Анализ ассоциаций полиморфизма генов вазоактивных гормонов с формированием хронического гломерулонефрита

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Анализ ассоциаций полиморфизма генов вазоактивных гормонов с формированием хронического гломерулонефрита

03.02.07 - генетика

На правах рукописи

Литовкина Ольга Николаевна

Белгород - 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном автономном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Белгородский государственный национальный исследовательский университет»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Чурносов Михаил Иванович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, доцент Солодилова Мария Андреевна

доктор биологических наук, доцент Батлуцкая Ирина Витальевна

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Защита состоится 26 мая 2011 г. в 14.00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 212.015.13 при ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке ФГАОУ ВПО «Белгородский государственный национальный исследовательский университет» по адресу: 308015, г. Белгород, ул. Победы, д. 85.

Автореферат разослан «____»__________2011 г.

Ученый секретарь совета по защите докторских и кандидатских диссертаций, доктор биологических наук В.И. Кочкаров.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Среди болезней почек хронический гломерулонефрит (ХГН) является одним из самых серьезных заболеваний по своей медицинской и социальной значимости, из-за высокой распространенности и прогрессирующего течения, приводящего к развитию хронической почечной недостаточности, требующей проведения програмного гемодиализа или трансплантации почки (Корякова Н.Н. и др., 2006; Макарова Ю.А. и др., 2006; Мовчан Е.А, 2008). Хронический гломерулонефрит занимает доминирующее место в группе хронических болезней почек, ежегодно приводящих к смертности примерно 850000 человек и обуславливающих более 1,5 млн. случаев утраты трудоспособности (Смирнов А.В. и др., 2006). Прогрессирование хронического гломерулонефрита неуклонно ведёт к терминальной стадии хронической почечной недостаточности, а также к увеличению числа пациентов, получающих заместительную почечную терапию, что требует дополнительных экономических расходов на её проведение (Бадаева С.В. и др., 2006; Ткалич Л.М. и др., 2006; Rutkowski B. et al., 2006; Бикбов Б.Т. и др., 2007).

Хронический гломерулонефрит - это хроническое диффузное заболевание почек, развивающееся преимущественно на иммунной основе, характеризуется первичным поражением клубочкового аппарата с последующим вовлечением остальных структур почки и прогрессирующим течением, исходом которого являются нефросклероз и почечная недостаточность (Сметанникова Т.С. и др., 2006). Важное значение в развитии и прогрессировании ХГН отводится вазоактивным гормонам, активация которых происходит после запуска цепи иммуно-воспалительных реакций (Камышова Е.С. и др., 2005; Карабаева А.Ж. и др., 2006; Buraczynska М. et al., 2006). Вазоактивные гормоны регулируют почечную гемодинамику, пролиферацию мезангиальных клеток, а также процессы синтеза и деградации межклеточного матрикса, влияют на скорость развития гломерулосклероза (Шестаков А. Е., 2006).

Изучению генетических основ хронического гломерулонефрита посвящен ряд работ (Белянская Т.В. и др., 2005; Shu K.H. et al., 2005; Шестаков А. Е. и др., 2006; Buraczynska М. et al., 2006; Babel N. et al., 2006; Шишкин А.И. и др., 2007). В России такие исследования затрагивают лишь узкий набор локусов: интегральных мембранных белков (Шестаков А.Е., 2006), факторов некроза опухоли (Некипелова Е.В. и др., 2006), интерлейкинов (Петросян Э. К. и др., 2006а; Калмыкова Е.В., 2009). В некоторых исследованиях показаны ассоциации полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов с хроническим гломерулонефритом (Камышова Е.С. и др., 2005; Калиев Р.Р. и др., 2005; Buraczynska М. et al., 2006;. Шарнова Ж.П. и др., 2006б; Шарнова Ж.П. 2007). Следует отметить, что результаты исследований разных авторов не дают однозначного ответа о патогенетической роли отдельных полиморфизмов генов вазоактивных гормонов при хроническом гломерулонефрите. Это диктует необходимость проведения дальнейших исследований в данной области.

Работа выполнена в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (государственный контракт № 02.740.11.0496 «Генетические факторы мультифакториальных заболеваний человека»).

Цель исследования: Изучить полиморфизмы генов вазоактивных гормонов и оценить их патогенетическую значимость для хронического гломерулонефрита.

Задачи исследования:

1. Изучить распределение полиморфизмов десяти генов вазоактивных гормонов (I/D ACE, 4а/4b eNOS, S311C PON2, -6A/G AGT, -1166A/С ATIIR1, G/A GNB3 (rs2301339), G460W ADD1, +46G/A ADRB2, K198N ET-1, +6986G/A CYP3A5) у больных хроническим гломерулонефритом и в популяционном контроле.

