Характеристики структурно-функциональной организации нейтрофилов и лимфоцитов у здоровых детей в онтогенезе с различным исходным вегетативным тонусом

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

ХАРАКТЕРИСТИКИ СТРУКТУРНО-ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ ОРГАНИЗАЦИИ НЕЙТРОФИЛОВ И ЛИМФОЦИТОВ У ЗДОРОВЫХ ДЕТЕЙ В ОНТОГЕНЕЗЕ С РАЗЛИЧНЫМ ИСХОДНЫМ ВЕГЕТАТИВНЫМ ТОНУСОМ

Гренц Вера Ивановна

Специальность: 03.00.13 - физиология

14.00.09 - педиатрия

Тюмень 2004

Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессиональном образования «Тюменский государственный университет» и государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия»

Научный руководитель:

доктор медицинских наук,

профессор Чимаров Валерий Михайлович

Научный консультант:

доктор медицинских наук,

профессор Сорогин Валентин Петрович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Колпаков Виктор Васильевич

доктор медицинских наук, Перевощикова Нина Константиновна

профессор

Ведущая организация:

Защита диссертации состоится «___»________________2004 г. в ___ часов на заседании диссертационного Совета Д.212.274.07 в Тюменском государственном университете. Адрес: 625003, г. Тюмень, ул. Пирогова, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в читальном зале библиотеки Тюменского государственного университета.

Автореферат разослан «___» _______________2004 года.

Ученый секретарь

диссертационного Совета

доктор биологических наук,

профессор - Е.А. Чирятьев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Необходимость глубокого изучения проблем обеспечения здоровья детей и подростков в связи с постоянным увеличением хронической патологии во всем мире, в том числе и в России, приобретает все большее значение (Перевощикова Н.К., 2003; Шарапова О.В., Царегородцев А.Д. и др., 2004; Lawlor G.I. e..a., 2000 и др.). По мнению Ю.Е. Вельтищева (2003), одним из приоритетных направлений в изучении индивидуального здоровья является углубление исследований в области геномики детского возраста. Изучение онтогенетических особенностей формирования уровня здоровья в критические периоды роста и развития ребенка (ускорение физического развития, перекресты в формуле белой крови, переключение метаболических путей и др.) является основой раннего выявления отклонений от генетической программы развития (Безруких М.М., 2004, Соловьев В.С., 2003). Исследования последних лет показали, что генетически детерминированная программа физиологической гибели клеток (апоптоз) в онтогенезе предопределяет пролиферацию, дифференцировку или пребывание этих клеток в покое (Ройт А. и др., 2000; Потапнев М.П., 2002; Караулов А.В., 2002; Шаповалов В.Д. и др., 2002; Заботина Т.Н. и др., 2003; Lawlor G.I. e.a., 2000; Fuller G.M., e.a., 2003). Особая роль в формировании хронической патологии у детей принадлежит отклонениям физиологического апоптоза циркулирующих клеток крови - нейтрофилов и лимфоцитов. Поэтому изучение механизмов формирования структуры и функции указанных клеток у детей в различные периоды онтогенеза и роли их преобразований в обеспечении уровня здоровья является актуальной задачей физиологии и педиатрии (Шалабодов А.Д., 1999; Маянский А.Н., 2003). Однако проблеме становления функции реактивности в онтогенезе у детей в указанном аспекте посвящены немногочисленные и противоречивые исследования (Прахин Е.И.,1997; Ботвиньева В.В. 1999; Мазуров Д.В. и др., 2002; Дамбаева С.В. и др., 2002; Lawlor G.I. e.a., 2000). Функционирование иммунной системы у детей в процессе их онтогенетического развития в значительной мере определяется взаимодействиями с вегетативной нервной системой (ВНС) как ведущим центром регуляции гомеостазиса, обеспечения адекватных приспособительных реакций организма, обусловливающих его жизнедеятельность (Щедрина А.Г. и др., 1989; Парцерняк С.А., 1999; Вейн А.М., 2000; Колпаков В.В., 2001; Беляева Л.М. и др., 2003). Однако закономерности онтогенетических структурно-функциональных преобразований нейтрофилов и лимфоцитов у здоровых детей во взаимосвязи с функционированием ВНС не исследованы, не изучено их значение для роста, развития детей, формирования здоровья, а также развития патологических состояний на разных этапах постнатального онтогенеза. Эти положения определили цель и задачи настоящего исследования

Цель работы - исследовать закономерности структурно-функциональной организации нейтрофилов и лимфоцитов у здоровых детей в зависимости от исходного вегетативного тонуса и определить роль выявленных взаимосвязей в формировании индивидуального здоровья в постнатальном онтогенезе.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Дать комплексную оценку состояния здоровья детей с различным типом функционирования ВНС в онтогенезе.

