Распределение альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)-этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метил-этил) бензолацетонитрила в организме теплокровных животных

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Распределение альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)-этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метил-этил) бензолацетонитрила в организме теплокровных животных

Квачахия Л.Л.

Кандидат фармацевтических наук

Аннотация

Изучены особенности распределения альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-ме-тилэтил) бензолацетонитрила в организме всеядных теплокровных животных (крысы) после внутрижелудочного введения половинной летальной дозы отравляющего вещества. Изолирование альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)этил]-метил-амино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацето-нитрила из органов, их содержимого и биожидкостей животных проводили ацетоном. Очистку извлечённого соединения осуществляли хроматографией в колонке «Силасорб С-18» 30 мкм (элюент - ацетонитрил -вода (9:1)). Для идентификации и количественного определения исследуемого соединения использовали методы ТСХ, ГХ-МС и УФ-спектрофотометрии. Присутствие наибольших количеств исследуемого вещества зафикировано в желудке, его содержимом, печени и почках. Полученные результаты позволяют рекомендовать данные органы в качестве основных объектов судебно-химических экспертиз при отравлении верапамилом.

Ключевые слова: альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)этил]метиламино]-пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрил (верапамил), распределение, судебно-химический анализ.

Kvachakhiya L.L.¹

¹PhD in Pharmaceutics, Senior Lecturer, Kursk State Medical University,

DISTRIBUTION OF ALPHA-[3-[[2-(3.4-DIMETHOXYPHENYL)-ETHYL]-METHYLAMINO] PROPYL]-3.4-DIMETOXY-ALPHA-(1-METHYL-ETHYL) BENZOL ETHAN NITRILE IN THE ORGANISM OF WARM-BLOODED ANIMALS

The article studies the distribution of alpha-[3-[[2-(3.4-dimethoxyphenyl)ethyl]-methylamino] propyl] -3.4-dimethoxy-alpha-(1-methylethyl) benzol ethan nitrile in the organism of omnivorous warm-blooded animals (rats) after intragastric infiltration of a half lethal dose of the poison agent. Isolation of alpha-[3-[[2-(3.4-dimethoxyphenyl)ethyl]-methyl-amino] propyl]-3.4-dimethoxy-alpha-(1-methylethyl) benzol ethan nitrile from organs, their contents and bio-fluids of the animals was conducted with the help of acetone. Purification of the extracted compound was carried out by chromatography on a column of “Silasorb S-18” 30 micrometers (eluent-ethan nitrile-water (9:1)). To identify and quantify the test compound, TLC, GC-MS, and UV spectro-photometry were used. The presence of the largest quantities of the tested substance is fixed in the stomach, its contents, liver and kidneys. The results obtained enable us to recommend these organs as the main objects of forensic and chemical analysis for finoptin poisoning.

Keywords: alpha-[3-[[2-(3.4-dimethoxyphenyl)ethyl]methylamino]-propyl]-3.4-dimethoxy-alpha- (1-methylethyl) benzol ethan nitrile (finoptin), distribution, forensic and chemical analysis.

Альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)этил]метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрила гидрохлорид) (верапамил) (синонимы: верапамила хлоргидрат, ипровератрила гидрохлорид, 5-((3,4-диметоксифенетил)метиламино)-2-(3,4-диметокси-фенил)-2-изопропилвалеронитрила моногидрохлорид); торговые названия: изоптин, фаликард, финоптин, манидон, калан, кордилокс) - лекарственное вещество, проявляющее свойства антагониста ионов кальция. Он способен оказывать сосудорасширяющее, а также отрицательное инотропное действие, снижает потребность сердечной мышцы в кислороде, обладает недостаточно выраженным противоаритмическим эффектом [1, C. 411], [2, C. 1].

Гидрохлорид альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)этил]метиламино]-пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрила имеет форму бесцветных кристаллов, плавящихся при 146оС и способных растворяться (мг/мл) в воде (83), а также ряде гидрофильных (метанол (более 100), этанол (более 100), пропанол-2 (4,6), пропиленгликоль (93), диметилформамид (более 100) и гидрофобных (дихлорметан (более 100), этилацетат (1,0), гексан (0,001)) органических растворителях [3, C. 568]. Растворимость верапамила-основания в воде - 4,47 мг/л [4, C. 1].