2. Исследовать влияние генетических полиморфизмов на форми-рование хронического гломерулонефрита.

3. Рассмотреть ассоциации генов-кандидатов с качественными и количественными патогенетически значимыми признаками хронического гломерулонефрита.

4. Проанализировать генетические и средовые факторы почечной выживаемости.

5. Выявить молекулярно-генетические маркеры ускоренного прогрессирования хронического гломерулонефрита.

Научная новизна. Впервые комплексно изучен полиморфизм генов вазоактивных гормонов - ангиотензин-превращающего фермента (I/D ACE), эндотелиальной синтазы окиси азота (4а/4b eNOS), параоксоназы-2 (S311C PON2), ангиотензиногена (-6A/G AGT), рецептора ангиотензина-II первого типа (-1166A/С ATIIR1), ?3-субъединицы гуанин связывающего белка (G/A GNB3 rs2301339), ?-аддуцина (G460W ADD1), ?2-адренорецептора (+46G/A ADRB2), эндотелина-1 (K198N ET-1), цитохрома 3A5 (+6986G/A CYP3A5) у больных хроническим гломерулонефритом русской национальности, являющихся уроженцами Центрального Черноземья РФ.

Выявлены ассоциации полиморфных генетических маркеров с особенностями дебюта хронического гломерулонефрита. Установлены взаимосвязи генов вазоактивных гормонов с клинически значимыми качественными и количественными признаками при обострении хронического гломерулонефрита. Показано значимое влияние генетических полиморфизмов вазоактивных гормонов на почечную выживаемость и характер прогрессирования ХГН.

Научно-практическое значение. Результаты работы вносят вклад в расшифровку генетических механизмов развития и прогрессирования хронического гломерулонефрита, формирование представлений о молекулярно-генетических основах заболевания.

Выделены генетические факторы риска развития неблагоприятных качественных и количественных клинически значимых признаков ХГН. Определены генетические маркеры раннего развития хронической почечной недостаточности. Установлены прогностические значимые факторы, снижающие почечную выживаемость - аллели 311S PON2, -1166C ATIIR1 и наличие артериальной гипертонии. Проведение молекулярно-генетического тестирования больных ХГН позволит формировать группы риска неблагоприятного течения заболевания и уже в этих группах пациентов более эффективно проводить лечебно-профилактические мероприятия.

Положения, выносимые на защиту:

1. Полиморфные варианты генов вазоактивных гормонов взаимосвя-заны с клиническими особенностями дебюта хронического гломерулонефрита.

2. Молекулярно-генетические маркеры ассоциированы с клинически значимыми качественными и количественными признаками при обострении ХГН.

3.Факторами риска развития хронической почечной недостаточности служат генетические полиморфизмы +6986G/A CYP3A5 и S311C PON2.

4. Генетическими факторами ускоренного падения функции почек являются 311SC и 311SS PON2, -1166AC и -1166CC ATIIR1, +46AA ADRB2, 198KK и 198KN ET-1.

Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: X Международном конгрессе «Здоровье и образование в XXI веке» «Инновационные технологии в биологии и медицине» (Москва, 2009), Съезде кардиологов и терапевтов ЦФО России «Традиции, современность, будущее» (Тверь, 2009), 43-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых учёных «Актуальные проблемы теоретической, эспериментальной, клинической медицины и фармации» (Тюмень, 2009), Всероссийском школе-семинаре для студентов, аспирантов и молодых учёных «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2009), Межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные вопросы диагностики и лечения заболеваний внутренних органов» (Белгород, 2009), V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров, посвящённом 200-летию со дня рождения Ч. Дарвина (Москва, 2009), 63-й итоговой научной конференции молодых учёных с международным участием (Ростов-на-Дону, 2009), 64-й Всероссийской научно-практической конференции молодых учёных и студентов с международным участием «Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения» (Екатеринбург, 2009), IX Всероссийской университетской научно-практической конференции молодых учёных по медицине (Тула, 2010), Международной научно-практической конференции «Актуальные вопросы полиморбидной патологии в клинике внутренних болезней» (Белгород, 2010), V Международной (XIV Всероссийской) Пироговской научной медицинской конференции (Москва, 2010), третьей международной научно-практической конференции «Геронтологические чтения - 2010» (Белгород, 2010), VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов-на-Дону, 2010).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 4 в журналах из списка ВАК.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, включает в себя 20 таблиц, 28 рисунков. Состоит из введения, 4 глав, заключения и выводов. Библиографический список включает 231 источник, из них 113 отечественных и 118 иностранных.

