Размещено на http://www.allbest.ru/

На правах рукописи

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Иммунотропные свойства синтетических пептидных производных белков фетоплацентарного комплекса человека.

14.03.09.- Клиническая иммунология, аллергология

МАКАРОВ ТИМОФЕЙ ВЯЧЕСЛАВОВИЧ

МОСКВА-2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Салмаси Жеан Мустафаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Козлов Иван Генрихович

доктор медицинских наук, профессор Лусс Людмила Васильевна

Ведущая организация: Государственное общеобразовательное учреждение высшего профессионального образования «Московская медицинская академия им. И.М. Сеченова» Росздрава

Защита состоится на заседании диссертационного совета Д 208.072.05 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» 117997 Москва, ул. Островитянова д.1.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГОУ ВПО РГМУ Росздрава по адресу: 117997 Москва, ул. Островитянова д.1.

Автореферат разослан 2010 г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат медицинских наук, доцент Т.Е. Кузнецова.

Общая характеристика работы

Актуальность исследования. Современная медицинская наука развивается высокими темпами, и достигла значительных успехов. Раскрыты многие звенья патогенеза иммунопатологических заболеваний и получены лекарственные средства, позволяющие эффективно контролировать развитие клинических симптомов. Однако современные методы лечения аллергических и аутоиммунных заболеваний недостаточно эффективны и практически не влияют на патогенетическую основу данных заболеваний [Грачева Л.,1997; Чучалин А.Г., 1995]. В тоже время, современная биотехнология позволяет получать вещества заданного состава и с необходимыми свойствами [Халимская Л.М., 2000]. Синтетические вещества отличаются от природных постоянством химического состава и отсутствием необходимости использовать донорский материал. В настоящее время создано большое количество синтетических иммуноактивных пептидов: гепон, вилон, бестим и другие. Они созданы на основе естественных тимических пептидов и обладают заметным иммунорегулирующим действием. Однако они чаще применяются при лечении острых и хронических инфекций [Оковитый С. В., 2005], так как обладают иммуностимулирующими эффектами. Следовательно, возникает необходимость поиска новых иммуноактивных веществ, которые могут применяться для лечения иммунопатологических состояний.

Имеется ряд наблюдений, что в третьем триместре беременности у больных иммунопатологическими болезнями (ревматоидный артрит, ревматизм, тромбоцитопеническая пурпура, рассеянный склероз) наблюдается развитие ремиссии. Это связывают с эффектами фетоплацентарных белков [Кузник Б.И., Васильев Н.Б., 1998]. Получение и применение фетоплацентарных белков природного происхождения имеет ряд существенных трудностей: поиск донорского материала, нестабильность химической структуры и возможность парентеральной передачи вирусов [Шмагель К.В., Черешнев В.А., 2003]. В последние годы появились работы, в которых показано наличие иммуномодулирующих свойств, присущих нативным фетоплацентарным белкам, а также синтетическим пептидам, содержащим определенные пептидные последовательности фетоплацентарных белков. На кафедре биохимии РГМУ профессором Терентьевым А.А. в молекулах АФП и ТБГ были определены пептидные последовательности, которые согласно теоретическим представлениям должны отвечать за ограничение активации иммунной системы.

В лаборатории кафедры патологической физиологии РГМУ ранее исследовался синтетический аналог белка АФП, были получены данные о его влиянии на пролиферацию лимфоцитов [Казимирский А.Н. и соавт., 1999]. Позднее были проведены исследования влияния белков АФП и на популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов, активационные процессы в культуре клеток больных АБА [Казимирский А.Н., 2003], где было показано снижение клеток с экспрессией ранних активационных маркеров. Затем, было выдвинуто, предположение о наличии активных центров в нативных молекулах АФП и ТБГ. Позже были выделены и синтезированы полипептидные последовательности, предположительно отвечающие за иммунотропные эффекты АФП и ТБГ [Терентьев А.А., 2001].

Необходимость прицельно изучить иммунотропные свойства синтетических пептидов аналогов белков АФП и ТБГ, которые могут стать новыми средствами для лечения иммунопатологических и аллергических заболеваний человека, обосновало выбор направление исследования.

Цель работы. Исследовать иммунотропное действие синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса (БТК) человека, на экспериментальных моделях. Задачи работы.

Изучить действие синтетических аналогов пептидов БТК человека на изменение количества лимфоцитов экспрессирующих поверхностные маркеры здоровых доноров in vitro.

Изучить действие синтетических аналогов пептидов БТК человека на изменение количества лимфоцитов экспрессирующих поверхностные маркеры больных ревматоидным артритом in vitro.

Изучить действие синтетических аналогов пептидов БТК на изменение количества лимфоцитов экспрессирующих поверхностные маркеры больных атопической бронхиальной астмой in vitro.

Исследовать влияние синтетических аналогов пептидов БГК человека на анафилактическую и медиатор-индуцированную контрактуру гладких мышц in vitro.

Исследовать влияние синтетических аналогов пептидов БТК человека на развитие сенсибилизации морских свинок.

Научная новизна исследования.

Диссертационная работа посвящена исследованию иммунотропных свойств ранее не изучавшихся синтетических пептидов, производных БТК человека.

Впервые изучено влияние пептидa АФП_14-20, пептидa V, пептидa Q, пептид CEA, пептидa E на изменение количества клеток несущих ранние активационные маркеры (CD25, CD71), поздние активационные маркеры (HLA-DR, CD95) при культивировании лимфоцитов здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, больных ревматоидным артритом.

