Россия (Тува)

238

263

274С/Т, INT4, 1465-85G/A, D543N,

1465-85G/A

Рудко А.А. и др., 2004

Китай

120

240

INT4, D543N, 3'UTR

D543N, 3'UTR

Liu W. et al., 2004

Способность уничтожать внутриклеточных паразитов зависит от стадии активации макрофагов и приобретается ими под действием цитокинов, в частности, под действием гамма интерферона (IFN-), которые выделяются стимулированными лимфокинпродуцирующими Т-клетками [Ройт А., 1991]. Цитокины представляют собой группу полипептидных медиаторов, участвующих в формировании и регуляции защитных реакций организма. К цитокинам относят интерфероны, колониестимулирующие факторы, интерлейкины, хемокины, трансформирующие ростовые факторы, группа фактора некроза опухолей и некоторые другие. К общим главным свойствам цитокинов, объединяющим их в самостоятельную систему регуляции, относятся: плейотропизм и взаимозаменяемость биологического действия, отсутствие антигенной специфичности действия, саморегуляция продукции и формирование цитокиновой сети. Цитокины в первую очередь регулируют развитие местных защитных реакций в тканях с участием различных типов клеток крови, эндотелия, соединительной ткани и эпителиев. Гиперпродукция цитокинов ведет к развитию системной воспалительной реакции и может служить причиной развития ряда патологических состояний [Симбирцев А.С., 2002].

Мутации генов некоторых цитокинов, играющих важную роль в механизмах иммунологической защиты против микобактерий, а так же мутации генов кодирующих рецепторы к этим интерлейкинам могут играть свою роль в предрасположенности к туберкулезу. Так, генетически измененные мыши («нокауты»), лишенные гена, кодирующего IFN- или рецептор к нему, очень чувствительны к заражению микобактериями [Flynn J. et al., 1993]. Описаны также случаи летальной БЦЖ инфекции у детей с врожденным дефектом экспрессии рецепторов к IFN- [Altare F. еt al., 1998]. Примечательно, что в литературе не встречается описание пациентов с генетическим недостатком IFN-. Вероятно, такие мутации являются фатальными.

Роль макрофагов в противотуберкулезном иммунитете не ограничивается фагоцитозом. Второй основной функцией клеток макрофагального ряда является презентация переработанных микобактериальных антигенов, что необходимо для запуска последующих иммунологических реакций [Покровский В.И. и др., 1979]. Кроме того, макрофаги участвуют в синтезе важнейших медиаторов иммунного ответа при туберкулезе, таких как интерлейкин-1 (ИЛ-1) и др. [Chensue S. et al., 1986]. ИЛ-1 является ключевым элементом в развитии воспаления, биологический эффект которого опосредуется через специфические клеточные рецепторные комплексы. Регуляция действия данного цитокина осуществляется посредством рецепторного антагониста интерлейкина-1, который конкурентно взаимодействует с рецептором к ИЛ-1 и, таким образом, ингибирует провоспалительный эффект [Tarlow J.K. et al., 1993].

S. Chensue и соавторы (1986) считают, что продукция интерлейкина-1 мононуклеарными клетками периферической крови больных является специфическим индикатором активности процесса, более выраженным, чем показатели СОЭ или С-реактивного белка, и предлагают использовать этот показатель для диагностики активного туберкулеза и контроля за эффективностью лечения больных.

В одной из работ была исследована in vitro способность макрофагов синтезировать интерлейкин-1 в ответ на воздействие синтетического активатора макрофагов мурамилдипептида у больных туберкулезом и здоровых доноров. Обнаружено, что макрофаги больных отличает пониженная способность секретировать этот цитокин [Селедцова Г.В. и др., 1991]. Причем при фиброзно-кавернозной форме туберкулеза наблюдалось более выраженное снижение продукции ИЛ-1, чем при инфильтративном туберкулезе [Хонина Н.А. и др., 2000] В настоящее время многие цитокины, в том числе и интерлейкин-1, применяются в клинической практике в виде лекарственных препаратов. Была изучена эффективность лечения больных туберкулезом с применением в комплексной терапии рекомбинантного ИЛ-1. Наблюдения показали, что использование препарата беталейкина повышает эффективность лечения по закрытию полостей распада, уменьшению и фрагментации специфических фокусов, степени выраженности остаточных изменений [Скворцова Л.А. и др., 2003].

Возможно, неспособность макрофагов активироваться для продукции ИЛ-1 под влиянием стимула связана с мутацией в гене, кодирующем этот цитокин. Было показано, что ген, кодирующий интерлейкин-1 - IL1B находится на хромосоме 2q14, а недалеко от этого гена на участке 2q14.2 расположен ген рецепторного антагониста ИЛ-1 - IL1RN [Patterson D. et al., 1993; Nicklin M.J.H. et al., 1994]. Известны два биаллельных полиморфизма в гене IL1В в позициях - 511 и +3953 [Giovine F.S. et al., 1993; Pociot F. et al., 1992]. Так же описан VNTR полиморфизм во втором интроне гена IL1RN, обусловленный тандемным повтором участка из 86 п.о. от 2 до 6 раз. Пяти аллелям VNTR полиморфизма в зависимости от частоты встречаемости были присвоены следующие названия: самый частый аллель - А1 (четыре повтора), второй по частоте аллель А2 (два повтора), А3 (пять повторов), А4 (три повтора), А5 (шесть повторов) [Tarlow J.K. et al., 1993].

Анализ полиморфизма кластера генов интерлейкина-1 (IL1A, IL1B, IL1RN) у африканцев показал взаимосвязь IL1A, IL1RN с чувствительностью к туберкулезу. Так, гетерозиготы по аллелю 2 VNTR полиморфизма гена IL1RN статистически значимо реже встречались среди больных туберкулезом, чем в контрольной группе. Однако авторы отмечают отсутствие влияния полиморфизма IL1B на подверженность туберкулезу [Bellamy R., Ruwende C., 1998]. В другом исследовании не было найдено различий в частотах генотипов IL1RN между выборками больных легочным туберкулезом и контрольной [Selvaraj P. et al., 2000].