гломерулонефрит почечный выживаемость генетический

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Материал исследования. Анализ полиморфизмов генов вазоактивных гормонов проводили на материале двух выборок: 238 больных хроническим гломерулонефритом (127 мужчин и 111 женщин) и 304 человека популяционного контроля (164 мужчины и 140 женщин) в возрасте от 15 до 79 лет (p>0,05).

В выборки больных и популяционного контроля включались индивидуумы русской национальности, являющиеся уроженцами Центрального Черноземья и не имеющие родства между собой. Пациенты включались в группу больных только после установления диагноза заболевания, подтвержденного с помощью клинических и лабораторно-инструментальных методов обследования. Клиническое обследование и диагностика проводились сотрудниками отделения нефрологии Белгородской областной клинической больницы (заведующая отделением - к.м.н. Некипелова Е.В.).

Всем больным ХГН и индивидуумам популяционного контроля проводилось типирование десяти генов вазоактивных гормонов: ангиотензин-превращающего фермента (I/D ACE), эндотелиальной синтазы окиси азота (4а/4b eNOS), параоксоназы-2 (S311C PON2), ангиотензиногена (-6A/G AGT), рецептора ангиотензина-II первого типа (-1166A/С ATIIR1),
?3-субъединицы гуанин связывающего белка (G/A GNB3 rs2301339),
?-аддуцина (G460W ADD1), ?2-адренорецептора (+46G/A ADRB2), эндотелина-1 (K198N ET-1), цитохрома 3A5 (+6986G/A CYP3A5). Выбор данных генетических полиморфизмов для исследования обусловлен их патогенетической значимостью для хронического гломерулонефрита и способностью изучаемых полиморфизмов изменять продукцию соответствующих вазоактивных гормонов.

Методы исследования. Молекулярно-генетические методы.

ДНК выделяли из периферической крови методом фенольно-хлороформной экстракции (Mathew C.C, 1984).

Анализ всех локусов осуществлялся методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) синтеза ДНК. ПЦР проводилась на амплификаторах «Терцик-МС4» производства компании “ДНК-технология” и Bio-Rad IQ5 (Multicolor Real-Time PCR Detection System) с использованием ДНК-полимеразы Thermus aquaticus производства фирмы “Силекс-М” и олигонуклеотидных праймеров и зондов (для детекции методом Tag Man), синтезированных фирмой «Синтол».

Генотипирование ДНК-маркеров производилось следующими методами: анализ полиморфизма длин амплифицируемых фрагментов (ПДАФ) (Alu полиморфизм ACE , VNTR eNOS)); анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) (локусы S311C PON2, -6A/G AGT, -1166A/C ATIIR1) продуктов ПЦР-амплификации специфических участков генома с использованием соответствующих ферментов рестрикции производства ООО «Сибэнзим» (Новосибирск); анализ дискриминации аллелей методом Tag Man зондов (локусы K198N ET-1, +6986G/A CYP3A5, G/A GNB3 (rs2301339), G460W ADD1, +46G/A ADRB2).

Статистические методы. Формирование базы данных и статистические расчеты осуществлялись с использованием программы «STATISTICA 6.0». Определение фенотипических и генных частот проводили стандартными методами (Животовский Л.А, 1983). Для оценки соответствия наблюдаемого распределения генотипов ожидаемому, исходя из равновесия Харди-Вайнберга, использован критерий 2 (Вейр Б., 1995).

Ассоциации аллелей и генотипов изученных ДНК-маркеров с предрасположенностью к хроническому гломерулонефриту, а также с качественными признаками, характеризующими его клинические особенности, оценивали с помощью анализа таблиц сопряженности 2х2 с расчетом критерия 2 с поправкой Йетса на непрерывность и отношения шансов (OR) с 95% доверительными интервалами (CI) (Schlesselman J., 1982). При проведении множественных сравнений с целью минимизации ошибок 1-го рода, связанных с получением ложноположительных результатов, использовали поправку Бонферрони (Реброва О.Ю., 2006).

При изучении взаимосвязей генетических полиморфизмов с количественными признаками, имеющими важное патогенетическое значение при ХГН, вначале оценивали характер распределения исследуемых признаков с использованием критерия Шапиро-Уилка (Реброва О.Ю., 2006). Получено, что распределение всех исследуемых количественных признаков (уровень систолического и диастолического артериального давления, возраст манифестации заболевания, уровень креатинина, гематурии, протеинурии, скорость клубочковой фильтрации) не соответствовало закону нормального распределения, и поэтому для их описания использовали медиану (Me), интерквартильный размах (Q25-Q75), а для сравнительного анализа - критерий Манна-Уитни (Реброва О.Ю., 2006).

