Размещено на http://www.allbest.ru/

ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН

На правах рукописи

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Изучение генетически обусловленной чувствительности к действию мутагенов окружающей среды в индуцированном мутагенезе на клетках человека

Специальности 14.00.07 - «Гигиена»

03.00.15 - «Генетика»

Григорьева Светлана Алексеевна

Москва -2007

Работа выполнена в лаборатории молекулярно-генетической диагностики ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет им. Н.И. Пирогова

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор Ревазова Юлия Анатольевна

кандидат биологических наук Аксенова Марина Геннадьевна

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Асанов Алий Юрьевич (ГОУ ВПО Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова Росздрава)

доктор биологических наук Сычева Людмила Петровна (ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН)

Защита состоится «29» ноября 2007 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 001.009.01 в ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН по адресу: 119992 Москва, ул. Погодинская д. 10/15, строение 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН.

Автореферат разослан «26» октября 2007г.

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор Беляева Наталия Николаевна.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Одной из актуальных проблем профилактической медицины является оценка индивидуальной чувствительности (устойчивости) индивидуума к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды. Выявление связи генетических полиморфизмов системы биотрансформации с ответом на воздействие факторов окружающей среды (контакт с вредными химическими веществами, сопутствующие факторы - курение и т.д.) открывает возможности для вторичной профилактики экологозависимых патологий. Становятся возможными более ранняя диагностика экологически обусловленных болезней, в частности онкологических, вероятностный прогноз распознавания и коррекции профессиональных заболеваний, формирование групп повышенного риска в экологически неблагоприятном регионе (Рахманин Ю.А. с соавт., 2004-2006; Пальцев М.А., 2004; Бочков Н.П., 2004; Сычева Л.П., 2001).

Решение этой проблемы стало возможным в связи с успехами молекулярной медицины и разработкой адекватных молекулярно-генетических методов.

В зависимости от особенностей генома человек может обладать аллелями, ассоциированными с повышением или понижением активности ферментов детоксикации, определяющими подверженность вредным воздействиям, включая восприимчивость к известным или предполагаемым мутагенам и канцерогенам.

В настоящее время найдены потенциальные гены-кандидаты, которые могут влиять на частоту спонтанных и индуцированных хромосомных повреждений у человека. Составление генной сети для каждого мультифакториального заболевания, идентификация в ней центральных генов и генов-модификаторов, анализ ассоциации их полиморфизмов с конкретным заболеванием, разработка на этой основе комплекса профилактических мероприятий для конкретного пациента составляют основу предсказательной медицины (Баранов В.С. с соавт., 2005 г.). В этой связи наиболее подходящими генетическими маркерами для экогенетических исследований мультифакторных заболеваний являются полиморфные варианты генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков, экспрессия которых, в отличие от других классов генов, непосредственно регулируется влияниями средовых факторов химической природы (Саприн А.Н., 1991; Nebert D.W., 1996, 1997; Кулинский В.И., 1999; Баранов В.С. с соавт., 2000).

В ряде исследований установлено, что нулевые генотипы по глутатион-S-трансферазе (GSTM1 и GSTT1) ассоциированы с более высоким уровнем хромосомных аберраций (Ревазова Ю.А. с соавт., 2005) и что частота нулевых генотипов среди пациентов с определенными онкологическими заболеваниями значительно выше, чем в контроле (Вавилин В.А. с соавт., 2003). Установлено, что среди людей, чувствительных к действию 1,2:3,4-диэпоксибутана, частота GSTT1-«нулевых» генотипов значительно выше среднепопуляционной.

Эпидемиологические исследования указывают на то, что практически все широко распространенные заболевания, включая почти 90% злокачественных опухолей, в той или иной мере связаны с неблагоприятными внешними факторами, среди которых видное место принадлежит курению и продуктам питания. Различные химические токсины, воздействуя на организм, могут провоцировать начало этих заболеваний. Гены, детерминирующие реакцию организма на канцерогены и экзотоксины, кодируют белки, которые по-разному взаимодействуют с канцерогенами (Баранов В.С. с соавт., 2005). Поэтому в зависимости от особенностей генома эффект действия канцерогенов может различаться.

Зачастую в медико-генетических исследованиях мультифакторных заболеваний нивелируются или игнорируются эффекты окружающей среды, которые именно для данного класса болезней имеют первостепенное значение. Доказательством важности средовой компоненты является быстрый рост в последние годы частоты многих заболеваний в популяциях, который невозможно объяснить изменением генетической составляющей за такой короткий промежуток времени с эволюционной точки зрения (Jarvis D., Burney P., 1997; Beasley R., 1998).

Концепция генетического мониторинга здоровья населения предполагает использование эпидемиологического, цитогенетического, клинико-генеалогического и других методов, позволяющих выявлять связи между динамикой изменения качества окружающей среды и частотами генетических событий.

В настоящее время идет целенаправленный поиск генов (или их аллельных состояний), контролирующих предрасположенность ко многим заболеваниям у человека и определяющих риск их возникновения при контакте с определенными вредными факторами производственной или окружающей среды. Оценка генетически детерминированной индивидуальной чувствительности человека к действию высокоактивных генотоксикантов может быть полезной как на стадии профессионального отбора, так и в процессе верификации причин и степени тяжести патологических процессов у обследуемых пациентов с отягощенным профмаршрутом. Создание «метаболического паспорта» сможет обоснованно рекомендовать человеку перечень желательных и нежелательных профессий в соответствие с его генетическими характеристиками.

