Реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени

Реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение

14.00.16 - патологическая физиология

03.00.13 - физиология

кандидата биологических наук

Шаинидзе Кристина Зурабовна

Санкт-Петербург - 2009

Работа выполнена в отделе Общей патологии и патофизиологии, Научно-исследовательском институте Экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской Академии Медицинских Наук и на кафедре анатомии и физиологии человека и животных Российского Государственного Педагогического Университета им. А.И. Герцена

Научные руководители:

Академик РАМН Корнева Елена Андреевна

Д.б.н. проф. Даринский Ю.А.

Официальные оппоненты:

1. Чернышева Марина Павловна, доктор биологических наук, профессор кафедры физиологии общей физиологии человека и животных Санкт-Петербургского Государственного Университета.

2. Петрищев Николай Николаевич, доктор медицинских наук, заведующий кафедрой патофизиологии Санкт-Петербургского медицинского университета им. И.П. Павлова.

Ведущая организация:

Российская Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова.

Защита состоится «23» июня 2009 г. в «11» часов на заседании диссертационного совета Д001.022.02 при Научно-исследовательском институте Экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке Научно-исследовательского института Экспериментальной медицины СЗО РАМН по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, д. 12.

Автореферат разослан «22» мая 2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

д.м.н. П.А. Дыбан

Общая характеристика работы

экспрессия препроорексин гипоталамус нейрон

Актуальность проблемы. На протяжении многих десятилетий главной задачей нейроиммунофизиологии являлось изучение возможных связей между нервной и иммунной системами. Применение прецизионных методов молекулярно-биологического и молекулярно-генетического анализа в сочетании с иммуногистохимическими методами исследования дало возможность оценить вовлеченность различных структур мозга, а также степень участия различных биологически активных веществ, вырабатываемых нервными клетками, в механизмах реализации нейроиммунных взаимодействий.

В настоящее время широко изучается влияние стресса на функции нервной и иммунной систем. Стресс-индуцированные изменения в работе этих систем исследуются на экспериментальных моделях и в клинической практике у пациентов после длительных психоэмоциональных переживаний. Имеется большое количество работ, отражающих возможность позитивного и негативного эффектов действия стресса на защитные функции организма (Rybakina E.G. et al., 1996; Shanin S.N. et al., 2005; Sheridan J.F. et al., 1991; Brenner G.J. and Moynihan J.A., 1997; Glaser, R. Et al., 1990), причем характер их влияния зависит от интенсивности и длительности стрессорного воздействия, а также от исходного функционального состояния (Меерсон и др., 1984; Фролов., Б.А., 1987; Rybakina E.G. et al., 1997). Применение подобных моделей экспериментального стрессорного воздействия позволяет изучить и возможную роль различных нейромедиаторов и нейропептидов в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия.

Есть основания полагать, что открытые в 1998 году нейромедиаторы орексин А и орексин В могут принимать участие в реализации реакции мозга на стрессорные воздействия. Установлено, что основное количество орексин-содержащих нейронов расположено в области латерального гипоталамического поля (LHA) (De Lecea L. et al., 1998). Небольшое количество их также представлено в паравентрикулярном (PVN), дорзомедиальном (DMH) ядрах и заднем поле гипоталамуса (PH) ( Peyron C., 1998).

С помощью иммунногистохимического метода выявления c-Fos белка и орексина А в клетках мозга установлена избирательность реакции орексин-содержащих нейронов при различных стресс-индуцирующих воздействиях. Показано, что данные воздействия приводят к активации доли орексин-содержащих нейронов гипоталамуса, которая варьируется в зависимости от силы и длительности применяемого воздействия (Moriguchi T., 1999; Kurose T. et al., 2002; Estabrooke I.V. et al., 2001; Zhu L. et al., 2002). При охлаждении и ограничении подвижности молодых крыс показано увеличение количества c-Fos-позитивных орексин-содержащих клеток гипоталамуса на 15 и 24 % соответственно (Ida T. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004), тогда как применение болевого разражения активирует более 90% орексин-позитивных нейронов гипоталамуса (Zhu L. et al., 2002). Однако изменения интенсивности синтеза м-РНК препроорексина не столь однозначны: при ограничении подвижности, охлаждении, гипогликемии и ограничении питания количество м-РНК препроорексина возрастает, тогда как при реакциях страха - напротив снижается (Ida T., et al. 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kurose T. et al., 2002; Zhu L. et al., 2002). По-видимому, избирательность реагирования орексин-содержащих нейронов на стрессорные воздействия разного рода, может быть связана с функциональными различиями популяции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса.

