Активность маркеров клеток крови при пиелонефрите и введении эритроцитарной формы цефтриаксона

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Активность маркеров клеток крови при пиелонефрите и введении эритроцитарной формы цефтриаксона

Пиелонефрит - одно из самых распространенных заболеваний у человека и занимает второе место после острых респираторных инфекций. Пиелонефрит является основой глубоких морфологических и энзимопатических нарушений в почках, что в свою очередь вызывает системные иммунометаболические изменения [1]. В регуляции механизмов иммунологической защиты организма при пиелонефрите принимают участие нейтрофилы, лимфоциты, эритроциты, тромбоциты. Метаболическим маркером нейтрофилов может служить активность НАДФН-оксидазы, лимфоцитов - концентрация фруктозы - 2,6 - дифосфата (ФДФ), эритроцитов - активность Mg⁺²-АТФ-азы, тромбоцитов - содержание МДА.

Цель работы. Выяснить влияние эритроцитарной формы цефтриаксона на активность маркеров клеток крови при экспериментальном пиелонефрите.

Материалы и методы. Исследования проведены на белых беспородных крысах массой 180 - 200 г. Все животные содержались в одинаковых условиях, на обычном пищевом рационе. Для получения статистически достоверных результатов группы формировались из 9 животных, примерно одного возраста. Разброс в группах по исходной массе не превышал 10%. Все исследования проводили в одно и то же время суток с 8.00 до 12.00 с соблюдением принципов, изложенных в Конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других целей (г. Страсбург, Франция, 1986). Экспериментальный пиелонефрит моделировали путем однократного внутрижелудочного введения ртути дихлорида 2 мг/кг и внутривенной инъекции предварительно оттитрованных доз суточной агаровой культуры Staphylococcus aureus, содержащих 1Ч10⁸микробных тел в 0,5 мл раствора.

Для подтверждения развития необструктивного пиелонефрита проведены определения клинических показателей (масса и температура тела), лабораторных и гематологических показателей (количество и соотношение форменных элементов крови, концентрации мочевины и креатинина в крови) [2], морфологических и энзиматических изменений в почках.

В работе в качестве антибактериального препарата использовали цефтриаксон (Индия). При системном введении цефтриаксон вводили в дозе 15 мг/кг внутривенно, однократно.

Для включения цефтриаксона в строму эритроцитов (ЭН) использовали метод гипоосмотического гемолиза, позволяющий ввести максимально возможное количество препаратов (эритроцитарная форма) [3, С. 19-20], [4, С. 54-56]. В части опытов в инкубационную среду добавляли АТФ в количестве 0,5 мл.

Определение цефтриаксона в биоматериале проводили по нормативной документации на субстанцию препарата (высокоэффективной жидкостной хроматографией).

Активность НАДФН-оксидазы определяли спектрофотометрической методикой на спектрофотометре СФ 2000. Использовали квадратные кюветы с толщиной слоя 10 мм. Объем пробы равнялся 3 мл. В состав пробы входили Na-K-фосфатный буфер, гомогенат клеток (1 млн/мл), субстрат НАДФН (0,5 нмоль/мл). Контрольная проба не содержала субстрата. Определение проводили при комнатной температуре. Активность фермента оценивали по скорости НАДФН-оксигеназной реакции, рассчитываемой по убыли поглощения НАДФН (за счет его окисления) при длине волны 340 нм [5, С. 14-18].

Тромбоциты из крови выделяли по методике, описанной Ермолаевой Т.А. с соавторами [6, С. 33-38]. Метаболический маркер тромбоцитов МДА определяли по методике Негреску Е.В. с соавторами [7, С. 36-39].

Лимфоциты периферической крови выделяли по Т.В. Федосеевой с соавторами и определяли в них содержание ФДФ [8, С. 232-237].

Показателем активности эритроцитов может служить Mg²⁺-ATФаза, которую определяли по методике Рыжковой Г.Ф. и Вишнякова С.И. [9].

Статистическую обработку результатов исследования проводили путем вычисления средних арифметических изучаемых показателей (M) и их стандартных ошибок (m). Существенность различий средних величин оценивали по критериям Стьюдента и Вилкоксона-Манна-Уитни [10].

Результаты исследования и их обсуждения.

Установлено, что введение ртути дихлорида совместно с микробным агентом вызывало развитие необструктивного гематогенного пиелонефрита, подтверждающееся клиническими показателями: гипертермия, снижение веса на 12-14%, нарушение выделительной функции почек (табл. 1).

Изменение функциональных показателей у животных с необструктивным пиелонефритом

цефтриаксон эритроцитарный метаболический тромбоцит

Анализ выделительной функции почек показал резкое повышение уровня в крови мочевины в 1,75-2,2 раза и креатинина в 1,8-3,2 раза, появление лейкоцитов и белка в моче (табл. 1).

Установлены изменения лейкоцитарной формулы - увеличение количества лейкоцитов на 30-35%, уменьшение количества лимфоцитов на 20-24% и повышение количества нейтрофилов крови на 21-23%. В почках отмечено снижение активности СДГ, ГДГ, ЩФ в 1,9-2,3 раза, на фоне высокой активности ЛДГ, выявлены морфологические изменения (очаговые скопления лейкоцитов в виде микроабсцессов) (рис. 1). В ходе приготовления гистологических препаратов использовалась окраска гематоксилином и эозином. При окраске цитоплазма клеток окрашивается в розовый цвет, ядра в фиолетовый.

Анализ патологических изменений в мозговом слое почек показал многочисленные очаговые некрозы, местами разрушенные канальцы и на их месте очаговые скопления лейкоцитов - микроабсцессы.