Анализ ассоциаций почечной выживаемости с полиморфными генетическими маркерами проведен методом множительных оценок Каплан-Майера (Камышева E.С. и др., 2003). Влияние генетических и средовых факторов на почечную выживаемость изучали с применением регрессионной модели Кокса (Бикбов Б.Т., 2004).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Исследование взаимосвязей генетических полиморфизмов вазоактивных гормонов с качественными и количественными патогенетически значимыми для хронического гломерулонефрита признаками

Проведённый популяционно-генетический анализ показал, что практически для всех изученных локусов в группе больных ХГН и в популяционной выборке эмпирическое распределение генотипов соответствует теоретически ожидаемому при равновесии Харди-Вайнберга (p>0,05). Уровень аллельного разнообразия по изученным локусам варьировал от Н0=0,15 (для локуса +6986G/A CYP3A5) до Н0=0,53 (для локуса I/D ACE) среди больных ХГН и от Н0=0,11 (+6986G/A CYP3A5) до Н0=0,50 (+46G/A ADRB2) в популяционной выборке.

При сравнительном анализе распределения частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов в контрольной группе и среди больных ХГН статистически достоверных различий выявлено не было (табл.). Это согласуется с литературными данными, свидетельствующими о том, что гены вазоактивных гормонов не являются этиологическими факторами ХГН, но играют определенную роль в патогенезе хронического гломерулонефрита (Lovati E. et al., 2001; Stratta P. et al., 2004; Камышова Е.С. и др., 2005; Buraczynska М. et al., 2006). На следующем этапе работы проводилось исследование взаимосвязей полиморфных маркеров вазоактивных гормонов с патогенетически значимыми признаками хронического гломерулонефрита.

Из полученных результатов следует, что для девяти из десяти рассмотренных генетических полиморфизмов вазоактивных гормонов (4а/4b eNOS, S311C PON2, -6A/G AGT, -1166A/С ATIIR1, G/A GNB3 (rs2301339), G460W ADD1, +46G/A ADRB2, K198N ET-1, +6986G/A CYP3A5) нами выявлены значимые ассоциации с различными клинически значимыми качественными и количественными признаками хронического гломерулонефрита, характером прогрессирования заболевания.

При изучении распределения полиморфных генетических маркеров среди больных ХГН с сохранной и сниженной функцией почек в дебюте заболевания, а также в контрольной группе выявлены статистически достоверные различия в частотах генотипов и аллелей по локусу S311C параоксоназы-2. Установлено, что среди больных ХГН со сниженной функцией почек, концентрация генотипа 311SS составила 72,72% и была наибольшей по сравнению как с контролем, где данный показатель составил 50,66% (?2=8,27, p=0,005, с учётом поправки Бонферрони pcor =0,015, OR=2,60, 95%Cl 1,32-5,15), так и с пациентами с ХГН с сохранной функцией почек (52,83%, ?2=5,16, p=0,02, pcor = 0,06). Выявлена высокая частота аллеля 311S в группе больных со сниженной функцией почек (84,55%) по сравнению как с группой пациентов с сохранной функцией почек (72,17%, ?2=5,48, p=0,02) так и с контролем (71,88%, ?2=7,10, p=0,009, OR=2,14, 95%Cl 1,20-3,84) (рис. 1).

Таблица Сравнительный анализ частот аллелей и генотипов полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов у больных ХГН и в контрольной группе

Механизм данных ассоциаций может быть связан со снижением антиоксидантных эффектов параоксоназы-2, приводящих к окислительному стрессу и склерозированию почечной ткани, а соответственно, и к снижению почечной функции у пациентов с маркерами 311S PON2 и 311SS PON2 (Sawant J. et al., 2010).

Рис. 1. Распределение аллеля 311S PON2 в группах больных ХГН с сохранной и сниженной функцией почек в дебюте заболевания и в контроле

Получены достоверные различия в концентрациях генотипов среди больных ХГН с сохранной и сниженной функцией почек по локусу
-1166A/C ATIIR1: у больных со сниженной функцией почек частота генотипа -1166AC равнялась 28,85%, что значительно ниже (в 1,7 раз) по сравнению с концентрацией данного генотипа среди пациентов с сохранной функцией почек (50,47%, ?2=5,81, p=0,017, pcor=0,05). Согласно литературным данным (Wang X. et al., 2006; Sethupathy P. et al., 2007) полиморфизм, связанный с заменой аденина на цитозин в позиции 1666 локуса ATIIR1, связан с усиление экспрессии гена, что может приводить к повышенному образованию ангиотензина-II. В почках при этом усиливаются процессы гипертрофии и пролиферации мезангиальных, интерстициальных и других клеток паренхимы, повышается синтез различных компонентов внеклеточного матрикса, развивается гипофильтрация (Шестакова М. В., 1998; Мареев В. Ю., 2000). Это может обуславливать повышение уровня креатинина и мочевины в сыворотке крови и развитие симптомов почечной недостаточности.