Внутрижелудочковое введение орексина ведет к стимуляции секреции адренокортикотропного гормона (АКТГ) (Ida T. et al., 2000; Sakamoto F. et al., 2004; Kuru M., et al. 2004; Samson W.K., 2002), активации ГГАС (Kuru M. et al., 2004), повышению уровня кортикостерона в плазме крови (Kuru M. et al., 2004; Kurose T., et al., 2002; Jaszberenyi M., et al., 2000; Jaszberenyi M., et al., 2001; Hagan J.J., et al., 1999; Al-Barazanji K.A., et al., 2001; Russell S.H., et al., 2001; Mullett M.A., et al., 2000), а также увеличению количества с-Fos-позитивных нейронов в мелкоклеточной части PVN, на мембранах которых были обнаружены рецепторы к орексинам (Trivedi P. et al., 1998).

Появившиеся в последнее время данные свидетельствуют о том, что орексин-содержащие нейроны помимо участия в ответе на стрессорные воздействия, вовлечены в процесс терморегуляции и теплопродукции (Monda M, 2001; Monda M, 2003; Monda M, 2003; Monda M, 2004; Jaszberenyi M, 2002; Digby J. E., 2006; Szйkely M, 2002). Однако, данные работ, в которых показана причастность орексин-содержащих нейронов к процессу терморегуляции, неоднозначны. Известно, что дорзомедиальное (DMH) и паравентрикулярное (PVH) ядра, а также латеральное и заднее (PH) гипоталамические поля, в которых представлены орексин-содержащие нейроны, имеют причастность к процессу теплопродукции (Imai-Matsumura K. et al 1984; Amir, 1990; Zaretskaia, 2002; Cao 2004, Tanaka, et al 2001). При разных условиях внутрижелудочковое введение орексина А может вызывать как повышение температуры животного, так и понижение (Monda M, 2001; Monda M, 2003; Monda M, 2003; Monda M, 2004; Jaszberenyi M, 2002; Digby J. E., 2006; Szйkely M, 2002). У мышей, ноккаутных по гену препроорексина отсутствуют циркадные изменения температуры тела (Mochizuki T., 2005). Наряду с данными, свидетельствующими о действии орексина на процесс терморегуляции, известны и данные о контролирующем действии коры на терморегуляционный эффект орексина: подавление активности коры во фронтальной области блокирует повышение температуры тела, вызванное внутрижелудочковым введением орексина А (Monda M., 2004). Кроме того внутрижелудочковое введение орексина А снижает лихорадку, вызванную введением LPS (Jaszberenyi M., 2002).

Известно, что ограничение подвижности, охлаждение животных и комбинированный стресс (ограничение подвижности в сочетании с охлаждением) запускают ярко выраженную стрессорную реакцию, инициируя значительные изменения содержания в плазме крови катехоламинов и глюкокортикоидов (Sheridan et al., 1991; Pacak K., 2001). Таким образом, применение адекватной экспериментальной модели стресс-индуцирующего воздействия позволит расширить представления о степени участия орексин-содержащих нейронов гипоталамуса в развитии комплекса реакций, протекающих в мозге в процессе формирования ответа на стрессорное воздействие. Решение данного вопроса представляется актуальным для фундаментальной науки и направлено на раскрытие механизмов реализации реакции нейронов гипоталамуса, синтезирующих орексин, на изменения, происходящие в центральной нервной системе на фоне стрессорного воздействия.

Целью данной работы явилось изучение реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса на экспериментальное ограничение подвижности и охлаждение животного.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Исследовать динамику экспрессии гена препроорексина по синтезу м-РНК препроорексина в клетках гипоталамуса крыс во время и после ограничения подвижности, а также во время и после комбинированного воздействия - ограничения подвижности и охлаждения.

2. Определить иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, локализованных в различных структурах и зонах перифорникальной области латерального гипоталамуса, при ограничении подвижности крыс и при комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении.

3. Установить паттерн реакций структур и зон гипоталамуса, в которых представлены орексин-содержащие нейроны, характерный для проявления ответа мозга на данные виды стрессорных воздействий.

4. Проанализировать возможные механизмы развития морфо-функциональных изменений орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при ограничении подвижности крыс и при комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении на основе результатов сочетанного исследования изменений экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе и иммуногистохимических особенностей орексин-содержащих нейронов.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Уровень экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса возрастает в 5.5 раз через 1 час после окончания ограничения подвижности крыс и нормализуется через 1 час после охлаждения на фоне ограничения подвижности.

2. Изменения иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, после примененных стрессорных воздействий, происходят только в определенных структурах и зонах гипоталамуса крыс, представленных на срезах мозга 29-го уровня.

3. Ограничение подвижности приводит к снижению иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных в LHAd на срезах мозга 28-го уровня; в LHAm на срезах мозга 29-го уровня; и к повышению иммунореактивности этих нейронов в DMHa, LHAs на срезах мозга 29-го уровня, а также в PH на срезах мозга 31 уровня (согласно атласу мозга Swanson L.W).

4. Сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения приводит к повышению иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в LHAjd, LHAd, локализованных на срезах мозга 28-го уровня и понижению иммунореактивности таких нейронов в PH на срезах мозга 31 уровня.