Рассматриваемое соединение относится к группе веществ достаточно токсичных для теплокровных животных и человека. ЛД₅₀ альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифенил)этил]метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метил-этил) бензолацетонитрила гидрохлорида (в мг/кг) при пероральном введении лабораторным крысам составляет по разным данным 108, 150 или 341, мышам - 163, морским свинкам - 140, собакам - более 400, при введении в вену крысам - 16, мышам - 5,8 [2, C. 1], [5, C. 1].

LD₅₀ альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифенил)этил]метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрила - основания для мышей при введении в вену - 8 мг/мл [4, C. 1].

В научных литературных источниках приводятся различные примеры отравления людей данным лекарственным средством, произошедших из-за его ошибочного приёма, превышения допустимых доз в ходе лечебных мероприятий или с суицидальными целями [6, C. 401], [10, C. 253].

Достаточно высокая токсичность альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифенил)этил]метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрила, его многоцелевое применение в медицинской практике, отмеченные случаи отравления с летальным исходом позволяют рассматривать данное лекарственное вещество в качестве важного объекта судебно- химического исследования [11, C. 50], [12, C. 167], [13, C. 21 ], [14, C. 32].

Для определения органов и биожидкостей - наиболее целесообразных объектов исследования при экспертизе случаев отравления - необходимо предварительное изучение на лабораторных животных особенностей распределения отравляющего вещества в организме теплокровных [15, C. 24], [16, C. 50].

Целью настоящей работы явилось изучение характера распределения альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)этил]метиламино]-пропил]-3,4-ди-метокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрила в организме всеядных теплокровных (крысы) при летальном отравлении.

Экспериментальная часть. Как объект исследования был рассмотрен альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрила гидрохлорид, отвечающий критериям НД 42-5047-01 и содержащий ? 99 % основного вещества.

В ходе экспериментов использовались крысы породы Wistar (возраст пять месяцев, масса - 230-245 г), из которых были сформированы 5 опытных групп и 1 контрольная, в каждую из которых входило по 5 особей. Животным опытных групп через пластмассовый зонд вводили рассматриваемое вещество в желудок в виде водной суспензии в количестве 341 мг на 1 кг массы крысы. После того, как животные погибали, их трупы подвергались вскрытию, одинаковые биологические объекты (органы или биожидкости), взятые от погибших особей внутри каждой из групп, объединяли и исследовали на наличие в них альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрила. Параллельно подобным образом исследовали органы и биожидкости животных контрольной группы.

Схема изолирования аналита из биоматриц. В каждом случае определённое количество измельченного (средние размеры частиц 0,2-0,4 см) паренхиматозного или полого органа, содержимого полого органа или биожидкости заливали количеством ацетона, в два раза (по массе) превышавшем количество биологического объекта. Смесь биоматериала с изолирующим агентом выдерживали в течение получаса, периодически перемешивая. По истечении указанного времени жидкую часть смеси (ацетоновое извлечение) отделяли от твёрдого остатка, а процесс настаивания повторяли в описанном выше режиме. Первое и второе ацетоновые извлечения сливали в одну выпарительную чашку, растворитель и остатки воды испаряли в токе воздуха (температурный интервал 18-22^оС) до получения сухого остатка [17, C. 9], [18, C. 14].

Порядок очистка извлечённого аналита. Сухой остаток подвергали обработке 2-3 мл системы растворителей ацетонитрил-вода (9:1), получаемый раствор вносили в макроколонку сорбента «Силасорб С-18» 30 мкм (диаметр 10 мм, высота 150 мм). Аналит элюировали из колонки двухкомпонентным полярным элюентом ацетонитрил-вода (9:1). Фракции элюата, истекающего из макроколонки (по 2 мл каждая) собирали в градуированные пробирки. Серию фракций с 14 по 17 сливали в выпарительную чашку, а растворители удаляли из чашки, помещая её в поток воздуха комнатной температуры. После удаления растворителей остаток обрабатывали 5-7 мл этанола, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили этанолом до метки (исходный раствор). В две фарфоровые выпарительные чашки (№ 1 и № 2) вносили по 1,0-4,5 мл исходного раствора и удаляли из него растворитель в потоке воздуха комнатной температуры.

