Влияние препаратов-проводников с лимфотропной активностью на фармакокинетические и фармакодинамические параметры цефотаксима

Размещено на http://www.allbest.ru/

3

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

14.03.06 - фармакология, клиническая фармакология

Влияние препаратов-проводников с лимфотропной активностью на фармакокинетические и фармакодинамические параметры цефотаксима

Юров Дмитрий Евгеньевич

Москва - 2011

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы исследования

Разработка и внедрение средств и методов направленного транспорта лекарственных препаратов является одной из важнейших стратегических задач современной фармакологии [Kshirsagar N.A., 2000; Gholam A. et al., 2005]. Их применение позволяет увеличивать биодоступность лекарственных веществ, минимизировать потери при распределении в тканях, повышать концентрацию в очаге повреждения и увеличивать время полувыведения. В целом, использование средств и способов направленной доставки препаратов повышает эффективность проводимой терапии, улучшает ее переносимость, безопасность и комплаентность [Леонова М.В., 2009; Muranishi S., 2000; Wertheimer A., 2005].

В качестве одного из перспективных фармакотерапевтических направлений рассматривается целевая доставка лекарственных средств в лимфатическую систему, которая является ключевым звеном гуморального транспорта и участвует практически во всех патологических процессах, независимо от их этиологии и патогенеза [Левин Ю.М., 2008]. Кроме того, играя важную роль в регуляции иммунного ответа и элиминации чужеродных веществ, лимфатическая система одновременно служит одним из основных путей распространения в организме опухолевых клеток, бактерий и вирусов [Левин Ю.М., 1987; Аничков Н.М. и др., 1989; Charman W., 1992; Jain R., 2002; Cao Y., 2005]. Поэтому направленный транспорт лекарственных веществ в лимфатическую систему позволяет не только оказывать эффективное терапевтическое воздействие на патологический процесс непосредственно в лимфатических сосудах и лимфоузлах, но и доставлять их к очагу повреждения [Буянов В.М., 1991; Бородин Ю.И., 2010].

В связи с этим, в последние годы ведется активный поиск способов, обеспечивающих накопление лекарственных средств (особенно противоопухолевых, антибактериальных и противовирусных) в лимфатической системе [Панченков Р.Т. и др., 1982; Левин Ю.М., 1982, 2003; Бондарь Г.В., 2009; Yumei X., 2009]. С этой целью в клинической практике используются прямое введение лекарственных препаратов в лимфатические сосуды (эндолимфатический способ введения) и метод непрямого лимфотропного введения [Чернеховская Н.Е. и др., 2000]. Для создания лимфотропности лекарственных средств применяют локальное эндотрахеальное и эндобронхиальное введение в подслизистые оболочки, системы направленной доставки на основе нанотехнологий, эндолимфатические проводники, способствующие транспорту низкомолекулярных веществ из интерстиция в лимфатические капилляры. Установлено, что свойствами препаратов-проводников обладают, например, лекарственные средства с протеазной активностью - гиалуронидаза, химотрипсин. Показано, что они усиливают движение жидкости и белков в тканях, ускоряя тем самым лимфатический дренаж, что, по-видимому, и обеспечивает транспорт низкомолекулярных ксенобиотиков (в том числе лекарственных веществ) преимущественно в лимфатическую систему Левин Ю.М., 1982; Свиридкина Л.П. и др., 2007; D.E. Golan et al., 2007.

Как прямой, так и непрямой способы введения лекарственных препаратов в лимфатическую систему имеют свою терапевтическую нишу. Многие авторы указывают на перспективность именно второго подхода, т.к. он сочетает в себе удобство применения, безопасность и высокую эффективность [Левин Ю.М., 1998; Свиридкина Л.П. и др., 2001; Долидзе Д.Д. и др., 2001; Джугостран В.Я. и др., 2005].

Широкое применение нанотехнологических систем доставки ограничивают высокая стоимость, трудоемкость получения и недостаточно хорошо изученные побочные эффекты, а эндотрахеальное и эндобронхиальное введение в подслизистые оболочки требует наличия эндоскопического оборудования и специальной подготовки медицинского персонала. В связи с этим весьма актуальным является поиск препаратов - эндолимфатических проводников для подкожного и внутримышечного введения, что расширило бы возможности непрямой лимфотропной терапии и привело к повышению эффективности лечения целого ряда заболеваний.

Цель исследования: изучить влияние препаратов-проводников, обладающих лимфотропной активностью на фармакодинамические и фармакокинетические параметры цефотаксима.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние гиалуронидазы, гиалуронидазы+азоксимера и гепарина натрия на скорость лимфатического дренажа в брыжейке мышей.