5. Картирование орексин-позитивных нейронов в различных структурах гипоталамуса и определение уровня экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса крыс при ограничении подвижности и его сочетании с охлаждением, позволило выявить функциональную дискретность орексин-содержащих нейронов, локализованных в различных структурах и зонах гипоталамуса.

6. Снижение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных в отдельных структурах и зонах гипоталамуса, при одновременном повышенном уровне экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса свидетельствует о нарушении баланса между синтезом и потреблением орексина в этих нейронах и вовлеченности данных структур в реализацию реакций мозга на примененные стрессорные воздействия.

Научно-практическое значение. Работа является приоритетным экспериментальным исследованием и этапом в развитии нового научного направления по изучению участия нейромедиатора орексина в механизмах реализации реакций мозга на стрессорные воздействия. При помощи сочетанного применения методов оценки экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса и иммуногистохимического выявления орексина в нейронах перифорникальной гипоталамической области впервые проведен детальный анализ реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и охлаждение. Определен паттерн вовлечения этих нейронов, локализованных в различных структурах гипоталамуса крыс, в процесс реализации реакции мозга на ограничение подвижности и охлаждение. Выявлена дискретность функциональных изменений, происходящих в орексин-содержащих нейронах, представленных в структурах гипоталамуса крыс, при ответе на данные стрессорные воздействия. Определены структуры и зоны гипоталамуса крыс, в которых наблюдается нарушение баланса синтеза и утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах при ограничении подвижности и охлаждении. Результаты работы расширяют и дополняют сложившиеся в настоящее время представления о системе орексин-эргичеких нейронов и могут быть использованы в научной практике, связанной с исследованием клеточных и молекулярных механизмов формирования ответа организма на стрессорное воздействие, а также могут войти в курс преподавания по физиологии, патофизиологии, нейрофизиологии и иммунологии.

Апробация работы. Материалы исследования изложены в 6 публикациях, в том числе представлены на Российских и Международных конференциях:

1. Второй Санкт-Петербургский Международный экологический форум «Окружающая среда и здоровье человека» 1 - 4 июля 2008 года, Санкт-Петербург, Россия

2. 4-й Объединенный Иммунологический Форум 30 июня - 3 июля, Санкт-Петербург, Россия

3. Международная конференция «Физиология и патология иммунной системы» 15-17 сентября 2008 годаб Москва, Россия.

4. Межвузовская конференция молодых ученых «Герценовские чтения» 13-16 апреля 2008 года.

Структура и объем работы: Диссертация изложена на 132 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов работы, результатов собственных исследований, выводов и списка цитируемой литературы из 258 источников, из них 249 - зарубежных авторов. Работа проиллюстрирована 17 рисунками и 5 таблицами.

Материалы и методы исследования

Работы была выполнена на 80 крысах-самцах, породы Wistar, весом 200-250г. Опыты начинали в 11 часов утра с целью нивелирования различий, связанных с суточными колебаниями содержания орексина в клетках гипоталамуса. Экспериментальные животные были поделены на 2 группы. I-ой группе животных ограничивали подвижность в течение 1 часа. II группе также ограничивали подвижность в течение часа, но после первых 20 минут они подвергались охлаждению: - 20 С. в течение 20 минут. После охлаждения животные II группы находились в контейнерах, ограничивающих подвижность оставшиеся 20 минут. Взятие материала проводили через 20, 40, 60, 90, 120 минут от начала опыта. По завершению опыта животные были наркотизированы фенобарбиталом (в/б 60мкг/кг веса животного). В качестве контроля использовали интактных животных, которых наркотизировали фенобарбиталом (в/б 60мкг/кг веса животного) одновременно с экспериментальными.

Для проведения полимеразно-цепной реакции в реальном времени (PCR RT) по завершению опыта у наркотизированных крыс извлекали мозг и помещали в Purezol (BioRad). Выделение пула РНК клеток гипоталамуса производилось с помощью набора «Aurum Total RNA Fatty and Fibrous Tissue Pack» (Bio-Rad). Реакция синтеза к-ДНК/Обратная Транскрипция (ОТ) осуществлялась с использованием набора One Step RT PCR Kit (BioRad). Для проведения реакции использовались праймеры, рассчитанные по программе и произведенные лабораторией «СинТол». Регистрация длины продукта была проведена методом электрофореза в агарозном геле. Контроль над ходом реакции и регистрацию данных производили с помощью ПК и программы «Opticon Monitor 3.1». Уровень экспрессии гена препроорексина определяли относительно уровня экспрессии гена глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы и рассчитывали по формуле встроенным программным обеспечением амплификатора.

