Роль ангиотензина и цитокинов в развитии почечной недостаточности в эксперименте и эффекты антицитокиновой терапии

- оценить способность рекомбинантного ангиотензина II индуцировать продукцию провоспалительных (IL-1, TNF, IL-18) и противовоспалительных (IL-1Ra) цитокинов и хемокинов (IL-8) лейкоцитами в культуре in vitro;

- выяснить механизм активации синтеза хемокина IL-8 рекомбинантным ангиотензинном II;

- сравнить цитокининдуцирующие свойства рекомбинантного ангиотензина II с бактериальным эндотоксином (LPS);

- определить механизм ингибиции продукции цитокинов в культуре клеток крови in vitro при действии препарата каптоприл, являющегося ингибитором ангиотензинпревращающего фермента;

- исследовать ренопротективные свойства препаратов каптоприл и пироксам как антицитокиновых агентов с разным механизмом действия на модели ишемически-реперфузионного острого повреждения почек у лабораторных животных и разработать схему комплексной антицитокиновой терапии острой почечной недостаточности как одного из компонентов синдрома полиорганной недостаточности.

Научная новизна работы. Впервые показано наличие у общеизвестного вазоактивного регуляторного пептида ангитензина II провоспалительного действия, проявляющегося в способности активировать синтез провоспалительных цитокинов клетками крови in vitro.

Показана каскадность провоспалительного эффекта ангиотензина II при активации синтеза цитокинов в клетках крови in vitro.

Открыт факт спонтанного синтеза ангиотензина II культурой клеток крови человека in vitro.

Проведен сравнительный анализ провоспалительного действия ангиотензина II и LPS, показано сходство вызываемых обоими агентами провоспалительных цитокиновых каскадов.

Показано, что ангиотензин II-блокирующий препарат каптоприл (известный в основном как ингибитор ангиотензинпревращающего фермента) обладает способностью блокировать синтез провоспалительных цитокинов in vitro, и что этот противовоспалительный, антицитокиновый эффект не связан с общеизвестным механизмом действия каптоприла - ингибированием ангиотензинпревращающего фермента.

Впервые разработана схема превентивной антицитокиновой терапии острой почечной недостаточности в эксперименте на животных in vivo, подобран эффективный антицитокиновый агент, определена его доза и путь введения.

Доказана эффективность антиангиотензиновой и неспецифической антицитокиновой терапии острой почечной недостаточности у экспериментальных животных с помощью нового препарата пироксам (SAHA).

Теоретическая и практическая значимость работы. Результаты проведенной работы проливают дополнительный свет на роль ренин-ангиотензиновой системы в норме и патологии. Благодаря полученным данным получает экспериментальное освещение механизм воспалительного повреждения паренхимы почек при ишемии и сепсисе, становится более ясной роль иммунологических последствий повышения уровня эндогенного ангиотензина II в патогенезе неспецифических системных васкулитов при гипертензиях.

1. Человеческий рекомбинантный ангиотензин II обладает цитокининдуцирующими свойствами и активирует синтез про- и противовоспалительных цитокинов клетками крови in vitro.

2. Ангиотензин II-индуцированный синтез хемокина IL-8 в лейкоцитах происходит опосредованно, через первичную активцию провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF.

3. Препарат пироксам (SAHA) защищает животных от поражения почек и развития ОПН в условиях ишемии почек на ишемически-реперфузионной модели за счет снижения выброса в кровь ангиотензина II и провоспалительных цитокинов IL-1, TNF, IL-18.

4. Ингибитор ангиотензинконвертирующего фермента каптоприл подавляет синтез цитокинов in vitro, независимо от его антиферментативной активности, но антицитокиновое действие препарата каптоприл недостаточно для клинического эффекта in vivo.

Личный вклад в проведение исследования. Личным вкладом автора в выполненную работу является самостоятельное проведение большинства экспериментов и интерпретация полученных результатов. Вклад соавторов ограничивался обучением работе с лабораторными животными, применяемым методам исследования, научно-методическими советами и конструктивной критикой, ценными советами по настройке установок экспериментов и отработкам методик. Личным вкладом также является вся организационная и практическая работа по забору и культивированию клеточных культур и проведению работ с кровью, а также часть работ по выполнению экспериментов на мышах по ишемии-реперфузии почек.