Идентификация в тонком слое сорбента. Остаток, находящийся в чашке № 1, обрабатывали несколькими небольшим порциями этанола по 0,2-0,3 мл и количественно перенося раствор в виде полосы на линию старта хроматографической пластины «Сорбфил» ПТСХ-АФ-А-УФ. Рядом на линию старта наносили 5-10 мкл 0,04% раствора (в этаноле) вещества-свидетеля. Хроматографировали, используя элюент гексан-ацетон (2:8). Получаемые тонкослойные хроматограммы проявляли, облучая их УФ-светом с длиной волны 254 нм. Альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацето-нитрил, идентифицировали по величине Rf.

Идентификация и количественное определение с использованием УФ- спектрофотометрии.Часть хроматограммы с находящимся на ней пятном исследуемого вещества вырезали, вносили в градуированную пробирку вместимостью 10 мл и элюировали вещество из сорбента в течение 15 минут 5 или 10 мл этанола в режиме периодического перемешивания. Полученный этанольный элюат отделяли в кварцевую кювету с длиной оптического пути 10 мм и проводили исследование его светопоглощения в диапазоне длин волн от 200 до 400 нм на спектрофотометре модели СФ-2000. Если оптическая плотность элюата превыщала 1,4, его разбавляли этанолом.

Принимая во внимание оптическую плотность этанольного элюата, измерения которой проводили в области 282 нм, определяли количественное содержание альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил)бензолацето-нитрила спектрофотометрическим методом.

Идентификация методом ГХ-МС. Сухой остаток, находящийся в выпарительной чашке № 2 обрабатывали 2 мл трихлорметана. 4 мкл, взятые из полученного раствора, вводили в хроматограф фирмы Agilent Technologies (США) модели 6890N с масс-селективным квадрупольным детектором модели 5973N (Agilent Technologies). Процесс хроматографирования осуществляли в колонке DB-1MS (J&WScientific, США) с неподвижной жидкой фазой диметилполисилоксан (длина колонки 30 м, внутренний диаметр 0,25 мм, толщина пленки фазы 0,25 мкм).

Начальная температура термостата колонки составляла 80°С (задержка на 2 минуту). Температура программировалась от 80°С до 250°С со скоростью 40°С в минуту с выдержкой при конечной температуре 6 минут. Температура инжектора составляла 280°С, температура интерфейса - 300°С. В качестве газа-носителя использовался гелий. Подача газа-носителя производилась со скоростью 39 см/с. Проба вводилась в режиме без деления потока, задержка 3 мин. Фрагментация молекул аналита в ионизационной камере осуществлялась с использованием электронного удара (70 эВ). Обнаружение вещества проводилось в режиме регистрации по полному ионному току (диапазон сканирования 40-550 m/z). Анализируемое соединение идентифицировали как по значению времени удерживания, так и по совпадению его масс-спектра с масс-спектром стандарта на 86% и более.

Результаты и их обсуждение. При идентификации в тонком слое сорбента альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрил проявлялся на хроматограммах в УФ-свете в виде темных розово-фиолетовых пятен на более светлом общем фоне пластины. Анализируемое вещество идентифицировали на основе совпадения значения его абсолютной хроматограической подвижности (Rf) в тонком слое силикагеля со значением Rf вещества-стандарта (038±0,03).

По результатам идентификации альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил)бензолацетонитрила методом УФ-спектрофотометрии отмечается совпадение формы спектральных кривых аналита, извлечённого из биоматриц, а также положения в них максимумов (при 205 и 232 и 282 нм) с этими же характеристиками вещества-стандарта.

Градуировочный график линейной зависимости оптической плотности этанольных растворов альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)этил]-метиламино]про-пил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил)бензолацето-нитрила от концентрации в них аналита (5,00-120,00 мкг/мл) для спектрофотометрического определения может быть описан уравнением прямой:. А = 0,010202•С-0,001794, в котором переменные А и С - орсоответственно значения оптической плотности и концентрации анализируемого вещества в фотометрируемом растворе (мкг/мл). Коэффициент корреляции > 0,99.