Впервые изучено влияние пептидa V, пептидa Q, пептид CEA, пептидa E на изменение количества содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺), NK-клеток (CD16⁺, CD56⁺), B-лимфоцитов (CD20⁺), изменения количества разных форм дифференцировки В-лимфоцитов (CD72⁺, CD23⁺, IgM⁺, IgG⁺) при культивировании лимфоцитов здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, больных ревматоидным артритом. Показана способность, всех исследованных пептидов аналогов БТК человека, снижать содержание Т-лимфоцитов (CD3⁺), Т-хелперов (CD4⁺), цитотоксических лимфоцитов (CD8⁺) при культивировании лимфоцитов здоровых доноров.

Впервые исследовано действие синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей БТК человека на развитие экспериментальной анафилаксии и медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц.

Впервые показано, что пептиды АФП_14-20, V, CEA, E не влияют на развитие медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц морской свинки под действием ацетилхолина и гистамина. Была выявлена способность пептида Q, увеличивать медиатор-индуцированную контрактуру гладких мышц морской свинки к ацетилхолину и снижать медиатор-индуцированную контрактуру к гистамину.

Впервые была исследована и охарактеризована, способность пептидов аналогов БТК человека влиять на развитие сенсибилизации in vivo. Показано, что пептид АФП_14-20 способен усиливать сенсибилизацию морских свинок.

Полученные результаты, позволяют охарактеризовать иммунотропные эффекты синтетических пептидов аналогов БТК человека.

Практическая значимость работы. Предложен способ оценки иммунотропных свойств пептидов при культивировании лимфоцитов здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, больных ревматоидным артритом, включающий широкий спектр антигенных маркеров.

Полученные данные расширяют представления о взаимосвязи структуры и функции пептидов.

Показанные иммунотропные свойства исследованных пептидов позволяют рассматривать их в качестве потенциальных лекарственных препаратов.

Положения, выносимые на защиту.

Синтетические пептиды, аналоги некоторых пептидных производных белков трофобластического комплекса оказывают иммунотропное действие на лимфоциты здоровых доноров, больных атопической бронхиальной астмой, ревматоидным артритом.

Пептид АФП_14-20 и пептид Е, in vitro в исследованных моделях, уменьшают количество клеток экспрессирующих ранние активационные маркеры (CD25, CD71) больных иммунопатологическими заболеваниями.

Пептиды, синтетические аналоги белков ТБГ - V, Q, СЕА подавляют Т-клеточное звено (CD3, CD4, CD8) иммунной системы больных иммунопатологическими заболеваниями.

Синтетический пептид АФП_14-20 усиливает сенсибилизацию.

В условиях in vitro пептид Q, способен усиливать действие ацетилхолина и значительно снижать эффект гистамина на гладкую мускулатуру тонкого кишечника морской свинки.

Внедрение результатов исследования. Полученные результаты используются в учебном процессе и научной деятельности кафедры патологической физиологии и кафедры биохимии РГМУ.

Апробация работы. Материалы диссертации представлены на конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины, (Москва, 2003), на XIII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2006). Основные положения диссертации доложены на совместной научно-практической конференции кафедры патофизиологии и кафедры биохимии ГОУ ВПО РГМУ от 13.02.2007. Также материалы диссертации представлены на XVII Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2010).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 10 печатных работ, в том числе три в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 124 страницах машинописного текста, включает в себя введение, обзор литературы, 4 главы собственных исследований, заключение, выводы. Работа иллюстрирована 15 таблицами и 16 рисунками. Обзор литературы содержит 190 источников, из них 59 отечественных и 131 зарубежных автора.

пептид белок бронхиальный астма

Материалы и методы исследования

В работе представлены результаты исследований на лимфоцитах периферической крови 10 больных атопической бронхиальной астмой, 10 больных ревматоидным артритом, и 9 здоровых доноров. Всего проведено 196 исследований, каждое из которых включало определение 16 поверхностных маркеров лимфоцитов

Для проведения нашего исследования были отобраны здоровые доноры в возрасте 19-22 года. Всего мы исследовали субпопуляционный состав лимфоцитов у 9 здоровых доноров. Все обследованные доноры не страдали аллергическими, иммунопатологическими и хроническими воспалительными заболеваниями. Последнее острое заболевание завершилось не менее, чем за два месяца до проведения исследования.

Группа больных атопической бронхиальной астмой (сенсибилизация к пыльце растений) состояла из 10 человек, мы проводили наше исследование в приступный период заболевания (апрель-июнь). Диагноз был подтвержден данными анамнеза, клинического обследования и лабораторных данных (кожные пробы, титр антител). При постановке кожных проб была выявлена поливалентная сенсибилизация к пыльце деревьев и трав, продуктам питания. Среди этиологически значимых аллергенов были выявлены: дуб, подсолнечник, рожь, ежа сборная, амброзия, полынь, одуванчик, береза, овсяница, ольха, клен, ясень, мятлик, райграс, фундук, яблоки, груша. Все обследованные пациенты получали базисную медикаментозную терапию: кромогликаты, антигистаминные препараты, b-адреномиметики, М-холиноблокаторы. Степень тяжести заболевания (средне-тяжелая) и период (приступный) были подтверждены на основании критериев классификации бронхиальной астмы [GINA, 2003]. Для купирования приступов не применялись кортикостероидные препараты.

