Влияние регуляторного белка на развитие катаракты в эксперименте

Размещено на http://www.allbest.ru/

2

АФТОРЕФЕРАТ

Диссертация на соискание учёной степени кандидата медицинских наук

14.00.08 - глазные болезни

03.00.02 - биофизика

Влияние регуляторного белка на развитие катаракты в эксперименте

Гурмизов Евгений Петрович

Москва - 2007

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. В настоящее время в мире насчитывается около 50 миллионов больных с помутнением хрусталика, более половины из них требуется хирургическое вмешательство, приблизительно 67% людей преклонного возраста страдают этой патологией, а после 80 лет - практически все (Мальцев Э.В., Павлюченко К.П., 2002). Велико желание врачей, а тем более больных, избежать оперативного вмешательства, несмотря на современную технику хирургии, а также на полученные в этой области офтальмологии блестящие результаты. Применяемые в повседневной практике антикатарактальные фармакологические препараты не обладают желаемым клиническим эффектом. В связи с этим разработка новых медикаментозных средств для профилактики развития катаракты, также ее рассасывания, продолжает оставаться актуальной проблемой современной офтальмологии.

Известно, что состояние межклеточных адгезионных взаимодействий в тканях является важнейшим фактором, определяющим регуляцию гомеостаза у позвоночных на органно-тканевом уровне (Васильев Ю.М., Маленков А.Г., 1968; Anderson H., 1990; Turner M.L, 1992). Ранее было показано, что в различных тканях животных, в том числе и в тканях глаза, содержатся регуляторные белки, которые характеризуются способностью в сверхмалых дозах, соответствующих 10^-10 - 10^-16мг белка/мл, оказывать влияние на ход и направленность основных биологических процессов, протекающих в тканях: адгезию, миграцию, дифференцировку и пролиферацию клеток (Ямскова В.П. и др., 1977; Ямскова В.П., Резникова М.М., 1991; Гундорова Р.А. и др., 1997; Ямсков И.А. и др., 1999; Краснов М.С. и др., 2003а). В основе молекулярного механизма биологического действия регуляторных белков этой группы лежит их способность стимулировать резервный клеточный отдел соответствующей ткани за счет регуляторного воздействия на микроокружение его клеток и, таким образом, регулировать распространение и прохождение регуляторного сигнала в ткани (Ямскова В.П., Резникова М.М., 1991; Краснов М.С. и др., 2003а). Было показано, что регуляторные белки данной группы локализованы в межклеточном пространстве соответствующей ткани взрослых особей позвоночных животных (Краснов М.С. и др., 2003а; Маргасюк Д.В. и др., 2005). Биологическая активность данных регуляторных белков характеризуется отсутствием видовой, но наличием тканевой специфичности (Ямскова В.П., Резникова М.М., 1991; Краснов М.С. и др., 2003а).

На основе регуляторных белков, обнаруженных ранее в тканях млекопитающих, были разработаны фармакологические препараты нового поколения, которые обладают рядом позитивных свойств, таких как отсутствие побочных воздействий на организм, способность в сверхмалых дозах стимулировать восстановительные и репаративные процессы в патологически измененных тканях (Гундорова Р.А. и др., 1997; Ямсков И.А., Ямскова В.П., 1998; Романова И.Ю. и др., 2004). Одним из таких препаратов является созданный на основе регуляторного белка, выделенного из сыворотки крови быка, Адгелон - глазные капли, в настоящее время применяемый для лечения ряда кератопатий (Романова И.Ю. и др., 2004).

Целью настоящего исследования явилось изучение влияния нового, ранее не известного регуляторного белка, выделенного из хрусталика глаза быка, на развитие катарактогенеза у позвоночных животных в эксперименте in vitro и in vivo.

В отдельные задачи данного исследования входило:

1. Идентификация регуляторного белка, биологически активного в сверхмалых дозах, в хрусталике глаза млекопитающих; его очистка, изучение физико-химических свойств, а также изучение дозовой зависимости биологического действия.

2. Исследование локализации изучаемого регуляторного белка в хрусталике глаза позвоночных животных.

3. Разработка экспериментальных моделей катарактогенеза у позвоночных животных in vitro и in vivo, отражающих различные механизмы возникновения данной патологии.

4. Изучение протекторного действия регуляторного белка хрусталика на экспериментальных моделях катарактогенеза in vitro и in vivo.

Научная новизна. Впервые в хрусталике глаза млекопитающих идентифицирован ранее не изученный регуляторный белок (РБ), действующий в сверхмалых дозах (СМД), соответствующих

10^-12 - 10^-15 мг белка/мл. Показано, что данный РБ является низкомолекулярным белком, вторичная структура которого характеризуется преимущественным содержанием в-структур и статистического клубка. Установлено, что молекулы РБ хрусталика образуют в водных растворах наноразмерные частицы. Для изучения специфической активности РБ хрусталика были применены экспериментальные модели катарактогенеза in vitro и in vivo, различающиеся по механизму развития патологического процесса и отражающие наиболее часто встречаемые типы катаракт у человека: травматическая, некоторые формы сенильной катаракты, диабетическая и др. Была впервые разработана экспериментальная модель катарактогенеза in vitro, в основе которой лежит механизм нарушения электролитного баланса в хрусталике позвоночных животных - аналог диабетической катаракты человека. На данных экспериментальных моделях катарактогенеза у позвоночных животных in vitro и in vivo было проведено исследование РБ хрусталика и впервые было показано, что данный белок в СМД тормозит развитие катаракт, в основе которых лежит нарушение работы Са⁺²-зависимых ферментных систем, а также систем перекисного окисления липидов (ПОЛ).

Практическая значимость работы. На основании результатов проведенного исследования, свидетельствующих о способности изучаемого РБ хрусталика проявлять в эксперименте протекторное свойство, представляется возможной разработка нового фармакологического препарата для профилактики, а также лечения катаракты у человека.

Положения, выносимые на защиту:

1. Идентификация биологически активного в СМД РБ в хрусталике глаза позвоночных.

2. Локализация исследуемого белка в хрусталике глаза позвоночных.