Wilkinson R.J. и соавторы (1999) не обнаружили различий в частотах генотипов полиморфизма генов IL1B и IL1RN в группах больных туберкулезом и здоровых индивидов. Между тем было показано, что стимулированная in vitro микобактериями туберкулеза секреция IL-1RN у IL-1RNА2 индивидов выше, чем у IL1RNА2- индивидов. Таким образом, с аллелем 2 (2 повтора) VNTR полиморфизма связано повышение продукции IL1RN. В исследовании было описано влияние полиморфизма +3953А1/А2 IL1B на экспрессию продукта гена. В дополнение к этому авторы обнаружили ассоциацию IL1RNА2-/IL1B(+3953)А1+ гаплотипа с низкой экспрессией IL1RN и повышенным уровнем IL-1, что проявляется в провоспалительном фенотипе [Wilkinson R.J. et al., 1999].

Ген, кодирующий интерлейкин-12? (IL12В) также можно рассматривать в качестве кандидата при развитии туберкулезной инфекции, так как продукт данного гена играет ключевую роль в клеточном иммунном ответе [Тотолян А.А., Фрейдлин И.С., 2000]. Brightbill H. D. и соавторы (1999) продемонстрировали, что бактериальные лиганды (липопротеины) стимулируют выработку IL-12 макрофагами человека посредством активации Toll-like рецепторов на поверхности макрофага. Интерлейкин -12 связывается с 1 и 2 комплексом рецептора к IL-12 на поверхности Т-хелперов и других клеток-киллеров. В свою очередь, Т-хелперы продуцируют IFN-, который связывается с R1/R2 комплексом рецептора к IFN- на поверхности макрофагов и активирует их. Активированные макрофаги устремляются к месту нахождения микобактерий и активно их поглощают [Rook G. A. W. et al., 1985]. Таким образом, гибель микобактерий внутри макрофага осуществляется в результате сложных, опосредованных цитокинами, взаимодействий лимфоцитов и фагоцитов.

Интерлейкин 12 имеет 2 цепи, массой 35 kD (р35), кодируемая IL12А и массой 40 kD (р40), кодируемая IL12В. Тогда как IL12р40 главным образом взаимодействует с рецептором IL121 на поверхности Т-хелпера, IL12р35 в первую очередь сцепляется с IL122. Используя иммунопреципитацию, Oppmann B. и соавторы (2000) определили, что IL12В и р19 формируют растворимый комплекс, который они назвали IL23. Анализ установил, что IL23, подобно IL12, связывается с рецептором IL121. Не так давно были выявлены цитокины IL18 и IL29 имеющие сходство в функции с IL12 и IL23.

Ген NKSF2 (от англ. Natural Killer Cell Stimulatory Factor 2 - альтернативное название IL12) был картирован в дистальной области длинного плеча 5 хромосомы [Warrington J.A. et al., 1992]. В дальнейшем при помощи ПЦР анализа ДНК клеток гибридов был определен участок на хромосоме 5q31-33, где локализован IL12В [Sieburth D. et al., 1992]. J. A Warrington. и U Bengtsson. (1994) используя методы физического картирования, определили порядок расположения и относительное расстояние между 12 генами в 5q31-33 регионе. Ген IL12В был одним из них.

Группа исследователей картировала ген IL12в на 11 хромосоме мыши [Noben-Trauth N. et al., 1996]. Используя модель животного, были получены экспериментальные данные о роли гена IL12В в защите от туберкулезной инфекции. Элиминация функции IL12в у «нокаутированных» мышей (IL12р40-/-) при условии их инфицирования вирулентным штаммом М. tuberculosis приводила к распространенной туберкулезной инфекции и гибели животного. Однако мыши с генотипом IL12р35-/- не проявляли повышенной чувствительности к туберкулезу. Данное наблюдение наводит на мысль о значительной роли субъединицы р40 интерлейкина-12 в развитии резистентности к туберкулезу [Cooper A. M. et al., 2002].

Генетический дефицит IL12 или IL12R приводит к частичной или полной недостаточности выработки IFN-. Как правило, вакцина BCG и непатогенные микобактерии не вызывают у человека заболевания, однако известны случаи, когда они приводили к развитию тяжелой распространенной инфекции. Так было описано несколько пациентов с генетическим дефектом выработки IL12р40 и IL12р70 (комплекс судъединиц р40 и р70), большинство из которых страдали от диссеминированной инфекции М. bovis BCG. Недавно был обнаружен мононуклеотидный полиморфизм гена IL12В в 3`-UTR, обусловленный заменой А на С [Cervino A.C.L. et al., 2000]. Эта информация дает возможность оценить роль изменчивости гена IL12В в формировании полигенной подверженности к туберкулезу.

Если рассмотреть патогенез туберкулеза, возникает множество привлекательных кандидатов на роль «причинного» гена. Одним из таких генов, предположительно влияющих на исход отношений между человеком и микобактерией, является ген рецептора к витамину Д (VDR) [Uitterlinden A.G. et al., 2004]. Витамин Д - это группа родственных стероидов, одним из важнейших среди которых является так называемый Д3 (холекальциферол). Главный эффект активированного витамина Д3 (1,25(ОН)2Д3) или кальцитриола - стимуляция активной адсорбции кальция и фосфата из кишечника. К тому же кальцитриол оказывает влияние на клетки крови - модулирует пролиферацию и дифференциацию лимфоцитов, а также способствует конверсии циркулирующих моноцитов в макрофаги [Rigby W. F., 1988; Bellamy R., Hill A. V. S., 1998].

Активизированные макрофаги в свою очередь также способны к образованию кальцитриола. При туберкулезе этот локально продуцируемый кальцитриол может активизировать «проглатывание» и элиминацию МБТ макрофагами и минимизировать тканевую деструкцию [Davies P.D.O., 1985; Cadranel J. et al., 1988]. Исследования in vitro показали, что метаболиты витамина Д могут усиливать способность моноцитов человека ограничивать размножение внутриклеточно расположенных микобактерий туберкулеза. В то время как добавление одного рекомбинантного человеческого IFN- к пулированным моноцитам человека не оказывало влияния на их туберкулостатическую активность, введение в данную систему дополнительно кальцитриола приводило к полной остановке роста микобактерий [Rook G.A.W. et al., 1986; Denis M., 1991].