Относительная ошибка среднего результата при определении альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрила данной методикой в субстанции не превышает 1,0 % (при шести параллельных опытах и доверительной вероятности 0,95).

При исследовании извлечений из биоматриц, взятых от крыс, не получавших альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил)бензолацетонитрил, установлено отсутствие данного вещества в паренхиматозных и полых органах, их содержимом, а также в крови животных контрольной серии. Измеренное при длине волн 282 нм фоновое поглощение элюатов из участков хроматограмм, по площади и положению относительно линии старта соответствующих анализируемому веществу, не превышало 0,024 единиц оптической плотности для различных биологических объектов в пересчёте на 5 г биоматериала.

На рис. 1 представлен внешний вид газо-жидкостных хроматограмм исследуемого аналита, выделенного из некоторых биоматриц (желудок (А) и печень(Б)), а также вид хроматограммы вещества-стандарта (В).

Рис. 1 - Газо-жидкостные хроматограммы исследуемого аналита: выделенного из желудка (А), выделенного из печени (Б), вещества-стандарта (В)

сосудорасширяющий инотропный аритмический лекарственный

Данные, приводимые на рисунке, позволяют заключить, что в предложенных условиях проведения идентификации сочетанием ГЖХ и масс-селективного детектирования значение времени удерживания альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацетонитрила, извлечённого из биоматериала, совпадало с таковым вещества-стандарта и соответствовало интервалу 13,4±0,14 минуты.

Рис. 2 - Масс-спектры исследуемого аналита: извлечённого из желудка (А), извлечённого из печени (Б), вещества-стандарта (В)

При сравнении хроматограмм исследуемого соединения с хроматограммой вещества-стандарта (метод ГХ-МС) не наблюдалось присутствие дополнительных пиков и заметного смещения базовой линии в зоне, соответствующей промежутку значений времени удерживания 12,5-14,5 мин.

В масс-спектрах исследуемого вещества, извлечённого из биологических объектов (желудок и печень), взятых от отравленных животных, присутствовали сигналы характерных осколков (заряженных частиц) для молекулы альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацето-нитрила с массами (m/Z): 58, 84, 107, 130, 151, 177, 260, 303. Основным (масса которого принимается за 100%) является осколок с массой 303 (см. рис. 2).

Результаты определения рассматриваемого соединения в 10 биологических объектах (паренхиматозных органах, полых органах и их содержимом, биожидкостях), взятых от трупов отравленных животных, представлены в таблице.

Таблица 1 - Результаты изучения распределения альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-ме-тилэтил) бензолацетонитрила в организме теплокровных (крысы)

Как видно из таблицы, альфа-[3-[[2-(3,4- диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолаце-тонитрил присутствует в неизменном виде как в органах, так и в крови погибших организмов. Наибольшие количества отравляющего вещества (мг в 100 г органа или биожидкости) обнаруживаются в желудке (512,341±26,371) и его содержимом (935,346±120,278), печени (241,753±22,664) почках (179,172±21,660) и селезёнке (135,712±11,542) несколько меньшие - в тонком кишечнике с содержимым (121,585±11,775), в мышцах (56,265±3,591) и лёгких (43,210±3,816) отравленных животных.

Выводы

Изучено распределение альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)-этил]метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил) бензолацето-нитрила в организме теплокровных животных (крысы) при введении LD₅₀ данного отравляющего вещества в желудок.

Показано, что отравляющий агент обнаруживается в значительных количествах в трупах погибших от отравления крыс в неизменном виде.

Наибольшие количества альфа-[3-[[2-(3,4-диметоксифенил)этил]-метиламино]пропил]-3,4-диметокси-альфа-(1-метилэтил)бензолацето-нитрила присутствуют в желудке (512,341±26,371), его содержимом (935,346±120,278), печени (241,753±22,664) и почках (179,172±21,660).