Анализ распределения полиморфизмов генов вазоактивных гормонов у больных ХГН в зависимости от клинических синдромов дебюта выявил достоверные различия в концентрации генотипов по локусам -6A/G AGT и G460W ADD1 в сравнении с популяционным контролем. Получено, что у больных ХГН, имеющих остронефритический синдром при возникновении заболевания, концентрация генотипа -6АG AGT составила 67,24%, что значительно превысило частоту данного генотипа как в контроле (43,89%, ?2=9,72, р=0,003, pcor=0,009, OR=2,62, 95%Cl 1,40-4,96), так и среди больных ХГН с другими синдромами (43,4-47,5%). Наряду с этим выявлена ассоциация аллеля 460W гена ADD1 с мочевым синдромом при формировании ХГН: частота данного аллеля у больных с мочевым синдромом равнялась 23,58%, что достоверно выше чем в группе контроля - 15,13% (?2=4,11, р=0,04, OR=1,73, 95%Cl 1,02-2,93).

Далее нами были рассмотрены взаимосвязи генетических полиморфизмов с количественными патогенетически значимыми признаками ХГН (уровнень систолического (САД) и диастолического (ДАД) давления, возраст манифестации заболевания, уровень креатинина, гематурии, протеинурии и скорость клубочковой фильтрации).

Полиморфный генетический маркер 4a/4b гена эндотелиальной синтазы окиси азота ассоциирован с уровнем протеинурии у больных ХГН при обострении заболевания (рис. 2). У пациентов с генотипами 4a4a и 4a4b по данному локусу наблюдается более высокий уровень протеинурии (медиана 2,80 г/сут, интерквартильный размах 0,95-4,00 г/сут) по сравнению с больными с генотипом 4b4b (медиана 1,18 г/сут, нижний квартиль 0,50 г/сут, верхний квартиль 2,10 г/сут, p=0,009).

Рис. 2. Ассоциации полиморфизма 4a/4b eNOS с уровнем протеинурии у больных ХГН при обострении заболевания

Литературные материалы свидетельствуют о снижении концентрации и активности эндотелиальной синтазы окиси азота у лиц c генотипами 4a4a, 4a4b по сравнению с гомозиготами 4b4b eNOS (Song J. et al., 2003; Dosenko V.E. et al., 2006). Снижение продукции эндотелиальной синтазы окиси азота может приводить к нарушению перфузии тканей почки, повышению фильтрации белка через клубочковый капиллярный фильтр, снижению канальцевой реабсорбции профильтрованных белков, что и обуславливает в конечном итоге повышенный уровень протеинурии (Шейман Д.А., 1999; Нефрология, 2000).

Обнаружены взаимосвязи генетических вариантов локуса G/A
?3-субъединицы гуанин связывающего белка (rs2301339) с уровнем гематурии: у больных с генотипом AA медиана уровня гематурии составила 11,00 ед (интерквартильный размах 3,0-25,0 ед), что достоверно выше данного показателя в группе пациентов с генотипами GG и GA по данному полиморфизму (медиана - 5,0 ед, интерквартильный размах
5,0-12,0 ед, p=0,026).

Выявлено плейотропное действие генетического полиморфизма S311C PON2 на формирование патогенетически значимых признаков хронического гломерулонефрита (уровень протеинурии и креатинина у больных ХГН при обострении заболевания) (рис. 3). Пациенты с генотипами 311SC и 311CC отличаются меньшими уровнями протеинурии (медиана 0,90 г/сут, интерквартильный размах 0,45-3,15 г/сут) и креатинина (медиана 100,00 мкМоль/л, нижний квартиль 74,00 мкМоль/л, верхний квартиль 120,00 мкМоль/л) по сравнению с больными, которые имеют генотип 311SS (медиана 2,00 г/сут, интерквартильный размах 0,90-3,40 г/сут, p=0,047 и медиана 102,00 мкМоль/л, интерквартильный размах 97,20-269,00 мкМоль/л, p=0,044 соответственно).