Однако в литературе отсутствуют исчерпывающие данные, подтверждающие или опровергающие роль полиморфизма ферментов системы биотрансформации ксенобиотиков в индивидуальном ответе на воздействие химических веществ на цитогенетическом уровне (хромосомные аберрации).

В связи с вышесказанным, целью работы явилось изучение генетически обусловленной чувствительности человека к действию мутагенов окружающей среды на модели химически индуцированных цитогенетических нарушений.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) Модифицировать, апробировать и верифицировать неинвазивные методики получения ДНК для изучения полиморфных генов и подобрать условия для оценки индуцированного мутагенеза (выбор мутагена, используемых концентраций, экспозиции и т.д.).

2) Охарактеризовать выборку в 200 человек с учетом половозрастной структуры, наличия хронических заболеваний, контакта с мутагенами и канцерогенами и другими сопутствующими факторами. Изучить частоты полиморфных генов ферментов биотрансформации и системы оксидантного равновесия (CYP1А1, GSTT1 и GSTM1, CAT, MPO, PON1) в выборке жителей г. Москвы.

3) Изучить уровни хромосомных аберраций в лимфоцитах обследованных людей, имеющих генотипы, обуславливающие сниженный или, наоборот, повышенный уровень активности ферментов биотрансформации и антиоксидантной защиты. Проанализировать цитогенетические препараты, определить частоты хромосомных аберраций, типы цитогенетических нарушений.

4) Оценить совместное действие изучаемых полиморфизмов на мутагенный ответ хромосом человека при действии митомицина С.

5) Провести анализ ассоциаций полиморфизмов генов ферментов биотрансформации (CYP1А1, GSTT1 и GSTM1) в группах детей с эколого-зависимой бронхолегочной патологией и нарушениями мочеполовой системы (крипторхизм).

Научная новизна работы:

Работа направлена на решение фундаментальной проблемы медицины окружающей среды, экологической генетики и генетической токсикологии, связанной с изучением механизмов индивидуальной чувствительности человека к воздействию неблагоприятных факторов окружающей среды.

Впервые изучены на трех значительных по объему выборках (взрослых г. Москвы, детей г. Оренбурга и г. Чапаевска) сочетанные частоты полиморфных вариантов шести основных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и системы оксидантного равновесия (CYP1А1, PON1, GSTT1, GSTM1, CAT, MPO), а также проведено сравнение их частот с аналогичными данными в других популяциях в нашей стране и за рубежом.

Впервые оценен in vitro как спонтанный, так и индуцированный уровень хромосомных аберраций в зависимости от полиморфизмов системы детоксикации ксенобиотиков.

Создана структура электронной базы данных для анализа полученной информации по индуцированному мутагенезу у лиц с разными генотипами и наличием вредных факторов в среде обитания.

Практическая значимость работы:

Утверждены председателем Межведомственного Научного совета по экологии человека и гигиене окружающей среды Российской Федерации академиком РАМН Ю.А. Рахманиным методические рекомендации «Неинвазивный молекулярно-генетический метод оценки индивидуальной чувствительности человека к действию ксенобиотиков» (2007 г.).

Оценена сравнительная информативность анкет, включающих в себя вопросы, определяющие социально-психологический статус обследуемых, их профессиональный маршрут, наличие контакта с вредными химическими веществами, курения и приобретенных или наследственных заболеваний.

Полученные результаты могут быть использованы в оценке индивидуального и популяционного генетического и канцерогенного риска.

Положения, выносимые на защиту:

1. Оценку здоровья населения на донозологическом уровне необходимо проводить с учетом генетического полиморфизма ферментов биотрансформации ксенобиотиков молекулярно-генетическими методами.

2. Сочетание активных полиморфных вариантов PON1 и CAT приводит к уменьшению числа хромосомных разрывов на клетку по сравнению с вариантами со слабой активностью этих ферментов.

3. Делеция одновременно по генам GSTT1 и GSTM1 определяет более высокий уровень хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов периферической крови при нагрузке митомицином С по сравнению с лимфоцитами испытуемых с активными формами этих генов.

4. Уровень мутагенного ответа зависит от сочетанного взаимодействия аллельных вариантов нескольких генов.

Апробация работы. Работа прошла апробацию в ГУ НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им. А.Н. Сысина РАМН 19 июня 2007 г. Результаты диссертационной работы были представлены на II Всероссийской научно-практической конференции молодых ученых и специалистов «Окружающая среда и здоровье» (г. Рязань 29 мая - 1 июня 2007 г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 печатных работ, из них 2 в изданиях, рекомендованных ВАК и одна глава в коллективной монографии.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и приложения. Список литературы состоит из 189 источников, из них 63 отечественных и 126 зарубежных авторов. Работа изложена на 124 листах машинописи. Текст содержит 27 таблиц и 1 рисунок.

Личный вклад автора составляет 80 %.

Объекты и методы исследования

Объекты исследований:

Исследованы следующие группы населения:

200 сотрудников ГУ НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина и Медико-генетического научного центра РАМН, постоянно проживающих в Москве и имеющие или не имеющие контакта с вредными веществами, включая мутагены и канцерогены.

104 мальчика, проживающих в г. Чапаевске («диоксиновом городе») и имеющих патологию мочеполовой системы (крипторхизм).

96 детей, проживающих в г. Оренбурге и страдающих хронической бронхолегочной патологией.

Содержание работы

Материалы и методы исследований

При обследовании были применены следующие методы: молекулярно-генетические, цитогенетические, статистические и социо-психологическое анкетирование.