Группа больных ревматоидным артритом включала в себя 10 больных. Диагноз был подтвержден данными анамнеза, клинической картиной, данными инструментальных (рентгенография) и лабораторных исследований (ревматоидный фактор, С-реактивный белок). В исследование были включены как серопозитивные, так и серонегативные пациенты. Все обследованные больные находились в стадии обострения заболевания и получали соответствующую терапию: нестероидные противовоспалительные препараты, протекторы хрящевой ткани, хондроитинсульфаты, витамины и общеукрепляющие средства. Терапия этих больных не включала стероидные противовоспалительные и цитостатические препараты в период не менее 6 месяцев до проведения нашего исследования.

Определение содержания в периферической крови лимфоцитов, экспрессирующих поверхностные маркеры: CD3, CD4, CD8, CD16, CD56, CD20, CD72, CD23, IgM, IgG, CD25, CD71, HLA-DR, CD95 оценивали с помощью моноклональных антител («Медбиоспектр», Москва; «Сорбент» Москва) в реакции непрямой иммунофлюоресценции (микроскоп «Люмам-И3»).

Лимфоциты культивировали с синтетическими пептидами, аналогами некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса человека (таблица 1), в течении 16 часов. Для оценки жизнеспособности лимфоцитов проводился тест с трипановым синим.

Таблица 1. Аминокислотные последовательности исследованных пептидов.

Исследованные пептиды	Аминокислотная последовательность
АФП14-20	14- Leu-Asp-Ser-Tyr-Gln-Cys-Thr - 20
Е	213-Pro___________ Tyr- Glu- Cys- Glu -217
Q	306-Pro___________ Tyr-Gln-Cys- Glu -310
V	391-Leu___________ Tyr-Val-Cys-Ser-395
CEA	71-Ser_____________ Tyr-Lys-Cys- Glu -75

Синтетические пептиды получены методом твердофазного синтеза в лаборатории синтеза пептидов Кардиологического научного центра РФ. Препарат микроскопировали в водной иммерсионной системе с использованием люминесцентного микроскопа "Люмам И-3". В каждой лунке считали не менее 200 клеток, исключая клетки с морфологией моноцитов, затем вычисляли процент клеток несущих соответствующие поверхностные маркеры.

На животных моделях была проведена серия экспериментов. Сенсибилизацию животных вызывали трехкратным, с интервалом в 1 сутки, введением антигена - яичного альбумина (ЯА). ЯА вводили в неполном адъюванте Фрейнда по 2 мг на животное (8 мг белка/кг массы тела). С первого дня индукции сенсибилизации подопытным свинкам ежедневно, в течении 21 дня, внутримышечно вводили пептид АФП_14-20 (8 животным) и пептид Е (8 животным) в дозировке 3*10^-5М, таким образом конечная концентрация составила 10^-7М за счет объема распределения. Выбор дозы был обусловлен ранее проведенными исследованиями [Терентьев А.А., и соавт. 2003].

Опыты проводились на 21 сутки от начала сенсибилизации на 1,5 см. отрезках подвздошной кишки морских свинок. Отрезки подвздошной кишки прошивали с обеих сторон и помещали в термостатируемую ванночку для изолированных органов объемом 10 мл при 37^оС и постоянной аэрации. Сократительную реакцию гладкомышечных органов вызывали дигидрохлоридом гистамина фирмы Merck в концентрации 0,1 мкг/мл и регистрировали в изометрическом режиме с помощью механотрона на самописце. После получения устойчивых контрольных реакций в ответ на действие гистамина в раствор Кребса вносили яичный альбумин в конечной концентрации 0,1 мкг белка/мл.

Исследование медиатор-индуцированной и анафилактической контрактуры гладких мышц морских свинок проводили на отрезках кишки, полученных от интактных животных. В ванночку с отрезком подвздошной кишки морской свинки добавляли пептиды: АФП_14-20, Е, СЕА, Q, V и фиксировали изменение сократительной активности при помощи механотрона. Добавление пептидов не вызвало развитие контрактуры. После отмывки в ванночку добавляли гистамин и после повторной отмывки раствором Кребса ацетилхолин. Величину полученных кривых сравнивали с амплитудой кривых после добавления ацетилхолина и гистамина без предварительного введения пептида, эти значения были приняты за 100%.

Статистические методы обработки полученных результатов.

Статистическая обработка выполнена пакетом прикладных программ STATISTIKA 5.1. Для статистической оценки был применен параметрический метод, так как было обнаружено нормальное распределение признака в изучаемых группах и равенство дисперсий. В таблицах приведены средние значения изучаемого признака и его стандартное отклонение.

Результаты исследования и их обсуждение

В эксперименте на животных мы смогли изучить действие пептидов на развитие сенсибилизации и влияние пептидов на контрактуру гладких мышц, вызванную гистамином, ацетилхолином и антигеном.

Исследование на клеточных моделях, позволило выявить и охарактеризовать иммуноактивные свойства у синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса.

При воспроизведении анафилактической контрактуры гладкой мускулатуры тонкого кишечника, было выявлено, что пептид Е не влияет на развитие сенсибилизации у животного. В тоже время у морских свинок, получавших пептид АФП_14-20, анафилактическая контрактура гладкой мускулатуры тонкого кишечника значительно превышала показатель контрольной группы. В группе животных получавших пептид АФП_14-20 произошло достоверное (р-0,00009) увеличение амплитуды анафилактической контрактуры гладких мышц, по сравнению с контролем, ее величина составила 128,25-6,14% от контрактуры вызванной гистамином. Следовательно, пептид АФП_14-20 при парентеральном введении, совместно с антигеном, способен усиливать сенсибилизацию подопытных животных, что приводит к изменению степени выраженности контрактуры гладкой мускулатуры в ответ на введение значимого антигена. Можно предположить, что подобное явление может иметь в своем патогенезе несколько механизмов. Которые связанны с влиянием на гладкую мускулатуру, тучные клетки или иммунную систему.