2. Разработать метод визуализации накопления лекарственных препаратов в клетках лимфатической системы.

3. Провести изучение влияния препаратов-проводников на накопление лекарственного препарата в лимфатической системе.

4. Провести сравнительную оценку концентраций цефотаксима в крови, тканях печени и стенки кишечника мышей через 1, 5 и 24 часа после его совместного введения с препаратами-проводниками, обладающими лимфотропной активностью.

5. Провести сравнительную оценку выживаемости мышей с моделированным гнойно-воспалительным процессом органов брюшной полости после однократного внутримышечного введения цефотаксима и его совместного введения с препаратами-проводниками.

Научная новизна исследования

· Впервые проведена сравнительная оценка концентраций антибиотика цефотаксима в плазме крови и тканях печени мышей после его совместного применения с препаратами-проводниками (гиалуронидазой, гиалуронидазой+азоксимером, гепарином натрия), обладающими лимфотропной активностью. Установлено, что предварительное введение препаратов-проводников не только приводит к созданию в плазме крови более высоких концентраций антибиотика, чем в случае его моновведения, но и обеспечивает поддержание более высоких уровней цефотаксима на протяжении суток. Кроме того, показано, что при моновведении цефотаксима его печеночные концентрации превышают плазменные, тогда как при совместном введении с препаратами-проводниками отмечена обратная направленность.

· Впервые разработан метод визуализации накопления лекарственных препаратов в клетках лимфатической системы, сутью которого является определение процента флуоресцирующих лимфоцитов лимфоузлов при накоплении в них антибиотика доксициклина. С его помощью впервые изучено влияние гиалуронидазы, гиалуронидазы+азоксимера и гепарина натрия на накопление антибиотика в клетках лимфоузлов мышей. Показано, что все изученные препараты-проводники увеличивают накопление доксициклина в клетках лимфоузлов экспериментальных животных.

· Показано, что совместное использование препаратов-проводников с лимфотропной активностью и цефотаксима увеличивает выживаемость лабораторных животных с моделированным гнойно-воспалительным процессом органов брюшной полости.

· Впервые проведена сравнительная оценка концентраций антибиотика цефотаксима стенки кишечника мышей после его совместного применения с препаратами-проводниками (гиалуронидазой, гиалуронидазой+азоксимером, гепарином натрия), обладающими лимфотропной активностью. Установлено, что предварительное введение препаратов-проводников создает в ткани стенки кишечника более высокие концентрации антибиотика, чем в случае его моновведения, а также обеспечивает поддержание более высоких уровней цефотаксима на протяжении суток.

Практическая значимость работы

Полученные в ходе исследования данные позволяют обосновать целесообразность изучения клинического использования лимфотропной терапии, включающей применение препаратов-проводников, у пациентов с гнойно-воспалительными заболеваниями органов брюшной полости с целью повышения эффективности проводимой антибактериальной терапии.

Разработанный метод визуализации накопления лекарственных препаратов в клетках лимфатической системы может быть использован для изучения поступления лекарственных веществ в лимфатическую систему.

Результаты проведенного исследования углубляют имеющиеся представления о возможностях метода непрямой лимфотропной терапии.

Основные положения, выносимые на защиту

Препараты-проводники с лимфотропной активностью (гиалуронидаза, гиалуронидаза+азоксимер и гепарин натрия) оказывают влияние на фармакокинетику антибиотика ЦФ, вызывая увеличение его концентрации в плазме крови и некоторых тканях, а также пролонгируют время циркуляции в организме.

Изученные препараты-проводники обладают способностью ускорять лимфатический дренаж и увеличивают поступление антибиотика в лимфатическую систему.

Применение лимфотропной антибиотикотерапии ЦФ, повышает эффективность проводимой терапии, увеличивая выживаемость животных с моделированным гнойно-воспалительным процессом органов брюшной полости.

Апробация работы

По результатам исследований опубликовано 8 работ. Основные положения диссертации были представлены на III съезде лимфологов России (Москва, 2008), XVI Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2009), Конференции «44 года основания и становления общеклинической лимфологии и эндоэкологической реабилитации» (Москва, 2009).

Апробация диссертации состоялась на расширенном заседании кафедры фармакологии ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет Росздрава.