Использовали кровь 14 здоровых волонтеров (5 женщин, 9 мужчин) 24-40 лет. Мыши-самцы массой 20-25 г линии C57Bl/6 были получены из Jackson Laboratories. Питательные среды RPMI 1640 и DMEM для клеточных культур (Life Technologies) обогащали добавлением следующих компонентов: 10 мM L-глутамина, 24 мM NaHCO3, 10 мM HEPES, 100 Ед/мл пенициллина, 100 мг/мл стрептомицина и 10% сыворотки плодов крупного рогатого скота (Life Technologies). Использовали стерильный физиологический раствор (0,9 % NaCl; Baxter Healthcare), раствор гистопака-1077 для выделения мононуклеаров из крови человека, рекомбинантные препараты человеческих ангиотензина II (Sigma), IL-1 (Cistron Biotechnology), рецепторного антагониста IL-1 (IL-1Ra), TNF-связывающего протеина (TNF-BP, или TNF-Rp; Peprotech), IL-18-связывающего протеина IL-18BP (Peprotec), TNF (Vertex Pharmaceuticals), а также липополисахарид (LPS) E. coli (Difco), реагенты для иммуноферментного определения ангиотензина II человека (Promega), реактивы для иммуногистохимического исследования (Santa Cruz Biotechnology), препараты каптоприл (Sigma) и пироксам (suberoyl-3-aminopyridineamide hydroxamic acid, SAHA; Italfarmaco, Cinisello Balsamo, Italy). Все использованные в культурах клеток препараты, реагенты и рекомбинантные цитокины, согласно паспортам, были стерильными и апирогенными по критериям Food's and Drug's Administration.

Культуры клеток цельной крови человека и культуры выделенных из крови мононуклеаров инкубировали в среде RPMI 1640 в 96- или 24-луночных планшетах (Becton Dickinson; Greiner) в CO2-инкубаторе при 37 °C в течение 10-12 ч. Концентрации активаторов и других реагентов в среде составляли: ангиотензина II - 250, 500 и 1000 нМ; LPS E. coli - 20 нг/мл; IL-1 - 20 нг/мл; IL-1Ra) - 100 нг/мл; IL-18BP - 50 нг/мл; каптоприла - 2 мМ, 1 мМ, 0,5 мМ. Содержание цитокинов в культуральной среде оценивали методом жидкостной электрохемилюминесценции на приборе Origen Analyzer (Igen). Определение содержания ангиотензина II в супернатанте производили иммуноферментным методом (Promega).

Ишемию-реперфузию почек у мышей производили под общей анестезией пережатием обеих почечных сосудистых ножек на 22 мин. Это вызывало обратимую ОПН. Контрольной группе операцию проводили так же, но сосудистые ножки не пережимали (ложнооперированные животные). Экспериментальной группе вводили препарат пироксам (SAHA) внутрибрюшинно и per os в различных дозировках от 10 до 100 мг/кг. Число мышей в группах перед началом каждого эксперимента составляло 15. Степень ОПН оценивали по уровню креатинина и азота мочевины крови (BUN). Проводили гистологическое и иммуногистохимическое исследование почек; в экстрактах почек измеряли концентрацию цитокинов. Гистологические изменения в почках оценивали количественно, в баллах, по критериям ATN (Acute Tubular Necrosis) для оценки степени повреждения почечной паренхимы и острого канальцевого некроза. При статистической обработке данных использовали тест ANOVA. Статистическая значимость различий принималась в 95% доверительном интервале. Значения выражены как средняя арифметическая ± стандартная ошибка средней (M±SE).

Результаты исследования и их обсуждение

Установлено, что стимуляция культур клеток крови человека (как разбавленной цельной крови, так и выделенных из нее мононуклеаров) in vitro рекомбинантным препаратом ангиотензина II человека в концентрациях от 250 до 1000 нM дозозависимым образом стимулирует продукцию цитокинов провоспалительного ряда: IL-8, IL-1, TNF, а также вызывает дозозависимое увеличение выработки IL-1Ra - противовоспалительного цитокина, антагониста рецептора IL-1. По сравнению с нестимулированными культурами крови ангиотензин II вызывал статистически значимое увеличение уровня указанных цитокинов в супернатанте культур (во всех случаях p<0,05).

