003; George S.A. and Ferguson J., 1992; McNeely W. and Goa K.L., 1998]. При ФХТ АтД ранее успешно применялись лекарственные препараты, содержащие 8-МОП [Каламкарян А.А. и соавт., 1983; Uetsu N. и Horio T., 2003]. Однако убедительные данные о терапевтических возможностях аммифурина при ПУВА-терапии АтД отсутствуют. В связи с этим нами была изучена терапевтическая эффективность, оцениваемая по шкале SCORAD, и переносимость аммифурина при ПУВА-терапии АтД. Разовая доза аммифурина составляла 1,2 мг на 1кг массы тела пациента.

На первом этапе был оценен лечебный эффект аммифурина при ПУВА-терапии в 2-х группах больных с тяжелым и среднетяжелым течением АтД. Все пациенты дополнительно получали антигистаминные препараты. Пациенты группы контроля получали стандартную терапию. Результаты лечения представлены на рис.6.

На рис. 6 а видно, что ПУВА-терапия с аммифурином более эффективно подавляет клинические признаки воспаления в обеих группах по сравнению с группой контроля. Исходные показатели индекса SCORAD достоверно (р<0,01) снизились к 10-му сеансу ФХТ с 74,9±10,0 до 24,8±4,1 балла у пациентов с тяжелым течением, с 46,0±7,6 до 5,3±1,8 балла со среднетяжелым. Стандартная терапия уменьшила признаки воспаления кожи на 25% по сравнению с исходным уровнем только к концу 3-й недели (р<0,01).

Рис. 6. Динамика регресса клинических проявлений АтД при ПУВА-терапии с аммифурином

Нами установлена линейная дозовая зависимость величины индекса SCORAD от числа процедур ПУВА. Данный эффект наблюдался в интервале с 1-й по 10-ю процедуру ФХТ и не отмечен с 10-й по 15-ю в группе тяжелых больных (р>0,05). Это можно объяснить тем, что ФХТ приводит к образованию вторичной гиперпигментации кожи, субэпидермальная ткань оказывается недоступной для облучения из-за экрана меланина и, следовательно, уменьшается терапевтический эффект. Анализ динамики площади поражения (см. рис. 6, б), объективных показателей воспаления (см. рис. 6, в), и зуда кожи (см. рис. 6, г) в ходе ФХТ выявил однонаправленное снижение всех проявлений АтД в обеих группах пациентов. Регресс воспаления начинался с 5-7-й процедуры. Полный курс ПУВА-терапии способствовал более быстрому сокращению площади пораженной кожи (на 86% в 1-й группе и на 91% в 2-й группе), тогда как объективные признаки воспаления кожи и зуд регрессировали медленнее (данные показатели снизились в 1-й группе на 70 и 78%, во 2-й группе на 86 и 88% соответственно).

Сравнительные данные по итогам лечения в разных возрастных группах указывают на то, что противовоспалительное действие ПУВА-терапии с аммифурином на атопическое воспаление кожи равнозначно для взрослых и подростков (хороший результат лечения получен у 82 и 69% больных соответственно). Отмечено, что гиперемия, отечность, воспалительная инфильтрация кожи в области лица и шеи разрешались несколько менее активно у подростков по сравнению со взрослыми, зуд исчезает в этих локализациях позже, чем в других.

Таким образом, при тяжелом АтД после 15 процедур ПУВА-терапии получено клиническое выздоровление у 6 (27%), значительное улучшение - у 6 (27%), улучшение - у 4 (18%) больных. В 3 (14%) случаях эффективность лечения оценивалась как недостаточная, 3 (14%) пациентам терапию отменили после 3-го сеанса. При среднетяжелом течении заболевания клиническое выздоровление отмечалось у 15 (83%) больных, значительное улучшение - у 3 (17%). В ходе лечения обострения сопутствующих заболеваний не было. Продолжительность ремиссии составила в среднем 6,1 ± 1,2 мес.

Полученные результаты свидетельствуют о высокой эффективности метода лечения. Тем не менее, с учетом данных литературы о противоаллергическом и противовоспалительном действии антигистаминных препаратов [Коростовцев Д.С., 2002], можно предположить, что результат ПУВА-терапии мог быть улучшен при использовании супрастина и эриуса.

Оценка влияния антигистаминных препаратов на терапевтический эффект ПУВА-терапии с аммифурином при АтД среднетяжелой формы. Антигистаминные препараты являются стандартом базисной терапии АтД. Несмотря на это, их эффективность при хроническом кожном воспалении в настоящее время подвергается сомнению [Herman S. M. and Vender R. B., 2003]. Спорным также остается вопрос о необходимости применения антигистаминных препаратов при ФХТ АтД. В связи с этим нами был оценен вклад антигистаминных препаратов в терапевтический эффект ПУВА-терапии у больных со среднетяжелым течением заболевания.