Все перечисленные эффекты холекальциферола осуществляются посредством специальных рецепторов, которые присутствуют во многих клетках и органах, в том числе в лимфоцитах периферической крови и моноцитах [Griffin M.D. et al., 2003]. Такая широкая распространенность рецепторов к витамину Д говорит о том, что данный стероид и его метаболиты регулируют деятельность многих систем организма.

Локализация гена кодирующего рецептор к витамину Д определена у человека на хромосоме 12q12-q14 [Labuda M., 1991]. Известны его полиморфные варианты, наиболее часто из которых исследуются три полиморфизма: F/f, T/t, B/b. Обозначение и название этих полиморфных маркеров произошло от первых букв рестриктаз, используемых для их детекции в ПДРФ-анализе (FokI, TagI, BsmI).

Результаты исследования, проведенного в Западной Африке (Гамбия) методом случай - контроль, выявили статистически значимую ассоциацию tt генотипа VDR гена с резистентностью к легочному туберкулезу [Bellamy R., 2000]. Подобная работа была проведена в Китае, результаты которой показали наличие ассоциации ff генотипа VDR гена с подверженностью к ТБ.

Однако в популяции Перу статистически значимой ассоциации различных полиморфизмов гена VDR с туберкулезом найдено не было [Roth D. E. еt al., 2004]. В другом исследовании было показано, что большую роль в предрасположенности к ТБ играют гаплотипы гена VDR [Bornman L. et al., 2004]. В Лондоне была проведена работа, в результате которой исследователи определили наличие связи между дефицитом холекальциферола в организме человека и активным туберкулезом. Наряду с этим, авторы продемонстрировали отрицательное влияние комбинации генотипов ТТ и Tt, а так же генотипа ff с недостатком витамина Д на резистентность к ТБ [Wilkinson R.J. et al., 2000].

В другом исследовании было показано, что генотип tt VDR гена ассоциирован с подверженностью к легочному туберкулезу у женщин, а, в свою очередь, ТТ генотип - с резистентностью к ТБ у женщин [Selvaraj P. et al., 2000]. Таким образом, витамин Д, действуя через рецепторы и модулируя функцию макрофагов, может повышать противотуберкулезную защиту человека. Данное утверждение отчасти объясняет тот факт, что заболеваемость туберкулезом выше в течение холодных сезонов года, когда кожный синтез кальцитриола от экспозиции солнца понижен и серологический уровень витамина Д более низкий [Chan T.Y., 2000].

Однако известно, что действие продукта экспрессии гена рецептора витамина D оказывает умеренное влияние на полную чувствительность к туберкулезу [Hill A.V.S., 2001]. К тому же, роль кальцитриола в антибактериальном иммунитете не однозначна, поскольку он наряду с активизацией макрофагов проявляет такие эффекты, как угнетение пролиферации лимфоцитов, снижение продукции иммуноглобулина и синтеза цитокинов [Bellamy R., Hill A.V.S., 1998; Wilkinson R. J. et al., 2000].

В целом, можно отметить, что в настоящее время имеется достаточно разрозненная информация о генетических основах подверженности к туберкулезу, а так же, видимо, общее количество генов, в той или иной мере влияющих на развитие этого инфекционного заболевания, гораздо выше.

Таким образом, поиск новых генов-кандидатов туберкулеза, а так же изучение полиморфизма известных генов-кандидатов в популяциях различного этнического состава и их вклада в общую подверженность к заболеванию представляется на сегодняшний день важной задачей, решение которой позволит определить новые подходы к более эффективному лечению и профилактике ТБ.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

2.1 Обследованные группы населения

Настоящее исследование включало три аспекта: анализ популяционной распространенности полиморфизма генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL1RN и IL12В, оценку их патогенетической значимости в отношении туберкулеза, а также влияние исследуемых генов на патогенетически важные параметры заболевания. В соответствии с этим, первую часть работы выполнили на материале популяционной выборки здоровых жителей г. Томска (140 человек). Вторая и третья часть исследования проведена на материале выборки больных туберкулезом (304 человека) и их семей (42 семьи, 109 человек), живущих в г. Томске и Томской области.

Работа выполнена на базе ГОУ ВПО Сибирский государственный медицинский университет Росздрава и ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН. Набор материала для исследования осуществлялся в Областной Томской клинической туберкулезной больнице, Детском легочно-туберкулезном отделении Железнодорожной больницы, Областной детской туберкулезной больнице, а также Областном противотуберкулезном диспансере, в соответствии с этическими нормами с обязательным получением согласия испытуемых.

2.1.1 Характеристика контрольной выборки

В качестве контрольной группы использовалась популяционная выборка, сформированная для настоящего исследования на основе ДНК-банка ГУ НИИ медицинской генетики ТНЦ СО РАМН. Все лица, вошедшие в эту группу, были русскими. Основным критерием отбора образцов было отсутствие родства между индивидами. В данную выборку вошли индивиды никогда не болевшие туберкулезом по анамнестическим данным (140 человек), средний возраст которых составил 61,819,4 лет. Частично ее составили индивиды (118 человек) не родственные между собой и не имеющие по результатам клинического и параклинического обследования легочной патологии. Остальная часть контрольной группы (22 человека) включала пациентов, которым первоначально ошибочно был выставлен диагноз туберкулеза, но затем при более детальном обследовании данное заболевание было исключено. Таким образом, этих индивидов можно считать здоровыми от ТБ.

2.1.2 Характеристика выборки больных туберкулезом

Исследованная выборка больных туберкулезом была сформирована из индивидов, не родственных между собой. Выборка была однородной как по расовой принадлежности, так и по этническому происхождению, средний возраст составил 30,615,4 года. Все пациенты были русскими; женщин - 99 (32,6%), средний возраст которых составил 26,3 14,6 года, мужчин -205 (67,4%), средний возраст - 32,8 15,4 лет.

Диагноз туберкулеза легких устанавливался на основании данных микроскопии мокроты с обязательным рентгенологическим исследованием легких для определения формы заболевания и распространенности специфического процесса (общепринятые методы). Обследованные пациенты имели следующие клинические формы туберкулеза: у 43 человек был диагностирован первичный туберкулез (у 35 - туберкулез внутригрудных лимфоузлов, у 3 - первичный туберкулезный комплекс, у 2 - плеврит туберкулезной этиологии первичного периода, у 2 - гематогенно-диссеминированный туберкулез легких), 150 пациентам был поставлен диагноз инфильтративного туберкулеза легких, 65 - диссеминированный туберкулез легких, 27 пациентам - очаговый туберкулез, у пятерых обследованных индивидов развилась казеозная пневмония, у 4 - фиброзно-кавернозный туберкулез легких, такому же количеству больных был выставлен диагноз туберкуломы легких, 3 пациентам - туберкулез почек, 2 - туберкулез бронха, 1 - плеврит туберкулезной этиологии.