3. Влияние РБ, выделенного из хрусталика глаза быка, на катарактогенез в экспериментальных моделях у позвоночных животных in vitro и in vivo, отражающих различные механизмы данной патологии.

4. Отсутствие видовой специфичности биологического действия РБ хрусталика.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на следующих научно-практических конференциях: «Неотложная помощь, реабилитация и лечение осложнений при травмах органа зрения и чрезвычайных ситуациях», (апрель 2003, Москва); «Лечение посттравматической патологии заднего отдела глаза у пострадавших в экстремальных ситуациях», (21-22 апреля 2004, Москва); V Всероссийском научном семинаре и Молодежной научной школы «Химия и медицина» (5-8 сентября 2005, Уфа); I съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 19-23 сентября 2005, Сочи); «Оказание первой и специализированной помощи при травмах органа зрения в экстремальных ситуациях и катастрофах» (12-13 апреля 2006, Москва); «Биотехнология будущего» Симпозиума «ЕС-Россия: Перспективы сотрудничества в области биотехнологии в 7-ой Рамочной программе», (6-8 июня 2006, Санкт-Петербург); VII международном симпозиуме по травме глаза (29 июня-1 июль 2006, Италия, Рим); IV Международном Конгрессе «Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине» (3-7 июля 2006, Санкт-Петербург); Ш Международной научной конференции “Факторы экспериментальной эволюции организмов” (25-28 сентября 2006, Автономная Республика Крым, Украина, Алушта).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 134 страницах, содержит 235 литературных источников (62 отечественных, 173 зарубежных), 43 рисунка и 8 таблиц и состоит из:

Введения;

Литературного обзора;

Главы “Материалы и методы исследования”;

Главы “Экспериментальная часть”;

Главы “Результаты и их обсуждение”;

Выводов.

Материалы и методы исследования

белок хрусталик глаз катарактогенез

В работе было использовано 123 амфибии (246 хрусталиков): лягушки Xenopus laevis и Rhana temporaria обоих полов в возрасте 3-6 месяцев, выращенных и содержащихся в акваториальной Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН; 312 (624 хрусталика) крыс породы Wistar обоих полов, возрастом не старше 6 месяцев, содержащихся в виварии того же Института; 130 глаз от молодых бычков - материал бойни Таганского мясоперерабатывающего комбината г. Москвы. Кроме того, для биотестирования фракций белков, получаемых в процессе очистки РБ хрусталика, были использованы 54 мыши гибридов F1 (СВА/С57Вl), самцы, весом 17-20 г, содержащиеся в виварии того же Института.

Биотестирование РБ хрусталика в процессе очистки проводили с помощью адгезиометрического метода, разработанного специально для идентификации РБ, биологически активных в СМД (Ямскова В.П. и др., 1977). Метод позволяет оценивать мембранотропное действие РБ данной группы на клетках млекопитающих (гепатоциты мыши) in vitro.

Для решения поставленных задач применяли комплекс современных биофизических, биохимических и биологических методов. Степень чистоты фракций РБ хрусталика, значение «кажущейся» молекулярной массы определяли методами электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и обращено-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Вторичную структуру белка изучали методом кругового дихроизма. Размер частиц, присутствующих в водных растворах РБ хрусталика, определяли методами динамического лазерного светорассеяния и атомно-силовой микроскопии.

Для определения локализации РБ в ткани хрусталика крыс использовали методы иммуногистохимии (Энгельгардт Н.В., 1966).

Экспериментальная часть. Выделение и очистка РБ хрусталика. РБ выделяли путем экстракции целых свежеэнуклеированных хрусталиков глаз бычков в физиологическом растворе в течение

2-х часов при 4 єС. Тканевой экстракт далее центрифугировали при 5000g/мин в течение 20 мин, высаливали, добавляя при перемешивании сухой сернокислый аммоний (760 г соли на 1 литр раствора). Через 24 часа собирали центрифугированием надосадочную жидкость - супернатант, который концентрировали в вакуумном испарителе при 40 єС и разделяли изоэлектрофокусированием в градиенте плотности сахарозы при интервале рН 3, 5-10, 0. Собирали фракцию кислых белков в интервале рН менее 3, 0 - фракция кислый РБ хрусталика (КРБХ). В работе так же исследовали фракцию КРБХ-Э, которую получали электрофорезом в ПААГ фракции КРБХ в отсутствии детергента. Данные фракции РБ хрусталика изучали с помощью метода биотестирования, а также на экспериментальных моделях катарактогенеза in vitro и in vivo.

Для получения поликлональной антисыворотки у кролика была использована фракция КРБХ. Раствор белкового антигена вводили инъекционно, подкожно, через каждые 7 дней. Забор проб крови производили, начиная со 2-ой недели после первой иммунизации путем надреза ушных сосудов. Пробы исследовали на наличие антител методом твердофазного иммуноферментного анализа ELISA с интервалом в 7 дней. Для изучения локализации кислого белка из хрусталика глаза крупного рогатого скота использовался метод непрямого иммуноокрашивания с применением вторых (против IgG кролика), меченых FITC-антител (Sigma, США).

Определение дозовой зависимости химических агенов, индуцирующих катарактогенез у позвоночных животных in vitro. Изучали катарактогенное действие пероксида водорода в диапазоне концентраций от 0, 1 мМ до 100 мМ; хлорида кальция - от 1, 25 до 300 мМ, а также галактозу - от 10 мМ до 300 мМ, которую применяли только в опыте на хрусталиках глаз амфибий Rhana temporaria. После выбора концентрации повреждающих агентов, было проведено две серии опытов на культивируемых in vitro хрусталиках всех указанных позвоночных животных с данными концентрациями катарактогенных веществ. Культивирование хрусталиков проводили в течение 3-8 дней. Во всех экспериментальных сериях повреждающие факторы добавляли в питательную среду в начале эксперимента, а также при смене питательной среды на 3-и сутки культивирования.

Изучение РБ хрусталика на модели катарактогенеза у позвоночных животных in vitro.

В данной серии опытов изучали фракцию КРБХ в концентрации, соответствующей 10^-12 мг белка/мл и фракцию КРБХ-Э в концентрации, соответствующей 10^-14 мг белка/мл. Обе фракции добавляли, соответственно, в питательную среду в начале культивирования хрусталиков одновременно с добавлением повреждающего агента, а также при смене питательной среды на 3-и сутки культивирования.