У каждого испытуемого было взято информированное согласие, в котором он подтверждал свое согласие сдать соскоб с внутренней поверхности щеки для определения частот генов и 30 мл венозной крови для определения спонтанной и индуцированной частот хромосомных аберраций в культуре лимфоцитов, а также ответить на ряд вопросов, касающихся его здоровья и образа жизни.

Проведено анкетирование всех обследуемых с использованием стандартных опросников, позволяющих определить их социально-психологический статус. хромосомный аберрация генотип

В анкету включены вопросы, отражающие характер работы, в частности, с вредными веществами, наличие или отсутствие заболеваний, социальное положение и т.п.

Шкалу САН (Самочувствие, активность, настроение) использовали для анализа функционального состояния реципиентов. Шкалу субъективного благополучия (ШСБ) применяли для анализа социальных, биологических и психологических факторов, свидетельствующих об эмоциональном состоянии, социальном поведении, некоторых физических симптомах.

Проведено тестирование генетического полиморфизма систем биотрансформации ксенобиотиков обследованных.

В качестве материала для генотипирования использовали ДНК, извлеченную из клеток слизистой оболочки рта методом фенол-хлороформной экстракции. Забор буккального эпителия осуществляли с помощью одноразовых стерильных зондов. Данный способ забора клинического материала является неинвазивным, что соответствует требованиям ВОЗ и Министерства здравоохранения и социального развития РФ и необходим при массовых обследованиях населения.

Оценка аллельных вариантов генов ферментов биотрансформации методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) включала: определение ферментов 1 фазы детоксикации - цитохрома, параоксаназы (CYP1А1 и PON1), определение ферментов 2 фазы детоксикации - глутатион-S-трансферазы М1 и Т1 (GSTT1 и GSTM1), и системы оксидантного равновесия - каталазы и миелопероксидазы (CAT и MPO).

ПЦР проводили на амплификаторах ТЕРЦИК (Россия) и экспериментально подбирали необходимую программу смены температур и длительности каждого шага реакции. При анализе генов GSTM1 и GSTТ1 на наличие делеций использовали мультиплексную ПЦР. В амплификационную пробу вносили две пары праймеров, что давало возможность одновременно амплифицировать фрагменты каждого из указанных генов. Такой подход, во-первых, вдвое сокращает время генотипирования. Во-вторых, в том случае, если в конкретной пробе отсутствует только один из фрагментов, можно с уверенностью утверждать, что это является результатом истинной делеции в данном гене, а не следствием некорректно проведенной амплификации. Сомнения могут вызывать случаи, когда отсутствуют оба фрагмента. По имеющимся данным, вероятность этого события мала, и такие случаи анализировали, используя другой внутренний стандарт.

Последователи праймеров и длина амплифицированных фрагментов приведены в табл. 1.

Таблица 1 Основные характеристики исследуемых генов системы биотрансформации ксенобиотиков

Ген	Нуклеотидные последовательности праймеров	Длина амплифицированного фрагмента, (пар нуклеотидов)	Мутация
CYP1A1	5'-GАА CТG CCА CТТ CАG CТG ТCТ-3'	187	Экзон 7 ILE46VAL A4889G
	5'-GАА АGА CCТ CCC АGC GGТ CА-3'
GSTM1	5'-GАА CТC CCТ GАА ААG CТА ААG C-3'	219	Делеция
	5'-GТТ GGG CТC ААА ТАТ АCG GТG G-3'
GSTT1	5'-ТТC CТТ АCТ GGТ CCТ CАC АТC ТC-3'	459	Делеция
	5'-ТCА CCG GАТ CАТ GGC CАG CА-3'
PON1	5' TAT TGT TGC-TGT GGG ACC TGA G 3'	124	LEU55MET
	5' CAC-GCT AAA CCC AAA TAC ATC TC 3'
CAT	5`-TGA-AGG ATG CTG ATA ACC-3`	130	С1167Т
	5`-ATC-AGC ACC ACC CCC TCG TC-3`
MPO	5'-CGG TAT AGG CAC ACA ATG GTG-AG-3`	350	G463A
	5'-GCA ATG GTT CAA GCG-ATT CTT C-3

Для идентификации аллелей генов PON1, MPO, CYP1A1 и CAT проводили рестрикцию продуктов амплификации с помощью эндонуклеаз (фирма «Fermentas»). Для этого 5 мкл амплификата смешивали с 5 мкл рестрикционной смеси. Образец рестрицировали при оптимальной для каждого фермента температуре и времени.

Для идентификации аллелей гена CYP1A1 используют рестриктазу HincII. В норме продукт амплификации рестрицируется на 2 фрагмента размером 144 и 48 пар нуклеотидов. При мутации в образце возникает дополнительный сайт рестрикции и на электрофореграмме при гомозиготе по мутации можно наблюдать три фрагмента 125 п.о., 48 п.о. и 19 п.о. Для гена CYP1A1 генотип ILE/ILE проявляется в наличии двух фрагментов и указывает на гомозиготность по нормальному аллелю. Генотип ILE/VAL проявляется в присутствии трех фрагментов и означает гетерозиготность по мутантному аллелю.

Для идентификации аллелей гена РОN1 используют рестриктазу NcoI. Для гена PON1 генотип L/L означает гомозиготу по нормальному аллелю и проявляется в наличии одной полосы размером 124 п.о.. Присутствие полос 124, 108 и 26 соответствует гетерозиготе по мутации и обозначается как L/M. Наличие только двух полос - 108 и 26 наблюдается у гомозигот по мутации и обозначается как M/M.