Для иммуногистохимического анализа животных подвергали интракардиальной перфузии с последующим приготовлением замороженных срезов мозга. Детекцию орексин-содержащих нейронов гипоталамуса осуществляли авидин-биотиновым методом с применением кроличьих антител к орексину А (1:5000) (Sigma) и моноклональных анти-кроличьих иммуноглобулинов (клон RG-16), конъюгированных с биотином (1:1000) (Sigma), выявление которых проводили с помощью авидин-пероксидазной метки. В качестве субстрата для пероксидазы использовали 3'3 диаминобензидин (DAB) (Sigma). При анализе иммуногистохимически окрашенных срезов мозга оценивали количество орексин-позитивных клеток во всех структурах, соотвтетствующих 25-32 уровням срезов гипоталамуса в соответствии с атласом мозга крыс (Swanson L.W., 1992). Окрашивание срезов мозга всех групп животных, проводили одновременно. Время окраски было строго стандартизировано. При подсчете клеток, учитывали только клетки, с четко окрашенными контурами и наполненные гранулами с орексином не меньше чем на 1/3 клетки. Результаты экспериментов обрабатывали с помощью стандартных методов вариационной статистики. Достоверность различий оценивали по t-зависимому критерию Стьюдента. Подсчеты данных и построение гистограмм выполнены на IBM PC при помощи программы Excel.

Результаты исследований и их обсуждение

Измерение уровня экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс при ограничении подвижности и охлаждении.

Для определения реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на применяемые стрессорные воздействия проводили исследование динамики изменения синтеза орексина косвенно по изменению уровня экспрессии гена препроорексина (Рис.1). У интактных животных в период с 11-40 до 13-00 часов в клетках гипоталамуса крыс происходит постепенное увеличение экспрессии гена препроорексина. Относительный уровень экспрессии гена препроорексина у интактных животных в 12-00 был в 3.6 раза выше по сравнению с ее уровнем у интактных животных в 11-40. Затем в 12-30 уровень экспрессии гена препроорексина значительно снижался (в 8 раз) и снова возрастал к 13-00.

Сразу после окончания ограничения подвижности уровень экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса уменьшается в 10 раз по сравнению с его уровнем у интактных животных (Рис 1), а через 1 час - увеличивается в 5.7 раз по сравнению с его уровнем у интактных животных.



Рисунок 1 Относительный уровень экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс породы Wistar при ограничении подвижности и охлаждении.

По оси ординат - (Y) - уровень экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс; по оси абсцисс (X) - время опыта.

Группы животных:

¦- интактные;

подвергнутые:

¦- ограничению подвижности,

¦- ограничению подвижности и охлаждению

*p < 0.05, **p < 0.005 по сравнению с уровнем экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе у интактных животных, взятых в опыт в предыдущий срок; # p < 0.05, ## p < 0.005 по сравнению с уровнем экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе у интактных животных; ¦ p < 0.05 по сравнению с уровнем экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе у животных, подвергнутых ограничению подвижности.

Анализ интенсивности экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс при комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении - выявил снижение количества м-РНК препроорексина в 10 раз сразу после окончания стрессорного воздействия по сравнению с его уровнем у животных контрольной группы (животные, подвергнутые ограничению подвижности) (рис.1). Через 30 минут сохраняется значительное снижение уровня экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс, а через 1 час констатировано снижение уровня экспрессии гена препроорексина в 6 раз в клетках гипоталамуса крыс по сравнению с его уровнем у животных контрольной группы.

Сравнение данных, полученных в результате анализа экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса, крыс позволяет заключить, что наиболее значительные изменения интенсивности его экспрессии наблюдаются сразу и через час после окончания стрессорных воздействий. Поэтому в следующей серии экспериментов явился иммуногистохимический анализ реакции орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс на ограничение подвижности и комбинированное воздействие (ограничение подвижности и охлаждение) проводили через час после их окончания.

Орексин-позитивные нейроны гипоталамуса после ограничения подвижности и охлаждения.

Орексин-содержащие нейроны характеризуются разнообразием форм: сферическая, эллипсоидная, треугольная. У интактных животных нейроны заполнены орексиновыми гранулами, имеют четко окрашенные контуры. Показано, что орексин-содержащие нейроны локализованы, главным образом, в перифорникальной области латерального гипоталамического поля (LHA). Небольшое количество их также представлено в паравентрикулярном (PVN), дорзомедиальном (DMH) ядрах и заднем поле гипоталамуса (PH). В гипоталамусе интактных крыс орексин-содержащие нейроны расположены в структурах, представленных на срезах мозга с 25 по 32 уровни. Максимальное количество орексин-позитивных клеток располагается в структурах, локализованных на срезах мозга 28-го, 29-го, 30-го уровней.