Хрусталики позвоночных животных разделяли на три группы, по 4-5 хрусталиков в каждой:

1-ая контрольная группа - питательная среда с добавлением физ. раствора;

2-ая контрольная группа - к культурам хрусталиков добавляли раствор повреждающего агента.

3-ья опытная группа - к культурам хрусталиков добавляли раствор повреждающего агента и раствор фракции КРБХ (или фракции КРБХ-Э в эксперименте с хрусталиками крыс Wistar).

Осмотическую катаракту моделировали на хрусталиках лягушек Xenopus laevis путем их инкубации в дистиллированной воде в течение 5 минут. Далее хрусталики помещали в питательную среду с добавлением либо физ. р-ра (контроль), либо р-ра фракции КРБХ (опыт).

Травматическую катаракту вызывали путем перфорации иглой через роговицу на заданную глубину переднего полюса хрусталиков глаз крыс Wistar in vivo. Ежедневно животным контрольной группы инстиллировали однократно физ. р-р; животным опытной группы - р-р фракции КРБХ. Через 7 дней животных выводили из эксперимента.

Лучевую катаракту моделировали рентгеновским излучением (общая доза 1600 рентген, краниальное облучение) крыс Wistar in vivo. В течение 14 дней ежедневно животным контрольной группы инстиллировали однократно физ. р-р; животным опытной группы - р-р фракции КРБХ. Через 30 дней животных выводили из эксперимента.

Эксперименты каждой серии повторяли не менее 3-х раз.

Во всех сериях экспериментах степень помутнения хрусталиков определяли либо спектрофотометрически (при длинах волн 340, 405, 490, 550, 630 нм) либо визуально, методом фотографирования, используя цифровую камеру.

Гистологический метод исследования (криосрезы) применяли для хрусталиков крыс Wistar во всех экспериментальных сериях.

Статистическую обработку полученных результатов проводили с помощью критерия Стьюдента.

Результаты и их обсуждение

Выделение, очистка и изучение физико-химических свойств РБ хрусталика. Тканевой экстракт хрусталиков глаза быка получали по методике, ранее разработанной для выделения РБ из различных тканей животных, исключающей механическое и ферментативное повреждение ткани (Ямсков И.А. и др., 1999). Очистку РБ хрусталика проводили с помощью биохимических методов, включающих высаливание белков сернокислым аммонием, изоэлектрофокусирование (ИЭФ) в градиенте сахарозы, электрофорез в ПААГ. Собирали и далее исследовали фракцию РБ хрусталика - фракция КРБХ. Эта белковая фракция была выбрана согласно картине разделения при 280 нм, а также на основании результатов, ранее полученных при исследовании РБ данной группы, выделенных из других тканей позвоночных животных, которые показали, что именно фракция кислых белков проявляет биологическую активность в СМД (Ямсков И.А. и др., 1999).

Методом биотестирования было показано, что изучаемая фракция проявляет мембранотропное действие в СМД, т. е. содержит РБ данной группы (рис 1) (Ямскова В.П., Резникова М.М., 1991).

Из рис. 1 видно, что биологическая активность КРБХ характеризуется полимодальной дозовой зависимостью (Ямсков И.А. и др., 1999). Следует отметить, что данный тип дозовой зависимости характерен и для многих других соединений, биологически активных в СМД (Подколзин А.А., Гуревич К.Г., 2002). Для фракции КРБХ была выбрана как наиболее биологически активная концентрация, соответствующая 10^-12 мг белка/мл.



Рис. 1. Определение дозовой зависимости биологического эффекта КРБХ. По оси абсцисс - степени десятикратного разбавления РБ (исходная концентрация 0, 1 мг/мл). По оси ординат - биологический эффект. К - контроль.

Как видно из данных таблицы 1, в результате проведенной очистки активность РБ возросла в 10⁸-10¹⁰ раз. На основании ранее полученных результатов, указывающих на существование в тканевых экстрактах веществ, модулирующих активность РБ, можно предположить, что такое значительное увеличение биологической активности РБ хрусталика по мере очистки обусловлено отделением не только примесных белков, но и его модуляторов (Ямсков И.А. и др., 1999).

Для определения состава и значений молекулярных масс белков, входящих во фракцию КРБХ, было проведено исследование с помощью метода электрофореза в ПААГ. Следует отметить, что после проведения электрофореза в ПААГ и элюирования соответствующей фракции низкомолекулярного белка из геля - КРБХ-Э, с помощью метода биотестирования было показано, что данная фракция проявляет биологическую активность в СМД, то есть содержит РБ изучаемой группы.

Табл.1. Характеристика фракций РБ хрусталика, полученных в процессе очистки*

Название изучаемого раствора	Объем, мл	Концентра-ция белка, мг/мл	Интервал степени разбавления фракции, в котором проявляется биологическая активность
Тканевый экстракт хрусталика	300	0, 3 - 0, 4	10-3 - 10-6
Супернатант тканевого экстракта	460	0, 02	10-3 - 10-6
Фракция кислых белков после ИЭФ супернатанта тканевого экстракта (КРБХ)	5	0.8	10-12 - 10-13
Низкомолекулярный белок после электрофореза в ПААГ (КРБХ-Э)	2	0.01	10-12 - 10-13

*-данные получены для тканевого экстракта 100 хрусталиков глаз быка

Фракцию КРБХ после электрофореза в ПААГ разделяли методом обращено-фазовой ВЭЖХ в градиенте: вода - ацетонитрил. Было установлено, что биологическая активность соответствовала фракции, время удержания которой составляет 3, 34 мин. Эти результаты свидетельствуют о выраженных гидрофильных свойствах изучаемого белка.

На рис. 2 представлена картина разделения фракции КРБХ, полученная при проведении электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия. Как видно, основным компонентом данной фракции является низкомолекулярный белок со значением «кажущейся» молекулярной массы менее 3, 5 кДа. Кроме того, полученные данные указывают на высокую степень очистки фракции КРБХ.