На примере активации синтеза IL-8 были проведены эксперименты по выяснению зависимости его синтеза от участия других цитокинов, в частности, IL-1, TNF и IL-18. С этой целью проводили стимуляцию синтеза IL-8 в культурах крови и лимфоцитов человека рекомбинантным ангиотензином II в условиях блокирования активности провоспалительных цитокинов IL-1 и TNF. Для блокирования IL-1 использовали рекомбинантный препарат рецепторного антагониста IL-1Ra человека, для блокирования TNF -- растворимый рекомбинантный рецептор TNF (TNF-Rp) человека. Они добавлялись в культуры крови вслед за ангиотензином II, чтобы активация синтеза IL-8 происходила в условиях нейтрализации IL-1 и TNF ингибиторами. Для сравнения было исследовано влияние указанных ингибиторов на ангиотензин II-индуцированный синтез IL-1. Полученные данные показали, что ангиотензин II-активированный синтез IL-8 является TNF- и IL-1-опосредованным. Это подтверждается тем, что при блокировании IL-1 и TNF соответствующими белками (IL-1Ra и TNF-Rp) продукция IL-8 статистически значимо снижалась (p<0,05) по сравнению с культурами, стимулированными ангиотензином II без ингибиторов IL-1 и TNF.

Результаты описанных экспериментов указывают на то, что вызываемая ангиотензинном II продукция хемокина IL-8 не является результатом прямого действия ангиотензина на механизм запуска синтеза IL-8, а является вторичным событием, наступающим под действием таких активированных ангиотензингом провоспалительных цитокинов, как IL-1 или TNF, либо их обоих. В то же время, механизм запуска синтеза IL-1 под действием ангиотензина II иной, - возможно, прямой, во всяком случае, он не зависит от TNF. Отсутствует также зависимость ангиотензин II-стимулированного синтеза IL-8 от IL-18. Добавление IL-18-связывающего протеина (IL-18BP) к стимулированной культуре клеток никак не воздействовало на синтез IL-8.

По оси абсцисс отложены варианты опыта: контроль (культуры, инкубированные с физиологическим раствором), культуры с ангиотензином II (500 нM), культуры с ангиотензином II (500 нM) и IL-1Ra (100 нг/мл), культуры с ангиотензином II (500 нM) и TNF-Rp (1 мкг/мл), культуры с ангиотензином II (500 нM) и IL-18Bp (50 нг/мл). По оси ординат - кратность повышения синтеза IL-8 по сравнению с контролем (культурами, инкубированными с физиологическим раствором).

Представлены средние величины и ошибки средних (MSE) по культурам клеток крови 14 доноров. Звездочки - отличие от контроля достоверно, p<0,05.

Аналогичный эксперимент проведен с LPS в качестве стимулятора культуры клеток крови. При стимуляции культур клеток LPS, как и ангиотензинном II, синтез IL-8 также индуцируется опосредованно, через IL-1 и TNF, задействован в этом случае также IL-18. Добавление соответствующих связывающих агентов статистически значимо снижало выработку IL-8. По характеру снижения синтеза IL-8 ведущим путем следует признать цепочку LPS IL-1 IL-8. Иными словами, первичным эффектом LPS, как и ангиотензина II, является активация синтеза провоспалительного цитокина IL-1, а уже этот цитокин вызывает активацию хемокина IL-8.

Для подтверждения неспецифического противовоспалительного действия препаратов группы ингибиторов ангиотензинпревращающего фермента мы проанализировали влияние одного из них - препарата каптоприл - на выработку IL-8 в культуре клеток крови здоровых доноров. В качестве стимулятора синтеза IL-8 в этих опытах был использован LPS в дозе 20 нг/мл. Мы показали, что имеет место снижение LPS-индуцированного синтеза IL-8 каптоприлом, значимое (p?0,05) при его дозах 1 и 2 мМ. Содержание IL-8 при этом снизилось в 4-5 раз. Поскольку известный механизм действия каптоприла - это ингибиция ангиотензинконвертирующего фермента, то с этим механизмом действия, в первую очередь, следует связывать и наблюдаемый эффект каптоприла в LPS-стимулированной культуре клеток. Таким образом, синтез IL-8 в клетках крови не только может быть индуцирован ангиотензинном II, добавленным в культуру клеток извне в качестве активирующего агента, но находится под контролем эндогенного ангиотензина II и существенно зависит от образования этого медиатора внутри клеток, поскольку подавляется в присутствии ингибитора фермента, ответственного за процессинг ангиотензина II.