Для идентификации аллелей гена CAT используют рестриктазу Sma. Для гена CAT генотип C/C означает гомозиготу по «дикому» аллелю и выявляется как наличие одной полосы размером 130 п.о. Гетерозигота проявляется наличием 3 полосами размером 130 п.о., 100 п.о. и 30 п.о. и обозначается как C/T. В случае гомозиготы по мутации T/T выявляются только 2 полосы, размером 100 п.о. и 30 п.о.

Для идентификации аллелей гена MPO используют рестриктазу AciI. Для гена MPO генотип G/G соответствует двум фрагментам длиной 289 п.о. и 61 п.о. и указывает на гомозиготность по нормальному аллелю. Генотип G/A является гетерозиготным и проявляется в присутствии 4 полос длиной 289 п.о., 169 п.о., 120 п.о. и 61 п.о. Присутствие гомозиготы A/A определяется 3 полосы 169 п.о., 120 п.о. и 61 п.о.

Разделение продуктов амплификации генов CAT, GSTM1 и GSTТ1 проводили в горизонтальном 3% агарозном геле, приготовленном на однократном трис-боратном буфере (1хТВЕ), а продуктов амплификации генов PON1, MPO, CYP1A1 в вертикальном 7% полиакриламидном геле (ПААГ), приготовленном на однократном трис-боратном буфере (1хТВЕ).

Агарозные и полиакриламидные гели красили бромистым этидием и визуализировали в проходящем ультрафиолетовом свете. Всего в исследовании было проведено 1500 ПЦР-реакций.

Оценка спонтанного уровня хромосомных нарушений в лимфоцитах периферической крови и уровня хромосомных аберраций при нагрузке мутагенами in vitro проводили в соответствии со стандартными методами учета цитогенетических нарушений в соматических клетках человека совместно с сотрудниками академической группы академика Н.П. Бочкова МГНЦ РАМН. Всего было проанализировано более 5000 метафаз.

Исследование проводили на лимфоцитах периферической крови 47 здоровых индивидов, не имеющих контакта с источниками ионизирующего излучения, не работающих в условиях химического производства, не болевших вирусными заболеваниями последние 3 месяца, не проходивших последние полгода рентгенодиагностическое обследование. В настоящем исследовании использовали цельную периферическую кровь здоровых доноров, получаемую из локтевой вены. Выбор реципиентов определен с позиции различных сочетаний «протективных» и «предрасполагающих» аллельных вариантов.

Лимфоциты культивировали в соответствии со стандартной методикой (Hungerford, 1965; Buckton, Evans, 1973) с модификациями.

В качестве модельного мутагена был выбран митомицин С. Это алкилирующий агент, содержащий две этилениминовые группы и отнесенный к одноцентровым мутагенам (Бочков Н.П., Чеботарев А.Н., 1989). Митомицин С представляет собой антибиотик, выделенный из бульонной культуры Streptomyces caespitosus, который обладает противоопухолевым действием и селективно ингибирует синтез дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

Для данного соединения были ранее изучены некоторые количественные закономерности мутагенного действия в культуре лимфоцитов человека (Синкус А.Г., 1969; Бочков Н.П. с соавт., 1972). Митомицин С обладает рядом удобных с экспериментальной точки зрения свойств: легко растворим в воде, физиологическом растворе; растворы довольно стойкие и при температуре 37°С не снижают своей цитогенетической активности на протяжении нескольких часов.

Методика обработки мутагеном культур лимфоцитов была общепринятой. Концентрация мутагена после специально проведенных экспериментов составила 0,05мг/мл. Воздействие митомицином С производили на 48 часу в G1 стадии, после чего на 70-м часу следовало введение колхицина. Фиксацию осуществляли на 72 часу.

При статистическом анализе результатов использовались классические статистические методы, включая кластерный и факторный анализы.

Учитывая литературные данные о скорости метаболизма ксенобиотиков и публикации зарубежных коллег, мы выбрали в качестве устойчивых или протективных и чувствительных или предрасполагающих следующие генотипы, представленные в табл. 2.

Таблица 2 Сочетание аллелей генов системы биотрансформации ксенобиотиков(CYP 1A1, PON1, GSTT1, GSTM1, CAT, MPO)

Сочетание аллелей	CYP1A1	PON1	GSTT1	GSTM1	CAT	MPO
«Протективное» устойчивый генотип	ILE/ILE	M/M	+/+	+/+	T/T	A/A
«Предрасполагающее» чувствительный генотип	ILE/VAL, VAL/VAL	L/M, L/L	0/0	0/0	C/C, C/T	G/G, G /A

Результаты и их обсуждение

1. Результаты анализа анкет, определяющих социо-психологический статус обследуемой группы сотрудников ГУ НИИ ЭЧ и ГОС им. А.Н. Сысина РАМН и Медико-генетического научного центра РАМН

В первой части исследования использовалась анкета, разработанная в НИИ экологии человека и гигиены окружающей среды им А.Н. Сысина РАМН.

При обработке анкет получены следующие результаты. Всего было опрошено 198 человек, из них: 48 мужчин и 150 женщин. Возраст испытуемых был от 20 до 40 лет. Большинство обследованных людей (53%) работали с вредными веществами, из них: 17,7% - с кислотами и растворителями, 5,1% - с бензином и смазочными маслами, 0,5% - с почвенной пылью, 19,2% - с известными мутагенами и канцерогенами, 10,5% - с другими вредными веществами. Более трети опрошенных отметили у себя заболевания желудочно-кишечного тракта, нервной системы и аллергию. Болезни органов дыхания отметила пятая часть опрошенных, также как болезни сердечно-сосудистой системы и опорно-двигательного аппарата. Болезни молочной железы и урологические заболевания - меньше чем у пятой части выборки. О наличии наследственных болезней заявляет пятая часть данной выборки. Наименее представленными в анкетах оказались: травмы и операции, кожные, гинекологические, опухолевые заболевания и болезни эндокринной системы (около десятой части всей выборки).