Рис. 7. Эффективность моно-ПУВА-терапии с аммифурином у больных АтД.

Сплошная линия (1-я группа) - моно-ПУВА-терапия; пунктирная линия (2-я группа) - ПУВА-терапия с антигистаминными препаратами.

Суммарная доза УФА в 1-й группе (16 больных) 36,7±3,1 Дж/смІ, во 2-й (18 больных) - 30,7±4,5 Дж/смІ. Каждая точка представляет среднее ±SEM.

На рис. 7 видно, что скорость снижения индекса SCORAD не уменьшается в группе пациентов, получающих моно-ПУВА-терапию. Сравнение лечебных эффектов моно-ПУВА-терапии с аммифурином и в комбинации с антигистаминными препаратами не выявило достоверных различий динамики регресса индекса SCORAD между группами (р > 0,05). Анализ показателей изменения интенсивности объективных симптомов воспаления и зуда кожи (раздельно) в ходе лечения у больных АтД показал, что процедуры ПУВА обеспечивают равный в обеих группах (р > 0,05) противозудный и противовоспалительный эффект.

Таким образом, при ПУВА-терапии АтД средней тяжести применение системных антигистаминных препаратов нецелесообразно.

Сравнительная оценка терапевтического эффекта аммифурина и оксорален-ультра при системной ПУВА-терапии. На следующем этапе мы оценили специфичность терапевтического действия аммифурина, содержащего 5-МОП, 8-МОП и 5,8-диМОП и оксорален-ультра, состоящего только из 8-МОП, в сравнении при ПУВА-терапии АтД. Нас интересовала зависимость динамики индекса SCORAD и его составляющих от типа фотосенсибилизатора. Для этого группе пациентов с АтД была проведена ПУВА-терапии с препаратом оксорален-ультра. Результаты лечения сравнили с таковыми для аммифурина. Данные исследования представлены в табл. 1 и на рис. 8.

Таблица 1

Основные показатели лечения больных АтД методом ПУВА-терапии с различными фотосенсибилизаторами

Фотосенсибилизатор	Число больных в группе	Разовая доза препарата, мг/кг	Индекс SCORAD исходно, М±	Индекс SCORAD после лечения, М±SEM	Суммарная доза УФА (Дж/см2), М±
Оксораленультра	12	0,6-0,8	54,0±13,3	12,5±2,7	24,9±4,5
Аммифурин	12	1,2	52,4±4,4	7,0±2,2	31,8±6,6

Из табл. 1 видно, что исходно тяжесть заболевания по индексу SCORAD в обеих группах была равной. При данных дозах фотосенсибилизаторов (0,6-0,8 мг/кг для оксорален-ультра и 1,2 мг/кг для аммифурина) общие закономерности динамики индекса SCORAD (а), признаков воспаления кожи (б) и регресса зуда (в) оказались равными (см. рис. 8).

Рис.7. Динамика тяжести заболевания и симптомов воспаления кожи у больных АтД при ПУВА-терапия с аммифурином и оксорален-ультра.

По осям абсцисс - число процедур. а - тяжесть заболевания; б - выраженность кожного воспаления; в - зуд кожи.

Пунктирная линия (1-я группа, 12 больных) - ПУВА-терапия с оксорален-ультра; сплошная линия (2-я группа, 12 больных) - ПУВА-терапия с аммифурином. Каждая точка - среднее±SEM.

Лечебные эффекты оксорален-ультра и аммифурина в исследуемых группах достоверно не различались (р>0,05).

Таким образом, комбинирование УФА-света с фурокумаринами различной химической структуры оказывает сходное терапевтическое действие у больных АтД. Средняя суммарная доза УФА, необходимая для получения аналогичного лечебного эффекта на фоне приема аммифурина, на 22% выше таковой для оксорален-ультра (31,8±6,6 и 24,9±4,5 Дж/см2 соответственно, р<0,05).

Осталось неясным, какой из данных лекарственных препаратов дает меньше побочных эффектов. Для ответа на этот вопрос определили переносимость аммифурина и оксорален-ультра с учетом мнения больных и объективной оценки врачей при сравнительном обследовании 102 пациентов - 63 с АтД и 39 с вульгарным псориазом. Результаты представлены в табл. 2.