Внедрение результатов исследования

Полученные в исследовании результаты используются в учебном процессе и экспериментальных исследованиях на кафедре фармакологии ГОУ ВПО РГМУ Росздрава, в отделе молекулярной и экспериментальной гематологии, онкологии и иммунологии ФНКЦ ДГОИ Росздрава.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 101 странице, состоит из введения, обзора литературы, главы «Материалы и методы исследования», главы «Результаты собственных исследований», обсуждения, выводов и списка литературы, включающего 116 отечественных и 91 зарубежных источников. Диссертация иллюстрирована 2 таблицами и 19 рисунками.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве экспериментальных животных были выбраны белые лабораторные беспородные мыши и мыши линии CBA - Luc, которые содержались в стандартных условиях вивария. Все эксперименты проведены в острых опытах с соблюдением правил работы на животных согласно основным отечественным и международным нормативным документам (Приказ №755 от 12.08.1977 МЗ СССР «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных», Правила проведения качественных клинических испытаний в РФ (1998), положения Хельсинкской декларации 2000 г.).

Определение скорости лимфатического дренажа. В исследование были включены белые беспородные лабораторные мыши массой 20-25 г. Изучали влияние лекарственных препаратов ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН на скорость лимфатического дренажа в брыжейке мышей. Дозу всех изученных препаратов рассчитывали исходя из разовой дозы, рекомендуемой для человека, применяя межвидовой коэффициент пересчета для мышей.

Проведено 3 серии экспериментов на 51 животных. Во время эксперимента мыши находились под нембуталовым наркозом (5 мг/100 г массы внутримышечно). За 15 мин. до начала определения скорости лимфатического дренажа животным основных групп в заднюю лапу вводили один из изучаемых лекарственных препаратов, а животным контрольных групп - 0, 3 мл физиологического раствора. В течение эксперимента животное находилось на специальном подогреваемом столике, а ткани брыжейки орошались теплым (37єС) физиологическим раствором.

Скорость лимфатического дренажа тканей определяли по времени (мин.), за которое происходило полное удаление из ткани брыжейки предварительно введенного в нее лимфотропного маркера - 0, 002 мл 2% раствора красителя Evans blau («Merck»), который инъецировали с помощью прецизионного шприца на расстоянии 2-3 мм от места прокола в толщу корневого участка брыжейки. После введения красителя появлялась хорошо визуализируемая метка в виде синего пятна с четкими границами. В дальнейшем визуально производили оценку динамики рассасывания пятна краски из брыжеечной ткани и фиксировали время его полного исчезновения.

Оценка накопления доксициклина (ДЦ) в лимфоцитах лимфатических узлов мышей. В опыт включались мыши линии СВА (самцы массой 30 г). Животным вводили подкожно в верхнюю треть наружной поверхности задней лапы препарат-проводник в объеме 0, 15 мл. Контрольным животным вводится равный объем ФСБ. Через 60-90 сек. через ту же иглу вводили ДЦ в дозе 0, 25 мг. Еще через 30 мин. животное выводили из эксперимента, выделяли и гомогенизировали лимфоузлы, клеточную взвесь фильтровали через капроновый фильтр и дважды отмывали ФСБ. Все процедуры проводили при 4?С. Осадок клеток ресуспензировали в ФСБ до концентрации 10⁶ в 1 мл, отбирали аликвоту объемом 100 мкл и быстро смешивали с 900 мкл охлажденного до -20?С этанола. Инкубировали 60 мин. Клетки осаждали центрифугированием, добавляли 0, 5 мл ФСБ и проводили анализ с помощью метода проточной цитофлуориметрии при длине волны 488 нм.

Определение концентрации цефотаксима (ЦФ) в плазме крови мышей, тканях печени и стенке кишечника. Исследование проведено на 72 мышах, которые были подразделены на восемь подгрупп. В двух подгруппах животным под кожу задней лапы вводили ЦФ в дозе 3 мг. Мышам остальных шести подгрупп такую же дозу антибиотика вводили через 3 мин. после предварительной инъекции ГЛРД, ГЛРД+Аз, ГепН. Животных первых четырех подгрупп выводили из эксперимента путем декапитации через 1, 5 ч, следующих четырех подгрупп - через 24 ч после введения препаратов, предварительно наркотизировав. Кровь собирали в пробирку с гепарином натрия. Органы извлекали непосредственно после выведения животных из эксперимента.

После подготовки проб плазмы крови и тканей органов проводили хроматографическое определение концентрации ЦФ на жидкостном хроматографе «Agilent 1100 Series» с ультрафиолетовым детектором (длина волны 264 нм) на колонке «Zorbax Eclipse XBD-C8» c использованием подвижной фазы состава: 500 mM уксуснокислый натрий (CH₃COONa) - 900 мл, ацетонитрил - 100 мл, рН 3, 75. Скорость подвижной фазы составляла 1, 0 мл/мин. Концентрации в пробе определялись по площади пика на основании калибровочной кривой. В качестве стандарта использовался образец коммерческого цефотаксима в виде натриевой соли производства ООО «Деко». Все используемые реактивы соответствовали классу чистоты не ниже ХЧ (химически чистых).