Исследование фракции КРБХ методом кругового дихроизма показало, что вторичная структура РБ хрусталика преимущественно содержит в-структуры (около 60 %) и статистический клубок (около 31%) и небольшое количество б-спиралей (9 %).

Эти данные указывают на значительное сходство между вторичной структурой РБ хрусталика и РБ, выделенных из других тканей позвоночных животных (Ямскова В.П. и др., 2004; Назарова П.А. и др., 2006).



Согласно литературным данным, преобладание -структур во вторичной структуре белков указывает на их способность к образованию в водных растворах высокомолекулярных ассоциатов (Ross C.A., Poirier M.A., 2004). Такое свойство было отмечено у белков фракции-КРБХ, как и у РБ, выделенных из других тканей (Ямскова В.П., Резникова М.М., 1991; Ямсков И.А. и др., 1999, Ямскова В.П. и др., 2003).

Исследование размера частиц в водных растворах РБ хрусталика проводили с помощью метода динамического светорассеяния. Был построен график зависимости величины, обратной гидродинамическому радиусу, от квадрата синуса половинного угла рассеивания 1/Rh = f(sin2/2) с использованием программы Origin 7.0. Графическое экстраполирование усредненных данных позволяет оценить размеры частиц при величине угла рассеивания 0 (Provencher S.W., 1985) как 13012, 4 нм. Полученная величина гидродинамического радиуса частиц в водном растворе КРБХ значительно превышает значения данной величины, измеренные для других, более крупных белков. Так, гидродинамический радиус геликазы RecQI человека, имеющей молекулярную массу 158 кДа, составляет 5, 4±0, 6 нм, а для фибриногена с молекулярной массой 340 кДа - 10, 95 нм (Cui S. et al., 2004). Данный факт может косвенно свидетельствовать о способности молекул изучаемого РБ к ассоциации.

Аналогичные результаты были получены при исследовании растворов РБ хрусталика методом атомно-силовой микроскопии. Было установлено, что в растворе фракции РБ хрусталика, полученной после обращено-фазовой ВЭЖХ, обнаруживаются частицы, радиусом, близким к 130 -140 нм (рис. 3).

Таким образом, с помощью двух методов исследования - метода динамического лазерного светорассеяния и метода атомно-силовой микроскопии, было установлено, что в водных растворах РБ хрусталика присутствуют наночастицы, размером 130-140 нм.

Определение локализации РБ в хрусталике позвоночных. В качестве антигена для иммунизации использовали фракцию КРБХ и получали поликлональную кроличью антисыворотку.

Методами иммуногистохимии было показано, что изучаемый РБ локализован в межклеточном пространстве эпителия хрусталика (рис. 4). Известно, что эпителий капсулы ответственен за процессы волокнообразования в хрусталике, т.е. данная зона содержит клеточные источники регенерации хрусталика (Мальцев Э.В., Павлюченко К.П., 2002). В связи с этим, представляется вероятным, что локализованный в эпителии хрусталика РБ может опосредовать восстановительные и репаративные процессы в этой структуре глаза.

Изучение специфической биологической активности РБ хрусталика. Во всех сериях опытов in vitro и in vivo при изучении биологического действия РБ хрусталика всегда наблюдали статистически достоверные различия между контрольными и опытными параметрами - данные спектрометрии и визуального контроля. Следует отметить, что эффект торможения развития катаракты наблюдался во всех случаях, хотя степень торможения катарактогенеза была различной. Исключение составляет опыт по продуцированию лучевой катаракты, при котором не выявлено достоверных различий между хрусталиками контрольных и опытных групп.

Для изучения специфической активности РБ хрусталика были разработаны новые экспериментальные модели в условиях in vitro и in vivo. В этих экспериментах не исследовали дозовую зависимость воздействия РБ хрусталика, а изучали раствор РБ хрусталика (фракция КРБХ) в концентрации, соответствующей 10^-12 мг белка/мл.

Изучение дозовой зависимости химических агентов, индуцирующих катарактогенез у позвоночных животных in vitro. Данное исследование проводили на культуре целых хрусталиков глаз позвоночных животных; катарактогенез индуцировали добавлением в питательную среду пероксида водорода или хлорида кальция. Выбранный химический метод катарактогенеза с использованием Н₂O₂ и СаСl₂ не случаен. Механизм повреждения пероксидом водорода - активация ПОЛ в мембранах его волокон и клеток, наблюдается при осложненных, травматических и некоторых формах сенильных катаракт у человека (Bhatnagar А. et al., 1993; Bhuyan K.C., Bhuyan D.K., 1984). Механизм действия хлорида кальция обусловлен изменением работы Са²⁺-связанных ферментных систем в клетках хрусталика. Такую экспериментальную модель катарактогенеза можно рассматривать как аналог ядерной формы сенильной катаракты человека (David R.R., Shearer T.R., 1984; Tang D. et al., 2003). Таким образом, действие этих химических агентов приводит к образованию наиболее часто встречающихся форм катаракт в офтальмологической практике.

Концентрации повреждающих агентов и время культивирования были подобраны опытным путем, таким образом, чтобы катарактогенез развивался в течение 3-4 суток (Lou M.F. et al., 1995; Bhatnagar A. et al., 1995). За этот период времени нарушения биохимических процессов и морфологические изменения в структуре хрусталика не были не обратимым, и поэтому на культивируемых хрусталиках можно было изучать биологическую активность РБ (Cui X.L., Lou M.F., 1993).

В качестве критерия степени помутнения хрусталиков были выбраны такие обозначения: а) - (прозрачный хрусталик); б) +/- (среднее помутнение, при котором еще просматриваются линии подложки); в) + (полное помутнение, при котором линии подложки не видны). Соответственно, подбор концентрации повреждающих агентов происходил в такой закономерности, чтобы на первые сутки культивирования хрусталиков в них не определялось выраженного помутнения; на 3-4 сутки - развивалось помутнение средней степени, а на 7-8 сутки - полное помутнение хрусталиков. Во всех опытах хрусталики глаз изучаемых позвоночных животных, культивированные в питательной среде без добавления повреждающих агентов, оставались прозрачными в течение всего времени культивирования (контроль).