Морфологические изменения в препаратах почек при пиелонефрите. Окраска гематоксилином и эозином

У животных с пиелонефритом отмечено значительное подавление активности НАДФН-оксидазы нейтрофилов, Mg²⁺-АТФазы эритроцитов, снижение концентрации ФДФ в лимфоцитах и повышение содержания МДА в тромбоцитах.

Системное введение цефтриаксона животным с пиелонефритом достоверно снижало активности метаболических маркёров нейтрофилов, лимфоцитов, эритроцитов и повышало уровень МДА в тромбоцитах. В связи с полученными данными интересно было изучить влияние эритроцитарной формы цефтриаксона на функциональную активность клеток при пиелонефрите. Установлено, что введение ЭН с включенными антибактериальным препаратом повышало активности НАДФ-оксидазы нейтрофилов, Mg²⁺-АТФазы эритроцитов, концентрацию ФДФ в лимфоцитах и снижало содержание МДА в тромбоцитах (табл. 2).

Влияние эритроцитарной формы цефтриаксона на показатели функциональной активности клеток крови при пиелонефрите

Обмен макроэргических соединений в эритроцитах в значительной степени определяется активностью мембранных АТФаз, осуществляющих энергозависимый перенос ионов через цитоплазматическую мембрану клеток. Особый интерес представляют Mg⁺² - АТФаза, «накачивающая» в эритроциты ионы магния, активирующие большинство ферментов гликолиза [11] и в форме Mg-АТФаз, повышающие активность Na⁺, K⁺ и Ca²⁺.

В связи с изложенным большой интерес представляло выяснение влияния ЭН с иммобилизованным в присутствии или без АТФ цефтриаксоном на активность Mg⁺²-АТФазы мембраны эритроцитов. Оказалось, что активность Mg⁺²-АТФазы повышалась только в случае введения ЭН с включенным в присутствии АТФ цефтриаксоном. Полученные результаты подтверждают, что необходимым условием активации Mg⁺²-АТФаз мембраны эритроцитов служит увеличение биологической доступности, вследствие возможного образования органических комплексов с АТФ (табл. 3).

Активность Mg⁺²-АТФазы в строме эритроцитов крыс, получавших инъекции ЭН с иммобилизованным в присутствии АТФ цефтриаксоном

Таким образом, установлено, что введение клеточной формы (эритроцитарной) цефтриаксона нормализовало нарушенную при пиелонефрите активность метаболических маркеров: повышало активности Mg²⁺-АТФазы эритроцитов, НАДФН-оксидазы лейкоцитов, ФДФ в лимфоцитах и снижало уровень МДА в тромбоцитах.

Установленные изменения могут быть рекомендованы в качестве дополнительных критериев для прогнозирования иммунометаболической активности клеточных форм химиопрепаратов в условиях необструктивного пиелонефрита.

Список литературы

цефтриаксон эритроцитарный метаболический тромбоцит

1. Есилевский Ю.М. Патогенез пиелонефрита / Ю.М. Есилевский. - М.: МЕДпресс-информ, 2007. - 368 с.

2. Меньшиков В.В. Лабораторные методы исследования в клинике: справочник /ред. В.В. Меньшиков. - М.: Медицина, 1987. - 365 с.

3. Генинг Т.П. Фармакокинетика антибиотика, вводимого в организм в клеточных носителях / Т.П. Генинг, К.К. Мануйлов // Антибиотики и химиотерапия. - 1991. - №9. - С. 19-20.

4. Жумадилов Ж.Ш. Особенности включения некоторых антибиотиков в эритроцитарные тени - систему целенаправленной доставки химиотерапевтических препаратов / Ж.Ш. Жумадилов, Р.В. Макаренкова // Антибиотики и химиотерапия. - 1990. - Т. 35, №11, - С. 54-56.

5. Рыбников В.Н. Иммуномодулирующее действие эритроцитов и их стромы инкубированных с менадионом и гетерополисахаридами Poligonaceae при острой кровопотере / В.Н. Рыбников, И.Л. Бровкина, М.Г. Газазян // Антибиотики и химиотерапия. - 2003. - Т.48, №4. - С. 14-18.

6. Ермолаева Т.А. Методы выделения из крови интактных тромбоцитов / Т.А. Ермолаева, О.Г. Головина, В.М. Пономаренко // Лабораторное дело. -1991. - №10. - С. 33-38.

7. Негреску Е.В. Антиоксиданты, перекисное окисление липидов и рецепторзависимое увеличение концентрации Са²⁺ в тромбоцитах человека / Е.В. Негреску, А.В. Лебедев, Г.Н. Балденков и др. // Вопросы медицинской химии. - 1992. - Т. 38, вып. 1. - С. 36-39.

8. Коровкин Б.Ф. Изменение содержания фруктозо - 2,6 - бифосфата в лимфоцитах периферической крови больных сахарным диабетом // Б.Ф. Коровкин, Н.Ф. Беляева, С.А. Краевой и др. // Вопросы медицинской химии. -1999. - Т. 45, вып. 3. - С. 232-237.

9. Рыжкова Г.Ф. Методическое пособие по выделению, очистке и определению активности транспортных АТФаз в органах и тканях животных / Г.Ф. Рыжкова, С.И. Вишняков. - Воронеж, 2005. - 31 с.

10. Гублер Б.В. Вычислительные методы анализа и распознавания патологических процессов / Е.В. Гублер. - Л.: Медицина, 1978. - 294 с.

11. Ленинджер А. Основы биохимии / А. Ленинджер // М.: Мир. - 1985, Т.1. - 365 с.

Размещено на Allbest.ru