Можно предположить, что под влиянием пептида АФП_14-20 имеет место увеличение плотности рецепторов к гистамину на мембране гладкомышечной клетки и, следовательно, увеличивается ответ на внешние спазмогенные стимулы. Однако в ответ на введение разрешающей дозы гистамина увеличения амплитуды кривой не отмечалось, что позволило исключить данный механизм увеличения контрактуры.

Таблица 2. Изменение медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц морских свинок при добавлении синтетических пептидов, аналогов некоторых пептидных последовательностей белков трофобластического комплекса человека.

Исследованные пептиды	Величина амплитуды в %
	По отношению к гистамину	По отношению к ацетилхолину
Контроль n=14	100	100
Пептид АФП14-20 n=7	93,97±4,66	94,97±6,88
Пептид Е n=7	104,07±4,94	103,45±6,66
Пептид Q n=7	69,78±8,13*	116,56±9,20*
Пептид V n=14	105,43±6,59	100,56±6,81
Пептид СЕА n=14	108,14±6,53	87,89±6,87

Примечание: *-p<0,05.

Результаты эксперимента по изучению медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц морской свинки представлены в таблице 2.

Полученные данные убедительно показывают, что все исследованные пептиды не обладают спазмогенной активностью и не влияют, кроме пептида Q, на выраженность контрактуры гладких мышц при добавлении гистамина и ацетилхолина. Пептид Q, единственный из исследованных пептидов, приводил к изменению амплитуды кривой после добавления гистамина и ацетилхолина. Следует отметить, что пептид Q снижал амплитуду кривой при добавлении гистамина и, напротив, увеличивал указанный показатель при добавлении в ванночку ацетилхолина.

Исследование иммунотропного действия пептидов на клеточных моделях in vitro было начато с изучения изменения количества лимфоцитов экспрессирующих исследуемые маркеры на клеточной модели здоровых доноров. Выбранные антигенные маркеры лимфоцитов позволяют количественно охарактеризовать популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов, а также оценить состояние активационных процессов в иммунной системе.

Все исследованные пептиды у здоровых доноров снижали содержание Т-лимфоцитов, за счет однонаправленного изменения численности CD4⁺ клеток и CD8⁺ (Т-цитотоксических лимфоцитов) (таблица 3).

Таблица 3. Изменение популяционного и субпопуляционного состава Т- лимфоцитов здоровых доноров после культивирования c пептидами.

Исследованные пептиды	количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
	CD3	CD4	CD8	CD16	CD56
Контроль	66,71±1,32	39,40±1,34	27,33±1,24	14,08±0,96	5,79±0,60
АФП14-20 n=10	45,12±0,63*	11,82±0,42*	17,14±0,62*	8,32±0,70*	4,32±0,46
Е n=10	46,73±1,46*	17,65±1,87*	18,41±0,95*	7,24±1,04*	6,22±1,27
V n=10	53,90±1,75*	11,42±1,02*	16,40±1,17*	6,96±1,06*	5,96±0,53
Q n=10	48,84±1,74*	12,07±1,19*	15,02±1,52*	9,90±1,46*	6,24±0,83
CEA n=10	34,40±0,61*	9,92±1,25*	10,67±0,86*	5,54±0,65*	5,59±1,42

Примечание: *-p<0,05; достоверность различий указана по сравнению с контролем.

При детальном анализе описанных изменений выяснилось, что сумма CD4⁺ клеток и CD8⁺ клеток, превышает общее количество Т-лимфоцитов (CD3⁺). В соответствии с литературными источниками подобное явление можно объяснить активацией Т-лимфоцитов при ограничении их пролиферации вне тимуса, или гибелью некоторой части лимфоцитов [Казимирский А.Н., 2002].

На В-лимфоцитарное звено здоровых доноров оказали влияния только два, из всех исследованных пептидов: пептид СЕА и пептид AFP_14-20 (таблица 4). На количество В-лимфоцитов (CD20⁺) оказал влияние пептид AFP_14-20, уменьшив их содержание в культуре клеток. Пептид СЕА снизил содержание В-лимфоцитов (CD20⁺) и их активированных форм (CD72⁺).

Таблица 4. Изменение содержания В-лимфоцитов и их основных форм дифференцировки здоровых доноров после культивирования c пептидами.

Исследованные пептиды	количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
	CD20	CD72	IgM	IgG
Контроль	8,58±0,97	4,91±0,77	6,94±0,71	7,36±0,59
АФП14-20 n=10	6,10±0,21*	3,26±0,47	5,93±0,68	6,19±0,59
Е n=10	7,76±1,17	4,34±0,70	6,49±1,43	6,09±0,81
V n=10	9,48±1,08	5,31±0,70	7,61±0,53	6,21±1,02
Q n=10	7,01±1,15	4,47±0,61	6,00±0,98	6,53±1,25
CEA n=10	4,88±2,51	5,50±1,30	1,76±0,50*	2,01±0,98*

Примечание: p<0,05; достоверность различий указана по сравнению с контролем.