2.1.3 Характеристика семейной выборки пробандов, больных туберкулезом

Исследованная семейная выборка была зарегистрирована по пробандам - больным туберкулезом, находившихся на лечении в противотуберкулезных учреждениях г. Томска в период с 2000 по 2004 г. Всего было обследовано 42 семьи (109 человек), в том числе 25, зарегистрированных по пробандам - детям в возрасте от 1 года до 15 лет. Семнадцать семей было выбрано по взрослым пробандам в возрасте от 17 до 48 лет (табл. 3).

Таблица 3. Структура семейного материала выборки изученной по полиморфным ДНК-маркерам генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN

Выборка	Количество детей в семье	Всего
	1	2	3	4	5
Полные семьи (изучены оба родителя и дети)	19(57)	0	0	0	1(7)	20(64)
Неполные семьи (изучен один родитель и дети)	16(32)	1(3)	0	0	0	17(35)
Нет данных о родителях	0	5(10)	0	0	0	5(10)

Примечание. В скобках указано количество индивидов

Часть пробандов-детей составили мальчики (n=10), а девочек было в 1,5 раза больше (n=15). Средний возраст пробандов-детей разного пола достоверно не различался (7,2 года у мальчиков и 7,5 лет у девочек). Среди взрослых пробандов было 7 женщин (средний возраст - 19,8 лет) и 10 мужчин (средний возраст - 23,9 лет). Всем пробандам был поставлен диагноз туберкулеза, причем первичный и вторичный генез заболевания встречался с одинаковой частотой. Среди обследованных родственников пробандов первой степени родства было 28 лиц мужского пола, из них 8 человек болели туберкулезом, и 39 -женского, из них с туберкулезом 14.

2.2 Методы исследования

2.2.1 Клинико-лабораторные методы исследования

Клинико - эпидемиологический анализ больных туберкулезом включал: возраст начала заболевания, социальную категорию, вредные привычки (курение, злоупотребление алкоголем, употребление наркотиков), сопутствующую патологию, наличие контакта с туберкулезным больным, а также данные о туберкулезе у родственников больного. Анализу подвергались выраженность клинических проявлений (жалобы, объективный статус больного), результаты лабораторных и инструментальных методов исследования (микроскопия и посев мокроты на МБТ, чувствительность к противотуберкулезным препаратам, рентгенологическое исследование легких, общий анализ крови) на момент начала заболевания.

Для решения задачи по оптимизации и стандартизации сбора информации о больном ТБ была разработана специальная карта «Унифицированный носитель информации», содержащая блоки, охватывающие сведения о жалобах больного, эпидемиологическом анамнезе, анамнезе заболевания, объективном статусе, результатах лабораторного и инструментального обследования. В дальнейшем на основании сведений из этих карт была создана электронная база данных в формате Microsoft Excel.

2.2.2 Молекулярно - генетические методы анализа полиморфизма генов

Всего было изучено 9 полиморфных вариантов пяти генов - кандидатов подверженности туберкулезу. Исследовали 4 полиморфных варианта гена NRAMP1: 469+14G/C (INT4) - трансверсия гуанина на цитозин в 4 интроне, С274Т - консервативная замена в 3 экзоне, 1465-85 G/A - транзиция в 13 интроне и D543N - неконсервативная замена цитозина на аденин в 15 экзоне; два полиморфизма VDR гена: B/b, F/f; полиморфный вариант IL1B гена в 5 экзоне +3953А1/А2; VNTR полиморфизм гена IL1RN, расположенный во 2 интроне. Также выборки генотипировали по полиморфизму гена IL12В, обусловленному трансверсией аденина на цитозин в 3`-UTR области (табл. 4) .

Для генотипирования индивидов по указанным полиморфизмам использовали образцы тотальной ДНК, выделенной из цельной венозной крови по стандартной неэнзиматической методике [Маниатис Т. и др., 1984; Lahiri D. et al., 1992]. Выделенную ДНК замораживали и хранили при температуре -20 С до проведения эксперимента. Генотипирование осуществляли с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл.5).

Смесь для ПЦР содержала 0,5-2,0 мкл специфической пары праймеров с концентрацией 1 о.е./мл, 1,2-1,8 мкл 10 буфера для амплификации с концентрацией MgCl2 0,5-2,0 mM, 0,5-1,0 е. а. Taq ДНК-полимеразы («Сибэнзим», «Медиген», Новосибирск) и 100-200 нг геномной ДНК. Смесь помещали в 0,5 мл пробирки типа «Эппендорф», наслаивали сверху минеральное масло для предотвращения испарения и амплифицировали в автоматических минициклерах «MJ Rеsearch» (США) и «БИС 108» (Россия-Новосибирск).

Программа амплификации включала предварительную денатурацию при 94С в течении 5 минут, с последующими 30-35 циклами отжига при температуре 60С (1мин.), элонгации цепи при 72С (40 сек.) и денатурации при 94С (40 сек.). Программу завершала финальная элонгация при 72С в течение 3 минут. Амплификат подвергали гидролизу соответствующей рестриктазой (табл.5) при оптимальной для фермента температуре в течении 12-24 ч. Рестрикционная смесь включала 5-7 мкл амплификата, 1,0-1,2 мкл 10 буфера для рестрикции, поставляемого фирмой - производителем («Сибэнзим», Новосибирск), и 1-5 единиц активности фермента (в зависимости от эффективности его работы). Продукты рестрикции фракционировали в 3% агарозном геле при напряжении 120 В в течении 30 минут. Фрагменты ДНК окрашивали бромистым этидием и визуализировали в ультрафиолетовом свете.

