Иммуномодулирующие свойства Гликоразмулина и его исходных компонентов

Размещено на http://www.allbest.ru/

ИММУНОМОДУЛИРУЮЩИЕ СВОЙСТВА

ГЛИКОРАЗМУЛИНА И ЕГО ИСХОДНЫХ КОМПОНЕНТОВ

14.00.36 - Аллергология и иммунология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

НИГМАНОВ ФАРХОД ТОМОВИЧ

Ташкент - 2010

Работа выполнена в Институте иммунологии АН РУз

Научный руководитель:	доктор медицинских наук, профессор Арипова Тамара Уктамовна
Официальные оппоненты:	доктор медицинских наук, профессор УРАЗМЕТОВА Маиса Дмитриевна
	доктор биологических наук, профессор МАХМУДОВ Эркин Сирожиддинович
Ведущая организация:	Ташкентская Медицинская Академия

Защита состоится «_____»____________2010 г в______час. на заседании Специализированного совета Д 015.89.01 при Институте иммунологии АН РУз по адресу: 100060, г. Ташкент, ул. Я. Гулямова, 74.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института иммунологии АН РУз.

Автореферат разослан «____»_____________________2010 года.

Ученый секретарь

Специализированного Совета

доктор медицинских наук УМАРОВА А.А.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Иммунная система является одной из центральных структур, обеспечивающая целостность организма при контакте с чужеродными биологически агрессивными факторами. Одной из центральных функций иммунной системы является элиминация мутирующих (раковых) клеток, т.е. сохранение внутреннего гомеостаза организма.

При нарушениях работы иммунной системы вследствие различных заболеваний, стрессах, воздействии на организм неблагоприятных климатических, экологических, физических, химических и других факторов формируются вторичные иммунодефицитные состояния (ИДС) (Агафонова И.П., 2004).

В настоящее время для восстановления нарушений в иммунной системе при иммунопатологических состояниях применяются вещества различной химической структуры и происхождения. Одним из важных источников биологически активных веществ являются разные виды растений.

Известно, что растения являются источником самых разнообразных биологически активных веществ, которые широко применяются в практической медицине при лечении заболеваний различной этиологии (Blumenthal M et al., 2000). Из растений выделены вещества, относящиеся к различным группам химических соединений, обладающие широким спектром биологических эффектов. Так, в частности, из разных видов растений выделены фитоэкдистероиды (Bathori M., 2002; Stolsrov J. et al., 2001; Sano M. et al., 2003; Shi J. et al., 2003) и флавоноиды различных групп (Zhou J.-R. et al., 1998; Constantioni F.I. et al., 2001; Nijveldt R. et al., 2001). Эти группы соединений обладают выраженной активностью на различные процессы жизнедеятельности организма и их эффект проявляются на разных системах макроорганизма.

Установлено, что растения содержат полифенолы, оказывающие положительный терапевтический эффект при лечении атеросклероза и ишемической болезни у людей (Dubick M. et al., 2001).

Таким образом, видно, что вещества растительной природы являются источником целого ряда биологически активных веществ с различными точками приложения в организме.

Степень изученности проблемы. Известно, что мумиё, обладает многими биологическими эффектами и широко применяется в практической медицине в качестве средства, ускоряющего регенеративные процессы при переломах, неврологических патологиях, язвенных процессах, ожогах и т.д. (Агасаров Л. с соавт., 1993; Ахмедов Н.К. с соавт., 1979; Маджидов Н.М. с соавт., 1980; Дмитриев М.Т., 1991; Назарова З.А. с соавт., 1997). Однако механизм его влияния на иммунную систему в нормальных физиологических условиях и при вторичных иммунодефицитах до настоящего времени недостаточно изучен.

Радиола Семенова используется в качестве средства повышающего работоспособность организма (Краснов Е.А. с соавт., 1975), обладает противораковым эффектом (Боровская Т.Г. с соавт., 1988), влияет на сердечно-сосудистую и центральную нервную систему (Садритдинов Б.С. с соавт., 1983).

На основе мумиё и Радиолы Семенова разработан препарат Гликоразмулин, обладающий гипогликемическим эффектом (Рахматуллаева М.М. с соавт., 2006-2007).

Одним из направлений в современной фармакологии является разработка полифункциональных препаратов, способных одновременно воздействовать на разные системы или функции организма.

Поэтому весьма актуальным является сравнительное изучение механизма действия на иммунную систему мумиё и Радиолы Семенова, а также вещества, полученного на их основе - Гликоразмулина. Выяснение этих вопросов явилось предметом нашего исследования.

Связь диссертационной работы с тематическими планами НИР.

Работа выполнена в рамках совместного проекта Института иммунологии и фармацевтического института за № 149-06 «Механизмы действия на иммунную систему новых иммуномодулирующих средств местного природного происхождения в норме и при вторичных иммунодефицитных состояниях» Фонда поддержки фундаментальных исследований АН РУз.

Цель исследования: Изучить эффект Гликоразмулина и его исходных компонентов на иммунологическую реактивность в норме и при вторичных иммунодефицитных состояниях.

Задачи исследования:

1. Исследовать влияние Гликоразмулина и его компонентов на иммуногенез в системе in vivo и in vitro у мышей.

2. Изучить эффект Гликоразмулина и его компонентов на антителогенез in vitro и число иммунных розеткообразующих клеток в лимфоидных органах крыс.

3. Изучить эффект Гликоразмулина и его компонентов на состояние органов иммунитета у нормальных мышей.

4. Изучить влияние Гликоразмулина и его компонентов на пролиферацию кроветворных стволовых клеток.

5. Изучить влияние Гликоразмулина и его компонентов на иммунный статус мышей при остром токсическом гепатите и лучевой болезни.

Объект и предмет исследования. Объектом исследования являются селезенка, периферическая кровь разных видов животных.