У животных после ограничения подвижности происходит снижение степени иммунореактивности орексин-позитивных нейронов в структурах гипоталамуса, расположенных на 28 уровне среза мозга крыс, что проявляется в снижении степени визуализации орексин-позитивных нейронов, локализованных в этой области и соответственно уменьшении количества определяемых орексин-позитивных нейронов. То есть значительная часть орексин-позитивных клеток на срезах мозга у животных экспериментальной группы содержит меньше орексина в сравнении с его содержанием в орексин-позитивных клетках гипоталамуса интактных животных, что на срезах проявлялось снижением общего количества нейронов, в которых иммуногистохимически выявляли орексин. При анализе общего количества иммунореактивных орексин-содержащих нейронов у экспериментальных животных после ограничения подвижности определено изменение степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов (Таблица 2). Как видно из таблицы, в структурах гипоталамуса, локализованных на срезах, относящихся к 28 уровню мозга крыс, иммунореактивность орексин-содержащих нейронов снижена на 17%. В противоположность этому на срезах мозга 31 уровня, выявлено увеличение количества орексин-позитивных нейронов на 19% (Рис 2). При комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении - у экспериментальных животных на 31 % повышается количество орексин-позитивных нейронов в структурах гипоталамуса, расположенных на срезах мозга 28-го уровня (Рис. 2). В структурах гипоталамуса, локализованных на 31 уровне среза мозга крыс, наблюдается тенденция к снижению степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов (13 %). Изменений иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в структурах гипоталамуса, расположенных на 29, 30 и 32 уровнях срезов, не выявлено.

Таблица 1 Общее количество орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс, локализованных на срезе мозга определенного уровня, при ограничении подвижности и сочетанном применении ограничения подвижности и охлаждения.

Животные (n=6)	Средние значения количества орексин-позитивных нейронов в структурах, представленных на срезе мозга конкретного уровня
	28	29	30	31	32
Интактные	116,1±5,3	106,5±5,6	76,1±4,7	49,5±3,6	18,7±2,8
Подвергнутые ограничению подвижности	95,9±6,2*	108,0±7,6	85,1±6,3	58,9±2,8*	19,3±2,6
Подвергнутые ограничению подвижности и охлаждению	126,1±5,1##	114,7±14,3	81,5±4,9	51,6±6,5	24,2±3,7

Уровни срезов мозга указаны в соответствии с атласом мозга крыс Swanson's, 1992.* -- P<0,05; степень достоверности различий между средним количеством орексин-позитивных нейронов, расположенных на определенном срезе, в гипоталамусе интактных и подвергнутых воздействию животных; ## -- P<0,005 степень достоверности различий между количеством орексин-позитивных нейронов, расположенных на определенном срезе в гипоталамусе животных, подвергнутых ограничению подвижности и ограничению подвижности и охлаждению.



Рисунок 2 Количество орексин-позитивных нейронов в перифорникальной зоне латерального гипоталамуса крыс через 1 час после окончания ограничения подвижности и охлаждения. По оси ординат - (Y) - абсолютное количество орексин-позитивных нейронов на срезе; по оси абсцисс (X) -уровни срезов мозга крыс по атласу Swanson L.W.

Группы животных:

¦- интактные;

подвергнутые:

¦- ограничению подвижности,

¦- ограничению подвижности и охлаждению

*p < 0.05 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у интактных животных; ##p < 0.005 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у животных через час после ограничения подвижности.

Распределение орексин-содержащих нейронов в различных структурах гипоталамуса крыс при ограничении подвижности и сочетанном применении ограничения подвижности и охлаждения.

Как уже было отмечено выше, орексин-содержащие нейроны в основном расположены в LHA, DMH, PH. Для оценки особенностей распределения орексин-содержащих нейронов в гипоталамусе был произведен подсчет орексин-позитивных нейронов, локализованных в разных структурах (Рис 3).

Дифференцированное определение количества орексин-позитивных клеток в исследуемых структурах гипоталамуса позволило установить, что после ограничения подвижности животных иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, локализованных в LHA на срезах мозга 28-го уровня (Рис 3) снизилась на 17 % по сравнению с их количеством у интактных животных. После применения комбинированного воздействия количество орексин-содержащих нейронов, локализованных в LHA на срезах мозга 28-го уровня, повысилось на 29 % по сравнению с их количеством у животных после ограничения подвижности (Рис 3).

Рисунок 3. Количество орексин-позитивных нейронов, локализованных в латеральном гипоталамическом поле (LHA), дорзомедиальном ядре гипоталамуса (DMH), заднем гипоталамическом поле (PH) крыс через 1 час после ограничения подвижности и охлаждения.

По оси ординат - (Y) - количество орексин-позитивных нейронов в конкретных структурах, расположенных срезе мозга определенного уровня; по оси абсцисс (X) -уровни срезов мозга крыс по атласу Swanson L.W.

Группы животных:

¦- интактные;

подвергнутые:

¦- ограничению подвижности,

¦- ограничению подвижности и охлаждению

*p < 0.05 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у интактных животных; #p < 0.05, ##p < 0.005 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у животных через час после ограничения подвижности.