Таблица 4. Структура материала популяционных выборок г. Томска и Томской области, изученных по полиморфным ДНК-маркерам генов NRAMP1, VDR, IL1B, IL12B, IL1RN

Ген	Полиморфизм	Выборка больных туберкулезом	Выборка здоровых индивидов
NRAMP1	469+14G/C	279	137
	D543N	278	139
	1465-85G/A	279	135
	274C/T	299	116
IL12B	1188А/С	279	129
VDR	B/b	293	108
	F/f	298	113
IL1B	+3953A1/A2	301	139
IL1RN	VNTR	299	140

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблица 5. Характеристики исследованных полиморфизмов

Ген	Полимор-физм	Структура праймеров	Tо отжига прай-меров, оС	Фермент рестрик-ции	Продукты гидролиза, п. н.	Литерату-ра
					Аллель «дикого» типа	Мутантный аллель
NRAMP1	274C/T	5'-tgccaccatccctatacccag -3' 5'-tctcgaaagtgtcccactcag -3'	60	Mnl I	167;37;12 bp	102;65;37; 12 bp	Liu J. et al., 1995
	469+14 G/C	5'-tctctggctgaaggctctcc -3' 5'-tgtgctatcagttgagcctc - 3'	60	Apa I	624 bp	455;169 bp
	1465-85G/A	5'-gcaagttgaggagccaagac -3' 5'-acctgcatcaactcctcttc -3'	60	Bsе 1I	142;75;24 bp	102;75;40; 24 bp
	D543N	5'-gcatctccccaattcatggt -3' 5'-aactgtcccactctatcctg -3'	60	Bme 18I	126;79;39 bp	201;39 bp
IL12	A1188C	5'-ttctatctgatttgcttta -3' 5'-tgaaacattccatacatcc -3'	43	Taq I	233 bp	165;68 bp	Hall M. A. еt al., 2000
VDR	B/b	5'-aacttgcatgaggaggagcatgtc-3' 5'-ggagaggagcctctgtcccatttg-3'	60	Pct I	813 bp	505;308 bp	Wilkinson R.J. et al., 2000
	F/f	5'-agctggccctggcactgactctgctct-3' 5'-atggaaacaccttgcttcttctccctc-3'	60	Fok I	267 bp	197;70 bp
IL1B	+3953 A1/A2	5'-gttgtcatcagactttgacc-3' 5'-ttcagttcatatggaccaga-3'	58	Taq I	220 bp	148; 72 bp	Wilkinson R.J. et al., 1999
IL1RN	VNTR	5'-tcctggtctgcaggtaa-3' 5'-ctcagcaacactcctat-3'	60	А1-410 п.о. (4 повтора) А2-240 п.о. (2 повтора) А3-500 п.о. (5 повторов) А4-325 п.о. (3 повтора) А5-595 п.о. (6 повторов)	Tarlow J.K. et al., 1993

2.2.3 Генетико - статистические методы анализа

Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам проверяли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга (РХВ) с помощью точного теста Фишера [Вейр Б., 1995]. Рассчитывали ожидаемую гетерозиготность полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN [Nei M., 1975]. Относительное отклонение ожидаемой гетерозиготности от наблюдаемой (D) рассчитывали по формуле:

D=(hobs-hexp)/hexp

где hobs и hexp - ожидаемая и наблюдаемая гетерозиготность соответственно.

Для анализа ассоциации маркеров исследуемых генов с туберкулезом, а также с качественными патогенетически важными признаками заболевания, сравнивали частоты аллелей и генотипов в группах больных и здоровых индивидов, используя критерий ?2 с поправкой Йетса на непрерывность. При численностях генотипов менее пяти использовали точный тест Фишера. В дополнение к этому об ассоциации разных генотипов (или их комбинаций) с заболеванием судили по величине отношения шансов (odds ratio (OR)), которая показывает, во сколько раз выше вероятность заболеть для индивида с определенным генотипом (или комбинацией генотипов) [Pearce N., 1993].

OR= (A/B)/(C/D)

Где А - число (процент) людей с данным генотипом (комбинацией генотипов) в группе больных;

С - число (процент) людей с данным генотипом (комбинацией генотипов) в группе здоровых;

В - число (процент) индивидов, не имеющих данного генотипа (комбинации генотипов) в группе больных;

D - число (процент) индивидов, не имеющих данного генотипа (комбинации генотипов) в группе здоровых.

Значения OR>1 указывают на возможную положительную ассоциацию с заболеванием. Обсуждение величин OR проводили при уровне значимости не более 5%.

На материале семейной выборки больных изучение ассоциаций полиморфизма исследованных генов с туберкулезом проводили с использованием теста на неравновесие при переносе (Transmission/Disequilibrium Test, TDT), который в случае диаллельного маркерного локуса М сводится к анализу таблицы сопряженности 22, где в ячейках матрицы суммированы случаи наследования и не наследования от родителей больными детьми маркерных аллелей [Spielman R. S. et al., 1993].

a - число случаев наследования аллеля М1 от родителей М1М1;

b - число случаев наследования аллеля М1 от родителей М1М2;

c - число случаев наследования аллеля М2 от родителей М1М2;

d - число случаев наследования аллеля М2 от родителей М2М2;

Используются данные только от гетерозиготных родителей. Статистика теста рассчитывается по формуле:

TDT=(b-c)2/(b+c)

и в случае верной нулевой гипотезы (Н0: нет ассоциации) асимптотически распределена как ?2 с 1 степенью свободы.

С целью выявления ассоциации маркеров исследуемых генов с количественными, патогенетически важными признаками туберкулеза, проводили сравнение средних значений уровней метрических показателей у носителей разных генотипов с помощью однофакторного дисперсионного анализа по Фишеру и теста LSD. При наличии зависимости признака от пола показатели анализировались отдельно в группе мужчин и женщин. В случае влияния возраста на количественный параметр проводилась его корректировка, которая осуществлялась с помощью уровня линейной регрессии и рассчитывалась по формуле [Лильин Е.Т. и др., 1984]:

y=x+b(t0 -t)

где y - коррегированное значение исходной величины (х) признака;

t - возраст индивида

t0 - определенный возраст, к которому приводятся все значения;

b - коэффициент линейной регрессии признака по возрасту, который рассчитывается по формуле:

b=rxt/st2

где rxt - коэффициент корреляции признака с возрастом;

st - стандартное отклонение возраста в выборке.