Методы исследований: количественные и функциональные иммунологические методы.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Гликоразмулин и его компоненты обладают способностью повышать иммунологическую реактивность у интактных мышей и крыс в системе in vivo и in vitro, стимулировать пролиферацию клеток в органах иммунитета, повышать число кроветворных стволовых клеток в селезенках мышей.

2. Гликоразмулин и его компоненты повышают число антителообразующих и розеткообразующих клеток, а также количество клеток в центральных и периферических органах иммунитета, уровень которых резко снижается при остром токсическом гепатите и лучевой болезни.

Научная новизна. Установлено, что Радиола Семенова, мумиё, и полученный на их основе Гликоразмулин обладают свойством в несколько раз повышать иммунный ответ к эритроцитам барана и количество клеток в центральных (тимус, костный мозг) и периферических (лимфатические узлы) органах иммунитета; повышать титр антител к эритроцитам барана в периферической крови мышей; стимулировать пролиферацию эндогенных и экзогенных кроветворных стволовых клеток; усиливать процесс антителообразования в системе in vitro у мышей и крыс; повышать уровень иммунных розеткообразующих клеток в селезенке мышей и крыс.

Под воздействием изученных веществ происходит восстановление иммунологической реактивности организма при остром токсическом гепатите и лучевой болезни.

Научная и практическая значимость результатов исследования. Полученные результаты свидетельствуют, что Гликоразмулин является достаточно активным иммуномодулирующим средством и может использоваться для коррекции вторичных иммунодефицитных состояний при различных заболеваниях.

Реализация результатов. На основе результатов исследований подготовлены практические рекомендации «Экспериментальное обоснование использования Гликоразмулина в качестве иммуномодулятора», предназначенные для научных сотрудников, занимающихся вопросами разработки иммуноактивных препаратов.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены в материалах научно-практической конференции «Новые достижения в получении, изучении и применении лекарственных средств на основе природного сырья», посвященной 100 летию проф. Р.Л. Хазановича в Ташкентском фармацевтическом институте (Ташкент, 2006), в материалах республиканской научной конференции «Современные проблемы физиологии и биофизики» в институте физиологии и биофизики (Ташкент, 2007). Апробация работы состоялась на научном семинаре Института иммунологии АН РУз 7 октября 2009 года и 19 марта 2010 на научном семинаре при Специализированном совете Института иммунологии АН РУз.

Опубликованность результатов. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 2 журнальные статьи, 3 тезиса и 1 методические рекомендации.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 103 страницах компьютерного текста и включает введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, 2-и главы собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации и списка использованной литературы, включающего 213 источников, в том числе 183 русскоязычного и 30 иностранных авторов.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

гликоразмулин иммуногенез антителогенез

Во введении обоснована актуальность темы исследований, сформулированы цель и задачи работы, основные положения, выносимые на защиту, научная новизна и научно-практическая значимость результатов исследований, реализация и апробация работы, объем и структура диссертации.

В первой главе - «Обзор литературы» приводятся данные, касающиеся происхождения и биологической активности мумиё, анализируются работы по растениям семейства Радиолы и препарату Гликоразмулину.

Во второй главе описаны материал и методы исследования. В экспериментах использовали 476 белых беспородных мышей, 54 мышей линии BALB/c и 72 белых беспородных крыс.

В качестве антигена использовали эритроциты барана (ЭБ), которые брали у животных из яремной вены в стерильные флаконы с консервантом. ЭБ хранили в течение 7-10 дней при температуре +40С. Перед иммунизацией ЭБ 2-3 раза отмывали в среде 199 в течение 10 минут при 1000 об/мин. ЭБ в различных дозах вводили мышам однократно внутрибрюшинно.

Определение антителообразующих клеток (АОК) в селезенке и гематологические исследования. Количество АОК в селезенке определяли на 5-е сутки после иммунизации животных ЭБ методом локального гемолиза в агарозе по Jerne N. и Nordin A. (1963) В периферической крови мышей подсчитывали число эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева.

Определение общего количества клеток в органах иммунитета. После забоя у животных извлекали селезенки, брыжеечные лимфатические узлы, тимус и бедренную кость (Петров, Зарезкая,1965). Тимус, лимфатические узлы и селезенку очищали от жировой ткани и гомогенизировали в стеклянном гомогенизаторе в среде 199. Затем суспензии клеток пропускали через трехслойный капроновый фильтр. Бедренную кость мышей очищали от мышц, срезали эпифизы и с помощью шприца с тонкой иглой средой 199 вымывали костный мозг из костного канала. Во всех клеточных суспензиях органов иммунной системы подсчитывали число ядросодержащих клеток в камере Горяева и делали перерасчет на весь орган. Таким способом определяли общее количество клеток в центральных (тимус, костный мозг) и периферических (лимфатические узлы, селезенка) органах иммунитета.

Определение иммунных розеткообразующих клеток (иРОК) в органах иммунитета. На 4-5 сутки после иммунизации у животных извлекали селезенки, тимус, лимфатические узлы и определяли в них число иРОК по Zaalberg et al.(1972).

Определение антител в периферической крови. В 96-ти луночные планшеты помещали по 50 мкл физиологического раствора (Петров Р. В. с соавт., 1984). Затем в первую лунку помещали 50 мкл сыворотки иммунизированной мыши, тщательно смешивали и титровали последовательным переносом в последующие лунки до предпоследней в ряду. В последней лунке находился только физ. раствор (контроль). Затем во все лунки добавляли по 50 мкл 1% раствора ЭБ. Планшеты на 1 час помещали в термостат при +370С. После этого определяли титр антител в реакции гемагглютинации. За титр антител принимали последнее разведение сыворотки, которое давало реакцию с ЭБ (наличие «зонтика» в лунке). Результаты выражали в логарифмах с основанием 2 (log2).

Метод эндогенного клонирования кроветворных стволовых клеток. Эндогенные колонии определяли следующим образом. Мышей облучали тотально в сублетальной (6,5 Гр) дозе и на 9 сутки подсчитывали число колоний на поверхности селезенки (Till, McCulloch, 1963). В данной модели колонии в селезенке формируются из селезеночных стволовых клеток, сохранившихся после сублетального облучения.