Большинство обследованных людей - 68,2% - считали своё здоровье нормальным, хорошее здоровье отметили у себя 12,1%; плохое - 7,6%; затруднились ответить на этот вопрос - 12,1%. «Оптимистами» в оценке нынешней жизни, по сравнению с прошлой, оказалась почти половина опрошенных (43,9%); отметившими, что их жизнь не изменилась - чуть меньше половины (42,9%), жизнь ухудшилась у 13,1%. Статистический анализ материалов исследования показал, что исследованная выборка представляла собой группу, более половины которой - научные сотрудники и руководители лабораторий и отделов НИИ. Другую половину составили: аспиранты, лаборанты и технический персонал. Полученные результаты репрезентативны для социальной группы москвичей, относимых к категории служащих.

Отношение реципиентов к настоящему социальному статусу следующее: частично удовлетворёнными им оказалось меньше половины, полностью удовлетворёнными - более десятой части; остальные - не удовлетворены. Таким образом, большинство опрошенных хотели бы повышения собственного социального статуса. Прогноз улучшения материального положения в будущем в данной выборке скорее негативный, но некоторый «осторожный оптимизм» выражается в оценке своего нынешнего положения по сравнению с прошлым. Район проживания, по мнению реципиентов, отрицательно сказывается на здоровье более чем у трети анкетированных (33,8%), положительно влияет на 38,4%, остальные опрошенные не имели определённого мнения по этому вопросу (27,8%).

Преимущественно удовлетворительная оценка субъективного благополучия по ШСБ (шкале субъективного благополучия) позволяет судить в целом о выборке как о «субъективно неблагополучной». По шкале САН (Самочувствие, активность, настроение) большинство анкетированных (80%) в момент обследования оценили своё самочувствие и настроение как хорошее, также как и уровень физической активности.

Важно отметить, что субъективные суждения человека об удовлетворенности отдельными аспектами жизни имеют более тесную корреляцию с уровнем социального благополучия, чем объективные условия. Наибольшее влияние на субъективное благополучие оказывает удовлетворенность человека самим собой, образом жизни и семьей по сравнению с удовлетворенностью работой, здоровьем и социальным окружением.

2. Результаты генотипирования полиморфизмов генов 1 фазы (CYP1A1, PON1), 2 фазы (GSTT1 и GSTM1) биотрансформации ксенобиотиков и системы оксидантного равновесия (CAT, MPO)

2.1 Определение частот полиморфных аллелей генов CYP1A1 и PON1

Ген CYP1A1 участвует в метаболизме большого спектра углеводородов, включая такой известный канцероген, как бензопирен, играет главную роль в метаболизме многих обычно используемых лекарств, включая имизин, кофеин, парацетамол, фенацетин и теофиллин, которые также являются тератогенами. Кроме того, CYP1A1 метаболизирует эстрогены.

Генный полиморфизм обусловлен точковой мутацией в экзоне 7, характеризуется появлением «быстрого» аллеля (VAL). Последний встречается почти у 7% представителей европеоидной расы и рассматривается как фактор риска возникновения некоторых раковых заболеваний. ILE/VAL - гетерозиготы.

Результаты генотипирования полиморфизмов гена CYP1A1 представлены в табл. 3

Таблица 3 Частоты генотипов полиморфного гена CYP1A1 в группе 200 обследованных лиц

Генотипы и аллели гена CYP1A1	Частота аллельных вариантов
	Число лиц	%
Генотипы
ILE/ILE	178	89
ILE/VAL	22	11
VAL/VAL	0	0
Аллели
ILE	378	94,5
VAL	22	5,5

Таким образом, частота VAL аллеля гена CYP1A1 в исследованной нами выборке составила 5,5%. Данное значение не превышает известных литературных данных для европеоидов (табл. 9).

Ген PON отвечает за синтез параоксоназы - белка плазмы крови, играющего важную роль в детоксикации фосфорорганических соединений. Ген имеет два аллеля, коррелирующих с высоко активной и низко активной формами этого фермента. В случае замены лейцина на метионин образуется М аллель, соответствующий высокоактивной форме фермента. L аллель соответствует низко активной форме. L/M - гетерозиготы.

Результаты генотипирования полиморфизмов гена PON1 представлены в табл. 4.

Таблица 4 Частоты генотипов полиморфного гена PON1 в группе 200 обследованных лиц

Генотипы и аллели гена PON1	Частота аллельных вариантов
	Число лиц	%
Генотипы
L/L	92	46
L/M	84	42
M/M	24	12
Аллели
L	268	67
M	132	33

Частота М аллеля в нашей выборке составила 33%, что соответствует данным многоцентрового исследования европеоидов (табл. 9).

2.2 Определение частот полиморфных аллелей генов GSTT1 и GSTM1

Глутатион-S-трансферазы способствуют защите организма от широкого круга химических соединений, включая пестициды, лекарственные препараты и т.д., многие из которых являются потенциальными канцерогенами.

Ген GSTM1 существует в трех аллельных вариантах, два из которых (GSTM1A и GSTM1B) кодируют белки, несколько отличающиеся по своей энзиматической активности, и GSTM1, при котором, вследствие протяженной (около 15 тыс. п.о.) делеции РНК, белковый продукт вообще не синтезируется. “Нулевой аллель” GSTM1 широко распространен в человеческой популяции.

Гены GSTT1 и GSTM1 анализировались на наличие, либо отсутствие делеции («+» - нормальная активность, «0/0» - дефект фермента).