Проверку на нормальность распределений осуществляли с помощью критерия Колмогорова-Смирнова и Лилифорса. В случае неравных дисперсий использовали непараметрические тесты Манна-Уитни, Краскела-Уоллиса и медианный тест [Лакин Г.Ф., 1990]. Сравнение дисперсий проводили по критерию Левене.

Расчеты гаметического неравновесия между парами молекулярно-генетических маркеров проводили по Hill W. G. (1974). Все расчеты осуществляли с помощью программ «STATISTICA for Windows 6.0» и «Microsoft Excel 7.0».

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Учитывая поставленные задачи, исследование включало три аспекта: изучение популяционной распространенности полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN, анализ связи исследованных генов с туберкулезом и поиск ассоциаций с патогенетически важными параметрами заболевания у русских жителей г. Томска. К настоящему времени получены результаты исследования аллельных вариантов генов подверженности к ТБ у тувинцев, выполненного по аналогичной схеме и с использованием того же набора полиморфизма генов [Рудко А.А. и др., 2003]. Это дало возможность провести сравнение полученных результатов между русскими жителями г. Томска и тувинцами.

3.1 Распространенность полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN среди здоровых лиц (контрольная группа)

В настоящее время во многих популяциях мира достаточно широко исследованы полиморфные варианты гена NRAMP1, и в меньшей степени изучена распространенность аллелей генов VDR, IL12B, IL1B, IL1RN [Рудко А.А. и др., 2003; Имангулова М.М. и др., 2004; Bellamy R. et al., 1998; Ryu S. et al., 2000; Cervino A.C.L. et al., 2000;. Gao P. S., 2000; Baghdadi J. et al., 2004; Liu W. et al., 2004;]. Результаты исследований показали, что полиморфизм этих генов вносит вклад в возникновение туберкулеза.

Однако известно, что восприимчивость к инфекционному заболеванию определяется одновременно многими генами с различным вкладом каждого из них в формирование того или иного патологического фенотипа. К тому же, один и тот же ген может участвовать в формировании чувствительности (или резистентности) к нескольким инфекционным заболеваниям. Вероятно, для каждого гена (и их ансамблей) существует свое «поле действия», которое модифицируется средой [Пузырев В.П., 2000]. Сочетания генов предрасположенности к болезни могут быть неодинаковы в популяциях, обусловливая различия в подверженности к заболеванию у разных народов. В связи с этим перспективным направлением исследований генетических основ предрасположенности к туберкулезу является изучение вкладов конкретных сочетаний аллелей в подверженность к болезни в различающихся как по расовой, так и по этнической принадлежности популяциях.

У здоровых жителей г. Томска распределение генотипов по всем изученным полиморфным вариантам гена NRAMP1 (469+14G/C, D543N, 1465-85 G/A, 274 C/T), VDR (B/b, F/f), а также генов интерлейкинов (полиморфизм 1188A/C гена IL12B, полиморфизм +3953 A1/A2 гена IL1B) соответствовало ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (РХВ), причем для большинства полиморфизмов наблюдаемая гетерозиготность (Hobs) превышала ожидаемую (Hexp) (табл.6). Лишь для частот генотипов VNTR полиморфизма гена IL1RN показано отклонение от ожидаемых при РХВ (?2=16,75 р=0,010). При этом наблюдаемое количество гомозигот А2А2 превышало ожидаемое в 2,5 раза, а уровень гетерозиготности был меньше ожидаемого (D= -0,280). Возможно, этот факт объясняется тем, что анализируемая популяционная группа индивидов была выбрана не случайным образом из общей популяции, а включала только здоровых в отношении туберкулезной инфекции.

Сравнение распространенности полиморфизма генов NRAMP1, IL12B, VDR, IL1B, IL1RN у здоровых от туберкулеза русских и тувинцев показало статистически значимые отличия между этими этническими группами, которые имели место в распределении, как частот аллелей, так и генотипов по большинству изученных генов (табл. 7). Максимальные отличия между сравниваемыми этническими группами выявлены для полиморфизма B/b гена VDR, VNTR полиморфизма гена IL1RN и 1188А/С гена IL12B.

Таблица 6. Частоты аллелей и генотипов исследованных генов у здоровых жителей г. Томска

Ген	Поли-морфизм	Гено-типы	N.O.	N.E.	Частота аллеля	?2 (df)	Hobs	Hexp	D
NRAMP1	469+14 G/C	GG GC CC	97 38 2	98,22 35,56 3,22	G= 0,847	0,44 (1)	0,277	0,260	+0,069
	D543N	DD DN NN	127 12 0	127,26 11,48 0,26	D= 0,957	0,01 (1)	0,086	0,083	+0,045
	1465-85 G/A	GG GA AA	73 47 15	68,98 55,04 10,98	G=0,715	2,60 (1)	0,348	0,408	-0,146
	274C/T	CC CT TT	80 34 2	81,11 31,78 3,11	C=0,836	0,37 (1)	0,293	0,274	+0,070
IL12B	1188 A/C	AA AC CC	85 43 1	87,92 37,15 3,92	A=0,826	2,75 (1)	0,333	0,288	+0,157
VDR	B/b	BB Bb bb	19 63 26	23,61 53,77 30,61	b=0,532	2,93(1)	0,583	0,498	+0,172
	F/f	FF Ff ff	42 54 17	42,13 53,73 17,13	F=0,611	0,00 (1)	0,478	0,476	+0,005
IL1B	+3953 A1/A2	A1A1 A1A2 A2A2	90 44 5	90,24 43,51 5,24	A1=0,806	0,00 (1)	0,317	0,313	+0,011
IL1RN	VNTR	A1A1 A1A2 A1A3 A1A4 A2A2 другие	93 27 4 3 12 1	86,49 40,94 3,96 2,20 4,84 1,57	A1=0,786 A2=0,186 A3=0,018	16,8* (6)	0,250	0,347	-0,280

Примечание. N.O. и N.E. - наблюдаемая и ожидаемая численности генотипов соответственно; ?2 - критерий для сравнения ожидаемого и наблюдаемого распределения генотипов; d.f. - число степеней свободы; Hobs и Hexp - соответственно наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность; D - относительное отклонение наблюдаемой гетерозиготности от ожидаемой; * - p < 0,05

Таблица 7. Частоты аллелей и генотипов исследованных генов у русских жителей г. Томска и тувинцев