Метод экзогенного клонирования кроветворных стволовых клеток. Для определения экзогенных колоний мышей линии BALB/c облучали тотально в летальной (8,5 Гр) дозе и трансплантировали сингенные клетки костного мозга в дозе 5Ч104. Затем на 8 сутки после облучения мышей забивали, извлекали селезенки и подсчитывали число колоний на их поверхности (Till, McCulloch, 1961).

Моделирование вторичных иммунодефицитов. Острый токсический гепатит (ОТГ) моделировали путем подкожного введения мышам гепатотропного яда - 20% раствора четыреххлористого углерода (CCl4) по 0,2 мл в течение 3 дней. В день последнего введения CCl4 мышей иммунизировали ЭБ и еще через 5 дней определяли число АОК в селезенке.

Для моделирования лучевой болезни (ЛБ) мышей линии BALB/c тотально облучали в дозе 4 Гр. Через 3 дня их внутрибрюшинно иммунизировали ЭБ и еще через 4 дня определяли число АОК в селезенке, титр антител к ЭБ, количество клеток в тимусе, костном мозге, лимфатических узлах, число эритроцитов и лейкоцитов крови.

Исследованные вещества. Объектом исследований служили следующие вещества: 1) Мумиё очищенной (ФС 42 Уз-0210-07); 2) корни и корневища Радиолы Семенова (Rhodiola Semenovii A. Boriss, род Clementsia); 3) Гликоразмулин, полученный на основе мумиё и Радиолы Семенова. Гликоразмулин представляет собой порошок коричневого цвета с приятным ароматным запахом, горьковато-вяжущим вкусом, проходящим через сито с диаметром отверстий 0,3 мм. Гликоразмулин растворим в горячей воде, мало растворим в 95% спирте, практически не растворим в ацетоне.

Полученные данные подвергали статистической обработке, с вычислением среднеарифметической (М), среднего квадратичного отклонения (), стандартной ошибки (m), с вычислением вероятности ошибки (Р). Различия средних величин считали достоверными при уровне значимости Р<0,05.

В третьей главе «Влияние мумиё, Радиолы Семенова и Гликоразмулина на иммуногенез у интактных животных» приведены исследования по изучению иммуномодулирующих свойств веществ. Мышей внутрибрюшинно иммунизировали эритроцитами барана (ЭБ) в дозе 2107. После иммунизации мышам однократно внутрижелудочно вводили исследуемые вещества (Радиола Семенова, мумиё, Гликоразмулин) в дозе 50 и 100 мг/кг. Активность веществ сравнивали с иммуномодулирующими свойствами препарата иммунал (фирма «Лек»), который вводили в дозе 0,02 и 0,04 мл/кг однократно внутрижелудочно. На 4-е сутки после иммунизации и введения веществ мышей забивали и в селезенках определяли число антителообразующих клеток (АОК) прямым методом локального гемолиза в агарозе по Ерне и Нордину (1963). Установлено, что в контрольной группе в селезенках иммунизированных мышей образуется в среднем 7100545,9 АОК. В группе мышей, получавших Радиолу Семенова в дозе 50 мг/кг, в селезенках формируется 292003042,8 АОК, что в 4,11 раза больше, чем в контроле. Еще большее повышение (в 4,93 раза) уровня АОК выявлено при введении данного вещества в дозе 100 мг/кг.

Мумиё в дозах 50 и 100 мг/кг в 2,48 и 2,39 раза соответственно повышает иммунный ответ к эритроцитам барана у мышей. Гликоразмулин в изученных дозах (50 и 100 мг/кг) повышает иммунный ответ к эритроцитам барана в 3,72 и 2,14 раза, соответственно. При введении иммунала в дозе 0,02 мл/кг иммунный ответ повышается в 4,68 раза, а при дозе 0,04 мл/кг - в 2,25 раза.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что изученные вещества обладают выраженным иммуностимулирующим эффектом, который не уступает таковому препарата иммунал.

Далее мы провели исследования по оценке эффекта веществ на динамику накопления антител к ЭБ в периферической крови мышей. Кроме этого подсчитывали общее количество клеток в органах иммунитета. Установлено, что уже на 5-е сутки после иммунизации под воздействием веществ наблюдается повышение титра антител к ЭБ. Радиола Семенова на 5-е сутки повышает титр антител, по сравнению с контролем, в 1,51-1,69 раза, мумиё - в 1,41-1,45 раза, Гликоразмулин - 1,35-1,55 раза и иммунал - в 1,45-1,61 раза.

Аналогичные результаты получены и на 7-е сутки после иммунизации мышей ЭБ. В группе животных, получавших Радиолу Семенова, титр антител повышается в 1,57-1,73 раза, мумиё - в 1,27-1,40 раза, Гликоразмулин - 1,57-1,77 раза, иммунал - в 1,43-1,60 раза.

Представлял интерес выяснить сохраняется ли иммуностимулирующий эффект веществ в последующие дни, т.е. на 10-е сутки. Оказалось, что и в эти сроки иммуномодулирующая активность веществ не утрачивается. Так, Радиола Семенова на 10-е сутки повышает титр антител в 1,40-1,67 раза, мумиё - в 1,67-1,73 раза, Гликоразмулин - 1,67-1,87 раза и иммунал - в 1,60-1,93 раза.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии у изученных веществ выраженной иммуномодулирующей активностью, которая сохраняется как минимум до 10 суток после иммунизации животных ЭБ.

Таким образом, экспериментально показано, что сахароснижающее вещество Гликоразмулин и его исходные компоненты могут стимулировать иммунологическую реактивность организма к конкретному антигену.

Далее были проведены исследования по изучению эффекта веществ на общее количество клеток в центральных (тимус, костный мозг) и периферических (лимфатические узлы) органах иммунитета. Установлено, что при введении Радиолы Семенова общее число клеток в тимусе повышается в 1,50-1,61 раза, мумиё - в 1,31-1,41 раза, Гликоразмулина - в 1,22-1,44 раза и иммунала - в 1,24-1,53 раза.