При индукции катарактогенеза пероксидом водорода наблюдали помутнение кортикальных слоев, а ядро хрусталика оставалось прозрачным. Следует отметить, что у Xenopus laevis оптимальная концентрация этого катарактогенного вещества соответствовала 0, 5 мМ, а у Rana temporaria - 2 мМ. При воздействии в указанных концентрациях кортикальное помутнение средней степени возникало на 3-4 сутки. При использовании более высоких концентраций пероксида водорода помутнение возникало в ранние сроки культивирования; а более низкие концентрации - вызывали помутнение хрусталика только на 7-8 сутки культивирования.

При индукции катарактогенеза хлоридом кальция у амфибий наблюдали помутнение ядра хрусталика, кортикальные слои оставались прозрачными, в отдельных случаях наблюдали образование легкого налета в виде флера. У Rana temporaria при воздействии хлоридом кальция в концентрации 10 мМ наблюдали образование помутнения средней степени на 3-4 сутки, которое на 7-8 сутки становилось выраженным. В хрусталиках глаза Xenopus laevis этот агент вызывал аналогичную картину развития катарактогенеза в диапазоне концентраций 2, 5-3, 0 мМ. Полученные результаты указывают на различия в значениях концентраций изучаемых химических агентов, вызывающих катарактогенез у двух видов лягушек.

При индукции катарактогенеза в хрусталиках быков, как при воздействии хлоридом кальция (в концентрации 20 мМ), так и при воздействии пероксидом водорода (в концентрации 40 мМ), возникало кортикальное помутнение средней степени на 3-4 сутки культивирования. Концентрации повреждающих агентов, превышающие указанные значения, способствовали индукции помутнения хрусталиков в течение первых суток, а меньшие - на 7-8 сутки культивирования.

При культивировании хрусталиков крыс с пероксидом водорода возникало помутнение ядра хрусталика и, в большей мере, кортикальных слоев, то есть развивалось тотальное помутнение. Добавление пероксида водорода в концентрации 0, 5 мМ, индуцировало катарактогенез на 3-4 сутки культивирования хрусталиков крыс. Концентрация хлорида кальция, которая вызывала тотальное помутнение хрусталиков крыс на этих же сроках культивирования, соответствовала 15 мМ. Полученные нами результаты полностью согласуются с данными других исследователей, которые изучали катарактогенез в хрусталиках глаза крыс in vitro (Bhatnagar M.et al., 1993; Bettelheim F.A. et al., 1995; Lou X.L. et al., 1995).

В качестве примера, на рис. 5 представлены данные спектрофотометрического исследования, которые показывают, что хрусталик крысы, после культивирования с повреждающими агентами пропускает гораздо меньше света при различных длинах волн видимого спектра, по сравнению с контролем.

Рис. 5. Оптическая плотность хрусталиков крыс Wistar на 3-е сутки культивирования in vitro. Белые столбики (контроль) - хрусталики, культивированные в среде без добавления повреждающих агентов; черные столбики - хрусталики, культивированные в среде с 0, 5 мМ H₂O₂; серые столбики - хрусталики, культивированные в среде с 15 мМ CaCl₂. По оси абсцисс: длины волн (нм), при которых производили измерение оптической плотности. По оси ординат: величина оптической плотности, А.

Обнаруженные в этом исследовании различия в значениях концентраций пероксида водорода, при которых наблюдается развитие катарактогенеза в хрусталиках глаза амфибий и млекопитающих, можно объяснить размерами хрусталиков изучаемых животных. Учитывая то, что механизм катарактогенного действия пероксида водорода связан с повреждением мембран клеток и волокон хрусталика, концентрация данного повреждающего агента должна быть пропорциональна площади поверхности хрусталика.

Например, хрусталик Rana temporaria имеет радиус приблизительно в 4 раза больший, чем у Xenopus laevis; а радиусы хрусталиков глаза быка и крысы различаются не менее чем в 4-5 раз. Но, в то же время, следует отметить, что для индукции катарактогенеза в хрусталиках глаза Rana temporaria и крысы, приблизительно одинаковых по размерам, требовалось воздействие пероксида водорода, соответственно, в концентрации 2 мМ и 0, 5 мМ. Возможно, что это может быть связано с различием в состоянии таких важнейших ферментативных систем хрусталика глаза, как NADH и NADPH, проявляющих антиоксидантную активность (Roa C.M., Zigleer J.S.Jr., 1992). Авторами этого исследования было установлено, что хрусталики глаз лягушек Rana temporaria характеризуются высоким уровнем пиридиновых нуклеотидов, по сравнению с хрусталиками Xenopus laevis, а также крыс.

Отсутствие особых различий в значениях концентрации хлорида кальция, необходимых для индукции катарактогенеза in vitro в хрусталиках изучаемых позвоночных животных, можно объяснить сходным состоянием у них Са⁺²-зависимых ферментных систем (David L.L., Shearer T.R., 1984). Обращает внимание обнаруженное в этом исследовании различие в локализации помутнения хрусталика у изучаемых позвоночных животных. У амфибий оно кортикальное - при воздействии пероксида водорода и ядерное - при воздействии хлорида кальция. У млекопитающих такой тенденции в локализации помутнения не прослеживалось, а наблюдали одинаковую локализацию помутнения при воздействии указанными повреждающими агентами.

Очевидно, эти результаты также указывают на различия в активности и локализации антикатарактальных ферментных систем в хрусталике у изучаемых позвоночных животных (Siew E.L., Bettelheim F.A., 1996; David L.L., Shearer T.R., 1984; Tang D. et al., 2003; Roa C.M., Zigleer J.S.Jr., 1992).

Кроме указанных повреждающих агентов, в данном исследовании было изучено воздействие галактозы в качестве катарактогенного средства. Было показано, что галактоза в концентрации 30 мМ вызывает катарактогенез в хрусталике глаза крысы in vitro (Liu Y. et al., 2003). Сходная картина наблюдалась при индукции катарактогенеза глюкозой в концентрации 56 мМ (Kilic F. et al., 1999). Не смотря на это, не удалось индуцировать образование помутнения в хрусталиках глаз лягушек in vitro при использовании галактозы в интервале концентраций 10-300 мМ. При концентрации галактозы в питательной среде менее 200 мМ, хрусталики лягушек оставались прозрачными, а при концентрации 300 мМ наблюдали вакуолизацию и набухание клеток и волокон хрусталика из-за осмотического давления, то есть происходили необратимые деструктивные изменения.