На экспрессию активационных маркеров лимфоцитов здоровых доноров оказали влияние пептид СЕА, пептид V, пептид АФП_14-20. Пептид СЕА уменьшил количество CD23-позитивных клеток и зрелых лимфоцитов (HLA-DR⁺). Пептид АФП_14-20 увеличил содержание зрелых лимфоцитов, не изменив численность клеток, готовых к активационному апоптозу (CD95⁺). Под влиянием пептида V произошло увеличение количества лимфоцитов с экспрессией раннего активационного маркера CD25 рецептора (таблица 5). Таким образом, под влиянием описанных пептидов у здоровых доноров происходит: снижение общего количества (CD3⁺) и субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4⁺ и CD8⁺). Пептид СЕА и пептид АФП_14-20 оказали воздействия на В-клеточное звено. Пептид Е несколько увеличивает показатель пролиферативной активности, а под влиянием пептида СЕА, напротив увеличивается склонность к элиминации лимфоцитов, подтверждением чему, служит значительное снижение содержания Т-лимфоцитов и В-лимфоцитов (рисунок 4).

Затем были проведены эксперименты с культивированием лимфоцитов, полученных от больных АБА и РА, в присутствии пептидов. При анализе полученных результатов, оказалось, что исследованные пептиды можно разделить на две группы, по влиянию на количество клеток с экспрессией активационных маркеров. В первую группу вошли пептиды АФП_14-20 и Е, они снижали количество лимфоцитов, несущих ранние активационные маркеры. Во вторую группу вошли пептиды: СЕА, V, Q. Пептиды второй группы не оказали столь выраженного влияния на количество клеток с экспрессией ранних маркеров активации.

Таблица 5. Изменение содержания лимфоцитами экспрессии ранних и поздних активационных маркеров, здоровых доноров после культивирования c пептидами.

пептиды	количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
	CD23	CD25	CD71	HLA-DR	CD95
Контроль	4,41±0,47	4,35±0,45	4,23±0,56	10,37±0,31	6,50±1,11
АФП14-20 n=10	4,32±0,74	5,08±0,46	4,44±0,63	12,44±0,83*	8,21±0,98
Е n=10	4,94±0,87	5,44±1,01	3,98±0,68	9,87±1,23	4,50±0,67
V n=10	5,67±0,56	6,37±0,59*	5,10±0,57	12,53±1,23	8,65±1,43
Q n=10	5,22±0,73	5,35±1,08	3,70±0,55	9,83±1,05	8,88±1,19
CEA n=10	2,81±0,23*	0,98±2,34	3,67±1,28	2,48±2,69*	6,25±1,59

Примечание: p<0,05; достоверность различий указана по сравнению с контролем.

При культивировании с пептидом АФП_14-20 и пептидом Е у больных АБА произошло снижение численности CD3-положительных клеток (таблица 6). Данное снижение произошло вследствие однонаправленного изменения количества клеток с поверхностным рецептором CD4 и CD8.

У больных РА более значительное снижение общего количества Т-лимфоцитов (CD3⁺) сопровождалось снижением количества хелперов (CD4⁺) и цитотоксических лимфоцитов (CD8⁺) (таблица 7). Под действием пептида АФП_14-20 и пептида Е в обеих группах больных произошло значительное снижение содержания CD20⁺, CD72⁺ клеток вплоть до нормальных показателей.

Таблица 6. Характеристика состава поверхностных маркеров лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой после культивирования с пептидом АФП_14-20 и пептидом Е.

количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
	маркеры	АБА до культивирования	Пептид АФП14-20 n=10	Пептид Е n=10
Т- лимфоциты	CD3	58,09±0,94	40,02?1,14*	45,12±1,24*
	CD4	36,05±1,05	18,70?1,27*	23,38-1,28*
	CD8	24,25±0,91	12,64?0,90*	13,48-0,23*
NK-клетки	CD16	15,15±0,66	7,35?0,90*	7,59-0,89*
	CD56	15,10±0,73	8,93?0,57*	5,52-0,76*
В- лимфоциты	CD20	19,01±0,45	13,44?0,98*	9,_1±_,56*
	CD72	17,28±0,78	4,72?0,60*	9,34-0,80*
Ранние активационные маркеры	CD23	19,97±1,25	18,83?0,56	24,71-1,04*
	CD25	10,83±0,90	4,63?0,92*	5,54-0,99*
	CD71	12,06±0,67	2,69?0,90*	4,71-0,96*
Поздние активационные маркеры	HLA-DR	20,62±0,95	15,66?1,50*	13,99-0,93*
	CD95	14,27±1,24	10,86?0,87*	10,68-1,23*

Примечание: p<0,05; достоверность различий указана по сравнению с больными.

Все активационные маркеры по времени их появления на мембране лимфоцитов делятся на ранние и поздние. Активационные маркеры появляются на поверхности клеток в следующем порядке: CD25-CD71-HLA-DR-CD95 [Порядин Г.В. с соавт., 2006].при оценке количества лимфоцитов с экспрессией активационных маркеров появляется возможность оценить процессы активации происходящие в иммунной системе. Это обстоятельство позволяет более широко рассмотреть эффект исследованных пептидов. В проведенном исследовании пептиды AFP_14-20 и Е существенно снижали численность лимфоцитов, экспрессирующих ранние и поздние активационные маркеры. При расчете соотношения, характеризующего элиминацию лимфоцитов, выявлено снижение соотношения HLA-DR/CD95 под действием пептидов (AFP_14-20 и Е), что характерно для увеличения элиминации лимфоцитов.

Таблица 7. Характеристика состава поверхностных маркеров лимфоцитов больных ревматоидным артритом после культивирования с пептидом АФП_14-20 и пептидом Е.

количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
	маркеры	РА до культивирования	Пептид АФП14-20 n=10	Пептид Е n=10
Т- лимфоциты	CD3	54,68±1,15	30,09±3,15*	27,70±0,81*
	CD4	33,94±0,90	18,53-1,92*	17,85-1,28*
	CD8	26,78±1,57	12,55-0,48*	15,63-1,02*
NK-клетки	CD16	16,11±1,35	5,90-0,93*	8,06-0,75*
	CD56	13,98±0,87	9,05-0,58*	12,21-2,21
В- лимфоциты	CD20	17,11±0,82	9,01-,02*	10,23±_,94*
	CD72	13,97±1,02	6,65-0,59*	6,65-0,86*
Ранние активационные маркеры	CD23	13,21±1,23	8,36-0,76*	13,52-1,34
	CD25	10,91±0,86	6,41-0,35*	8,00-1,01*
	CD71	14,44±0,92	5,55-0,68*	6,50-0,78*
Поздние активационные маркеры	HLA-DR	19,84±1,05	13,29-0,61*	15,05-2,50*
	CD95	12,73±0,68	18,99-0,71*	12,45-1,46

Примечание: p<0,05; достоверность различий указана по сравнению с больными. Таким образом, анализируя полученные данные можно сделать следующее заключение - пептид АФП14-20 и пептид Е обладают выраженными иммунотропными свойствами, к основным эффектам можно отнести снижение общего количества Т-лимфоцитов (СD3⁺), субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4⁺, CD8⁺), содержания натуральных киллеров у больных АБА и РА. Аналогичное действие исследованные пептиды оказывают и на В-клеточное звено иммунного ответа (снижение общего количества CD20 и отдельных форм дифференцировки В-клеток) у больных АБА и РА. Культивирование лимфоцитов больных в присутствии пептида АФП14-20 и пептида Е приводит к значительному снижению количества лимфоцитов, экспрессирующих ранние и поздние маркеры активации. Особо следует отметить увеличение количества CD95⁺ лимфоцитов у больных РА. То есть, основываясь на полученных результатах, можно предположить, что пептиды синтетических аналогов белков трофобластического комплекса человека АФП14-20 и Е оказывают иммунотропное действие (супрессивного характера).

При исследовании действия пептидов из второй группы (V, Q и СЕА) на популяционный и субпопуляционный состав лимфоцитов и количество лимфоцитов, экспрессирующих активационные маркеры у больных иммунопатологическими заболеваниями были получены следующие результаты (таблица 8).

Таблица 8. Характеристика состава поверхностных маркеров лимфоцитов больных атопической бронхиальной астмой после культивирования с пептидом пептидом V, пептидом Q и пептидом CEA.

количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
	маркеры	АБА до культивирования	Пептид V n=10	Пептид Q n=10	пептид CEA n=10
Т- лимфоциты	CD3	58,09±0,94	41,65±1,27*	50,70±0,86*	59,52±1,23
	CD4	36,05±1,05	21,91-0,81*	33,10-0,92	30,49-1,32
	CD8	24,25±0,91	15,28-0,67*	24,99-0,59	14,34-1,59*
NK-клетки	CD16	15,15±0,66	6,42-0,43*	18,61-0,69*	11,02-1,46
	CD56	15,10±0,73	7,97-0,86*	17,38-0,89	6,13-0,74*
В- лимфоциты	CD20	19,01±0,45	13,33-0,96*	29,83-0,54*	22,98-1,13
	CD72	17,28±0,78	5,68-0,55*	15,35-0,89	13,97-1,07*
Ранние активационные маркеры	CD23	19,97±1,25	19,23-1,15	24,14-1,02*	23,24-1,22*
	CD25	10,83±0,90	18,62-1,06*	18,84±0,91*	7,75±0,66*
	CD71	12,06±0,67	18,44-1,06*	15,45-0,73*	4,74-0,39*
Поздние активационные маркеры	HLA-DR	20,62±0,95	19,45±1,10	33,10±1,38*	39,39±1,41*
	CD95	14,27±1,24	16,75±1,08	14,24±1,02	22,50±1,07*

Примечание: p<0,05; достоверность различий указана по сравнению с больными. Под влиянием пептида V произошло достоверное снижение общего количества Т-лимфоцитов, количества Т-хелперов и Т-цитотоксических лимфоцитов у больных АБА и РА. Отмечалось снижение содержания В-лимфоцитов (CD20) и примированных В-клеток (CD72) у больных иммунопатологическими состояниями.

У больных РА (таблица 9) под действием пептида V произошло снижение соотношения CD25/CD95 и соотношения HLA-DR/CD95, в основном за счет значительного прироста числа CD95-позитивных лимфоцитов. Именно такое изменение соотношений характерно для преобладания процессов элиминации лимфоцитов [Казимирский А.Н., 2002]. У больных АБА, произошло увеличение численности CD25-позитивных лимфоцитов, что привело к увеличению соотношения CD25/CD95, а подобное явление характерно для преобладания процессов активации над процессами элиминации лимфоцитов.

Под влиянием пептида СЕА отмечено преимущественное снижение численности Т-цитотоксической субпопуляции у больных АБА. При этом количество CD3⁺ лимфоцитов превышало сумму CD3⁺ и CD4⁺, клеток в субпопуляциях при культивировании с пептидом V на 4,46% (р<0,02) и при культивировании с пептидом СЕА на 14,68% (р<0,0006).