В области DMH на срезах мозга 29-го уровня количество орексин-позитивных нейронов после ограничения подвижности животных повысилось на 39% по сравнению с их количеством у интактных животных (Рис. 3). В DMH на срезах 31 уровня количество орексин-позитивных нейронов в этих условиях повышается на 138% по сравнению с их количеством орексин-позитивных нейронов у животных контрольной группы. После применения комбинированного воздействия количество визуализированных орексин-содержащих нейронов, локализованных в DMH на срезах мозга 28-го уровня, увеличилось на 65% (Рис. 3).

Распределение орексин-позитивных нейронов, локализованных в различных зонах исследуемых структур гипоталамуса, при ограничении подвижности и комбинированном воздействии - ограничении подвижности и охлаждении.

Анализ количества орексин-позитивных клеток в различных зонах определенных структур гипоталамуса (LHA, DMH, PH, PVH) позволил установить, что их количество изменяется по-разному в различных зонах одних и тех же структур после стрессорных воздействий.

Анализ количества орексин-содержащих клеток, локализованных в определенных зонах структур гипоталамуса, расположенных срезов мозга 28-го уровня крыс, позволил выявить снижение иммунореактивности нейронов только в LHAd на 31% через 1 час после окончания ограничения подвижности (Рис. 4). Применение комбинированного воздействия привело к повышению степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, локализованных на срезах мозга 28-го уровня, которое наблюдается в зонах LHAd (59%), DMH (65%), LHAjd (41%) (Рис. 4). В тех же структурах мозга, локализованных на срезах мозга крыс 29-го уровня, количество орексин-позитивных нейронов гипоталамуса после ограничения подвижности животных оставалось без изменений.

Однако, при анализе изменений иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в различных зонах тех же структур после данного воздействия, выявлены различия. В LHA на срезах мозга 28-го уровня количество иммунореактивных орексин-содержащих нейронов увеличивалось на 76% в области LHAs, тогда как в области LHAm происходило снижение числа орексин-позитивных клеток на 63% (Рис. 4).



Рисунок 4 Изменение иммунореактивности орексин-позитивных нейронов в зонах определенных структур гипоталамуса крыс.

По оси ординат - (Y) - количество орексин-позитивных нейронов в структурах, расположенных на срезе; по оси абсцисс (X) -зоны и структуры гипоталамуса, согласно по атласу Swanson L.W.

Группы животных:

¦- интактные,

подвергнутые:

¦- ограничению подвижности,

¦- ограничению подвижности и охлаждению

*p < 0.05 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у интактных животных; #p < 0.05, ##p < 0.005 по сравнению с количеством орексин-позитивных клеток у животных через час после ограничения подвижности.

В структурах гипоталамуса крыс, локализованных на срезах мозга 29-го уровня, после применения комбинированного воздействия изменения отмечаются в области LHAm, в которой количество иммунореактивных орексин-содержащих нейронов увеличивается на 135% (Рис 4). Количество орексин-позитивных клеток, представленных в структурах гипоталамуса на срезах мозга 31-го уровня, после ограничения подвижности повысилось на 19 %, главным образом, за счет увеличения степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов в дорзальной части PH на 41% (Рис 4).

В дорзальной части PH степень иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, расположенных на срезах мозга 31-го уровня крыс, понизилась на 39 %. Однако, в области DMH количество орексин-позитивных нейронов повысилось на 138%. Таким образом, можно заключить, что изменение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс, как при ограничении подвижности, так и при сочетанном применении ограничения подвижности и охлаждения, происходит преимущественно в структурах дорзальной части перифорникальной области гипоталамуса (Рис 5). Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса, локализованных в структурах под сводом головного мозга, не изменяется.

Детальный анализ гипоталамуса крыс на срезах мозга, соответствующих 29 уровню, после примененных стрессорных воздействий позволил установить наличие изменений иммунореактивности орексин-содержащих нейронов только в отдельных структурах и зонах гипоталамуса без изменений общего количества орексин-позитивных нейронов, локализованных на срезах данного уровня. В структурах гипоталамуса, локализованных на срезах мозга 29-го уровня, происходит увеличение количества орексин-позитивных нейронов на 76% в LHAs, а в LHAm - напротив, снижение на 63%. Таким образом, применение картирования орексин-содержащих нейронов по структурам и зонам гипоталамуса после примененных воздействий впервые позволило установить наличие функциональной дискретности популяции этих нейронов, не выявляемое при простом подсчете среднего количества орексин-позитивных нейронов, локализованных на одном срезе конкретного уровня и даже в одной структуре.