Исследование влияния РБ хрусталика на экспериментальных моделях катарактогенеза in vitro. Исследование влияния КРБХ (доза - 10^-12 мг белка/мл) на катарактогенез проводили на хрусталиках лягушки, крысы и быка, которые целыми культивировали в течение 4-5 суток in vitro. За этот период времени в хрусталиках, культивируемых в бессывороточной питательной среде без добавления повреждающих агентов, полностью сохранялась их прозрачность и морфология. Помутнение хрусталиков in vitro вызывали с помощью изменения концентрации ионов кальция в среде культивирования или добавления в нее пероксида водорода.

Исследование культуры хрусталиков амфибий Xenopus laevis. Хрусталики разделяли на следующие группы (по 4-5 хрусталиков в каждой):

№ 1 - питательная среда 199;

№ 2 - питательная среда 199, содержащая H₂O₂;

№ 3 - питательная среда 199, содержащая H₂O₂ + раствор КРБХ;

№ 4 - питательная среда 199, содержащая CaCl₂;

№ 5 - питательная среда 199, содержащая CaCl₂ + раствор КРБХ;

№ 6 - питательная среда 199 + хрусталики, предварительно помещенные на 5 минут в дистиллированную воду без добавления КРБХ;

№ 7 - питательная среда 199 + хрусталики, предварительно помещенные на 5 минут в дистиллированную воду с добавлением КРБХ.

По сравнению с контрольными группами (№№ 2, 4, 6), в опытных группах (№№ 3, 5, 7), помутнение хрусталиков визуально было значительно менее выражено. Полученные данные показывают, что независимо от механизма, лежащего в основе повреждающего действия используемых химических агентов, РБ хрусталика тормозил развитие катарактогенеза in vitro. Аналогичные результаты, демонстрирующие протекторное действие фракции РБ хрусталика, были получены на культурах хрусталиков быков и крыс, соответственно. Кроме того, в этих экспериментах было показано, что добавление РБ в среду культивирования хрусталиков глаз позвоночных животных при отсутствии повреждающих агентов не изменяло их прозрачности.

На культурах хрусталиков глаз амфибий была разработана новая модель осмотической катаракты, отражающая нарушение электролитного баланса в данной структуре глаза, которое имеет место, например, при диабетической катаракте человека. Результаты серий № 6, № 7 свидетельствуют о протекторном свойстве, проявляемом РБ хрусталика на развитие катарактогенеза, вызванного воздействием дистиллированной воды (рис. 6). Произвести оценку результатов экспериментов серии № 1 - № 7 спектрофотометрически не представлялось возможным в силу малых размеров хрусталиков.



Рис. 6. Влияние РБ хрусталика в СМД на катарактогенез в хрусталиках лягушки Xenopus laevis, индуцированный воздействием дистиллированной воды in vitro. Номера серий: № 6 - питательная среда 199 + хрусталики, предварительно помещенные на 5 минут в дистиллированную воду без добавления белка; № 7 - питательная среда 199 + хрусталики, предварительно помещенные на 5 минут в дистиллированную воду с добавлением белка. (Ув. ок.х8, об.х2).

На рис. 7 представлены результаты спектрофотометрического исследования влияния РБ хрусталика на развитие помутнения в хрусталиках глаз быков, индуцированного добавлением в питательную среду катарактогенных агентов.

Рис. 7. Спектрофотометрическое исследование влияния РБ на катарактогенез в хрусталиках быка, индуцированный воздействием пероксида водорода и хлорида кальция. Справа в малом столбце даны длины волн (нм), указаны различной штриховкой. По оси абсцисс указаны номера серий опытов: № 1 - питательная среда 199; № 2 - питательная среда 199, содержащая H2O2; № 3 - питательная среда 199, содержащая H2O2 + раствор исследуемого белка; № 4 - питательная среда 199, содержащая CaCl2; № 5 - питательная среда 199, содержащая CaCl2 + раствор исследуемого белка. По оси ординат: величина оптической плотности, А. Сравнение данных серий № 2, № 3 (контроль-опыт) и № 4, № 5 (контроль-опыт) показывает статистически достоверные отличия между ними, р<0.05.

Исследование хрусталиков глаз крыс. В этой экспериментальной серии было показано, что РБ хрусталика тормозит развитие помутнения линзы, которое развивалось после воздействия катарактогенных агентов. Данные оценки степени помутнения хрусталиков, полученные с помощью визуального наблюдения (рис. 8), полностью совпали с результатами спектрофотометрического исследования хрусталиков после их культивирования (рис. 9)

Рис. 8. Влияние РБ в СМД на катарактогенез в хрусталике глаза крысы, индуцированный воздействием пероксида водорода in vitro. Номера серий: № 1 - питательная среда 199; № 2 - питательная среда 199, содержащая H2O2; № 3 - питательная среда 199, содержащая H2O2 + раствор исследуемого белка. (Ув. ок.х8, об.х2).

На культуре крысиных хрусталиков in vitro было проведено следующее дополнительное исследование: помимо фракции КРБХ было изучено воздействие фракции, полученной после проведения электрофореза в ПААГ - фракция КРБХ-Э. Полученные данные показывают, что электрофоретически очищенная фракция РБ хрусталика также проявляет протекторное свойство в отношении хрусталиков крысы.

Однако при определении степени помутнения в изучаемых хрусталиках с помощью спектрофотометрического метода не удалось выявить достоверные отличия между хрусталиками, которые подвергали воздействию двух фракций РБ (рис. 9).

