Исследование процессов синтеза, накопления и выброса предсердного и мозгового натрийуретических пептидов при экспериментальной вазоренальной гипертензии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Исследование процессов синтеза, накопления и выброса предсердного и мозгового натрийуретических пептидов при экспериментальной вазоренальной гипертензии

М.В. Галкина

О.С. Баскина

М.Л. Бугрова

Цель исследования -- изучить динамику процессов синтеза, накопления и выброса предсердного (ПНП) и мозгового (МНП) натрийуретических пептидов на 60-е сутки экспериментальной вазоренальной гипертензии.

Материалы и методы. Эксперименты проведены на белых нелинейных крысах-самцах. Вазоренальную гипертензию изучали на двупочечной модели с перевязкой левой почечной артерии по Когану. Измеряли артериальное давление (АД) через хвостовую артерию инвазивным методом. Изучали площади кардиомиоцитов левого желудочка на светооптическом уровне. Проводили электронно-микроскопическое исследование образцов ткани левого желудочка и правого предсердия. Процессы накопления и выброса ПНП и МНП оценивали количественным анализом иммуномеченых гранул предсердных миоцитов (А-тип, «зрелые, запасающие», и В-тип, «растворяющиеся») в трансмиссионном электронном микроскопе. Осуществляли морфометрический анализ морфологических разновидностей митохондрий левого желудочка и правого предсердия.

Результаты. Установлено, что на 60-е сутки после перевязки левой почечной артерии у крыс количество гранул, содержащих ПНП и МНП, в предсердных миоцитах статистически значимо не отличалось от их количества в интактной группе. Выявлено снижение АД до исходного уровня. Восстановление содержания ПНП и МНП в предсердных миоцитах и АД происходило на фоне гипертрофии кардиомиоцитов, деэнергизации митохондрий и деструктивных изменений в микроциркуляторном русле.

Заключение. В отдаленный период экспериментальной вазоренальной гипертензии ПНП и МНП оказывают положительное влияние на уровень АД, снижающегося до исходного, за счет выброса изучаемых пептидов на 30-е сутки эксперимента. Эффективность натрийуретических пептидов, выступающих в роли регуляторного звена при формировании гипертонической болезни, зависит от генеза артериальной гипертензии.

Предсердный (ПНП) и мозговой (МНП) натрийуретические пептиды входят в группу гормонов, участвующих в регуляции водно-солевого баланса и гемодинамики. Действие их направлено на снижение артериального давления (АД) [1-6]. При различных сердечнососудистых патологиях, сопровождающихся повышенным АД, высокие концентрации натрийуретических пептидов не обеспечивают гипотензивный эффект. Предполагают [7], что одной из причин артериальной гипертензии служит недостаточный синтез ПНП и МНП: происходит повышение их концентрации в плазме крови и снижение -- в предсердиях. Другой причиной неэффективности натрийуретических пептидов считают снижение плотности рецепторов А- и В-типа на поверхности органов-мишеней и нарушение связи с гуанилатциклазой [8]. Существует еще версия об увеличении количества рецепторов С-типа, активация которых приводит к ферментативному разрушению ПНП и МНП нейтральной эндопептидазой [9]. Такая неоднозначность в гипотезах может быть связана с разными методологическими подходами: одни исследователи изучают плазму с помощью иммуноферментного анализа [10], другие используют блот-анализ миокарда [11], третьи -- морфометрию гранул предсердных миоцитов [12]. Сочетание методов электронной микроскопии, иммуноцитохимии с количественным анализом разных типов гранул секреторных кардиомиоцитов (КМЦ) и контролем уровня АД позволяет объяснить процессы, происходящие в организме крыс при моделировании патологических состояний [13].