Рис. 3. Ассоциации полиморфизма S311C PON2 с уровнем креатинина у больных ХГН при обострении заболевания

Изучение взаимосвязей полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов со скоростью прогрессирования ХГН

Ассоциации полиморфных маркеров генов вазоактивных гормонов c прогрессированием ХГН исследованы у 138 больных ХГН. Из них у 34 пациентов в качестве конечной точки наблюдения рассматривалось удвоение исходного уровня креатинина (наличие ХПН). В этой группе изучали влияние различных факторов на скорость прогрессирования почечной недостаточности.

Установлено, что среди больных с удвоением креатинина концентрация генотипа +6986GA CYP3A5 (27,27%) была более чем в 2,5 раза выше, чем в популяционном контроле (10,53%, ?2=6,32, р=0,013, рcor=0,039, OR = 3,19, 95%Cl 1,25 - 7,99). Аналогичной направленности результаты получены и по распределению аллелей локуса +6986G/A CYP3A5 (рис. 4). Выявлена более высокая частота аллеля +6986A (в 2 раза) в группе пациентов с удвоенным креатинином (13,64%) по сравнению с контрольной группой (5,92%, ?2=4,52, р=0,034, OR=2,51, 95%Cl 1,06-5,76). Согласно литературным данным (Givens R.C. et al., 2003), при генетическом полиморфизме +6986G/A CYP3A5, именно аллель +6986A определяет более высокий уровень продукции цитохрома 3A5. При этом у индивидуумов с повышенной продукцией CYP3A5 можно ожидать и более выраженные его медико-биологические эффекты, одними из которых являются усиление реабсорбции натрия, сужение почечных канальцев (Givens R.C. et al., 2003; Ho H. et al., 2005) и как результат этого гемодинамические нарушения, ведущие к снижению депурационной функции почек (Мосина Н.В. и др., 2004) и развитию хронической почечной недостаточности.

Рис. 4. Распределение аллеля +6986A CYP3A5 в группах больных ХГН в зависимости от уровня креатинина и в контроле

Достоверные различия в концентрациях аллелей между больными ХГН с удвоением креатинина и контролем были установлены и по локусу S311C параоксоназы-2. Частота аллеля 311S PON2 соcтавила 83,82% среди пациентов с удвоением креатинина, что выше, чем в контрольной группе (71,88%, ?2=3,85, р=0,05, OR=2,03, 95%Cl 1,01-4,20).

При оценке почечной выживаемости у больных ХГН в зависимости от генетических полиморфизмов вазоактивных гормонов, проведённой с использованием метода множительных оценок Каплан-Майера (Боровиков В., 2003), найдены статистически значимые взаимосвязи со скоростью прогрессирования заболевания по четырём из десяти рассматриваемых генетических маркеров: это генетические полиморфизмы S311C PON2,
-1166A/C ATIIR1, +46G/A ADRB2, K198N ET-1. Нами установлено, что с ускоренным падением функции почек ассоциированы следующие молекулярно-генетические маркеры: 311SC и 311SS PON2 (p=0,05) (рис. 5),
-1166AC и -1166CC ATIIR1 (p=0,008), +46AA ADRB2 (p=0,05), 198KK и 198KN ET-1 (p=0,05). Следует отметить, что в работе Buraczynska M. и соавт. (2006) также установлено, что у пациентов, имеющих генотипы
-1166AС и -1166СС, среднее время развития ХГН до ТХПН было значительно меньше, чем у лиц с генотипом -1166АА ATIIR1. Шарнова Ж.П. и соавт. (2006) выявили, что генотип -1166АС гена ATIIR1 является предрасполагающим фактором к развитию хронической почечной недостаточности в исходе нефротического синдрома у детей.

Рис. 5. Почечная выживаемость у больных ХГН в зависимости от генотипов полиморфного маркера S311C PON2

С целью установления факторов, обладающих неблагоприятным прогностическим значением для ХГН был проведен монофакторный анализ почечной выживаемости с использованием регрессионной модели Кокса. Установлено, что наличие аллеля 311S PON2 (р=0,01), аллеля
-1166C ATIIR1 (р=0,05) и артериальной гипертензии на протяжении ХГН (р=0,01) ухудшают почечную выживаемость.

Предполагая, что возможна взаимосвязь факторов, влияющих на почечную выживаемость, был проведен многофакторный регрессионный анализ, который показал аналогичные данным монофакторного анализа результаты: неблагоприятными прогностическими факторами являются носительство аллеля 311S гена параоксоназы-2 (р=0,002), наличие аллеля
-1166C гена рецептора ангиотензина-II первого типа (р=0,01), наличие артериальной гипертензии в течении ХГН (p=0,02).