Под действием пептида СЕА у больных АБА произошло снижение клеток с экспрессией ранних активационных маркеров и увеличение числа клеток, экспрессирующих поздние активационные маркеры. Вероятно, в этом случае может идти речь об элиминации лимфоцитов. Действие пептида СЕА на В-лимфоциты исследованных групп больных в отличалось. У больных АБА произошло снижение численности CD72⁺ (примированных В-лимфоцитов). У больных РА Пептид СЕА не оказал влияния на число CD20⁺ клеток. По действию на количество лимфоцитов с экспрессией активационных маркеров влияние пептида СЕА значительно отличалось в исследованных моделях. Так, у больных АБА произошло достоверное снижение, до нормальных показателей, количества лимфоцитов, экспрессирующих ранние активационные маркеры (CD25, CD71), при одновременном увеличении количества HLA-DR⁺, CD95⁺ клеток. У больных РА напротив, произошло увеличение клеток CD25⁺, CD71⁺ и HLA-DR⁺ лимфоцитов, количество CD95⁺ клеток не изменилось. Соотношение CD25/CD95 увеличилось у больных РА, то есть можно думать об увеличении активации в культуре лимфоцитов больных РА под действием пептида СЕА.

Таблица 9. Характеристика состава поверхностных маркеров лимфоцитов больных ревматоидным артритом после культивирования с пептидом V, пептидом Q и пептидом CEA.

количество лимфоцитов с экспрессией маркеров в %
	маркеры	РА до культивирования	Пептид V n=10	Пептид Q n=10	Пептид CEA n=10
Т- лимфоциты	CD3	54,68±1,15	39,23±2,22*	42,36±2,98*	51,91±2,44
	CD4	33,94±0,90	20,71-0,96*	24,93-1,61*	27,93-2,41
	CD8	26,78±1,57	14,13-1,59*	16,99-3,67*	25,17-2,35
NK-клетки	CD16	16,11±1,35	11,88-2,20	22,15-3,05*	16,47-2,12
	CD56	13,98±0,87	11,62-1,23	23,92-1,72*	20,30-2,49*
В- лимфоциты	CD20	17,11±0,82	13,19-0,76*	21,39-1,46*	18,88-2,16
	CD72	13,97±1,02	8,67-0,85*	23,54-2,22*	16,47-2,38
Ранние активационные маркеры	CD23	13,21±1,23	9,89-1,43*	20,74±1,73*	16,68±2,87
	CD25	10,91±0,86	12,32-2,16	11,50±1,65	27,20±2,50*
	CD71	14,44±0,92	15,27-2,12	10,57±2,21*	22,67±1,89*
Поздние активационные маркеры	HLA-DR	19,84±1,05	16,19-1,93	18,75±3,01	30,91±2,38*
	CD95	12,73±0,68	22,76-2,70*	12,06±1,38	13,22±2,03

Примечание: p<0,05; достоверность различий указана по сравнению с показателями больных.

При культивировании с пептидом Q было отмечено снижение общего количества Т-лимфоцитов у больных АБА; у больных РА произошло пропорциональное снижение общего количества Т-лимфоцитов, Т-хелперов, Т-цитотоксических лимфоцитов. Пептид Q, единственный из исследованных, повышал количество клеток с экспрессией CD23 у больных АБА и у больных РА. У больных АБА, также отмечалось увеличение количества клеток с экспрессией ранних активационных маркеров и позднего активационного маркера HLA-DR. У больных РА произошло снижение содержания CD71-позитивных клеток, но не отмечалось достоверных изменений количества лимфоцитов с экспрессией поздних активационных маркеров. У больных АБА вследствие, увеличения числа CD25-позитивных лимфоцитов увеличилось соотношение CD25/CD95, одновременно выросло соотношение HLA-DR/CD95 в результате повышения содержания HLA-DR⁺ лимфоцитов. Такое однонаправленное изменение указанных соотношений указывает на увеличение процессов активации и нарушение процессов элиминации лимфоцитов у аллергических больных под действием пептида Q. У больных РА изменений не отмечено.

Выводы

1. Под влиянием пептида АФП_14-20 в культурах лимфоцитов здоровых доноров, больных АБА и РА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺), NK-клеток (CD16⁺), B-лимфоцитов (CD20⁺); в культурах лимфоцитов больных АБА и РА также наблюдается снижение клеток с экспрессией активационных маркеров (CD25⁺, CD71⁺, HLA-DR⁺).

2. В культурах лимфоцитов всех исследованных групп под влиянием пептида E наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺), NK-клеток (CD16⁺), B-лимфоцитов (CD20⁺). В культуре лимфоцитов больных РА наблюдается снижение клеток с экспрессией ранних активационных маркеров (CD25⁺, CD71⁺); в культуре лимфоцитов больных АБА наблюдается снижение клеток с экспрессией как ранних, так и поздних активационных маркеров (CD25⁺, CD71⁺, CD95⁺, HLA-DR⁺).

3. Под влиянием пептида V в культуре лимфоцитов здоровых доноров наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺); в культуре лимфоцитов больных АБА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺), NK-клеток (CD16⁺), B-лимфоцитов (CD20⁺), повышение клеток с экспрессией ранних активационных маркеров (CD25⁺, CD71⁺); в культуре лимфоцитов больных РА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺), B-лимфоцитов (CD20⁺), повышение количества CD95⁺ лимфоцитов.

4. Под влиянием пептида Q в культуре лимфоцитов здоровых доноров наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺), NK-клеток (CD16⁺); в культуре лимфоцитов больных АБА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺), повышение количества клеток с экспрессией активационных маркеров (CD25⁺, CD71⁺, HLA-DR⁺); в культуре лимфоцитов больных РА наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺), CD71⁺ лимфоцитов.