Одной из распространенных патологий сердечнососудистой системы является вазоренальная гипертензия, развивающаяся вследствие ишемического повреждения почек. Как правило, при естественном течении болезни и отсутствии соответствующего лечения около 70% больных погибают в течение ближайших 5 лет от осложнений (инсульт головного мозга, инфаркт миокарда, почечная недостаточность) [14-16]. Для моделирования вазоренальной гипертензии при изучении ее патогенеза используют перевязку почечной артерии [17, 18]. Ранее в наших работах на данной модели [19] показано, что к 30-м суткам развивается стойкая артериальная гипертензия. При повышенном АД обнаружены снижение синтеза и увеличение выброса натрийуретических пептидов в предсердных миоцитах крыс в изучаемые сроки. Интерпретация полученных результатов может быть неоднозначна, так как существует предположение [20], что сами натрийуретические пептиды служат регуляторным звеном формирования гипертонической болезни. В связи с этим для понимания процессов патогенеза вазоренальной гипертензии необходимо исследование динамики изменений, происходящих в организме в более отдаленный период эксперимента (60 сут).

Цель исследования -- изучить динамику процессов синтеза, накопления и выброса предсердного и мозгового натрийуретических пептидов крыс на 60-е сутки экспериментальной вазоренальной гипертензии с применением морфометрии гранул секреторных кардиомиоцитов.

Материалы и методы. Исследования проведены в соответствии с правилами лабораторной практики на 15 нелинейных крысах-самцах массой 180-220 г. Работа выполнена в полном соответствии с этическими принципами, установленными Европейской конвенцией по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей (принятой в Страсбурге 18.03.1986 г. и подтвержденной в Страсбурге 15.06.2006 г.). Вазоренальную гипертензию изучали на двупочечной модели с перевязкой левой почечной артерии по Когану [21]. АД измеряли через хвостовую артерию инвазивным методом с помощью датчика давления MPX5050DP (Motorola, США). Полученный сигнал анализировали в программном комплексе PowerGraph V.2.0.

Электронно-микроскопический анализ образцов ткани левого желудочка и правого предсердия интактных и экспериментальных животных (на 60-е сутки после перевязки левой почечной артерии) проводили по стандартной методике [22]. Клеточную локализацию ПНП и МНП выявляли методом иммуноцитохимии на ультратонких срезах, заключенных в эпоксидные смолы, используя поликлональные антитела к ПНП -- Rabbit anti-Atrial Natriuretic Factor (1-28) (rat) (Peninsula Lab. Inc., Bachem, США) и МНП -- Rabbit anti-Brain Natriuretic Peptide-32 (Rat) Serum (Peninsula Lab. Inc., Bachem, США). В качестве вторых антител использовали Protein-A/Gold (15 nm) (EM Grade, Electron Microscopy Sciences, США). Срезы контрастировали уранилацетатом, цитратом свинца и анализировали в электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI, США). Количественный анализ двух типов гранул с пептидами в предсердных КМЦ (А-тип, «зрелые, запасающие», и В-тип, «растворяющиеся») выполняли подсчетом в полях зрения (38Ч38 мкм) [21, 23]. Проводили морфометрический анализ морфологических разновидностей митохондрий КМЦ правого предсердия и левого желудочка в полях зрения (38Ч38 мкм). По одной из основных классификаций [24] выделили три типа митохондрий: митохондрии в энергизированном состоянии (состояние физиологической нормы), ортодоксальные митохондрии (набухшее состояние, просветление матрикса и дезориентация крист) и вакуолизированные митохондрии (характерны крупные внутримитохондриальные вакуоли, которые содержат мембранные структуры, напоминающие миелиноподобные тела).

Исследование ткани левого желудочка на светооптическом уровне проводилось у интактных и у опытных крыс через 60 сут. после перевязки левой почечной артерии. Образцы фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина и заливали в парафин [24]. Приготовленные на микротоме SM 2000R (Leica, Австрия) срезы 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином и изучали с помощью светового микроскопа Eclips 80i (Nikon, Япония) и программы NIS-Elements BR 4.00.02. При увеличении Ч40 измеряли площади КМЦ, мкм².

Статистическую обработку проводили с помощью программы Statistica 10.0 с применением критерия Манна-Уитни (р<0,05).