Аналогичные данные получены при оценке эффекта веществ на общее число клеток в лимфатических узлах. В группе мышей, получивших Радиолу Семенова, число клеток в лимфатических узлах повышается в 1,63-1,93 раза, мумиё - в 1,42-1,52 раза, Гликоразмулин - 1,47-1,72 раза и иммунал - 1,42-1,83 раза. Подсчет клеток в костном мозге мышей дал следующие результаты. Введение Радиолы Семенова в разных дозах способствовало возрастанию костномозговых клеток в 1,60-1,71 раза, мумиё - в 1,31-1,41 раза, Гликоразмулина - 1,21-1,51 раза и иммунала - в 1,25-1,65 раза. Следовательно, можно утверждать, что изученные вещества усиливают пролиферацию клеток в центральных и периферических органах иммунитета.

Таким образом, проведенные исследования показали, что Гликоразмулин и его исходные компоненты обладают способностью повышать иммунологическую реактивность и стимулировать пролиферацию клеток в лимфоидных органах. Более выраженным, по сравнению с мумиё, биологической активностью обладает Радиола Семенова. Очевидно, изученные вещества повышают интенсивность кооперативных, пролиферативных и миграционных свойств разных популяций иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих реализацию иммунных реакций организма. Возможно, эффект веществ реализуется через стимуляцию каскада цитокинов иммунной системы.

Далее были проведены исследования по изучению эффекта веществ на антителообразование в системе in vitro и на число иммунных розеткообразующих клеток (иРОК) у мышей и крыс. У иммунизированных ЭБ животных выделяли клетки селезенки и добавляли вещества в дозе 50 и 100 мкг/мл (иммунал в дозе 0,02 и 0,04 мкл/мл). Затем пробирки ставили в термостат при +370С на 30 минут, затем определяли число АОК в суспензии клеток селезенки. Установлено, что 30-ти минутное инкубирование селезеночных клеток мышей с Радиолой Семенова в дозах 50 и 100 мкг/мл достоверно в 1,51 и 1,58 раза повышает число АОК. При добавлении к спленоцитам мышей мумиё в этих же дозах число АОК повышается соответственно в 1,34 и 1,40 раза, а под воздействием Гликоразмулина - в 1,47 и 1,29 раза.

Более выраженный эффект выявлен при обработке клеток селезенки мышей иммуналом: число АОК повысилось в 1,71 и 1,40 раза. Однако достоверных различий между иммуналом и другими изученными веществами не обнаружено. Следовательно, при кратковременном контакте веществ с клетками селезенки иммунизированных мышей происходит повышение уровня АОК.

Исследования эффекта веществ на уровень иРОК в центральном (тимус) и периферических (лимфатические узлы, селезенка) органах иммунитета у мышей дали следующие результаты. Под воздействием Радиолы Семенова в дозе 50 и 100 мг/кг число иРОК в тимусе мышей повышается соответственно в 1,60 и 1,55 раза по сравнению с контрольными показателями. В группах мышей, получавших мумиё в этих же дозах, количество тимоцитов возрастает в 1,40 и 1,46 раза соответственно. У мышей, обработанных Гликоразмулином в дозе 50 и 100 мг/кг, число тимоцитов повышается соответственно в 1,71 и 1,51 раза, т.е. в несколько большей степени в сравнении с его исходными компонентами. Под воздействием иммунала в двух изученных дозах количество тимоцитов у мышей повышается в 1,80 и 1,50 раза соответственно. Таким образом, изученные вещества обладают способностью стимулировать пролиферацию клеток у мышей.

В селезенке мышей уровень иРОК под воздействием Радиолы Семенова повышается соответственно в 1,51 и 1,60 раза, при введении мумиё - в 1,40 и 1,45 раза, Гликоразмулина - в 1,50 и 1,55 раза и иммунала - 1,71 и 1,63 раза.

Как видно уровень клеток в лимфатических узлах мышей, получавших Радиолу Семенова в дозах 50 и 100 мг/кг, повысился соответственно в 1,59 и 1,70 раза. В меньшей степени прирост клеток в лимфатических узлах мышей наблюдается при введении мумиё: в 1,53 и 1,39 раза соответственно. Под воздействием Гликоразмулина число клеток в лимфатических узлах мышей повышается соответственно в 1,50 и 1,41 раза. Более выраженный стимулирующий эффект в отношении клеток лимфатических узлов мышей выявлен при их обработке иммуналом в двух изученных дозах: уровень клеток повышался в 1,90 и 1,62 раза.

Таким образом, результаты свидетельствуют о способности изученных веществ повышать уровень иРОК в центральных и периферических органах иммунитета у мышей. Очевидно, это вещества стимулируют экспрессию рецепторов на иммунокомпетентных клетках, взаимодействующих в ЭБ.

Далее в этих же модельных системах провели оценку эффекта веществ у другого вида лабораторных животных - крыс. Исследование эффекта веществ на уровень АОК в системе in vitro в селезенке иммунизированных крыс дали следующие результаты. При добавлении Радиолы Семенова в дозах 50 и 100 мкг/мл в суспензию клеток селезенок крыс количество АОК повышается соответственно в 1,66 и 1,72 раза. Мумиё в этих же дозах в 1,40 и 1,53 раза стимулирует иммуногенез, а Гликоразмулин - в 1,62 и 1,46 раза. В этих же условиях иммунал, в двух изученных дозах, повышает уровень АОК в системе in vitro соответственно в 1,85 и 1,50 раза по сравнению с контролем. Препарат сравнения иммунал в дозах 0,02 и 0,04 мкл/мл соответственно в 1,85 и 1,5 раза повышает число АОК in vitro у крыс.

Таким образом, изученные вещества способны повышать уровень АОК в суспензии селезенки у крыс. Иммуностимулирующая активность веществ в большей степени проявляется у крыс, что свидетельствует о видовой чувствительности животных к изученным веществам.