Результаты генотипирования полиморфизмов генов 2 фазы (GSTT1 и GSTM1) биотрансформации ксенобиотиков представлены в табл. 5-6.

Таблица 5 Частоты генотипов полиморфного гена GSTT1 в группе 200 обследованных лиц

Генотипы гена GSTT1	Число лиц	%
+	123	61,5
0/0	77	38,5

Таблица 6 Частоты генотипов полиморфного гена GSTM1 в группе 200 обследованных лиц

Генотипы гена GSTM1	Число лиц	%
+	107	53,5
0/0	93	46,5

Частоты гомозигот по делециям генов GSTT1 и GSTM1 составили 38,5% и 46,5%, соответственно. Доля индивидуумов, имеющих нулевые генотипы сразу по обоим генам равнялась 16,5%.

Таким образом, при сравнении наших результатов по распространенности нулевого генотипа GSTM1 с аналогичными литературными данными можно отметить соответствие частоты гомозигот по делеции гена с таковыми в европеоидных и монголоидных популяциях (табл. 9).

2.3 Определение частот полиморфных аллелей генов CAT и MPO

Ген CAT отвечает за синтез каталазы - фермента, осуществляющего антиоксидантую роль, защищая клетки от перекиси водорода, которые крайне реакционноспособны и могут быстро окислять практически любые биологические молекулы. В гене каталазы описан полиморфный участок С1167Т - замена цитидина (С) на тимидин (Т) в нуклеотиде 1167. При осуществлении этой замены активность продуцируемого фермента повышается. C/T - гетерозиготы.

Результаты генотипирования полиморфизмов гена антиоксидантной защиты CAT представлены в табл. 7.

Таблица 7 Частоты генотипов полиморфного гена CAT в группе 200 обследованных лиц

Генотипы и аллели гена CAT	Частота аллельных вариантов
	Число лиц	%
Генотипы
C/C	99	49,5
C/T	74	37
T/T	27	13,5
Аллели
C	272	68
T	128	32

По данным проведенного исследования частота аллеля Т в московской популяции составила 32%, что соответствует ранее опубликованным данным для европеоидов (табл. 9).

Ген MPO отвечает за синтез специфического миелоидного фермента, который находится в нейтрофилах и моноцитах. Ген имеет два аллеля. Замена нуклеотидного основания в промоторном регионе гена с G (гуанозин) на А (аденозин) снижает активность фермента. G/A - гетерозиготы.

Результаты генотипирования полиморфизмов гена MPO представлены в табл. 8.

Таблица 8 Частоты генотипов полиморфного гена MPO в группе 200 обследованных лиц

Генотипы и аллели гена MPO	Частота аллельных вариантов
	Число лиц	%
Генотипы
G/G	149	74,5
G/A	46	23
A/A	5	2,5
Аллели
G	344	86
A	56	14

В нашем случае эта величина равна 14%. У европейцев эта величина составила от 27% у жителей Испании (Combarros, 2002) до 20,8% у населения США (Xu, 2002). Интересно отметить, что частота встречаемости аллеля А у европеоидов намного чаще, чем у азиатов.

Таблица 9 Литературные данные по частотам генетических полиморфизмов генов 1 фазы (CYP1A1, PON1), 2 фазы (GSTT1 и GSTM1) биотрансформации ксенобиотиков и генов CAT и MPO

Выборка	Частота Val аллеля гена CYP1A1	Частота М аллеля гена PON1	Частота 0/0 генотипа гена GSTM1	Частота 0/0 генотипа гена GSTT1	Частота T аллеля гена CAT	Частота A аллеля гена MPO
Настоящее исследование	0,055	0,33	0,465	0,385	0,32	0,14
Россия, Западная Сибирь (европеоиды)	0,05	0,31			0,56
Россия, Западная Сибирь (ненцы)	0,35
Многоцентровое исследование (европеоиды)	0,05	0,3	0,54	0,19
США (европеоиды)	0,03		0,53	0,19	0,24	0,21
Германия (европеоиды)	0,03	0,36				0,21
Финляндия (финны)	0,05	0,35				0,27
Многоцентровое исследование (монголоиды)	0,23	0,23
Япония (японцы)	0,20	0,08	0,54	0,48		0,10
Тайвань (китайцы)	0,26
Мексика (метисы)	0,34	0,15
Мексика (Майя)	0,55	0,05
Мексика (Теенеки)	0,65	0,02
Многоцентровое исследование (африканцы)	0,03		0,267
Китай (китайцы)		0,03	0,49	0,49	0,32	0,15
Польша (поляки)		0,36	0,48	0,16
Турция (турки)		0,28
Россия, Северо-западный регион (русские)			0,42
Россия, Волго-уральский регион (русские)			0,462
Испания (испанцы)			0,49	0,19		0,27
Эстония (эстонцы)			0,50
Корея (корейцы)			0,54	0,54		0,09
США (африканцы)			0,26			0,3
Швеция (шведы)					0,28
Бангладеш(индусы)					0,17

Нами проведено изучение сочетаний различных генотипов генов GSTM1 и GSTT1. Полученные данные свидетельствуют, что наблюдаемые сочетания полиморфизмов этих генов соответствуют ожидаемым сочетаниям, исходя из частот полиморфизмов отдельно по каждому гену (²= 0.67; df = 3; p < 0.88). Таким образом, в изученной популяции не наблюдается накопления редких сочетаний полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1.