Сопоставление данных, полученных в результате изучения экспрессии гена препроорексина, с данными иммуногистохимического анализа иммунореактивности орексин-содержащих нейронов гипоталамуса позволяет заключить, что наблюдаемое после ограничения подвижности увеличение уровня м-РНК препроорексина в структурах гипоталамуса ассоциируется с увеличением количества орексин-позитивных нейронов, локализованных в структурах PH, DMHa, и верхней части LHA. Однако, несмотря на повышенный синтез м-РНК препроорексина в гипоталамусе крыс при ограничении подвижности, иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, локализованных в LHAs и LHAd, значительно снижается.

Рисунок 5 Изменение иммунореактивности орексин-позитивных нейронов в структурах и зонах гипоталамуса крыс, на срезах, соответствующих 28-31 уровням.

1-4 -после ограничения подвижности; 5-8 - после ограничения подвижности и охлаждения. Черным цветом обозначены структуры и зоны гипоталамуса крыс (по атласу Swanson L.W.), в которых наблюдается увеличение иммунореактивности орексин-позитивных нейронов, темно-серым - ее уменьшение.

Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс повышается в LHAd, LHAjd, DMHa, LHAm при комбинированном применении ограничения подвижности и охлаждения. В LHAd, на срезах, соответствующих 28 уровню, а также в LHAm и PH на срезах соответствующих 29 и 31 уровню соответственно, при сочетанном применении ограничения подвижности и охлаждения наблюдается восстановление количества орексин-позитивных нейронов до его уровня, характерного для интактных животных. В DMHa, LHAjd, на срезах, соответствующих 28 уровню, в LHAs и DMHa, на срезах, соответствующих 29 уровню, а также в DMHa, на срезах, соответствующих 31 уровню, количество орексин-позитивных нейронов при ограничении подвижности и охлаждении крыс повышено.

Синтез м-РНК препроорексина при комбинированном воздействии снижается по сравнению с его уровнем у животных после ограничения подвижности, и соответствует показателям, характерным для интенсивности синтеза м-РНК препроорексина у интактных животных. Таким образом, при комбинированном воздействии (ограничение подвижности и охлаждение) наблюдается нивелирование, наблюдаемых после ограничения подвижности изменений, уровня экспрессии гена препроорексина в структурах гипоталамуса.

Анализ полученных данных позволяет полагать, что выявленные через 1 час после примененных стрессорных воздействий изменения, обусловлены как изменением интенсивности синтеза м-РНК препроорексина в клетках гипоталамуса крыс, так и по-видимому изменением скорости процесса утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах. Изменение соотношения интенсивности синтеза и утилизации орексина А в орексин-содержащих нейронах гипоталамуса проявляется снижением или повышением степени их иммунореактивности через 1 час после примененных экспериментальных воздействий. Установлено, что при данных видах воздействий происходит избирательное изменение степени иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, что свидетельствует о функциональной неоднородности популяции орексин-содержащих нейронов, расположенных в туберальной области гипоталамуса.

Дискретность изменений, происходящих в орексин-содержащих нейронах, как при ограничении подвижности, так и при комбинированном воздействии, может свидетельствовать о существовании функционально разнородных популяций орексин-содержащих клеток, дающих, по-видимому, проекции в разные области мозга.

Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов, расположенных в DMH, PH, и некоторых зонах LHA существенно изменяется при ограничении подвижности и охлаждении. Известно, что дорзомедиальное ядро (DMH), латеральная гипоталамическая область (LHA), и заднее (PH) поле гипоталамуса причастны к процессу теплопродукции (Imai-Matsumura K, et al 1984 Amir, 1990, Zaretskaia, 2002, Cao, 2004, Tanaka et al 2001). Изменение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов, расположенных в областях, вовлеченных в систему регуляции теплопродукции, дают основание предположить возможность участия орексин-содержащих нейронов в процессах терморегуляции.

Изменения уровня экспрессии гена препроорексина и содержания орексина в клетках разных структур гипоталамуса позволяет заключить, что орексин-содержащие нейроны гипоталамуса избирательно вовлекаются в развитие комплекса реакций, протекающих в мозге в процессе формирования ответа на ограничение подвижности и сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения. Таким образом, применение подробного картирования орексин-позитивных нейронов, локализованных в различных зонах структур гипоталамуса, впервые позволило установить функциональные различия популяции орексин-содержащих нейронов, не выявляемые при простой количественной оценке орексин-позитивных нейронов, расположенных на срезах мозга конкретного уровня.

Комплекс полученных результатов свидетельствует об участии орексинэргических нейронов гипоталамуса в механизмах реализации реакций мозга на ограничение подвижности и сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения. Выявлены конкретные структуры, активирующиеся при этих воздействиях, определен характер и степень участия орексин-содержащих нейронов в механизмах реализации реакций мозга при такого рода стрессорных воздействиях. Показаны различия паттернов их активации при ограничении подвижности и комбинированном применении ограничения подвижности и охлаждения, что важно для понимания механизмов реализации реакций мозга в этих условиях.