Следующим этапом явилось изучение эффекта веществ на уровень иРОК у иммунизированных крыс. Установлено, что все изученные вещества обладают свойством повышать уровень иРОК в центральных и периферических органах иммунитета у крыс. Исследования иРОК в тимусе дали следующие результаты: под воздействием Радиолы Семенова в дозах 50 и100 мг/кг число тимоцитов повышается соответственно в 1,55 и 1,43 раза; мумиё - 1,3 и 1,35 раза; Гликоразмулина - 1,58 и 1,41 раза и иммунала - 1,62 и 1,53 раза.

Под воздействием этих веществ популяция иРОК в селезенке крыс повышается в большей степени, чем в тимусе. Так, при введении изученных доз Радиолы Семенова количество иРОК повышается соответственно в 1,61 и 1,65 раза, мумиё - в 1,52 и 1,58 раза, Гликоразмулина - в 1,65 и 1,81 раза и иммунала - в 1,91 и 1,71 раза. Полученные результаты свидетельствуют о способности Радиолы Семенова, мумиё и Гликоразмулина стимулировать популяцию иРОК у центральных и периферических органах иммунитета у мышей и крыс.

Известно, что среди большого репертуара иммуноцитов стволовые клетки занимают особое место, как клетки-предшественники всех корпускулярных элементов кроветворной и иммунной систем. Воздействуя на данную популяцию клеток можно модулировать направление их дифференцировки в том или ином направлении.

Нами проведены исследования по оценке влияния Гликоразмулина и его компонентов на пролиферативные свойства кроветворных стволовых клеток.

Проведены две серии экспериментов. В первой серии белых беспородных мышей облучали тотально в сублетальной (6,5 Гр) дозе. После облучения мышам однократно внутрижелудочно вводили исследуемые вещества (Радиола Семенова, мумиё, Гликоразмулин) в дозе 50 и 100 мг/кг. Активность веществ сравнивали с иммуномодулирующими свойствами препарата иммунал (фирма «Лек»), который вводили в дозе 0,02 и 0,04 мл/кг однократно внутрижелудочно. Затем на 9-е сутки после облучения и введения препаратов мышей забивали и на поверхности селезенок подсчитывали число узелков (эндогенные колонии), каждая из которых образуется из стволовой клетки.

Во втором варианте мышей линии BALB/c облучали в летальной (8 Гр) дозе, после этого внутривенно вводили сингенные клетки костного мозга 5Ч104 и исследуемые вещества. Результат оценивали по количеству колоний, вырастающих на поверхности селезенок на 8-е сутки после облучения (экзогенные колонии). В данной модели колонии формируются из стволовых элементов костномозгового трансплантата.

Установлено, что изученные вещества обладают свойством стимулировать пролиферацию кроветворных стволовых клеток. Число эндогенных колоний на поверхности селезенок при введении Радиолы Семенова возрастает в 2,18-2,60 раза, мумиё - в 1,73-1,82 раза, Гликоразмулина - в 1,60-2,0 раза, иммунала - в 1,91-2,40 раза. Следовательно, изученные вещества обладают способностью влиять на пролиферативную активность эндогенных кроветворных стволовых клеток. Схожие данные получены при исследовании эффекта веществ на процесс экзогенного колониеобразования. Количество экзоколоний под воздействием Радиолы Семенова повышается в 2,63-2,76 раза, мумиё - в 2,32-2,42 раза, Гликоразмулина - в 2,37-2,84 раза и иммунала - в 2,18-2,68 раза.

Таким образом, на обеих моделях (эндогенное и экзогенное колониеобразование) показана способность изученных веществ в несколько раз повышать пролиферативные потенции кроветворных стволовых клеток. По своей активности вещества не уступают препарату иммунал.

Таким образом, Гликоразмулин оказывает стимулирующий эффект как на функциональные, так и на количественные показатели иммунной системы мышей и крыс.

В четвертой главе «Коррекция вторичных иммунодефицитов с помощью мумиё, Радиолы Cеменова и Гликоразмулина» приведены исследования по изучению влияния на иммунную систему ряда растительных веществ из местного сырья при экспериментальном остром токсическом гепатите (ОТГ). Объектом исследования служили 3 вещества: мумиё, Радиола Семенова и препарат Гликоразмулин, полученный на основе этих веществ.

Установлено, что при ОТГ формируется вторичный иммунодефицит, о чем свидетельствует резкое (в 5,16 раза) снижение числа АОК в селезенке иммунизированных мышей. Если иммунодефицитным животным с ОТГ ввести Радиолу Семенова в дозах 50 и 100 мг/кг, то число АОК в селезенке повышается соответственно в 3,78 и 4,01 раза. При введении мумиё в этих же дозах число АОК возрастает в несколько меньшей степени (в 3,30 и 3,50 раза). Препарат Гликоразмулин в дозах 50 и 100 мг/кг вызывал прирост АОК в селезенке мышей с ОТГ соответственно в 3,60 и 3,71 раза. Следовательно, все 3 вещества обладают способностью корригировать вторичный иммунодефицит при ОТГ. Более выраженная иммуностимуляция обнаружена при введении препарата иммунал: в изученных дозах он повышал иммунный ответ к ЭБ соответственно в 4,80 и 4,50 раза. Аналогичные результаты получены при расчете АОК на 1 млн. клеток селезенки.

Таким образом, полученные данные свидетельствую о способности изученных веществ в определенной степени восстанавливать иммунную реактивность организма при ОТГ.

При ОТГ число ЯСКС уменьшается в 1,64 раза, а при введении Радиолы Семенова количество спленоцитов повышается в 1,44-1,47 раза. В группах, получавших мумиё, число ЯСКС возрастает в 1,30-1,34 раза, а Гликоразмулин - в 1,39-1,42 раза. Под воздействием иммунала число ЯСКС увеличивается в 1,50-1,56 раза и приближается к контрольным значениям. Следовательно, изученные вещества при ОТГ восстанавливают не только иммунологическую реактивность организма, но и общее число клеток селезенки.