Рис. 10. Спектрофотометрическое исследование влияния фракций КРБХ и КРБХ-Э на катарактогенез в хрусталике глаза крысы, индуцированный воздействием пероксида водорода и хлорида кальция. Справа в малом столбце даны длины волн (нм), указаны различной штриховкой. По оси абсцисс указаны номера серий опытов: № 1 - питательная среда 199; № 2 - питательная среда 199, содержащая H₂O₂; № 3 - питательная среда 199, содержащая H₂O₂ + раствор КРБХ; № 4 - питательная среда 199, содержащая H₂O₂ + раствор КРБХ-Э; № 5 - питательная среда 199, содержащая CaCl₂; № 6 - питательная среда 199, содержащая CaCl₂ + раствор КРБХ; № 7 - питательная среда 199, содержащая CaCl₂ + раствор КРБХ-Э. По оси ординат: величина оптической плотности, А. Сравнение данных серий № 2 с данными серий № 3 и 4 (контроль-опыт), а также данных серий № 5 с данными серий № 6 и № 7 (контроль-опыт) показывает статистически достоверные отличия между ними, р<0.05.

Таким образом, в настоящем исследовании, проведенном на культурах хрусталиков глаз позвоночных животных, было установлено, что применение РБ хрусталика глаза быка, препятствует развитию катарактогенеза у позвоночных животных in vitro. Было также показано, что биологическая активность РБ хрусталика глаза быка характеризуется отсутствием видовой специфичности.

Гистологическое исследование хрусталиков глаза крысы. При гистологическом исследовании хрусталиков крысы было показано, что при культивировании при отсутствии повреждающих агентов - питательная среда или питательная среда, содержащая РБ хрусталика в СМД, состояние капсулы, эпителия, ядерной дуги, кортикальных волокон и нуклеуса имеют нормальное строение. Следует отметить, что при воздействии РБ капсула хрусталика на всём протяжении плотно прилегала к подлежащему эпителию. При отсутствии РБ в питательной среде между капсулой и эпителием хрусталика выявлялся диастаз. Полученные результаты указывают на проявление РБ хрусталика свойств фактора адгезии, т.е. способности поддерживать адгезионные межклеточные взаимодействия в эпителии капсулы хрусталика.

Культивирование хрусталиков крысы совместно с повреждающими агентами приводило к развитию в них значительных деструктивных процессов, которые при добавлении в питательную среду РБ хрусталика имели явно менее выраженный характер. В качестве примера на рис. 10 представлены гистологические срезы хрусталика крысы контрольной серии № 2, которые культивировали с пероксидом водорода и хрусталика опытной серии № 3.

Рис. 10 Гистологический срез хрусталика крысы 5-й день культивирования. а- питательная среда 199, содержащая H₂O₂ (контроль), б- питательная среда 199, содержащая H₂O₂ + раствор исследуемого белка (опыт). (Ув. ок.х10, об.х20).

Таким образом, проведенное гистологическое исследование хрусталиков крысы показало, что изучаемый РБ хрусталика проявляет протекторное свойство при экспериментально индуцированном катарактогенезе in vitro, которое выражается в поддержании гистоструктуры, предотвращении лизиса и развития деструктивных процессов в ткани.

Исследование влияния РБ хрусталика на экспериментальных моделях катарактогенеза у крыс Wistar in vivo. Исследование было проведено на 6-месячных крысах породы Wistar.

Модель травматической катаракты in vivo. У наркотизированных эфиром животных под контролем бинокулярного микроскопа наносили травму путем прокола переднего полюса хрусталика через роговицу инсулиновой иглой диаметром 0, 45 мм на заданную глубину.

В первой экспериментальной серии глубина прокола составляла 5, 1 мм от поверхности роговицы, во второй - 3, 4 мм.

Через 7 дней животных всех серий выводили из эксперимента, из глаз микрохирургически экстрагировали хрусталики и изучали их методом фотографирования.

В первой экспериментальной серии (глубина прокола 5, 1 мм) в контроле в глазах крыс наблюдалось развитие выраженного травматического факогенного воспаления: в области лимба отмечалось образование обширных плоскостных синехий радужки с капсулой хрусталика и роговицей, прорастание новообразованных сосудов по капсуле хрусталика. Данные изменения в переднем отрезке глаза препятствовали выделению хрусталиков без повреждения капсулы при использовании микрохирургической техники. Во всех контрольных хрусталиках, на которые воздействовали физ. раствором, наблюдали тотальную травматическую катаракту (рис. 11а).

В глазах крыс в опыте (воздействие КРБХ) признаки факогенного воспаления были гораздо менее выражены, чем у контрольных, и хрусталики удалось выделить без значительного повреждения. В хрусталиках данной серии наблюдали ядерную форму катаракты с сохранением прозрачности кортикальных слоев (рис. 11б).

Рис. 11. Влияние РБ на травматическую катаракту крыс Wistar in vivo на 7-е сутки (глубина прокола 5.1 мм от поверхности роговицы): а).-контроль; б).-опыт (Ув. ок.х8, об.х1).

Во второй экспериментальной серии (глубина прокола 3, 4 мм) в контроле в хрусталиках крыс в месте прокола передней капсулы наблюдали образование эпителиальной «пробки», которая по площади была больше таковой, которая имела место в опытных хрусталиках, подвергшихся воздействию КРБХ. Кроме того, следует отметить, что при выделении хрусталиков опытных серий отмечалось более плотное крепление цинновых связок, по сравнению с хрусталиками контрольных серий.

Данные гистологического исследования, проведенные с поврежденными на глубину 3, 4 мм хрусталиками, показали, что структура и плотность крепления эпителиальной «пробки» к прилежащим кортикальным волокнам была гомогенной и компактной в хрусталиках опытных серий, но пористой и неоднородной - в контрольных (рис. 12). В контроле в кортикальных волокнах наблюдали явления гидратации и нарушения упорядоченности, в то время как в опытных хрусталиках обнаруживалось сохранение архитектоники ткани и отсутствие ее оводнения.

Рис. 12. Гистологический срез хрусталика крысы Wistar на 7-й день, травма:3.2 мм. а) Контроль - инстилляция физ. р-ром (Ув. ок.х10, об.х10); б) Опыт - инстилляция РБ хрусталика. (Ув. ок.х10, об.х20). 1-эпителиальная «пробка»; 2-субкапсулярные волокна.