Выводы

1. Экспрессия гена препроорексина в нейронах гипоталамуса крыс снижается (с 0,283±0,034 до 0,027±0,010, p<0.005) сразу после окончания ограничения подвижности, а через 1 час - возрастает (с 0,165±0,038 до 0,945±0,247, p<0.05).

2. Экспрессия гена препроорексина в нейронах гипоталамуса крыс сразу после окончания ограничения подвижности, сочетанного с охлаждением, уменьшается (с 0,027±0,010 до 0,003±0,002, p<0.05) и нормализуется через 1 час после его окончания.

3. Через 1 час после окончания ограничения подвижности иммунореактивность орексин-содержащих нейронов изменяется: в LHAd количество орексин-позитивных нейронов, локализованных на срезах мозга 28-го уровня, снижается на 31%, на срезах мозга 29-го уровня - в LHAs и DMHa увеличивается на 76% и 75% соответственно, а в LHAm снижается на 63%; на срезах мозга 31-го уровня - возрастает на 41%в дорзальной части PH.

4. Сочетанное применение ограничения подвижности и охлаждения через 1 час после окончания воздействия приводит к восстановлению снижающегося при ограничении подвижности количества орексин-позитивных нейронов до показателей, характерных для количества этих нейронов у интактных животных в LHAd, на срезах мозга 28-го уровня, а также в LHAm и PH на срезах мозга 29-го и 31-го уровней соответственно. В DMHa, LHAjd на срезах мозга 28-го уровня, в LHAs и DMHa, на срезах мозга 29-го уровня, а также в DMHa, на срезах мозга 31-го уровня количество орексин-позитивных нейронов остается повышенным.

5. Картирование орексин-позитивных нейронов, локализованных в различных структурах гипоталамуса и их зонах, при ограничении подвижности и ограничении подвижности на фоне охлаждения демонстрирует дискретность функциональных изменений орексин-содержащих нейронов гипоталамуса, участвующих в процессе реализации ответа на данные виды стрессорных воздействий.

6. Повышение уровня экспрессии гена препроорексина в клетках гипоталамуса при одновременном снижении количества орексин-позитивных нейронов, локализованных в определенных структурах и зонах гипоталамуса, в условиях ограничения подвижности и его сочетанного применения с охлаждением, свидетельствует о нарушении баланса между синтезом и потреблением орексина в этих нейронах и их вовлеченности в процессы реализации реакций мозга на примененные стрессорные воздействия.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Шаинидзе К.З., Новикова Н.С., Алешина Г.М., Даринский Ю.А., Сынчикова А.П., Корнева Е.А. Изменение уровня экспрессии гена препроорексина в гипоталамусе крыс при ограничении подвижности и охлаждении. // Медицинский Академический журнал №2.- 2009.- С. 31-36.

2. Шаинидзе К. З., Новикова Н. С., Корнева Е. А. Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при ограничении подвижности у крыс // Вестник. Санкт-Петербургского университета.-Серия. 11 Медицина.- 2008.- № 3.-С. 145-153.

3. Шаинидзе К. З., Новикова Н. С., Даринский Ю.А., Корнева Е. А. Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при иммобилизационном и холодовом стрессах.//Материалы Второго Санкт-Петербургского Международного экологического форума «Окружающая среда и здоровье человека» 1 - 4 июля 2008 года, Санкт-Петербург, Россия, // Вестник Военно-Медицинской Академии 2008 Прил. 2 часть 2.- № 3(23).- 2008.- С. 374.

4. Шаинидзе К. З., Новикова Н. С., Корнева Е. А. Иммунореактивность орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс при ограничении подвижности и холодовом воздействии. // Материалы 4-й Объединенного Иммунологического Форума 30 июня - 3 июля, Санкт-Петербург, Россия, Российский иммунологический журнал.-Т.2 (11).-№2-3.- 2008.-С 157.

5. Шаинидзе К. З. Изменение иммунореактивности орексин-содержащих нейронов гипоталамуса крыс при различных моделях стрессорных воздействий. // Материалы Международной конференции «Физиология и патология иммунной системы» 15-17 сентября 2008 г. Москва, Россия, Аллергология и иммунология Том 9.- № 3.- 2008.-С. 270.

6. Шаинидзе К.З., Новикова Н.С., Даринский Ю.А., Корнева Е.А. Изменение степени визуализации орексин-содержащих нейронов гипоталамуса при ограничении подвижности и холодовом воздействии. // Материалы межвузовской конференции молодых ученых 13-16 апреля 2008 г. Санкт-Петербург, Россия, Герценовские чтения Выпуск 8.-2008.- С.136.

Сдано в набор 20.05.2009. Подписано в печать 20.05.2009.

усл. печат. листов 1.0

Уст. тираж 100 экз. Заказ 15-5/АР002.

Издано в Центре стратегического анализа общественных процессов

193036, СПб, Лиговский пр. дом 29.

Размещено на Allbest.ru

...