Оценка выживаемости мышей с моделированным гнойно-воспалительным процессом органов брюшной полости при совместном применении ЦФ с препаратами-проводниками (ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН). Исследование проводилось на 150 половозрелых мышах линии CBA - Luc, самцах, массой 28-30 г.

Гнойно-воспалительный процесс органов брюшной полости моделировался путем внутрибрюшинного введения микробной взвеси Staphylococcus aureus N: 25923 (J49) ATCC (NSDA, США), 1 единица оптической плотности которого соответствовала 8, 5·10⁸ мт/мл. Перед проведением эксперимента была определена LD₁₀₀, вызывающая гибель мышей на 5-7 сутки, равная 10⁹ мт/мл. Животным вводилась семичасовая культура микроорганизмов, находящихся в логарифмической фазе роста. Для определения фазы и скорости роста штамма S. aureus лиофилизированный стафилококк массой 30 мг помещали в стерильный бульон («Brain Heart Infusion» для культуральных работ, Panreac) объемом 50 мл и культивировали при 37єС. Затем через каждые два часа производили измерение оптической плотности раствора с использованием фотоэлектрического колориметра КФК-2МП при длине волны 540 нм. Количество микробных тел в бактериальной суспензии определяли с помощью стандартов мутности по McFarland. Далее выполняли двукратное центрифугирование при 3000 об/мин. в течение 10 мин. в растворе Хэнкса. После этого надосадочную жидкость удаляли из пробирки пастеровской пипеткой. К осадку добавляли 4 мл раствора Хэнкса, ресуспензировали и измеряли оптическую плотность раствора. Производили подсчет общего количества микробных тел с учетом оптической плотности и путем многократного разведения приготавливали раствор объемом 1 мл, содержащий 10⁹ мт, который внутрибрюшинно вводили экспериментальным животным.

Для оценки выживаемости из взятых в эксперимент мышей было сформировано 5 групп - по 30 животных в каждой. Всем животным внутрибрюшинно вводилось 10⁹ мт/мл (LD₁₀₀) микробной взвеси S. aureus и в течение 7 дней оценивалась их продолжительность жизни без лечения и на фоне проводимой терапии. Первая группа - контрольная, не получала лечения. Животным из второй группы через 60 мин. после введения микробной взвеси, в верхнюю треть бедра подкожно инъецировали 0, 3 мл 0, 9% раствора хлорида натрия, а спустя 3 мин. через ту же иглу ЦФ объемом 0, 3 мл в дозе 5, 9 мг. Мышам из третьей - пятой групп через 1 ч после введения микробной взвеси в качестве препарата-проводника в верхнюю треть бедра подкожно инъецировали соответственно по 0, 3 мл раствора ГЛРД, ГЛРД+Аз, ГепН и через ту же иглу спустя 3 мин. вводили 0, 3 мл ЦФ. Дозу всех изучаемых препаратов рассчитывали исходя из разовой дозы, рекомендуемой для человека, используя межвидовой коэффициент пересчета. В качестве растворителя для исследуемых препаратов использовали 0, 9% раствор хлорида натрия.

Статистическая обработка результатов. Результаты экспериментальных исследований обработаны статистически с применением критерия Стьюдента для малых выборок. Результаты считали достоверными при уровне вероятности p<0, 05. Для анализа выживаемости экспериментальных животных использовали метод множительных оценок Kaplan - Meier и одновариантный анализ с использованием log-rank теста для выявления существенных различий между сравниваемыми группами мышей.

лимфотропный фармакокинетический лекарственный цефотаксим

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ ИССЛЕДОВАНИЙ

1. Влияние ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН на скорость удаления лимфотропного красителя из брыжейки мышей (рис.1).

Время удаления лимфотропного красителя из брыжейки мышей в контрольной группе составило 43, 3±0, 5 мин., тогда как после введения ГЛРД оно равнялось 29, 9±0, 7 мин. (p<0, 001), ГЛРД+Аз - 32, 3±1, 4 мин. (p<0, 001) и ГепН - 28, 5±0, 6 мин. (p<0, 001).

Таким образом, все исследуемые препараты вызывали уменьшение времени исчезновения лимфотропного красителя синий Эванса из брыжейки мышей (в среднем на 29, 8%), что может свидетельствовать об их лимфостимулирующем действии.