Таким образом, было установлено, что РБ, выделенный из хрусталика глаза быка, приводит к уменьшению воспалительной реакции при глубоком травматическом повреждении вещества хрусталика и способствует быстрой эпителизации зоны дефекта.

Модель лучевой катаракты. Данное исследование основано на предположении, что изучаемый РБ хрусталика также может влиять на дифференцировку эпителиальных клеток капсулы в хрусталиковые волокна.

На крыс воздействовали рентгеновским излучением. Животным контрольной группы в течение первых двух недель после облучения инстиллировали в глаза физ. раствор; крысам опытной группы аналогично закапывали раствор КРБХ. На 30-е сутки животных всех групп выводили из эксперимента, и микрохирургически производили экстракцию хрусталиков, которые далее изучали методом фотографирования и спектрофотометрии.

Визуальный осмотр хрусталиков животных всех групп выявил наличие лучевой катаракты 1-й степени, причём количество заднекортикальных помутнений было больше в контрольной группе, а интенсивность - в опытной. Данные спектрофотометрии не определили достоверных различий между группами (р>0, 05) (рис. 13).

Рис. 13. Оптическая плотность хрусталиков крыс Wistar на 30-е сутки, лучевое воздействие in vivo. Черные столбики - инстилляция физ. р-ром (контроль); б) серые столбики - инстилляция РБ хрусталика (опыт). По оси абсцисс: длины волн, при которых производили измерение оптической плотности (нм). По оси ординат: величина оптической плотности, А. Данные недостоверны: p>0.05.

Гистологическое исследование показало, что в хрусталиках крыс обеих групп происходит нарушение волокнообразования: изменяется форма и продолжительность ядерной дуги, увеличивается количество ядросодержащих волокон в более зрелых слоях коры, ядра эпителиальных клеток гиперхроматизираванны.

Таким образом, в данном исследовании не удалось выявить протекторное действие РБ, выделенного из хрусталика глаза быка, на развитие лучевой катаракты крыс in vivo. Известно, что механизм повреждения ткани при воздействии рентгеновского излучения связан с поломкой хромосомного аппарата клеток. Возможно, что развивающиеся в этом случае деструктивные процессы оказываются не чувствительными к влиянию таких регуляторных сигналов, как РБ хрусталика.

Заключение

Суммируя полученные в данном исследовании результаты, можно заключить следующее.

В хрусталике глаза быка обнаружен РБ, представляющий собой низкомолекулярный белок, в водных растворах, однако, присутствующий в виде наноразмерных частиц. С помощью адгезиометрического метода было установлено, что данный РБ проявляет биологическую (мембранотропную) активность в СМД, соответствующих 10^-12-10^-15 мг белка/мл. Дозовая зависимость мембранотропной активности РБ имеет полимодальный характер. РБ локализован в межклеточном пространстве капсулярного эпителия, который играет принципиальную роль в гомеостазе этой структуры глаза, в частности, ответственен за процессы волокнообразования в хрусталике. Вероятно, эпителий капсулы является клеточным источником регенерации в хрусталике, т.к. именно здесь наиболее интенсивно идут процессы клеточной пролиферации и дифференцировки. Результаты, полученные при исследовании локализации РБ в хрусталике, указывают на возможность участия данного белка в этих процессах. Это предположение нашло полное подтверждениие при исследовании специфической биологической активности РБ хрусталика, в котором было продемонстрировано его протекторное свойство. Для решения этой задачи были исследованы разные модели катарактогенеза у позвоночных животных как в системе in vitro, так и in vivo. В результате проведенных исследований было установлено, что РБ, выделенный из хрусталика глаза быка, оказывал ингибирующее действие на развитие катаракты, возникающей при нарушении работы основных ферментных систем хрусталика - ПОЛ и Са⁺²-зависимых протеаз. Кроме того, было показано протекторное действие РБ хрусталика на развитие осмотической катаракты, вызванной нарушением ионного гомеостаза в хрусталике. Данная экспериментальная модель может отражать некоторые этапы патогенетического развития диабетической катаракты у человека.

На модели травматической катаракты in vivo была продемонстрирована способность РБ тормозить развитие воспалительных процессов в тканях глаза, а также препятствовать образованию полной катаракты. Экспериментально установленный факт отсутствия биологического эффекта РБ хрусталика на модели лучевой катаракты, указывает на его способность участвовать в регуляторных процессах, контролирующих работу основных ферментных систем хрусталика, но не влияющего на процессы восстановления в хромосомном аппарате клеток. Эти данные способствуют более конкретному пониманию механизма, лежащего в основе биологического действия РБ хрусталика, который, как и другие РБ, выделенные из разных тканей млекопитающих, принадлежит к новой группе биорегуляторов, которые осуществляют тонкую настройку процессов органно-тканевого гомеостаза (Краснов М.С. и др., 2003а). Изучение физико-химических свойств РБ хрусталика продемонстрировало способность его молекул в водных растворах участвовать в образовании устойчивых наночастиц. Эти данные позволяют поставить вопрос о связи между таким своеобразным состоянием в растворах молекул РБ хрусталика и проявлением им биологической активности в СМД. В этом аспекте следует отметить, что многие вещества при переходе в состояние наноразмерных частиц, начинают проявлять новые уникальные свойства (Cui S. et al., 2004; Olivier G., 2005; Рамис E., 2006).

Полученные в данной работе результаты, свидетельствующие о влиянии РБ хрусталика на развитие катарактогенеза в условиях in vitro и in vivo, позволяют сделать заключение о том, что этот белок в виде водно-солевого раствора в СМД можно рекомендовать в качестве нового офтальмологического препарата. В настоящее время этот препарат, получивший название «Вилензин» проходит вторую стадию клинических испытаний. В первой фазе этих исследований было показано полное отсутствие острой и хронической токсичности, иммунотоксичности, тератогенности и аллергенности данного фармакологического препарата, отсутствие при его применении каких-либо побочных неблагоприятных реакций со стороны отдельных тканей глаза и организма в целом. На основании данных, полученных при исследовании РБ хрусталика, а также нового офтальмологического препарата «Вилензин», разработанного на его основе, можно предположить, что данное лекарственное средство претендует на определенную нишу среди антикатарактальных препаратов.

...