В процессе развития печеночной патологии количество иРОК в селезенке уменьшается почти в 2 раза. При введении Радиолы Семенова число иРОК повышается в 1,46-1,52 раза, мумиё -1,42-1,44 раза, Гликоразмулина - 1,55-1,56 раза, а иммунала - 1,59-1,71 раза. Таким образом, изученные вещества при ОТГ способствуют приросту в селезенке не только числа АОК, но и популяции иРОК.

Установлено, что при ОТГ количество клеток в тимусе снижается в 1,50 раза, в лимфатических узлах - в 1,70 раза, в костном мозге - 1,61 раза. Под воздействием изученных веществ происходит повышение клеток в центральных и периферических органах иммунитета у животных с вторичным иммунодефицитом. При введении мышам с ОТГ Радиолы Семенова в дозах 50 и 100 мг/кг число тимоцитов повышается соответственно в 1,31 и 1,35 раза, число клеток в лимфатических узлах - в 1,39 и 1,31 раза, а число клеток костного мозга - в 1,31 и 1,34 раза. Следовательно, данное вещество при ОТГ оказывает несколько более выраженный стимулирующий эффект на клетки лимфатических узлов.

При обработке мышей с ОТГ препаратом мумиё число тимоцитов повышается в 1,21 и 1,30 раза, число клеток в лимфоузлах - в 1,33 и 1,25 раза, а число костномозговых клеток - в 1,37 и 1,41 раза. Иначе говоря, более чувствительными к стимулирующему воздействию мумиё являются клетки костного мозга и лимфатических узлов. Схожие результаты получены в группах мышей с ОТГ, получавших препарат Гликоразмулин: в тимусе число клеток повышается соответственно в 1,37 и 1,34 раза, в лимфоузлах - в 1,43 и 1,46 раза, в костном мозге - в 1,42 и 1,46 раза.

Препарат иммунал в изученных дозах у мышей с ОТГ в большей степени способствовал повышению числа клеток лимфатических узлов (в 1,60 и 1,56 раза) и костного мозга (в 1,56 и 1,49 раза); число тимоцитов повышалось в 1,42 и 1,39 раза.

Таким образом, проведенные исследования показывают, что Гликоразмулин и его исходные компоненты обладают способностью повышать иммунологическую реактивность и стимулировать пролиферацию клеток в лимфоидных органах при ОТГ.

Более чувствительными к стимулирующему воздействию веществ оказались клетки селезенки, лимфатических узлов и косного мозга. Вероятно положительный эффект веществ на иммунную систему реализуется через активацию пролиферативных и миграционных свойств иммунокомпетентных клеток, участвующих в иммунных реакциях организма.

Следовательно, Гликоразмулин и его исходные компоненты (Радиола Семенова и мумиё) корригируют вторичный иммунодефицит, формирующийся при остром токсическом гепатите. У иммунодефицитных мышей изученные вещества повышают число иммунных розеткообразующих клеток в селезенке, количество клеток в центральных (тимус, костный мозг) и периферических (лимфатические узлы) органах иммунитета.

Известно, что при лучевом поражении происходят глубокие нарушения в жизнедеятельности организма и в первую очередь страдает иммунная система. Для лечения лучевых поражений используются различные подходы в частности пересадка костного мозга, экстракты тканей различных видов животных. Нами изучено влияние растительных веществ на иммунологические показатели у мышей с лучевой болезнью.

При лучевом поражении иммунный ответ к ЭБ снижается в 6,92 раза. При введении животным Радиолы Семенова в дозах 50 и 100 мг/кг число АОК в селезенке по сравнению с не лечеными животными повышается соответственно в 3,58 и 3,21 раза. При введении мумиё в тех же дозах иммунный ответ повышается соответственно в 3,10 и 3,0 раза. Следовательно, компоненты, входящие в состав препарата Гликоразмулина, стимулируют угнетенный иммунный ответ к ЭБ примерно в равной степени.

Гликоразмулин в дозе 50 мг/кг в 3,50 раза повышает число АОК в селезенке мышей с ЛБ, а при дозе 100 мг/кг - в 2,90 раза. Таким образом, Гликоразмулин и его компоненты обладают способностью в определенной степени стимулировать угнетенную иммунную реактивность у животных при лучевом поражении.

Более выраженный иммуностимулирующий эффект выявлен при введении препарата иммунал: при дозе 0,02 мл/кг иммунный ответ к ЭБ повышается в 4,09 раза, а при дозе 0,04 мл/кг - в 3,81 раза. Следует отметить, что введение всех изученных веществ хотя и способствовало повышению иммунологической реактивности организма, но полной нормализации иммунного ответа к ЭБ не наблюдалось.

После облучения общее число клеток в селезенке уменьшается в 2,8 раза. При введении Радиолы Семенова число спленоцитов повышается в 1,35-1,41 раза, мумиё - 1,25-1,30 раза, Гликоразмулина - в 1,32-1,50 раза и иммунала - 1,52-1,60 раза.

Таким образом, Гликоразмулин и его исходные компоненты способны в определенной степени стимулировать иммунологическую реактивность организма и повышать уровень спленоцитов при лучевом поражении.

У облученных мышей количество иРОК, по сравнению с контрольной группой, снижается в 2,78 раза. В группах животных, получивших Радиолу Семенова в дозах 50,0 и 100,0 мг/кг, число иРОК повышается соответственно в 1,58 и 1,53 раза. Введение мумиё облученным мышам в этих же дозах способствует повышению количества иРОК соответственно в 1,47 и 1,39 раза.

Более выраженный эффект обнаружен при введении иммунодефицитным животным Гликоразмулина: уровень иРОК по сравнению с контрольными значениями увеличивается в 1,67 и 1,75 раза соответственно. Препарат иммунал у облученных мышей в изученных дозах повышал количество иРОК в селезенке соответственно в 2,0 и 1,77 раза.