Результаты. В КМЦ экспериментальных животных выявлен ПНП- и МНП-иммунореактивный материал в гранулах обоих типов. Следует отметить, что все гранулы были помечены обоими антителами, т.е. содержали и ПНП, и МНП. Морфометрический анализ секреторных КМЦ правого предсердия на 60-е сутки после перевязки левой почечной артерии показал, что число гранул А- и В-типов, общее количество гранул статистически значимо не отличались от показателей интактных животных (рис. 1).

Уровень АД к 60-м суткам эксперимента статистически значимо не отличался от исходного значения (рис. 2).

Рис. 2. Изменение среднего АД в течение 60 сут. после перевязки левой почечной артерии у крыс (по тесту Манна-Уитни)

Светооптическое изучение миокарда левого желудочка выявило гипертрофию КМЦ (рис. 3). Морфометрический анализ показал статистически значимое увеличение площади КМЦ на 61% по сравнению с интактными животными и на 6% -- относительно 30-х суток эксперимента (рис. 4).

Рис. 3. Структура миокарда левого желудочка; ок. Ч10, об. Ч40; окраска гематоксилин-эозином: а -- у интактной крысы; б -- у крысы через 60 сут. после перевязки левой почечной артерии

Рис. 4. Изменение площади кардиомиоцитов в течение 60 сут. после перевязки левой почечной артерии у крыс (по тесту Манна-Уитни)

При электронно-микроскопическом анализе левого желудочка и правого предсердия экспериментальных животных обнаружены аналогичные мозаичные изменения КМЦ: в одних клетках ядра содержали ядрышко и эухроматин; в других клетках ядра были без ядрышек, отмечались инвагинации кариолеммы и гетерохроматин, перинуклеарное пространство определялось тотально расширенным (рис. 5). Во всех миоцитах наблюдалось изменение структуры митохондрий: происходило снижение количества митохондрий в состоянии физиологической нормы почти вдвое; увеличение ортодоксальных форм митохондрий и вакуолизированных митохондрий (рис. 6).

Рис. 5. Ультраструктура кардиомиоцита правого предсердия через 60 сут после перевязки левой почечной артерии: АГ -- развитый аппарат Гольджи; Гр -- гранулы; Мх -- митохондрии; СПР -- расширенный саркоплазматический ретикулум; Я -- ядро; Ч8900

Рис. 6. Изменение процентного содержания морфологических разновидностей митохондрий на 60-е сутки после перевязки левой почечной артерии

Миофибриллы находились в состоянии релаксации. В отдельных КМЦ наблюдались зоны пересокращения миофибрилл. В большинстве миоцитов выявлено расширение цистерн саркоплазматического ретикулума. Комплекс Гольджи хорошо развит. Hаблюдались гиперплазия и гипертрофия его компонентов, которые располагались не только около ядра, но и на периферии предсердных КМЦ (см. рис. 5). Обнаружены участки с потерей четкости сарколеммы и разрыхлением основного вещества базальной мембраны. Эти изменения сочетались с межклеточным отеком. Наблюдалось расхождение вставочных дисков.

В микроциркуляторном русле выявлены деструктивные изменения: происходило нарушение целостности эндотелиальной стенки и выход эритроцитов в интерстициальное пространство, в капиллярах встречались агрегированные эритроциты и тромбоциты, определялся перикапиллярный отек (рис. 7).