ВЫВОДЫ

1. Генетические полиморфизмы вазоактивных гормонов (S311C PON2, -6A/G AGT, -1166A/С ATIIR1, G460W ADD1, +46G/A ADRB2, 4a/4b eNOS, +6986G/A CYP3A5 , K198N ET-1, G/A GNB3 rs2301339) ассоциированы с характером течения и прогрессирования хронического гломерулонефрита.

2. Молекулярно-генетический маркер S311C PON2 оказывает плейотропное действие на формирование патогенетически значимых признаков хронического гломерулонефрита.

3. Полиморфные варианты -1166A/C ATIIR1 и S311C PON2 связаны со снижением функции почек в дебюте хронического гломерулонефрита, а маркеры -6AG AGT и 460W ADD1 - с особенностями клинических синдромов при возникновении заболевания. Повышенный уровень протеинурии ассоциирован с маркерами 4a4a и 4a4b eNOS, высокий уровень гематурии - с AA GNB3.

4. Генетическими факторами риска формирования хронической почечной недостаточности являются +6986A CYP3A5 (OR=2,51), +6986GA CYP3A5 (OR=3,19) и 311S PON2 (OR=2,03).

5. Ускоренное падение функции почек при хроническом гломерулонефрите ассоциировано с полиморфизмами S311C PON2, +46G/A ADRB2, -1166A/C ATIIR1 и K198N ET-1. Сочетание аллелей 311S PON2, -1166C ATIIR1 и наличие артериальной гипертензии ухудшают почечную выживаемость.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Литовкина, О. Н. Популяционно-генетический анализ полиморфных маркеров eNOS, ACE и REN среди населения юга Центральной России / О. Н. Литовкина, М. И. Чурносов // Актуальные вопросы современной медицинской науки и здравоохранения : материалы 64-й всерос. науч.-практ. конф. молодых учёных и студентов с междунар. участием, Екатеринбург, 28-29 апр. 2009 г. / УГМА ; ред. колл. С. М. Кутепов (и др.). - Екатеринбург, 2009. - С. 573-574.

2. Изучение роли полиморфизма гена ангиотензин-превращающего фермента в формировании хронического гломерулонефрита / О. Н. Литовкина, Е. В. Некипелова, М. И. Чурносов (и др.) // V съезд вавиловского общества генетиков и селекционеров, Москва, 21-28 июня 2009 г. : материалы : в 2 ч. / РАН, Ин-т общ. генетики, Моск. гос. ун-т, Вавилов. о-во генетиков и селекционеров. - М., 2009. - Ч. 1. - С. 451.

3. Литовкина, О. Н. Молекулярно-генетические маркеры и особенности дебюта хронического гломерулонефрита / О. Н. Литовкина, Е. В. Некипелова, М. И. Чурносов // Актуальные проблемы теоретической, экспериментальной, клинической медицины и фармации : материалы 43-й всерос. науч. конф. с междунар. участием студентов и молодых учёных, Тюмень, 22-23 апр. 2009 г. / Тюмен. гос. мед. акад. М-ва здравоохранения и соц. развития. - Тюмень, 2009. - С. 96.

4. Литовкина, О. Н. Анализ ассоциаций полиморфных генетических маркеров с клиническим течением хронического гломерулонефрита / О. Н. Литовкина, Е. В. Некипелова, М. И. Чурносов // 63-я Итоговая научная конференция молодых ученых Ростовского государственного медицинского университета с международным участием, посвященная 70-летию СНО (МНО) : аннот. докл. и материалов Дня науки, Ростов-на-Дону, 24 апр. 2009 г. / ГОУ ВПО РостГМУ Росздрава ; отв. ред. И. С. Дерижанова. - Ростов н/Д, 2009. - С. 81.

5. О взаимосвязях генетического полиморфизма гена ангиотензин-превращающего фермента с развитием гипертонии при хроническом гломерулонефрите / О. Н. Литовкина, Е. В. Некипелова, М. И. Чурносов (и др.) // Традиции, современность, будущее : инновационные подходы в диагностике, лечении и профилактике сердечно-сосудистых заболеваний : материалы Съезда кардиологов и терапевтов ЦФО России, Тверь, 3 апр. 2009 г. / Всерос. науч. о-во кардиологов (и др.) ; (под ред. Е. С. Мазура). - Тверь, 2009. - С. 65-66.

6. Литовкина, О. Н. Анализ полиморфизма генов PON2, ADD1, GNB3 у больных хроническим гломерулонефритом / О. Н. Литовкина, М. И. Чурносов // Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы : сб. тез. всерос. шк.-семинара для студентов, аспирантов и молодых учёных, Белгород, 14-17 окт. 2009 г. / Белгор. гос. ун-т. - Белгород, 2009. - С. 27-29.