Рисунок 1. Влияние ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН на скорость удаления лимфотропного красителя из брыжейки животного

Примечание: *p<0, 001.

2. Накопление лекарственных препаратов в лимфоцитах лимфатических узлов мышей на фоне применения препаратов-проводников.

Само по себе лимфостимулирующее действие, оказываемое препаратами-проводниками, не всегда свидетельствует об их способности усиливать проникновение лекарственных средств вообще, и антибиотиков в частности, в лимфатическую систему. В связи с этим был разработан метод визуализации накопления лекарственных препаратов в клетках лимфатической системы, позволяющий регистрировать действие изучаемых препаратов-проводников на поступление лекарственных препаратов в лимфатическую систему.

В качестве исследуемого препарата был выбран доксициклин (ДЦ), что связано с его способностью проникать в лимфоциты и флуоресцировать в диапазоне длин волн регистрируемых с помощью проточной цитофлуориметрии.

Накопление ДЦ в лимфоцитах близлежащего к месту введения пахового лимфатического узла оценивалось по протоколу разработанного метода после предварительного введения препаратов-проводников: ГЛРД, ГЛРД+Аз, ГепН (рис. 2).

Рисунок 2. Схема метода

Использование всех трех исследуемых препаратов приводит к увеличению накопления антибиотика в лимфоузлах по сравнению с моновведением ДЦ (28, 78±2, 9% флуоресцирующих клеток) (рис. 3). Максимальный процент окрашенных клеток наблюдался при введении ДЦ на фоне ГЛРД+Аз и был на 40% выше, чем в случае введения моновведения ДЦ.



Рисунок 3. Накопление доксициклина в лимфоцитах паховых лимфоузлов мышей при различных способах его введения

Примечание: *p<0, 05.

3. Влияние предварительного введения ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН на концентрацию антибиотика ЦФ в плазме крови.

Анализ результатов исследования средней концентрация ЦФ в плазме крови через 1, 5 ч показал, что при его моновведении она составила 0, 126±0, 021 мкг/мл. Предварительное введение ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН увеличение до 0, 334±0, 042 мкг/мл (р<0, 01), 0, 206±0, 025 мкг/мл (р<0, 05) и 0, 294± 0, 033 мкг/мл (р<0, 01) соответственно (рис. 4).

Рисунок 4. Концентрации ЦФ в плазме крови мышей при различных способах его введения через 1, 5 ч

Примечание: *p<0, 05; **p<0, 01.

Через 24 ч концентрация ЦФ в крови при моновведении снизилась на 82% по сравнению с таковой определенной через 1, 5 ч, составив 0, 016± 0, 004 мкг/мл.

На фоне предварительного введения препаратов-проводников во всех трех случаях концентрация антибиотика также снижалась к концу первых суток, однако была достоверно выше, чем при моновведении ЦФ. Так в случае предварительного использования ГепН концентрация ЦФ составила 0, 034±0, 006 мкг/мл, (р<0, 05), ГЛРД - 0, 068±0, 013 мкг/мл, (р<0, 01), а ГЛРД+Аз - 0, 111±0, 011 мкг/мл (р<0, 01), что почти в 7 раз выше, чем при использовании только одного ЦФ (рис. 5).

Рисунок 5. Концентрации ЦФ в крови мышей при различных способах его введения через 24 ч

Примечание: *p<0, 05; **p<0, 01.

Таким образом, через 1, 5 ч у животных опытных групп регистрировалась более высокая плазменная концентрация ЦФ, чем у мышей контрольной группы. Наибольший уровень антибиотика в крови отмечался при его введении на фоне введения ГЛРД.

При использовании всех трех препаратов-проводников снижение концентрации ЦФ в плазме крови в сравнении с таковым после его моновведения было достоверно меньшим, что обеспечивало поддержание более высокого уровня антибиотика в кровотоке на протяжении суток. Наибольшая концентрация антибиотика ЦФ к 24 ч отмечалась в случае его использования с ГЛРД+Аз.

4. Влияние предварительного введения ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН на концентрацию антибиотика ЦФ в печени.

Анализ результатов исследования уровня ЦФ в ткани печени через 1, 5 ч показал, что при моновведении его средняя концентрация составила 0, 275±0, 021 мкг/г (в 2 раза выше, чем в плазме крови).

При предварительном введении ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН концентрации антибиотика в печени составили соответственно 0, 263±0, 038, 0, 255±0, 043 и 264±0, 045 мкг/г и достоверно не отличались от уровня ЦФ, применявшегося без предварительного введения проводника (рис.6).