Рис. 7. Капилляр с агрегированными эритроцитами; Ч8900, Эр -- эритроциты

Обсуждение. Внутриклеточные механизмы синтеза, накопления и выведения натрийуретических пептидов исследованы весьма поверхностно из-за методических трудностей их идентификации и визуализации [25]. Применение количественного метода подсчета иммуномеченых гранул секреторных КМЦ, морфологических и физиологических методов дает наиболее полную информацию для изучения натрийуретических пептидов сердца. С учетом данных, полученных нами на 30-е сутки эксперимента [19], дальнейшее исследование позволяет выявить динамику изменений, происходящих в организме крыс в отдаленный период. Отсутствие достоверных различий числовых значений А- и В-типов гранул и уровня АД на 60-е сутки эксперимента по сравнению с интактной группой свидетельствовало о восстановлении данных параметров до исходных в исследуемый период. На фоне этих результатов в КМЦ левого желудочка и правого предсердия выявлены выраженные деструктивные изменения. Из литературных источников [26] известно, что набухание митохондрий носит адаптивный характер. Однако оно способствует увеличению их функционирования до тех пор, пока сохранены пространственные взаимоотношения структурных элементов. Обнаруженное нами значительное набухание митохондрий свидетельствовало о нарушении эффективного функционирования -- деэнергизации. Наблюдаемые изменения митохондрий, сарколеммы и расширение цистерн саркоплазматического ретикулума являются общим признаком кальциевого повреждения КМЦ.

Исследования, проведенные нами ранее [19, 21], выявили быстрое выведение ПНП и МНП из клеток на 30-е сутки после перевязки левой почечной артерии на фоне повышенного АД и гипертрофии КМЦ (см. рис. 2). По данным J. Wang и соавт. [27], гипертрофия КМЦ связана с экспрессией ING3 (inhibitor of growth family, member 3), активация которого приводит к повышению плазменного уровня ПНП и МНП после пережатия брюшной аорты у крыс. Другими исследователями [20] отмечено, что гипертрофия КМЦ в левом желудочке, развивающаяся у 6-месячных крыс НИСАГ (крысы с наследственной индуцированной стрессом артериальной гипертензией) на фоне высокого АД, является компенсаторной реакцией на гемодинамические нарушения, обусловленные повышением периферического сопротивления.

По-видимому, натрийуретические пептиды способствовали наблюдаемому восстановлению уровня АД к 60-м суткам и таким образом являлись важным компонентом в цепи сложных компенсаторных реакций, направленных на сдерживание гипертензии. Защитные свойства пептидов были показаны в эксперименте на собаках с левожелудочковой недостаточностью, вызванной кардиостимуляцией: использование ингибитора нейтральной эндопептидазы и введение ПНП приводило к увеличению натрийуреза и образованию в почках циклического гуанозинмонофосфата [7]. В клинических исследованиях [28] выявлено, что внутрикоронарное введение МНП снижает давление в легочной артерии, конечное диастолическое давление в левом желудочке и среднее АД.

Обнаруженное восстановление количества гранул с ПНП и МНП и давлением до исходного уровня на 60-е сутки экспериментальной вазоренальной гипертензии не совпадает с результатами, показывающими снижение содержания натрийуретических пептидов в предсердиях у больных с прогрессирующей артериальной гипертензией [29, 30]. Авторами работы [25] отмечено накопление большого количества зрелых гранул и заторможенное выведение таких пептидов у старых крыс-гипертоников линии НИСАГ на фоне сохраняющегося повышенного давления. По-видимому, эффективность или неэффективность натрийуретических пептидов, выступающих в роли регуляторного звена при формировании гипертонической болезни, зависит от генеза артериальной гипертензии. Использование нами комплекса современных методов исследования позволило выявить положительное влияние ПНП И МНП на давление в отдаленном периоде (60-е сутки).

Таким образом, восстановление синтетической активности натрийуретических пептидов и возвращение АД к исходному уровню происходили на фоне напряженности системы внутриклеточной регуляции в условиях адаптации к вазоренальной гипертензии, о чем свидетельствуют выраженные ультраструктурные изменения кардиомиоцитов правого предсердия и левого желудочка и гемокапилляров.

Заключение. Проведенное исследование на уровне целостного организма с применением количественного анализа гранул предсердных кардиомиоцитов, содержащих предсердный и мозговой натрийуретические пептиды, позволяет сделать вывод, что в отдаленный период экспериментальной вазоренальной гипертензии (на 60-е сутки) предсердный и мозговой натрийуретические пептиды оказывают положительное влияние на уровень артериального давления, снижающегося до исходного за счет выброса изучаемых пептидов на 30-е сутки. Эффективность натрийуретических пептидов, выступающих в роли регуляторного звена при формировании гипертонической болезни, зависит от генеза артериальной гипертензии.