Для уточнения того, каким образом LPS вызывает синтез IL-8 (напрямую или опосредованно, через другой цитокин), и на каком уровне происходит блокировка провоспалительного цитокинового каскада каптоприлом, мы проверили, блокирует ли каптоприл синтез IL-8, индуцированный рекомбинантным цитокином IL-1. Установлено, что ингибирующий эффект каптоприла при IL-1-индуцированном синтезе IL-8 становится значимым при дозе 1 мM, в то время как эффект при LPS-индуцированном синтезе IL-8 наступает уже при концентрации 0,5 мМ, что говорит о том что в цепочке LPS IL-1 IL-8 данный препарат работает

Заштрихованные столбики - культуры, стимулированные LPS (20 нг/мл), белые столбики - культуры, стимулированные IL-1 (20 нг/мл). По оси ординат - кратность изменения синтеза IL-8 по сравнению с контролем (культурами с LPS или IL-1, но без каптоприла). Представлены средние величины и ошибки средних (MSE) по культурам клеток крови 14 доноров. Звездочки (*) - достоверное снижение по сравнению с контролем (культурами, содержащими соответствующий стимулятор - LPS или IL-1), p<0,05.

на обоих этапах. Возникает вопрос: приведенная цепочка провоспалительного каскада, индуцируемого LPS, связана с тем, что LPS индуцирует непосредственно синтез ангиотензина II, и тогда каптоприл действует общеизвестным способом посредством блокады процессинга ангиотензина I, или LPS не влияет на ренин-ангиотензиновую систему, и тогда полученные данные указывают на непосредственную антицитокиновую активность каптоприла? Выбор между этими альтернативными объяснениями позволяют сделать результаты экспериментов, приведенные ниже.

Для выяснения вопроса о возможном участии эндогенного ангиотензина II в цитокиновых ответах клеток крови на LPS нами была поставлена серия опытов по прямому определению уровня ангиотензина II при стимуляции культур клеток крови с помощью LPS. При этом мы получили следующий результат: кровь здоровых людей способна вырабатывать ангиотензин II и без стимуляции LPS, т.е. спонтанно. При этом обнаружена четкая временная зависимость: уровень эндогенного ангиотензина II в течение 4 ч повышался более чем в 2,5 раза по сравнению с начальным. Имеется статистически значимое различие (p<0,05) в уровнях ангиотензина II через 4 ч и в начале инкубации (0,5 ч) как в группе культур, стимулированных LPS, так и в группе нестимулированных культур цельной крови. В то же время нет никаких значимых различий между группами (культурами с LPS и культурами без LPS) на каждом сроке инкубации. Это говорит о том, что LPS не индуцирует синтез эндогенного ангиотензина кровью, следовательно ангиотензин не является медиатором провоспалительного действия LPS, а действует независимо, хотя и похожим образом.

На основании наших данных можно предполагать, что LPS запускает провоспалительные каскады цитокинов в клетках крови человека без индукции синтеза ангиотензина II, т.е. что ангиотензин II не является медиатором действия LPS. Таким образом, антицитокиновый эффект каптоприла может быть связан как с блокадой синтезируемого кровью ангиотензина II, так и с другими, пока не установленными механизмами.

Каптоприл был испытан нами и в качестве антицитокинового агента на модели острой ишемии почек у мышей. Эксперименты показали, что эффективная доза препарата, используемая in vitro в культурах клеток, не могла быть применена у животных из-за вызываемых ею тяжелых гемодинамических эффектов. Меньшая же доза каптоприла, в качестве препарата превентивной однократной монотерапии в острой ситуации эксперимента на ишемически-реперфузионной модели статистически значимого снижения уровня креатинина и мочевины не дала.