Список литературы / References

1. Машковский М.Д. Лекарственные средства. В 2 т. Т. 1. / М.Д. Машковский. - 16-е изд. - М.: Новая волна, 2014. - 540 с.

2. Verapamil Hydrochloride Injection. - URL: https://system.netsuite.com/core/media/media.nl?id=12072&c=723462&h=1ca152815ad524204649&_xt=.pdf (аccessed: 13.06.2017).

3. O'Neil M.J. (ed.). The Merck Index - An Encyclopedia of Chemicals, Drugs, and Biologicals. 13th Edition, Whitehouse Station. - N.J.: Merck and Co., Inc., 2001. - 1772 р.

4. Verapamil: DrugBank. - URL: https://www.drugbank.ca/drugs/DB00661 (аccessed: 13.06.2017).

5. Verapamil Hydrochloride MSDS. - URL: www.sciencelab.com/msds.php?msdsId=9925411 (аccessed: 13.06.2017).

6. Clarke's analysis of drugs and poisonsin Pharmaceuticals, body fluids and postmortem material. 3rd ed.- London: Pharmaceutical Press, 2004.- Vol. 2.- 550 p.

7. MacDonald D. Case report: fatal overdose with sustained-release verapamil / D. MacDonald, P.C. Alguire // Am. J. Med. Sci. - 1992- Vol. 303, N 2- Р. 115-117.

8. Calcium channel blocker sustained release: Only three tablets can be life threatening / M. Mihalcea, A. Geiger, J. Kopferschmitt and others // Journal of Emergencies, Trauma, and Shock. - 2012. - Vol. 5, N 2- Р. 208-209.

9. Gelbke H.P. Fatal poisoning with verapamil / H.P. Gelbke, H.J. Schlicht, Gg. Schmidt // Archives of Toxicology. - 1977. - Vol. 37, N 2. - Р. 89-94.

10. Critical care management of verapamil and diltiazem overdose with a focus on vasopressors: a 25-year experience at a single center / M. Levine, S.C. Curry, A. Padilla-Jones and others // Ann Emerg Med. - 2013. - Vol. 62, N 3.- Р. 252-258.

11. Карташов В.А. Сравнительная характеристика способов изолирования верапамила из биологического материала / В.А. Карташов, Л.Е. Кудрикова // Фармация. - 1988. - № 3. - С. 49-52.

12. Кормишин В.А. Денситометрический анализ эфедрина и верапамила в судебно-химической экспертизе / В.А. Кормишин, А.В. Воронин, И.Ф. Шаталаев // Вестник СамГУ - Естественнонаучная серия. - 2013. - № 6. - С. 167-174.

13. Муравьева Г.М. Судебно-химическое определение курантила и верапамила / Г.М. Муравьева, М.И. Дмитриченко // Судебно-медицинская экспертиза. - 1995. - Т. 38, № 1. - С. 21-23.

14. Кормишин В.А. Денситометрический анализ верапамила в судебно- химической экспертизе / В.А. Кормишин, А.В. Воронин, И.Ф.Шаталаев // Технические науки - от теории к практике: сборник статей по материалам VI международной научно-практической конференции. - Новосибирск: СибАК, 2012.-С. 31-35.

15. Шорманов В.К. Распределение карбосульфана в организме теплокровных животных / В.К. Шорманов, С.Г. Галушкин, А.П. Терских // Судебно-медицинская экспертиза. - 2015. - Т. 58, № 5. - С. 23-29.

16. Шорманов В.К. Распределение амлодипина в организме теплокровных животных / В.К. Шорманов, Л.Л. Квачахия // Судебно-медицинская экспертиза. - 2017. - Т. 60, № 1. - С. 48-53.

17. Квачахия Л.Л. Выявление верапамила в биологических жидкостях / Л.Л. Квачахия, В.К. Шорманов // Фармация. - 2015. - Т. 64, № 2. - С. 8-13.

18. Квачахия Л.Л. Определение нимодипина в биологическом материале / Л.Л. Квачахия, В.К. Шорманов, Г.С. Мещерякова // Фармация.-2016. - Т. 65, № 6. - С. 12-15.

Размещено на Allbest.ru