Финансирование исследования. Работа выполнена в рамках ведомственной НИР Минздрава России 2012-2016 гг. «Механизмы регуляции физиологических функций при экспериментальных состояниях организма».

Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.

Литература

натрийуретический пептид мозговой гипертрофия

1. Baertschi A.J., Monnier D., Schmidt U., Levitan E.S., Fakan S., Roatti A. Acid prohormone sequence determines size, shape, and docking of secretory vesicles in atrial myocytes. Circ Res 2001; 89(3): E23-E29, http://dx.doi.org/10.1161/hh1501.095715.

2. Marei H.E. Fine structural and immunohistochemical localization of cardiac hormones (ANP) in right atrium and hypothalamus if the white rat. Eur J Morphol 2002; 40: 37-41, http://dx.doi.org/10.1076/ejom.40.1.0037.

3. Крылова М.И. Хромогранин А: иммуноцитохимическая локализация в секреторных гранулах кардиомиоцитов предсердия лягушки. Цитология 2007; 49(7): 538-543.

4. Рахчеева М.В., Бугрова М.Л., Мухина И.В., Жаберева А.С. Предсердный натрийуретический пептид и экспериментальная вазоренальная гипертензия у крыс. Патологическая физиология и экспериментальная терапия 2010; 4: 31-33.

5. de Bold A.J. Thirty years of research on atrial natriuretic factor: historical background and emerging concepts. Can J Pharmacol 2011; 89: 527-531, http://dx.doi.org/10.1139/y11-019.

6. Ogawa T., de Bold A. The heart as an endocrine organ. Endocr Connect 2014; 3(2): R31-R44, http://dx.doi.org/10.1530/EC-14-0012.

7. Гуревич М.А., Мравян С.Р., Веселова Т.Е. Значение системы предсердных натрийуретических пептидов при сердечной недостаточности и артериальной гипертензии. Кардиология 2003; 9: 81-87.

8. Liu R.T., Xiao H.L., Guo H.L., Qui D.G., Yin H.H., Wang Z.R. Expression of A-type atrial natriuretic peptide receptor in the kidneys of renovascular hypertension rats and its implication. Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban 2005; 36(6): 776-778.

9. Irzmaсski R., Barylski M., Banach M., Piechota M., Kowalski J., Cierniewski C., Pawlicki L. The concentration of atrial and brain natriuretic peptide in patients with idiopathic hypertension. Med Sci Monit 2007; 13(10): CR449-CR456.

10. Saliba Y., Chouery E., Mйgarbanй A., Jabbour H., Farиs N. Microalbuminuria versus brain natriuretic peptide in cardiac hypertrophy of hypertensive rats. Physiol Res 2010; 59(6): 871-880.

11. Sun Y., Deng T., Lu N., Yan M., Zheng X. B-type natriuretic peptide protects cardiomyocytes at reperfusion via mitochondrial calcium uniporter. Biomed Pharmacother 2010; 64(3): 170-176, http://dx.doi.org/10.1016/j.biopha.2009.09.024.

12. Максимов В.Ф., Коростышевская И.М., Курганов С.А., Маркель А.Л., Руденко Н.С., Якобсон Г.С. Изменения миоэндокринных клеток правого предсердия у крыс при гипертензии и после снижения артериального давления. Цитология 2014; 56(10): 725-734.

13. Бугрова М.Л., Абросимов Д.А., Яковлева Е.И., Баскина О.С., Ермолин И.Л. Исследование предсердного натрийуретического пептида кардиомиоцитов в условиях отдаленного постреперфузионного периода в эксперименте. Современные технологии в медицине 2013; 5(4): 39-44.

14. Mussalo H. Cardiovascular autonomic regulation in patients with sustained hypertension of different etiology and severity. Doctoral dissertation. Kuopio University Publications; 2003.