Таблица 2

Частота встречаемости побочных эффектов у больных во время лечения методом системной ПУВА-терапии в зависимости от применяемого фотосенсибилизатора

Побочный эффект	Аммифурин	Оксорален-ультра
	Число пациентов	Число пациентов
	абс.	%	абс.	%
Тошнота	2	4	14	27
Головная боль	2	4	10	20
Зуд кожи	0	0	1	2
Не выявлено	47	92	26	51
Всего	51	100	51	100

Во время лечения методом ПУВА-терапии с аммифурином побочные эффекты отмечены лишь у 8% (4 больных). Легкая тошнота и головокружение в течение непродолжительно времени наблюдались после приема фотосенсибилизатора на первых 2-3 процедурах и проходили самостоятельно. При применении оксорален-ультра 49% пациентов испытывали дискомфорт (см. табл. 2), из-за этого у 6% больных данный фотосенсибилизатор отменили.

Таким образом, переносимость лекарственного препарата аммифурин при ПУВА-терапии лучше, чем оксорален-ультра, несмотря на большую разовую терапевтическую дозу препарата (1,2 мг на 1 кг массы тела по сравнению с 0,6-0,8 мг на 1 кг масса тела). Вероятно, это обусловлено тем, что 70% аммифурина содержит фотосенсибилизаторы со слабым фототоксическим действием.

Можно заключить, что, не уступая по клинической эффективности оксорален-ультра, аммифурин лучше переносится больными при лечении АтД.

ВЫВОДЫ

1. Выявлено, что в состав лекарственного препарата аммифурин входят 3 псоралена 5-МОП (15%), 8-МОП (30%) 5,8-диМОП (55%) в соотношении 1:1,8:3,3 соответственно. Данные получены на основании спектрофотометрического анализа спиртового экстракта аммифурина, этанольных растворов 8-МОП, 5-МОП и 5,8-диМОП и решения системы уравнений для 3 неизвестных.

2. Установлено, что ПУВА-терапия с 8-МОП и 5-МОП вызывает супрессию не только афферентной, но и эффекторной фазы реакции контактной чувствительности (КЧ) у мышей. ПУВА с 5-МОП оказывает более выраженное супрессорное действие, чем ПУВА с 8-МОП. Это указывает на преимущество использования аммифурина по сравнению с 8-МОП при ПУВА-терапии АтД.

3. Обнаружено, что предварительно облученные 5-МОП, 8-МОП и псорален оказывают супрессорное действие на КЧ у мышей без УФА-облучения кожи. Это дает основание утверждать о реализации иммуносупрессорного эффекта ПУВА-терапии через стадию образования продуктов фотоокисления псораленов.

4. Анализ клинико-анамнестических данных у больных с торпидным течением атопического дерматита выявил у 65% пациентов сопутствующую соматическую патологию, при этом частота встречаемости заболеваний в группе больных с тяжелым течением была выше (82%) по сравнению с группой со среднетяжелым (58%).

В результате применения ПУВА-терапии с аммифурином у больных АтД клиническое выздоровление достигнуто у 65,5%, значительное улучшение - у 12,5%, улучшение - у 11%. Лучшие результаты получены у больных со среднетяжелым течением АтД (100%), менее выражен эффект лечения у больных с тяжелым течением (72%). Установлена линейная зависимость терапевтического эффекта от числа процедур и дозы облучения в интервале с 1-й по 10-ю процедуры фотохимиотерапии. Применение системной ПУВА-терапии у больных АтД способствует более быстрому купированию воспалительного процесса и удлинению ремиссии заболевания до 6,1 ± 1,2 мес.

5. Клиническая эффективность ПУВА-терапии с аммифурином у больных АтД сопоставима с таковой при ПУВА-терапии с оксорален-ультра. Переносимость аммифурина при ПУВА-терапии в 6 раз лучше, чем оксорален-ультра.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Мошнина З.И., Ярвелов Б.Н., Мошнин М.В. Опыт лечения атопического дерматита методом ПУВА-терапии с использованием препарата аммифурин. Вестник последипломного медицинского образования. - 2002. - № 1. - С. 40.

2. Мошнина З.И., Ярвелов Б.Н., Мошнин М.В. Лечение атопического дерматита методом ПУВА-терапии аммифурином. Вестник последипломного медицинского образования. - 2002. - № 3. - С. 27-29.

3. Мошнина З.И., Ярвелов Б.Н., Мошнин М.В.. Опыт применения препарата аммифурин в сочетании с УФА при лечении атопического дерматита. Научно-практическая конференция «Актуальные вопросы терапии инфекций, передаваемых половым путем и хронических дерматозов»: Тезисы докладов. - Екатеринбург, 2002. - С. 143.

4. Мошнина З.И., Ярвелов Б.Н., Мошнин М.В. Отечественный фотосенсибилизатор аммифурин в лечении атопического дерматита методом ПУВА-терапии. Вестник последипломного медицинского образования. - № 2. - 2003. - С. 24-25.