3. Анализ взаимосвязей полиморфизмов генов CYP1A1, PON1, GSTT1, GSTM1, CAT с цитогенетическими нарушениями (хромосомные аберрации в лимфоцитах периферической крови) у обследованных лиц при нагрузке мутагенами

На основе результатов тестирования генетических полиморфизмов системы биотрансформации ксенобиотиков и генов анти- и прооксидантной защиты организма были сформированы группы для проведения цитогенетического обследования.

В общей сложности проведен цитогенетический анализ у 47 доноров. Выделено 8 групп, которые можно разделить на 4 пары:

1. 2 группы для изучения влияния нулевых вариантов GSTT1 и GSTM1 на частоту хромосомных аберраций при действии митомицина С. В одну из них вошли испытуемые, имеющие делецию одновременно по генам GSTT1 и GSTM1 (10 человек), а в другую 8 человек, у которых не отмечается делеции по генам GSTT1 и GSTM1, тогда как остальные исследуемые гены максимально приближены к «дикому» типу.

2. 2 группы для изучения влияния аллельных вариантов гена PON1 на частоту хромосомных аберраций при нагрузке мутагеном. Первая группа из 9 человек, имеющих сочетание аллелей L/L и вторая оппозитная группа с протективным сочетанием М/М (10 человек).

3. 2 группы по гену CYP1A1. Одна группа из 6 человек с «предрасполагающим» генотипом ILE/VAL и другая с генотипом ILE/ILE (7 человек).

4. 2 группы по гену CAT. 10 человек с сочетанием аллелей С/С в гене САТ и 8 человек с мутантным «протективным» генотипом Т/Т.

Мы использовали два показателя наличия цитогенетических нарушений в лимфоцитах: доля клеток с аберрациями и число хромосомных разрывов на клетку. При анализе всех материалов цитогенетических исследований показана правомочность использования любого из этих двух показателей, поскольку статистических различий у каждого индивидуума между этими показателями не обнаружено.

Результаты цитогенетических исследований по различным сочетаниям генетических полиморфизмов генов PON1, CYP1A1, CAT, GSTT1 и GSTM1 приведены в табл. 10-12.

Таблица 10 Сочетание частоты ХА с полиморфизмами генов GSTT1 и GSTM1 2 фазы системы биотрансформации ксенобиотиков в группе исследуемых при нагрузке митомицином С

Исследуемые генотипы	+/+	00/00	р
Хромосомные аберрации до введения мутагена	0,034	0,042	>0,05
Хромосомные аберрации после введения мутагена	0,24±0,03	0,29±0,04	<0,05

В результате исследования установлено, что в группе индивидуумов с делецией по генам GSTT1 и GSTM1 уровень хромосомных аберраций при введении мутагена достоверно выше, чем у испытуемых с «защитной» формой этих генов.

В результате действия мутагена на культуры клеток с «протективными» (L/L) и «предрасполагающими» (M/M) генотипами по гену PON1 количество хромосомных аберраций и разрывов хромосом на клетку не различается для этих групп.

При действии митомицина С на клетки с более активной (ILE/VAL) или менее активной (ILE/ILE) формой фермента гена CYP1A1 значимых различий между частотами хромосомных аберраций и разрывов хромосом не выявлено. Индивидуумы, имеющие сочетание аллелей ILE/VAL, представляют собой редкую группу, и явная связь не прослеживается, что может быть связано с низкой частотой аллеля VAL и небольшой выборкой этого аллеля в исследовании.

Таблица 11 Сочетание частоты ХА с полиморфизмом гена CYP1A1 1 фазы системы биотрансформации ксенобиотиков в группе исследуемых при нагрузке митомицином С

Исследуемые генотипы	ILE/ILE	ILE/VAL	р
Хромосомные аберрации	0,23±0,03	0,29±0,04	>0,05
Число хромосомных разрывов на клетку	0,31±0,06	0,42±0,06	>0,05

Не было выявлено статистически значимых различий между генетическим полиморфизмом гена САТ и цитогенетическими нарушениями (хромосомными аберрациями в лимфоцитах периферической крови человека).

Мы оценивали сочетание полиморфизмов генов PON1 и CAT в отношении влияния «протективных» (T/T L/M, T/T M/M) и «предрасполагающих» (C/T L/L, C/C L/L) генотипов на частоту хромосомных разрывов в клетках. Выявлено, что при сочетании защитных генотипов количество хромосомных разрывов достоверно ниже (р<0,05), как видно из табл. 12.

Таблица 12 Сочетание частоты ХА с «протективными» (T/T L/M, T/T M/M) и «предрасполагающими» (C/T L/L, C/C L/L) генотипами CAT и PON1 в группе исследуемых при нагрузке митомицином С

Исследуемые генотипы	Сочетание генотипов по CAT и PON1	р
	T/T L/M, T/T M/M	C/T L/L, C/C L/L
Число хромосомных разрывов на клетку.	0,26±0,03	0,38±0,04	<0,05

Наиболее неблагоприятным сочетанием считается высокая активность ферментов I фазы (активация ксенобиотиков) в комбинации с низкой активностью ферментов II фазы (детоксикация). Такое сочетание может обуславливать накопление активных форм ксенобиотиков, что может приводить к большей вероятности возникновения мутаций и развитию опухолевого процесса. В случае исследованных нами полиморфизмов этому сочетанию соответствует следующий набор генотипов: GSTM1 (0/0), GSTT1 (0/0) и CYP1A1 (VAL/VAL). Проведенный анализ всех возможных сочетаний изученных полиморфизмов не выявил отличий наблюдаемых значений от ожидаемых (² = 5,077; df = 7; p < 0,65). Распределение и сочетание генотипов генов GSTM1, GSTT1 и CYP1A1 полностью подчинялось закону Харди-Вайнберга (табл. 13).