Ген	Полимор-физм	Генотип / аллель	Русские N (%)	Тувинцы N (%)	p
1	2	3	4	5	6
NRAMP1	469+14 G/C	GG GC CC	97 (70,8) 38 (27,7) 2 (1,5)	224 (85,2) 36 (13,7) 3 (1,1)	0,002
		G	0,847	0,920	0,002
	D543N	DD DN NN	127 (91,4) 12 (8,6) 0 (0)	198 (75,3) 57 (21,7) 8 (3)	0,000
		D	0,957	0,861	0,000
	1465-85 G/A	GG GA AA	73 (54,1) 47 (34,8) 15 (11,1)	162 (61,6) 88 (33,5) 13 (4,9)	0,057
		G	0,715	0,783	0,040
	274 C/T	CC CT TT	80 (69) 34 (29,3) 2 (1,7)	207 (78,7) 49 (18,6) 7 (2,7)	0,072
		C	0,836	0,880	0,127
IL12B	1188 A/C	AA AC CC	85 (65,9) 43 (33,3) 1 (0,8)	104 (39,5) 119 (45,3) 40 (15,2)	0,000
		A	0,826	0,622	0,000
VDR	B/b	BB Bb bb	19 (17,6) 63 (58,3) 26 (24,1)	2 (0,8) 88 (33,5) 173 (65,7)	0,000
		b	0,532	0,825	0,000
	F/f	FF Ff ff	42 (37,2) 54 (47,8) 17 (15)	148 (56,3) 98 (37,3) 17 (6,4)	0,001
		F	0,611	0,749	0,000
IL1B	+3953 A1/A2	A1A1 A1A2 A2A2	90 (64,7) 44 (31,7) 5 (3,6)	197 (74,9) 61 (23,2) 5 (1,9)	0,086
		A1	0,806	0,865	0,035
IL1RN	VNTR	A1A1 A1A2 A2A2 другие	93 (66,4) 27 (19,3) 12 (8,6) 8 (5,7)	190 (72,5) 31 (11,8) 1 (0,4) 40 (15,3)	0,000
		A1 A2 A3	0,786 0,186 0,018	0,849 0,069 0,013	0,000

Примечание. N - численность лиц с соответствующими генотипами; р достигнутый уровень значимости

У русских г. Томска по сравнению с тувинцами аллели b гена VDR и А1 гена IL1RN встречались реже, а аллель 1188А гена IL12B - чаще. Кроме того, рассматриваемые популяционные группы статистически значимо различались по частотам аллелей и генотипов полиморфизмов 469-14G/C, D543N гена NRAMP1 и F/f гена VDR. Так, у русских чаще, чем у тувинцев наблюдали аллель 543D и реже аллель 469+14G гена NRAMP1. Индивиды, гомозиготы и гетерозиготы по аллелю f гена VDR, чаще встречались среди жителей г. Томска. Распределение генотипов полиморфизма 1465-85G/A гена NRAMP1 и +3953A1/A2 гена IL1B в исследованных популяционных группах не отличалось, однако частоты аллелей этих полиморфизмов были статистически значимо ниже у русских. Лишь для варианта 274С/Т гена NRAMP1 не найдено отличий по частотам аллелей и генотипов у русских и тувинцев.

К настоящему времени накоплены результаты многочисленных исследований роли генов-кандидатов туберкулеза в патогенезе заболевания у представителей различных этнических групп. Это позволило провести сравнительный анализ частот генотипов между русскими г. Томска и другими изученными популяциями мира. Найдены статистически значимые отличия русских от других этносов по частотам аллелей генов NRAMP1, VDR, IL12B (табл. 8).

Частота аллеля 469+14G NRAMP1 у жителей г. Томска оказалась статистически значимо ниже, чем у африканцев из Гамбии, но выше, чем у китайцев [Bellamy R. et al., 1998; Liu W. et al., 2004]. Самым широко исследованным полиморфизмом гена NRAMP1 оказался D543N. Во все изученных популяциях этот генный маркер был низко полиморфным. Русские отличались по частоте аллелей D543N от коренных жителей Башкирии, у которых аллель 543N вообще не обнаружен [Имангулова М.М. и др., 2004]. При сравнении с другими исследованными популяциями (китайцы, корейцы, японцы, татары, гамбийцы) статистически значимых отличий для этого полиморфного варианта не показано (рис. 2, табл. 8) [Имангулова М.М. и др., 2004; Bellamy R. et al., 1998; Ryu S. et al., 2000; Gao P. S. et al., 2000; Liu W. et al., 2004].

Рис. 2. Частоты аллелей гена NRAMP1 у русских г. Томска и в других популяциях мира (по данным литературы). * - р < 0,05

Таблица 8. Частоты аллелей генов-кандидатов туберкулеза в различных популяциях мира в сравнении с русскими г. Томска

NRAMP1 / 469+14 G/C
Популяции	Китайцы	Гамбийцы
Частота ал. ?2 (p)	G=0,785 3,83 (0,050)	G=0,934 18,65 (0,000)
NRAMP1 / D543N
Популяции	Китайцы	Корейцы	Японцы	Гамбийцы	Татары	Башкиры
Частота аллеля ?2 (p)	D=0,981 1,84 (0,175)	D=0,925 2,38 (0,123)	D=0,933 1,30 (0,254)	D=0,948 0,16 (0,690)	D=0,983 0,94 (0,333)	D=1,00 5,57 (0,018)
VDR / F/f
Популяции	Китайцы	Индийцы (Лондон)
Частота аллеля ?2 (p)	F=0,604 0,01 (0,935)	F=0,806 20,28 (0,000)
IL1B / +3953A1/A2
Популяции	Индийцы (Лондон)
Частота аллеля ?2 (p)	A1=0,794 0,05 (0,825)
IL1RN / VNTR
Популяции	Индийцы (Лондон)
Частота аллеля ?2 (p)	A1=0,719 A2=0,241 A3=0,039 A4=0 7,15 (0,067)
IL12B / 1188A/C
Популяции	Англичане	Камерунцы	Греки	Ирландцы
Частота аллеля ?2 (p)	А=0,835 0,06 (0,812)	А=0,625 18,37 (0,000)	А=0,789 0,98 (0,323)	А=0,802 0,23 (0,629)

Примечание. ?2 - критерий использован для сравнения частот аллелей; р - достигнутый уровень значимости

Рис. 3. Частоты аллелей полиморфизма F/f гена VDR, +3953A1/A2 гена IL1B, VNTR гена IL1RN у русских г. Томска и в других популяциях (по данным литературы). * - р < 0,05

Не показано различий при сравнении частот аллелей полиморфизма F/f гена VDR у русских г. Томска и китайцев [Liu W. et al., 2004]. Однако при сравнении с индийцами Лондона найдены статистически значимые отличия [Wilkinson R.J. et al., 2000]. В исследованной выборке русских аллель F гена VDR встречался реже (рис. 3, табл. 8).