7. Литовкина, О. Н. Полиморфизм гена рецептора ангиотензина-II первого типа при хроническом гломерулонефрите / О. Н. Литовкина, Е. В. Некипелова, М. И. Чурносов // Актуальные вопросы диагностики и лечения заболеваний внутренних органов : материалы межрегион. науч.-практ. конф., Белгород, 17 дек. 2009 г. / Каф. внутр. болезней № 2 БелГУ, Упр. здравоохранения администрации г. Белгорода (и др.) ; под ред. О. А. Ефремовой. - Белгород, 2009. - С. 36-37.

8. Гены сосудистых реакций и формирование артериальной гипертонии при хроническом гломерулонефрите / О. Н. Литовкина, Е. В. Некипелова, К. И. Прощаев (и др.) // Вестник РУДН. Сер. Медицина. - 2009. - № 4. - С. 633-634. (из списка ВАК)

9. Литовкина, О. Н. Изучение VNTR полиморфизма гена эндотелиальной синтазы окиси азота у больных хроническим гломерулонефритом / О. Н. Литовкина // Вестник новых медицинских технологий. - 2010. - Т. 17, № 2, прил. - С. 82-83. - (XI Всерос. унив. науч.-практ. конф. молодых учёных по медицине : сб. материалов).

10. Литовкина, О. Н. Анализ молекулярно-генетических маркеров «сосудистых реакций» при хроническом гломерулонефрите / О. Н. Литовкина // Материалы IV международной научной конференции молодых учёных-медиков, Курск, 25-26 февр. 2010 г. : 3 т. / Курск. гос. мед. ун-т, Воронеж. гос. мед. акад. (и др.) ; под ред. В. А. Лазаренко. - Курск, 2010. - Т. 2. - С. 206-208.

11. Изучение скорости прогрессирования хронического гломерулонефрита в зависимости от генетических полиморфизмов генов ADD1 и ATIIR1 / Е. В. Некипелова, О. Н. Литовкина, К. И. Прощаев (и др.) // Медицинская генетика. - 2010. - Спец. вып. - С. 126. - (Материалы VI Съезда Рос. о-ва мед. генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г.).

12. Анализ генов-кандидатов хронического гломерулонефрита / О. Н. Литовкина, Е. В. Некипелова, К. И. Прощаев (и др.) // Медицинская генетика. - 2010. - Спец. вып. - С. 104. - (Материалы VI Съезда Рос. о-ва мед. генетиков, Ростов-на-Дону, 14-18 мая 2010 г.).

13. Литовкина, О. Н. Молекулярно-генетические маркеры протеинурии при хроническом гломерулонефрите / О. Н. Литовкина, Е. В. Некипелова, М. И. Чурносов // Актуальные вопросы полиморбидной патологии в клинике внутренних болезней : материалы междунар. науч.-практ. конф., Белгород, 20 мая 2010 г. / БелГУ, Департамент здравоохранения и соц. защиты населения по Белгор. обл. ; под ред. О. А. Ефремовой. - Белгород, 2010. - С. 42-43.

14. Калмыкова, Е. В. Генетическое разнообразие локуса эндотелина-1 у больных хроническим гломерулонефритом / Е. В. Калмыкова, О. Н. Литовкина // Вестник РГМУ. - 2010. - Спец. вып., № 2. - С. 496. (из списка ВАК)

15. Литовкина, О. Н. Взаимосвязь полиморфизмов генов вазоактивных гормонов с особенностями дебюта хронического гломерулонефрита / О. Н. Литовкина, Е. В. Некипелова, М. И. Чурносов // Геронтологический журнал им. В. Ф. Купревича. - 2010. - № 2. - С. 45. - (Геронтологические чтения - 2010 : материалы III междунар. науч.-практ. конф., Белгород, 11-12 нояб. 2010 г.).

16. Литовкина, О. Н. К вопросу о распределении полиморфного маркера GNB3 у больных хроническим гломерулонефритом / О. Н. Литовкина // Медицинский академический журнал. - 2010. - Т. 10, № 5. - С. 125. (из списка ВАК)

17. Изучение популяционно-генетических характеристик генов вазоактивных гормонов среди больных хроническим гломерулонефритом / О. Н. Литовкина, Е. В. Некипелова, Е. Н. Крикун (и др.) // Научные ведомости БелГУ. Серия Медицина. Фармация. - 2011. - № 4 (99), вып. 13. - С. 146-152. (из списка ВАК)

Размещено на Allbest.ur