Через 24 ч концентрации ЦФ в ткани печени после предварительного введения ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН уменьшились и статистически не отличались от уровня антибиотика в случае его моновведения (0, 033±0, 009 мкг/г) и составили соответственно 0, 040±0, 011, 0, 044±0, 008 мкг/г и 0, 036±0, 007 мкг/г (рис. 7).

Рисунок 6. Концентрации ЦФ в печени мышей при различных способах его введения через 1, 5 ч

Таким образом, определение уровня ЦФ в ткани печени через 1, 5 ч не выявило статистически значимых различий в концентрациях антибиотика как в условиях его моновведения, так и в случае использования с любым из трех исследуемых препаратов-проводников. При этом концентрация ЦФ в печеночной ткани в случае моновведения и при использовании ГЛРД+Аз была в 2 и 1, 2 раза (соответственно) выше, чем в плазме крови. Напротив, при введении ЦФ с ГЛРД или ГепН концентрации в печени были ниже по сравнению с таковыми в плазме крови.

Через 24 ч достоверных отличий между концентрациями в печеночной ткани ЦФ, как при моновведении, так и на фоне препаратов-проводников, не отмечается (рис. 7). В тоже время обращает на себя внимание тот факт, что концентрация ЦФ при моновведении в плазме крови на протяжении суток прогрессивно снижалась, при этом через 24 ч в печени она была в 2 раза выше, чем в тот же момент в плазме крови.

Рисунок 7. Концентрации ЦФ в печени мышей при различных способах его введения через 24 ч

При использовании в качестве препарата-проводника ГЛРД уровень ЦФ определенный в плазме крови был в 1, 7 раза выше по сравнению с таковым в печени (как и в случае исследования концентраций антибиотика через 1, 5 ч), а при применении ЦФ после введения ГепН его концентрация в печеночной ткани и плазме крови выравнивалась.

Если препаратом-проводником была ГЛРД+Аз, то концентрация ЦФ, определенная через 1, 5 ч была выше в печени по сравнению с плазмой крови, тогда как к 24 ч (см. рис. 5, 7) происходила инверсия соотношения «печень - кровь» и уровень антибиотика становился в 2, 5 раза выше в крови по сравнению с таковым в печени.

Таким образом, на основании сравнения концентрации ЦФ в печени и крови через 1, 5 и 24 ч при различных способах его введения можно сделать вывод о зависимости фармакокинетики ЦФ от используемого препарата-проводника. Несмотря на различие во временной динамике общей тенденцией в действии всех трех исследуемых препаратов-проводников является создание более низкого по сравнению с плазмой крови уровня ЦФ в печени. Тогда как в случае моновведения антибиотика, его печеночная концентрация оказалась выше плазменной.

5. Влияние введения ЦФ и его совместного введения с ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН на выживаемость мышей с моделированным гнойно-воспалительным процессом органов брюшной полости.

Результаты предыдущих исследований показали, что препараты-проводники (ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН) увеличивают концентрацию ЦФ в плазме крови и пролонгируют время его циркуляции. Однако оставалось неясным, как изменение фармакокинетических параметров сказывается на фармакологической эффективности антибиотика. Для решения этого вопроса была использована модель гнойно-воспалительного процесса органов брюшной полости. Мышам линии CBA Luc внутрибрюшинно вводили 10⁹ мт/мл (LD₁₀₀) S. aureus и в течение 7 дней оценивали продолжительность жизни животных без лечения и на фоне проводимой терапии.

На рисунке 8 изображены кривые Kaplan - Meier, демонстрирующие динамику выживаемости животных в контрольной и экспериментальных группах. Как видно из представленных графиков, в контрольной группе к 7-му дню наблюдения все мыши погибли. Напротив, во всех экспериментальных группах часть животных выжила.

Статистическая обработка результатов показала, что процентное распределение выживших мышей, получавших лечение ЦФ, составило 39% (95% ДИ 1, 119-2, 214; p=0, 0007). При использовании антибиотика на фоне препаратов-проводников ГЛРД и ГЛРД+Аз выживаемость животных достоверно увеличивается. Так в течение 7 дней наблюдения выживало 75% и 72% мышей, получавших ГЛРД+ЦФ (95% ДИ 0, 12-0, 64; p=0, 0029) и ГЛРД+Аз + ЦФ (95% ДИ 0, 17-0, 9; p=0, 0266) соответственно. При использовании в качестве препарата-проводника ГепН выживаемость составила 43% и статистически не отличалась от таковой при использовании одного ЦФ.