На основании полученных данных можно придти к заключению, что изученные вещества способны повышать угнетенный уровень иРОК в селезенках мышей с лучевой болезнью. Более выраженный эффект выявлен у Гликоразмулина, который по активности не уступает иммуналу.

Исследования по изучению эффекта веществ на общее количество клеток в центральных (тимус, костный мозг) и периферических (лимфатические узлы) органах иммунитета у животных с лучевой болезнью дали следующие результаты. Общее число клеток в тимусе снижается в 2,45 раза, в лимфатических узлах - в 2,14 раза, в костном мозге - в 2,44 раза. Иначе говоря, происходит резкое уменьшение иммунокомпетентных клеток в центральных и периферических органах иммунитета.

При введении Радиолы Семенова число клеток в лимфатических узлах и костном мозге повышается в равной степени (в 1,40-1,46 раза), а в тимусе - в 1,55-1,61 раза. Иными словами тимоциты более чувствительны к стимулирующему эффекту Радиолы Семенова, чем клетки в других органах иммунитета. Возможно, на тимоцитах имеется больше рецепторов, взаимодействующих с данным веществом.

У животных с ЛБ, получавших мумиё, число клеток в тимусе, лимфатических узлах и костном мозге повышается в одинаковой степени (в 1,3-1,36 раза). Под воздействием Гликоразмулина больший прирост клеток наблюдается в тимусе (в 1,51-1,58 раза) и лимфатических узлах (1,44-1,5 раза). В костном мозге данный препарат повышает количество клеток в 1,38-1,46 раза.

При лучевом поражении иммунал способствует увеличению клеток во всех органах иммунитета и, особенно в тимусе (в 1,65-1,71 раза). По своей активности он превосходит Гликоразмулин и его исходные компоненты.

Таким образом, можно говорить о том, что изученные вещества способны стимулировать пролиферацию клеток в центральных и периферических органах иммунитета у животных, подвергшихся лучевому поражению. Тимоциты оказались более чувствительными к стимулирующему эффекту Радиолы Семенова, Гликоразмулина и иммунала.

Полученные нами данные свидетельствуют о том, что изученные вещества можно использовать в качестве радиотерапевтических средств для восстановления иммунной реактивности и стимуляции пролиферации клеток в лимфоидных органах при лучевом поражении.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

1. Установлено, что Гликоразмулин в 2,1-3,7 раза, а его исходные компоненты - Радиола Семенова и мумиё - в 2,4-4,9 раза повышают иммунный ответ у мышей. Динамические исследования (в течение 5-10 дней) показали, что вещества в 1,3-1,9 раза повышают титр антител к ЭБ в крови мышей. Гликоразмулин повышает число клеток в тимусе, костном мозге и лимфатических узлах в 1,2-1,7 раза, Радиола Семенова - в 1,5-1,9 раза, а мумиё - в 1,3-1,5 раза.

2. Гликоразмулин, Радиола Семенова и мумиё в 1,3-1,7 раза повышают число АОК в селезенке in vitro и уровень «иммунных» РОК в тимусе, селезенке и лимфатических узлах у мышей.

3. Установлено, что у крыс Гликоразмулин, Радиола Семенова и мумиё в 1,4-1,7 раза повышают иммуногенез in vitro в селезенке, и в 1,4-1,8 раза число клеток в центральных и периферических органах иммунитета.

4. Гликоразмулин (в 1,6-2,7 раза), Радиола Семенова (в 2,2-2,8 рааза) и мумий (1,7-2,4 раза) усиливают пролиферацию кроветворных стволовых клеток в селезенке мышей.

5. Показано, что Гликоразмулин, Радиола Семенова и мумиё в 3,5-4 раза повышают угнетенный иммунный ответ к ЭБ у мышей с острым токсическим гепатитом. Под воздействием этих веществ число «иммунных» РОК в селезенке возрастает в 1,4-1,6 раза, а количество клеток в тимусе, костном мозге и лимфатических узлах в 1,3-1,5 раза.

6. При лучевой болезни Гликоразмулин, Радиола Семенова и мумиё в 2,9-3,6 раза повышают угнетенную иммунологическую реактивность мышей; в 1,4-1,8 раза число «иммунных» РОК в селезенке и в 1,3-1,6 раза количество клеток в центральных и периферических органах иммунитета.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Гликоразмулин после проведения доклинических исследований и получения разрешения Фармкомитета РУз может быть рекомендован в качестве нового иммуномодулирующего средства для коррекции вторичных иммунодефицитных состояний различной этиологии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Журнальные статьи

1. Арипова Т.У., Аминов С.Н., Батырбеков А.А., Нигманов Ф.Т., Рахматуллаева М.М. Влияние Гликоразмулина и его компонентов на иммунную систему в эксперименте //Журнал теоретической и клинической медицины. -Ташкент, - 2007.- №2.- С. 6-8.

2. Арипова Т.У., Батырбеков А.А., Аминов С.Н., Нигманов Ф.Т., Рахматуллаева М.М. Эффект Гликоразмулина и его исходных компонентов на иммуногенез при остром токсическом гепатите //Журнал теоретической и клинической медицины. - Ташкент,- 2009.- №3.- С. 20-23.

Тезисы

3. Арипова Т.У., Нигманов Ф.Т., Рахматуллаева М.М. Аминов С.Н. Влияние Гликоразмулина и его исходных веществ на иммунную систему организма //Мат. Респ. науч.-прак. конф. «Новые достижения в получении, изучении и применении лекарственных средств на основе природного сырья», посвящ. 100 летию проф. Р.Л. Хазановича.- Ташкент,- 2006.- С. 247.

4. Нигманов Ф.Т. Эффект Гликоразмулина и его исходных компонентов на иммуногенез в эксперименте //Мат. респ. науч. конф. «Современные проблемы физиологии и биофизики».- Ташкент,- 2007.- С.96-97.