15. Kawarada O., Yokoi Y., Morioka N., Takemoto K. Renal artery stenosis in cardio -- and cerebrovascular disease: renal duplex ultrasonography as an initial screening examination. Circ J 2007; 71(12): 1942-1947, http://dx.doi.org/10.1253/circj.71.1942.

16. Мухин Н.А., Фомин В.В., Моисеев С.В. и др. Ишемическая болезнь почек (атеросклеротическая реноваскулярная гипертензия) -- клинический вариант распространенного атеросклероза и причина хронической почечной недостаточности. Вестник РАМН 2008; 11: 24-33.

17. Харин С.Н., Крандычева В.В. Методика сужения почечной артерии для моделирования реноваскулярной гипертензии у крыс. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2004; 7: 118-120.

18. Рахчеева М.В. Роль предсердного и мозгового натрийуретических пептидов в регуляции артериального давления при вазоренальной гипертензии у крыс. Автореф. дис. ... канд. биол. наук. М; 2009.

19. Рахчеева М.В., Бугрова М.Л., Мухина И.В., Жаберева А.С. Роль предсердного натрийуретического пептида в регуляции артериального давления при односторонней ишемии почки у крыс. Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского 2009; 6(1): 132-136.

20. Максимов В.Ф., Коростышевская И.М., Маркель А.Л., Филюшина Е.Е., Якобсон Г.С. Натрийуретические пептиды сердца и артериальная гипертензия: экспериментальное исследование. Вестник РАМН 2013; 1: 4-9.

21. Рахчеева М.В., Бугрова М.Л. Изменение соотношения гранул А- и В-типов, содержащих предсердный и мозговой натрийуретические пептиды, в предсердных миоцитах крыс в условиях вазоренальной гипертензии. Цитология 2010; 8: 629-633.

22. Микроскопическая техника. Под ред. Саркисова Д.С., Перова Ю.Л. М: Медицина; 1996; 544 с.

23. Бугрова М.Л., Яковлева Е.И., Абросимов Д.А. Взаимосвязь интенсивности синтеза, накопления и секреции предсердного натрийуретического пептида кардиомиоцитов с уровнем регуляции сердечного ритма у крыс в условиях раннего постреперфузионного периода. Современные технологии в медицине 2012; 3: 26-30.

24. Сударикова Ю.В., Бакеева Л.Е., Цыпленкова В.Г. Энергозависимые изменения ультраструктуры митохондрий кардиомиоцитов человека при алкогольном поражении сердца. Архив патологии 1999; 2: 15-20.

25. Коростышевская И.М., Максимов В.Ф., Курганов С.А. Возможности ультраструктурной оценки секреторной активности предсердных кардиомиоцитов. Цитология 2013; 55(8): 539-547.

26. Сперелакис Н., Форбс М.С. Ультраструктура миокарда млекопитающих. В кн.: Физиология и патофизиология сердца. Том I. М; 1990; с. 15-64.

27. Wang J., Liu Z., Feng X., Gao S., Xu S., Liu P. Tumor suppressor gene ING3 induces cardiomyocyte hypertrophy via inhibition of AMPK and activation of p38 MAPK signaling. Arch Biochem Biophys 2014; 562: 22-30, http://dx.doi.org/10.1016/j.abb.2014.08.007.

28. Бугримова М.А., Савина Н.М., Ваниева О.С., Сидоренко Б.А. Мозговой натрийуретический пептид как маркер и фактор прогноза при хронической сердечной недостаточности. Кардиология 2006; 1: 51-57.

29. Langenickel T., Pagel I., Hцhnel K., Dietz R., Willenbrock R. Differential regulation of cardiac ANP and BNP mRNA in different stages of experimental heart failure. Amer J Physiol Heart Circ Physiol 2000; 278(5): H1500-H1506.

30. Vesely D.L. Discovery of new cardiovascular hormones for the treatment of congestive heart failure. Cardiovasc Hematol Disord Targets 2007; 7(1): 47-62, http://dx.doi.org/10.2174/187152907780059128#sthash.aO3kug5A.dpuf.

Размещено на Allbest.ru