Рисунок 8. Выживаемость инфицированных животных при моновведении ЦФ (A) и в комбинации с ГЛРД (B), ГЛРД+Аз (C) и ГепН (D)

Таким образом, однократное введение антибиотика ЦФ как в виде монотерапии, так и на фоне введения препаратов-проводников обеспечивает выживаемость части мышей с моделированным гнойно-воспалительным процессом органов брюшной полости, по сравнению с контрольной группой, где погибает 100% животных. Причем лучшие результаты достигаются в группах с предварительным введением ГЛРД или ГЛРД+Аз, где выживаемость составляет более 70%.

6. Влияние предварительного введения ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН на концентрацию антибиотика ЦФ в стенке кишечника.

Полученные результаты, показавшие увеличение выживаемости животных с моделированным гнойно-воспалительным процессом органов брюшной полости при использовании ЦФ на фоне применения препаратов-проводников, побудили к определению концентрации антибиотика в очаге поражения - тканях стенки кишечника.

Анализ результатов исследования концентрации ЦФ в ткани стенки кишки через 1, 5 ч показал, что при моновведении его средний уровень составил 0, 412±0, 072 мкг/г.

Предварительное введение ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН приводило к статистически значимому увеличению концентраций антибиотика в стенке кишки, по сравнению с уровнем ЦФ в той же ткани, определявшемся при использовании режима монотерапии: соответственно 1, 5±0, 109 (p<0, 01), 0, 615±0, 071 (p<0, 05) и 0, 841±0, 077 мкг/г (p<0, 01) (рис. 9).

 Рисунок 9. Концентрации ЦФ в стенке кишечника мышей через 1, 5 ч при различных способах его введения

Примечание: *p<0, 05; **p<0, 01.

Через 24 ч (рис. 10) концентрации ЦФ в стенке кишечника после предварительного применения всех трех препаратов-проводников - ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН - были достоверно выше, чем при введении только одного антибиотика (0, 154±0, 03 мкг/г) и составили соответственно 0, 472±0, 084 мкг/г (p<0, 01), 0, 354±0, 074 мкг/г (p<0, 01) и 0, 351±0, 079 мкг/г (p<0, 01).

Таким образом, определение уровня ЦФ в стенке кишечника через 1, 5 ч выявило статистически значимые различия в концентрациях антибиотика, создаваемых при его моновведении и в случае использования ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН в качестве препаратов-проводников.



Рисунок 10. Концентрации цефотаксима в ткани стенки кишечника мышей через 24 ч при различных способах его введения

Примечание: **p<0, 01.

При этом концентрации ЦФ в стенке кишечника при любом из изучаемых способов введения антибиотика в разы превышала плазменные, например, при использовании в качестве препарата-проводника ГЛРД концентрация ЦФ была почти в 5 раз выше, чем в плазме крови.

Через 24 ч в стенке кишечника наблюдается уменьшение концентрации ЦФ вне зависимости от способов его введения, однако различия между концентрациями ЦФ, получаемыми с помощью моновведения антибиотика и его применением на фоне предварительного введения ГЛРД, ГЛРД+Аз и ГепН сохраняются: они достоверно выше в случае использования препаратов-проводников. При этом уровень ЦФ в тканях стенки кишки превышает плазменный, особенно при применении предварительного введения ГЛРД и ГЛРД+Аз, по сравнению с концентрациями ЦФ, определенными через 1, 5 ч.

Таким образом, при сравнении концентрации ЦФ в стенке кишечника и плазме крови через 1, 5 и 24 ч при различных способах его введения прослеживается зависимость фармакокинетики ЦФ от используемого препарата-проводника. Заметное уменьшение концентрации ЦФ в плазме крови через 24 ч при моновведении, ее увеличение при предварительном применении ГЛРД или ГЛРД+Аз, а также минимальное изменение при использовании ГепН коррелируют с уровнем ЦФ, определяемым в стенке кишечника.

ВЫВОДЫ

Установлено, что все используемые в исследовании препараты-проводники (гиалуронидаза, гиалуронидаза+азоксимер, гепарин натрия) обладают сравнимым лимфостимулирующим действием, которое выражается в увеличении скорости лимфатического дренажа.

Разработан метод визуализации накопления лекарственных препаратов в клетках лимфатической системы. С его помощью показано, что предварительное введение всех трех изученных препаратов-проводников увеличивает накопление модельного антибиотика доксициклина в лимфатической системе.