Для полиморфных вариантов +3953А1/А2 гена IL1B и VNTR гена IL1RN не выявлено отличий частот аллелей у русских и индийцев Лондона. Аллель 1188А гена IL12B у жителей г. Томска встречался чаще, чем у камерунцев (?2 =18,37 р=0,000). Не выявлено различий в распространенности этого маркера при сравнении с англичанами, ирландцами и греками (рис. 4, табл. 8) [Hall M.A. et al., 2000].

Установленные различия частот аллелей сравниваемых генов между русским населением г. Томска и другими популяциями мира свидетельствуют об этнической специфичности генов-кандидатов подверженности к туберкулезу. Возможно, это является одной из причин дифференциальной распространенности ТБ в этнических группах. Интересными представляются выявленные отличия по частотам аллелей для всех анализируемых маркеров у русских г. Томска при сравнении с жителями Тувы. Кроме того, известно, что по частотом аллелей рассматриваемых генов тувинцы значительно отличались не только от русских, но и от представителей иных популяционных групп [Рудко А.А. и др., 2003]. Вероятно, этот факт обусловлен длительной изоляцией тувинцев от других этносов, что привело к формированию уникального генофонда [Пузырев В.П. и др., 1999].



Рис. 4. Частоты аллелей полиморфизма 1188А/С гена IL12B у русских г. Томска и в других популяциях мира (по данным литературы). * - р < 0,05

Известно, что между неаллельными генами, расположенными близко на хромосоме, может возникнуть неравновесие по сцеплению в силу того, что в процессе мейоза кроссинговер между ними происходит реже, чем между далеко расположенными локусами. К тому же, под воздействием факторов популяционной динамики (естественного отбора) «сцепленными» могут оказаться гены, локализованные на разных хромосомах [Животовский Л.А., 1984]. Поэтому был проведен анализ гаметического неравновесия между исследованными полиморфными вариантами.

Известно, что гены NRAMP1, IL1B и IL1RN расположены на длинном плече второй хромосомы, ген VDR - на двенадцатой, а ген IL12B - на пятой хромосоме. У русских г. Томска установлено, что в неравновесии по сцеплению находятся четыре пары полиморфизмов гена NRAMP1: 469+14G/C и 274C/T, 469+14G/C и 1465-85G/A, 274C/T и 1465-85G/A, D543N и 1465-85G/A (табл. 9). Во всех случаях неравновесия в фазе притяжения были часто встречающиеся аллели.

Полиморфизм 274С/Т расположен в третьем экзоне гена, а 469+14G/C - в четвертом интроне. Такая локализация их в гене легко обьясняет наблюдаемое между ними сцепление (+0,104). Полиморфизм 1465-85G/A и D543N находятся в 13 интроне и 15 экзоне соответственно, что обусловливает неравновесие по сцеплению между ними (+0,017). Сила сцепления между полиморфизмом 1465-85G/A и вариантами 469+14G/C, 274C/T была примерно на одном уровне и составила +0,078 и +0,085, соответственно. Интересным представляется тот факт, что пары полиморфизмов гена NRAMP1, оказавшихся в неравновесии по сцеплению, были идентичны у тувинцев и русских [Рудко А.А., 2004]. Кроме того, у жителей г. Томска, в фазе притяжения оказались аллели гена VDR: b и F, сила сцепления между ними составила +0,053.

Аллельный вариант F/f гена VDR у русских оказался в фазе отталкивания с полиморфизмами 469+14G/C, 274C/T, 1465-85G/A гена NRAMP1, мера неравновесия для них была -0,040, -0,039, -0,058, соответственно. Во всех случаях в фазе отталкивания оказались часто встречаемые аллели.

Таблица 9. Неравновесие по сцеплению между парами исследованных полиморфных вариантов генов у русских г. Томска

Ген	NRAMP1	IL12B	VDR	IL1B	IL1RN
Ген	Полимор-физм	469+14G/C	274C/T	1465-85 G/A	D543N	1188 A/C	F/f	B/b	+3953 A1/A2	VNTR
NRAMP1	469+14 G/C	-	+0,104	+0,078	+0,078	-0,009	-0,040	-0,012	-0,030	+0,002
	274C/T	70,39	-	+0,085	+0,002	-0,019	-0,039	-0,003	-0,026	+0,003
	1465-85 G/A	29,94	29,79	-	+0,017	-0,041	-0,058	-0,027	-0,014	+0,016
	D543N	1,54	0,085	4,69	-	+0,001	-0,010	-0,005	-0,001	+0,013
IL12B	1188A/C	0,505	1,88	7,08	0,029	-	+0,011	+0,016	+0,018	-0,000
VDR	F/f	6,12	4,92	7,68	1,05	0,361	-	+0,053	-0,012	+0,008
	B/b	0,465	0,03	1,47	0,221	0,730	4,65	-	+0,006	-0,010
IL1B	+3953 A1/A2	5,88	3,63	0,747	0,017	1,85	0,371	0,104	-	-0,023
IL1RN	VNTR	0,024	0,042	0,890	3,08	0,001	0,162	0,217	2,65	-

Примечание. Над центральной диагональю указаны значения меры неравновесия по сцеплению (D), под диагональю - соответствующее значение ?2 для теста на неравновесие по сцеплению. Выделены величины, для которых достигнутый уровень значимости составил 5% и менее

Также в фазе отталкивания находились аллели 1465-85G гена NRAMP1 и 1188А гена IL12B, 469+14G гена NRAMP1 и +3953А1 гена IL1B, мера сцепления для них была -0,041 и -0,030.

Естественный отбор в теории популяционной генетики является важнейшим ф...