5. Мошнин М.В., Мошнина З.И., Ярвелов Б.Н. Возрастает ли резистентность к ПУВА-терапии псориаза при проведении повторных курсов лечения? Вестник последипломного медицинского образования. - № 1. - 2004. - С. 43.

6. Мошнин М.В., Кондратьева Ю.С., Мошнина З.И., Акимов В.Г. Повышение эффективности ПУВА-терапии псориаза с помощью кератолитиков. Сравнительная оценка препаратов. Вестник последипломного медицинского образования. - № 1. - 2004. - С. 44.

7. Мошнина З.И., Мошнин М.В., Ярвелов Б.Н. Лечение атопического дерматита методом ПУВА-терапии с аммифурином. Научная сессия МИФИ - 2005. Сборник научных трудов. - Том 5. - С. 75-76.

8. Акимов В.Г., Кондратьева Ю.С., Мошнин М.В., Мошнина З.И. Повышение эффективности ПУВА-терапии псориаза с помощью кератолитиков. Сравнительная оценка препаратов. Научная сессия МИФИ - 2005. Москва. Сборник научных трудов. - Том 5. - С. 16-17.

9. Цыбина Т.Н., Сыскова Т.Г., Сергиев В.П., …, Мошнина З.И., … . Профилактика лямблиоза: Методические указания.- М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2005. - 36 с.

10. Potapenko A.Ya., Kozir L.A., Moshnina Z.I., Kyagova A.A. Modulation of contact hypersensitivity in mice by photolysis products of psoralens. 11th Congress of the European Society for Photobiology. ESP 2005. Aix-les-Bains, France. 3-8 September 2005. Programme and Book of Abstracts. PI36. Page 120.

11. Мошнина З.И., Мошнин М.В. Терапевтическая эффективность ПУВА-терапии атопического дерматита с аммифурином. IX всероссийский съезд дерматовенерологов: Тезисы докладов. - Москва, 2005. - Том 1. - С. 109.

12. Moshnina Z.I., Moshnin M.V. PUVA-therapy of atopic dermatitis. Internacional congress «Immune-Mediated Diseases: From theory to therapy»: Abstract of the Congress. - Moscow, 3-8 October, 2005. - S. 72.

13. Мошнина З.И., Мошнин М.В. Фотохимиотерапия атопического дерматита. IY съезд фотобиологов России: Тезисы докладов. - Саратов, 26-30 сентября 2005. - С. 142-143.

14. Кягова А.А., Мошнина З.И., Козырь Л.А., Мошнин М.В., Глазунова О.В., Потапенко А.Я. Моделирующее действие продуктов фотолиза фурокумаринов на реакцию контактной чувствительности у мышей. IY съезд фотобиологов России: Тезисы докладов. - Саратов, 26-30 сентября 2005. - С. 105-106.

15. Мошнина З.И., Мошнин М.В. ПУВА-терапия хронических дерматозов. Четвертая московская ассамблея «Здоровье столицы»: Тезисы докладов. - Москва, 15-16 декабря 2005. - С. 78-79.

16. Аносов А.К., Мошнин М.В., Мошнина З.И. Спектрофотометрический анализ фотосенсибилизаторов. Научная сессия МИФИ - 2006. Москва. Сборник научных трудов. - Том 5. - С. 17-19 .

17. Kyagova A.A., Moshnina Z.I., Kozir L.A., Glazunova O.V., Moshnin M.V., Potapenko A.Ya. Specific Suppression of Contact Hypersensitivity in Mice by Photolysis Products of Psoralens. // 36 th Annual ESDR Metting, Paris, France 7-10 September, 2006. J. of Invest. Dermatol. - 2006. - V. 126. - Supp. 3. - P. s79.

18. Мошнин М.В., Мошнина З.И. Патент Российской Федерации на изобретение № 2290926 «Способ лечения псориаза» от 10.01.2007 (приоритетная справка от 27.04.2005, заявка № 2005112624/14 (014579).

19. Мошнина З.И., Мошнин М.В. Патент Российской Федерации на изобретение «Способ лечения атопического дерматита» (Решение о выдаче патента от 22.12.2006 приоритетная справка от 16.03.2006, заявка на изобретение№2006108070/14 (008777).

20. Мошнин М.В., Гончуков С.А., Мошнина З.И. Определение оптимального режима облучения при лечении псориаза. Научная сессия МИФИ - 2007. - Москва. Сборник научных трудов. - Том 5. - С. 49-50 .

21. Бутов Ю.С., Мошнина З.И., Кягова А.А., Потапенко А.Я. Лечение атопического дерматита методом ПУВА-терапии с аммифурином. Российский журнал кожных и венерических болезней.- 2007.- №3. - С.22-25.

Размещено на Allbest.ru

...