По данным литературы, другим препаратом, снижающим синтез ангиотензина, является пироксам - ингибитор гистондеацетилазы. Доказано также, что он имеет и антицитокиновый эффект широкого спектра. Испытание антицитокиновых свойств ингибитора гистондеацетилазы на модели ишемической ОПН in vivo показало, что, что эффективной дозой, статистически значимо защищающей почки от воздействия ишемии, является уже доза 10 мг/кг при пероральном введении. Внутрибрюшинный путь введения также достигал цели, т.е. обеспечивал ренопротективный эффект, но только при дозе 100 мг/кг. Оценку наступающей ишемической ОПН и ее степени проводили биохимически (по уровню креатинина в крови), морфологически (по ATN-score, индексу острого канальцевого некроза), иммуногистохимически (по определению IL-18 в ткани почек) и прямым измерением содержания IL-1, TNF и IL-18 в гомогенате паренхимы почек. Все исследования показали эффективность препарата SAHA статистически значимым снижением степени повреждения почек и содержания указанных выше провоспалительных цитокинов в группе мышей, получивших SAHA, по сравнению с группой нелеченых мышей (p<0,05).

Несмотря на то, что функцию почек удается защитить, анатомические признаки обратимого некроза почечных канальцев все же имеются, хотя и в значительно меньшем объеме, чем у не леченых мышей. Наши иммуногистохимические данные свидетельствуют и о снижении под влиянием пироксама (SAHA) продукции IL-18, с чем коррелирует ренопротективный эффект препарата.

По оси абсцисс - группы животных: группа 1 - ложнооперированные (контроль, n=15); группа 2 - ишемия без лечения (n=15); группа 3 - ишемия + SAHA: SAHA внутрибрюшинно за 30 минут до операции в дозах 10 мг/кг, 100 мг/кг (по 15 мышей на каждую дозу); SAHA per os в дозах 10 мг/кг, 30 мг/кг, 100 мг/кг (по 15 мышей на каждую дозу). По оси ординат - содержание креатинина плазмы крови, в мг/дл. Статистически значимые различия c группой 2 (оперированные, не леченные) указаны индексами p над соответствующим столбцом.

Данные литературы подтверждают выводы о собственном антицитокиновом действии препаратов группы блокаторов ангиотензинпревращающего фермента, подобные нашим. Так, показано, что каптоприл и лизиноприл ингибируют синтез IL-12 мононуклеарами крови человека in vitro при стимуляции LPS. Каптоприл нарушает синтез IL-1 моноцитами, стимулированными TNF. Установлено, что в данном случае каптоприл препятствует проникновению субчастицы p65 фактора NF-kappaB в ядро и, таким образом, прерывает синтез РНК для IL-1. Введение каптоприла и саралазина в культуры клеток zona glomeruloza почек крыс снижало синтез альдостерона и, соответвенно, ангиотензина. Имеются данные о снижении синтеза IL-6, IL-1, IL-10, IL-12 и IL-18 прекурсорами моноцитов человека.

Дальнейшие исследования помогут уточнить, какие ещё механизмы повреждения устраняет SAHA при ишемическом повреждении почек. К интересным наблюдениям может привести исследование свойств SAHA на других моделях ОПН - септической (LPS), токсической (глицерин, цисплатин). Перспективным для разработки терапевтических антицитокиновых фармакологических схем представляется сочетание SAHA с такими препаратами, как каптоприл (ACEi), блокаторами iNOS синтазы (пентоксифиллином).

Данное исследование может быть полезным при разработке стратегий лечения больных в сердечно-сосудистой хирургии, медицине катастроф (геморрагические, токсические шоки с гипотензией), неотложной токсикологии и инфекционно-токсических шоках, практике лечения синдрома полиорганной недостаточности в отделениях анестезиологии, реанимации и интенсивной терапии. Перспективным кажется использование препарата SAHA в качестве монотерапии или в сочетании с любым из вышеперечисленных препаратов за 30-60 мин до планируемого подключения аппарата АИК при операциях аорто-коронароного шунтирования, протезирования клапанного аппарата сердца. Данные литературы и нашего исследования предполагают возможность хорошего терапевтического эффекта для лечения ОПН, вызванной краш-синдромом, а также при отравлениях гемолитическими ядами и техническими жидкостями. Следует ожидать хорошего ренопротективного антицитокинового эффекта при синдроме полиорганной недостаточности, вызванной сепсисом или тяжелыми инфекционными заболеваниями.