При использовании цефотаксима в комбинации с препаратами-проводниками в плазме крови определяются более высокие концентрации антибиотика, которые снижаются более медленно в течение 24 ч, по сравнению с аналогичным показателем при моновведении цефотаксима. Общей тенденцией в действии препаратов-проводников является создание более низкого по сравнению с плазмой крови уровня ЦФ в печени. Тогда как в случае моновведения антибиотика, его печеночная концентрация регистрируется выше плазменной.

Введение цефотаксима в комбинации с гиалуронидазой, гиалуронидазой+азоксимером увеличивает более чем на 70% выживаемость экспериментальных животных с моделированным гнойно-воспалительным процессом органов брюшной полости, по сравнению с моновведением антибиотика, что может быть объяснено более высокой концентрацией цефотаксима в тканях стенки кишечника.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

При выборе способа введения антибактериальных средств у пациентов с гнойно-воспалительными процессами органов брюшной полости необходимо учитывать имеющиеся сведения о преимуществах метода непрямого лимфотропного применения антибиотиков.

Для изучения в экспериментальных условиях влияния препаратов-проводников на поступление лекарственных веществ в лимфатическую систему целесообразно использовать метод визуализации накопления лекарственных препаратов в клетках лимфатической системы.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кукушкин Г.В., Козлов И.Г., Юров Д.Е., Свиридкина Л.П., Топорова С.Г. Влияние курса трансторакального электрофореза террилитина на показатели липидного обмена у больных с ИБС и ХОБЛ. // Материалы III Междунар. конгр. «Эндоэкологическая Медицина». - Республика Кипр, 2007. - С. 73.

2. Свиридкина Л.П., Кукушкин Г.В., Юров Д.Е., Топорова С.Г., Баркинхоева Ф.А., Козлов И.Г. Влияние лимфостимулирующего препарата террилитина на показатели иммунного статуса. // Российский иммунологический журнал. - 2008. - Т. 2 (11) № 2-3. - С. 197-198.

3. Свиридкина Л.П., Бархинхоева Ф.А., Юров Д.Е., Кукушкин Г.В., Топорова С.Г., Козлов И.Г. Оптимизация фармакокинетики лекарственных средств путем использования эндолимфатических препаратов-проводников. // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2008. - №1 (19). - С. 67-69.

4. Попова С.А., Свиридкина Л.П., Топорова С.Г., Кукушкин Г.В., Юров Д.Е. Нарушения дренажной функции лимфатической системы при экзогенной интоксикации у мышей разного возраста и их коррекция антиоксидантами. // Альманах «Геронтология и гериатрия». - 2009. - Выпуск 8. - С. 66-71.

5. Юров Д.Е., Кукушкин Г.В., Баркинхоева Ф.А., Свиридкина Л.П., Шкопоров А.Н., Козлов И.Г. Повышение эффективности антибактериальной терапии при экспериментальном перитоните. - Материалы XVI российского национального конгресса «Человек и лекарство». - 2009. - С. 779.

6. Топорова С.Г., Свиридкина Л.П., Баркинхоева Ф.А., Кукушкин Г.В., Юров Д.Е. Влияние лидазы на фармакокинетику цефотаксима. - Материалы XVI российского национального конгресса «Человек и лекарство». - 2009. - С. 750.

7. Баркинхоева Ф.А., Свиридкина Л.П., Топорова С.Г., Кукушкин Г.В., Юров Д.Е. Влияние ряда лекарственных препаратов с различным действием на лимфатический дренаж и фармакокинетику цефотаксима. // Научно-практический журнал «Лимфология», г. Андижан. - 2009. - № 1-2 - С. 24-25. (Материалы Выездной научной сессии, посвященной 80- летию основоположника клинической лимфологии Узбекистана, профессора С.У. Джумабаева).

8. Юров Д.Е., Кукушкин Г.В., Павлова С.И., Свиридкина Л.П., Козлов И.Г. Новый метод для оценки эффективности препаратов - эндолимфатических проводников. // Вестник уральской медицинской академической науки. - 2009. - № 2/1 (24). - С. 237-238.

СПИСОК СОРАЩЕНИЙ

ГепН - гепарин натрия

ГЛРД - гиалуронидаза

ГЛРД+Аз - гиалуронидаза+азоксимер

ДИ - доверительный интервал

ДЦ - доксициклин

ЕД - единица действия

МЕ - международная единица

мт - микробное тело

УЕ - условная единица

ФСБ - фосфатно-солевой буфер

ЦФ - цефотаксим

LD₁₀₀ - доза смертельная абсолютная

Размещено на Allbest.ru

...