5. Под влиянием пептида CEA в культуре лимфоцитов здоровых доноров наблюдается снижение содержания Т-лимфоцитов (CD3⁺, CD4⁺, CD8⁺), NK-клеток (CD16⁺), HLA-DR⁺ лимфоцитов; в культуре лимфоцитов больных АБА наблюдается снижение содержания (CD8⁺ CD25⁺, CD71⁺) лимфоцитов, повышение количества клеток с экспрессией поздних активационных маркеров (HLA-DR⁺, CD95⁺); в культуре лимфоцитов больных РА наблюдается повышение количества клеток с экспрессией активационных маркеров (CD25⁺, CD71⁺, HLA-DR⁺).

6. Пептиды V, E, CEA не влияют на развитие медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц морской свинки; пептид Q увеличивает медиатор-индуцированную контрактуру гладких мышц морской свинки к ацетилхолину и снижает к гистамину.

7. Пептид АФП_14-20 не влияет на развитие медиатор-индуцированной контрактуры гладких мышц морской свинки, однако усиливает развитие сенсибилизации морской свинки на яичный альбумин.

Практические рекомендации

Полученные иммунотропные свойства исследованных пептидов позволяют рекомендовать изучение синтетических аналогов БТК в научных лабораториях, в медицинских научно-исследовательских центрах в качестве потенциальных лекарственных препаратов.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. А.А.Терентьев, Г.В.Порядин, Ж.М.Салмаси, Ю.С.Татаринов. А.К.Тагирова, Н.Т.Молдогазиева, И.А.Александрова, Т.В.Макаров, З.В.Рябинина, Л.Ю.Семенова, А.Н.Казимирский. Пептиды трофобластического бета-глобулина модулируют экспрессию рецепторов активационного апоптоза лимфоцитов (Fas и Fas-L)// Материалы конференции «Медико-биологические науки для теоретической и клинической медицины, М., 2003, С. 91. 1

2. А.А.Терентьев, Ю.С.Татаринов, Г.В.Порядин, Ж.М.Салмаси, И.А.Александрова, Т.В.Макаров, З.В.Рябинина, А.Н.Казимирский. Регуляция мембранной экспрессии Fas (CD95) и FasL (CD95L) - рецепторов запуска активационного апоптоза пептидными модуляторами белков фетоплацентарного комплекса. // Белки - маркеры патологических состояний. Астрахань-Москва, 2003, С.35-44.

3. А.А.Терентьев, Г.В.Порядин, Ж.М.Салмаси, И.А.Александрова, Т.В.Макаров, А.Н.Казимирский. Модулирование экспрессии рецепторов активационного апоптоза лимфоцитов CD95 (Fas) и CD96L (FasL) с помощью различных пептидов из альфа-фетопротеина и трофобластического бета-глобулина человека. // Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины. Астрахань-Москва, 2004, С. 150-151.

4. А.Н.Казимирский, А.А.Терентьев, И.А.Александрова, А.К.Тагирова, Н.Т.Молдогазиева, Т.В.Макаров, З.В.Рябинина. Модулирование экспрессии активационных антигенов лимфоцитов у больных иммунопатологическими заболеваниями. // Медицинская иммунология, 2004, т. 6, № 3-5, С.231-232

5. A.N.Kazimirski, A.A.Terentiev, G.V.Porjadin, J.M.Salmasy, I.A.Alexandrova, T.V.Makarov. Modulation of expression of apoptosis activation lymphocytes antigens (Fas and Fas-L) with the help of various peptides from human trophoblastic beta-globulin (TBG, sP1, PSG). // Abstracts of the 32th Meeting of International Society for Oncodevelopmental ISOBM 2004, Helsinki, Finland, P-265. P. 108

6. Терентьев А.А., Порядин Г.В., Салмаси Ж.М., Александрова И.А., Тагирова А.К., Макаров Т.В., Рябинина З.В., Казимирский А.Н. Пептиды из трофобластического в-глобулина человека изменяют экспрессию рецептора CD95L (FASL) в лимфоцитах в зависимости от их функционального состояния // Медицинская иммунология, 2005, том7, №2-3, С. 124.

7. Salmasi J.M., Terentiev A.A., Makarov T.V. The influence of synthetic fragments of _AFP14-20 and peptides from a human's TBG on the superficial markers of healthy donor's lymphocytes. // JAPAIR, 2005,v.6,suppl.1, M-28.

8. Порядин Г.В., Салмаси Ж.М., Кузьменко Л.Г., Рябинина З.В., Ларькова И.А., Макаров Т.В.. Влияние антигенной стимуляции на поверхностные маркеры лимфоцитов при обострении атопической бронхиальной астмы и при проведении специфической иммунотерапии у детей.// Вестник РГМУ.-2005- №7.-С.42-46.

9. Порядин Г.В., Балаболкин И.И., Салмаси Ж.М., Рябинина З.В., Ларькова И.А., Макаров Т.В.. Изменение экспрессии маркера активации лимфоцитов CD23 у детей с атопической бронхиальной астмой зависит от эффективности антигенспецифической иммунотерапии. // Материалы конгресса XIII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». Москва 2006. С.-256.

10. Терентьев А.А., Казимирский А.Н., Салмаси Ж.М., Макаров Т.В., Рябинина З.В., Порядин Г.В. Синтетический пептид на основе АФП способен нормализовать активационные процессы в лимфоцитах больных ревматоидным артритом.// Материалы XVII Российского национального конгресса «Человек и лекарство», М., 2010, С125.

Список использованных в автореферате сокращений

БТК - белки трофобластического комплекса;

АБА - атопическая бронхиальная астма;

РА - ревматоидный артрит;

ИЛ - интерлейкин;

ЗФР - забуференный физиологический раствор;

ЯА -яичный альбумин.

Размещено на Allbest.ru

...