5. Нигманов Ф.Т. Коррекция вторичных иммунодефицитов Гликоразмулином и его компонентами //Мат. респ. науч. конф. «Современные проблемы физиологии и биофизики».- Ташкент,- 2007.- С.97-98.

6. Арипова Т.У., Батырбеков А.А., Нигманов Ф.Т. Экспериментальное обоснование использования Гликоразмулина в качестве иммуномодулятора //Методические рекомендации.- Ташкент,- 2009.- 18 с.

Биология фанлари номзоди илмий даражасига талабгор Ф. Т. Нигмановнинг 14.00.36 - Аллергология ва иммунология ихтисослиги буйича «Гликоразмулин ва унинг компонентларини иммуномодулирловчи хусусиятлари» мавзусидаги диссертациясининг

РЕЗЮМЕСИ

Таянч сўзлар: иккиламчи иммунтан?исликлар, иммунитет коррекцияси.

Тад?и?от объектлари: тало?, турли ?айвонларни периферик ?они.

Ишнинг ма?сади: Гликоразмулин ва унинг компонентларини нормада ва иккиламчи иммун тан?ислиги холатларида иммунологик реактивликка таъсир самарасини ўрганиш.

Тад?и?от усули: ми?дорий ва функционал иммунологик усуллар.

Олинган натижалар ва уларнинг янгилиги: Ани?ландики, Семенов Радиоласи, мўмиё, ва улар асосида олинган Гликоразмулин ?ўй эритроцитларига иммун жавобни, ?амда марказий (тимус, суяк кўмиги) ва периферик (лимфа тугунлари) иммунитет органларида хужайралар ми?дорини бир неча марта ошириш; сич?онлар периферик ?онида ?ўй эритроцитларига антитаналар титрини ошириш; эндоген ва экзоген ?он яратувчи ўзак хужайралар пролиферациясини стимуллаш; сич?он ва каламушларда in vitro тизимида антитана шаклланиш жараёнини кучайтириш; сич?он ва каламушлар тало?ида иммун розетка шакллантирувчи хужайралар ми?дорини ошириш хусусиятига эга.

Ўрганилган моддалар таъсири остида ўткир токсик гепатит ва нур касаллигида организм иммунологик реактивлигининг тикланиши юз беради.

Амалий а?амияти: Олинган натижалар Гликоразмулинни етарлича фаол иммуномодулирловчи модда эканлигидан далолат беради ва ундан турли касалликларда юзага келадиган иккиламчи иммун тан?ислиги холатларида коррекция учун фойдаланиш мумкин.

Татби? этиш даражаси ва и?тисодий самарадорлиги: Тад?и?от натижалари Тошкент фармацевтик институтининг фармакалогик ва клиник фармация кафедраси ў?ув жараёнига татби? ?илинган.

?ўлланиш со?аси: биология ва иммунология.

РЕЗЮМЕ

диссертации Нигманова Ф.Т. на тему: «Иммуномодулирующие свойства Гликоразмулина и его исходных компонентов» на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.00.36 - Аллергология и иммунология

Ключевые слова: вторичные иммунодефициты, коррекция иммунитета.

Объекты исследования: селезенка, периферическая кровь разных видов животных.

Цель работы: изучить эффект Гликоразмулина и его исходных компонентов на иммунологическую реактивность в норме и при вторичных иммунодефицитных состояниях.

Метод исследования: количественные и функциональные иммунологические методы.

Полученные результаты и их новизна: Установлено, что Радиола Семенова, мумиё, и полученный на их основе Гликоразмулин обладают свойством в несколько раз повышать иммунный ответ к эритроцитам барана и количество клеток в центральных (тимус, костный мозг) и периферических (лимфатические узлы) органах иммунитета; повышать титр антител к эритроцитам барана в периферической крови мышей; стимулировать пролиферацию эндогенных и экзогенных кроветворных стволовых клеток; усиливать процесс антителообразования в системе in vitro у мышей и крыс; повышать уровень иммунных розеткообразующих клеток в селезенке мышей и крыс.

Под воздействием изученных веществ происходит восстановление иммунологической реактивности организма при остром токсическом гепатите и лучевой болезни.

Практическая значимость: Полученные результаты свидетельствуют, что Гликоразмулин является достаточно активным иммуномодулирующим средством и может использоваться для коррекции вторичных иммунодефицитных состояний при различных заболеваниях.

Степень внедрения и экономическая эффективность: Материалы исследований внедрены в научно-методическую деятельность кафедры фармакологии и клинической фармации Ташкентского фармацевтического института.

Область применения: биология и иммунология.

RESUME

Thesis of Nigmanov F.T. on the scientific degree of сandidate of biological sciences on specialty 14.00.36 - Allergology and immunology, subject: “ The immunomodulating properties glikorazmulin and its initial components”

Key words: secondary immunodeficiencies, immunity correction.

Subjects of the research: spleen, peripheral blood of different kinds of animals.

Purpose of work: to study effect glikorazmulin and its initial components on immune reactance in norm and at secondary immunodeficiency states.

Methods of research: quantitative and functional immunological methods.

The results obtained and their novelty: It is established, that radio-gramophone of Semenov, mumie, and received on their basis glikorazmulin possess property several times to raise the immune answer to erythrocytes a ram and quantity of cages in central (timuc, a bone brain) and peripheral (lymph nodes) immunity bodies; to raise titre antibodies to rythrocytes a ram in peripheral blood of mice; to stimulate prolyphiration endogen and eksogen cages; to strengthen process of antibodiformation in system in vitro at mice and rats; to raise level immune cages in a spleen of mice and rats.

Under the influence of the studied substances there is a restoration immune reactance of an organism at a sharp toxic hepatitis and radiation sickness.

Practical value: the received results testify, that glikorazmulin is active enough immunomodulating means and can be used for correction secondary immunodeficiency conditions at various diseases.

Degree of embed and economic effectivity: investigated materials were involved into science-methodological pharmacology and clinical department of pharmaceutical institute of Tashkent.

Field of application: biology and immunology.

Размещено на Allbest.ru

...