Выводы

1. Ангиотензин II индуцирует синтез про- и противовоспалительных цитокинов IL-1, IL-8 и TNF, IL-1Ra в культурах клеток цельной крови и культурах мононуклеаров здоровых людей, что объясняет известную способность этого пептида вызывать неспецифическую воспалительную реакцию как на местном, так и на системном уровнях.

2. Цитокининдуцирующая активность ангиотензина II in vitro может быть блокирована фармакологически, с помощью препаратов с антицитокиновым эффектом. Препарат группы ингибиторов ангиотензинконвертирующего фермента (ACEi) каптоприл снижает вызываемую ангиотензинном II продукцию цитокинов.

3. Механизм ингибирующего действия каптоприла на синтез провоспалительных цитокинов in vitro не ограничивается блокадой ангиотензинконвертирующего фермента, каптоприл влияет на синтез цитокинов и другим путем, который требует изучения и который можно назвать "собственным антицитокиновым эффектом".

4. Каптоприл, как антицитокиновый агент, эффективен в культуре клеток крови in vitro, но достичь с его помощью значимого ренопротективного эффекта in vivo у мышей с экспериментальной острой почечной недостаточностью не удалось.

5. Ишемическое поражение почек in vivo у лабораторных мышей связано с участием цитокинов IL-18, IL-1 и TNF.

6. Разработана и экспериментально обоснована схема терапии острой почечной недостаточности (на ишемически-реперфузионной модели у мышей in vivo) посредством превентивного (за 30 минут до ишемии) применения препарата пироксам (suberoyl-3-aminopyridineamide hydroxamic acid), подавляющего продукцию провоспалительных цитокинов IL-1, TNF и IL-18 и надежно обеспечивающего хороший профилактический ренопротективный эффект. Наиболее эффективен пероральный путь применения пироксама (клинически эффективной является доза 30 мг на кг массы тела) по сравнению с интраперитонеальным путем введения (100 мг/кг).

* * *

Работа поддержана грантом международного общества нефрологов (International Society of Nephrology) за 2002-2004 гг., грантом Российского фонда фундаментальных исследований 06-0449629, а также средствами лабораторий профессоров Роберта Шрайера и Чарлза Динарелло (University of Colorado Health Science Centre).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Соловьёв А.Г., Резников Л.Л., Назаров П.Г., Dinarello C.A. Провоспалительные цитокин-индуцирующие свойств ангиотензина II и механизм антицитокиновых эффектов ингибитора ангитензин-превращающего фермента каптоприла // Цитокины и воспаление. - 2006. - Т. 5, № 3. - С. 40-45.

2. Wang W., Faubel S., Ljubanovic D., Mitra A., Falk S.A., Kim J., Tao Y., Soloviev A., Reznikov L.L., Dinarello C.A., Schrier R.W., Edelstein C.L. Endotoxemic acute renal failure is attenuated in caspase-1-deficient mice // Am. J. Physiol. Renal. Physiol. - 2005. - Vol. 288, № 5. - F997-1004.

3. Соловьёв А.Г., Резников Л.Л., Назаров П.Г., Dinarello C.A. Влияние блокатора ангиотензинпревращающего фермента каптоприла на синтез IL-8 клетками крови человека in vitro // Russ. J. Immunol. - 2006. - Vol. 9, suppl. 3. - P. 129-130.

4. Соловьёв А.Г., Резников Л.Л., Назаров П.Г., Dinarello C.A. Способность человеческого ангиотензина II вызывать синтез провоспалительных и противовоспалительных цитокинов в культуре клеток крови человека in vitro // Мед. иммунол. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 178-179.

5. Соловьёв А.Г., Резников Л.Л., Назаров П.Г., Dinarello C.A. Механизм стимулирующего влияния ангиотензина 2 на синтез хемокина IL-8 культурой клеток крови человека: роль IL-1 и IL-18 // Мед. иммунол. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 179-180.

6. Соловьёв А.Г., Melnikov V.Y., Резников Л.Л., Назаров П.Г., Dinarello C.A. Влияние блокатора гистон-деацетилазы на развитие экспериментальной острой почечной недостаточности in vivo // Мед. иммунол. - 2006. - Т. 8, № 2-3. - С. 178.

Размещено на Allbest.ru