Таблица 13 Сочетания генотипов генов GSTM1, GSTT1 и CYP1A1.

GSTT	GSTM	CYP1A1	Наблюдаемое	Ожидаемое
+	+	ILE/ILE	52	58,3
+	+	ILE/ VAL	11	7,5
+	00	ILE/ILE	54	50,7
+	00	ILE/ VAL	6	6,5
00	+	ILE/ILE	39	36,5
00	+	ILE/ VAL	5	4,6
00	00	ILE/ILE	32	31,7
00	00	ILE/ VAL	1	4,1
Сумма			200	199,9

Связь данных анкетирования, результатов социо-психологических опросников и субъективных суждений человека об удовлетворенности отдельными аспектами жизни и уровнем социального благополучия, а также качества жизни с различными типами генетических полиморфизмов исследуемых генов не выявлена.

4. Частота полиморфных аллелей генов CYP1A1, GSTM1 и GSTT1 у детей Чапаевска, имеющих заболевание мочеполовой системы и детей Оренбурга, страдающих хронической бронхолегочной патологией

Результаты обследования 104 мальчиков г. Чапаевска и 96 детей г. Оренбурга представлены в табл. 14-18.

CYP1A1 является одним из важнейших ферментов, участвующих в метаболизме диоксиноподобных соединений, и определение популяционной частоты его аллельных вариантов необходимо для полного обследования населения неблагоприятных районов, в частности г. Чапаевска.

Диоксин - представитель особой группы ксенобиотиков - «суперэкотоксикантов». Для этих веществ характерно комплексное воздействие на человека, включающее общетоксическое действие, влияние на нейроэндокринную систему, иммунитет, повышение чувствительности к действию других ксенобиотиков, возможные мутагенные, канцерогенные и тератогенные эффекты. Поступление ксенобиотика в эмбрион может происходить через трансплацентарный барьер из организма матери. Исходя из этого, мы считаем необходимым учитывать способность материнского организма трансформировать химические соединения окружающей среды.

Принимая во внимание, что эффект одного гена может и не вызвать появление имеющейся патологии, возникает необходимость более детальных исследований по этому направлению как у детей, проживающих на загрязненных диоксином территориях, так и у их матерей.

Результаты генотипирования полиморфизмов гена CYP1A1 у детей г. Чапаевска представлены в табл. 14.

Таблица 14 Частоты полиморфных аллелей гена CYP1A1 у 104 мальчиков г. Чапаевска.

Генотипы и аллели гена CYP1A1	Частота аллельных вариантов
	Число лиц	%
Генотипы
ILE/ILE	95	91,4
ILE/VAL	8	7,7
VAL/VAL	1	0,9
Аллели
ILE	198	95,2
VAL	10	4,8

Частота аллеля VAL в исследуемой выборке составила 4,8%, что соответствует известным литературным данным для европеоидов.

Результаты генотипирования полиморфизмов гена CYP1A1 у детей г. Оренбурга представлены в табл. 15.

Таблица 15 Частоты генотипов полиморфного гена CYP1A1 у детей г. Оренбурга.

Генотипы и аллели гена CYP1A1	Частота аллельных вариантов
	Число лиц	%
Генотипы
ILE/ILE	90	93,7
ILE/VAL	6	6,3
VAL/VAL	0	0
Аллели
ILE	186	96,9
VAL	6	3,1

Частота аллеля VAL в группе детей составила 6,3%, что соответствует ранее опубликованным данным, равным примерно 7% для лиц европейской популяции.

Результаты генотипирования полиморфизмов генов GSTT1 и GSTM1 у детей г. Оренбурга представлены в табл. 16-17.

Таблица 16 Частоты генотипов гена GSTM1 у 96 детей г. Оренбурга.

Генотипы гена GSTM1	Число лиц	%
+	50	52
0/0	46	48

Таблица 17 Частоты генотипов гена GSTT1 у 96 детей г. Оренбурга.

Генотипы гена GSTT1	Число лиц	%
+	71	74
0/0	25	26

Полученные данные по генам GSTM1 и GSTT1 соответствуют литературным.

У больных хроническими бронхолегочными заболеваниями, согласно ранее опубликованным данным, нулевые генотипы встречаются с более высокой частотой. Результаты молекулярно-генетического анализа полиморфизма гена GSTM1 свидетельствуют о повышении частоты делеции у больных хроническими бронхолегочными заболеваниями до 50,5% против 42,7% у здоровых индивидов, однако в нашем исследовании такой связи не выявлено.

Таблица 18 Сочетание генотипов генов GSTT1 и GSTM1 в группе исследованных детей г. Оренбурга.

	GSTT1+/GSTM1+	GSTT1+/GSTM1-	GSTT1-/GSTM1+	GSTT1-/GSTM1-
n	41	28	9	18
%	42,7	29,1	9,4	18,8

При генотипировании группы детей из г. Оренбурга оказалось, что 18 детей (18,8%) оказались гомозиготами по делеции одновременно и по гену GSTМ1 и GSTT1 (табл. 18).

Заключение

В проделанной работе впервые были изучены на трех значительных по объему выборках сочетанные частоты полиморфных вариантов шести основных генов ферментов биотрансформации ксенобиотиков и системы оксидантного равновесия и оценен спонтанный и индуцированный мутагенез in vitro в зависимости от полиморфизмов исследуемых генов.

При определении групп риска здоровью на различных неблагополучных с позиции эколого-гигиенической оценки территориях важно учитывать у населения частоты генов, участвующих в биотрансформации ксенобиотиков. Такие попул...