2. Изучить интрацеллюлярный обмен кальция в нейтрофилах и лимфоцитах на основе анализа показателей кинетики ионов кальция, интрацеллюлярного уровня общего кальция и активности Са++-АТФазы у здоровых детей в зависимости от исходного вегетативного тонуса (ИВТ) в анализируемые периоды онтогенеза.

3. Исследовать активность ферментов, регулирующих обмен реактивных оксигенных радикалов в нейтрофилах и лимфоцитах у здоровых детей с различным ИВТ в онтогенезе.

4. Определить в мембранах нейтрофилов и лимфоцитов активность начальных этапов свободно-радикального окисления липидов, содержание фосфолипидов и холестерина у здоровых детей в зависимости от показателей функционирования ВНС в исследуемые периоды онтогенеза.

5. Установить характер корреляционных взаимосвязей онтогенетических структурно-функциональных преобразований нейтрофилов и лимфоцитов и функциональной активности ВНС по показателям исходного вегетативного тонуса и определить значение указанных взаимосвязей в формировании здоровья и риска развития патологии у детей.

Научная новизна.

Впервые проведено комплексное сравнительное исследование структурно-функциональной организации нейтрофилов и лимфоцитов в зависимости от функциональной активности ВНС у здоровых детей на разных этапах постнатального онтогенеза - в периоды набора массы тела (3-4 года и 8-11 лет) и вытягивания (5-7 лет).

Впервые установлены особенности обмена интрацеллюлярного кальция, реактивных оксигенных радикалов, структуры липидов нейтрофилов и лимфоцитов у здоровых детей 3-11 лет. При этом впервые показано, что исследуемые параметры структуры и функции, как нейтрофилов, так и лимфоцитов отличаются по величине и соотношению у детей с различным ИВТ: эйтонией, симпатикотонией и ваготонией.

В результате проведенных исследований в онтогенетическом аспекте впервые установлено, что структурно-функциональные преобразования нейтрофилов и лимфоцитов претерпевают возрастные изменения, имеющие специфические особенности у детей с эйтонической, симпатикотонической и ваготонической направленностью ИВТ. Установлено, что показатели онтогенетических преобразований нейтрофилов и лимфоцитов, тесно взаимосвязанные с функциональной активностью ВНС, отражают закономерности роста и развития детей, представляют новые критерии оценки уровня их здоровья и возможности прогнозирования развития патологических состояний.

Практическая значимость работы. Результаты настоящих исследований являются основой для разработки возрастных нормативов клинико-физиологического состояния детей в различные периоды онтогенеза. Выявленные показатели закономерностей онтогенетических преобразований структуры и функции нейтрофилов и лимфоцитов у детей с различным ИВТ позволили рекомендовать их в качестве новых объективных критериев диагностики здоровья и определения риска развития патологических состояний. Поскольку установлено, что при ИВТ эйтонии наблюдаются наиболее оптимальные соотношения уровня здоровья, структуры и функции нейтрофилов и лимфоцитов, данные показатели целесообразно расценивать и практически использовать в качестве нормативных параметров.

Положения, выносимые на защиту.

1. Характеристики структурно-функциональной организации нейтрофилов и лимфоцитов у здоровых детей в различные периоды онтогенеза в значительной мере предопределяются функциональным исходным состоянием ВНС - исходным вегетативным тонусом.

2. Показатели структурно-функциональных преобразований нейтрофилов и лимфоцитов отражают процессы дифференцировки указанных клеток в онтогенезе и представляют объективные критерии роста, развития и состояния здоровья детей.

3. Сравнительная характеристика показателей структурно-функциональной организации нейтрофилов и лимфоцитов в онтогенезе у здоровых детей с различным ИВТ (эйтонией, симпатикотонией, ваготонией) позволяет дифференцировать различный уровень формирования индивидуального здоровья и выделить факторы риска, способствующие развитию патологических состояний.

Апробация результатов исследования. Результаты настоящих исследований представлены на ежегодных международных симпозиумах «Медицина и охрана здоровья» (Тюмень 1999, 2000, 2003), первой межрегиональной научно-практической конференции «Формирование здорового образа жизни населения Урала и Сибири» (Тюмень 2004), II международном конгрессе в Греции «Терапия, оздоровление, профилактика в условиях кризиса экологии организма» (Халкиди 2002).

Реализация результатов исследования. Результаты исследования используются в детской поликлинике № 2, дошкольном образовательном учреждении № 113, школах № 37, № 57 г. Тюмени, в учебном процессе на кафедре валеологии Тюменского государственного университета и его филиале в г. Пыть-Ях, на профильных кафедрах педиатрического факультета Тюменской государственной медицинской академии.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 печатных работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на … страницах машинописного текста, содержит введение, главу, посвященную обзору литературы, главу «Материалы и методы исследования», три главы, отражающие результаты собственных исследований, заключение, выводы, практические рекомендации и список литературы.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

нейтрофил лимфоцит ребенок здоровье

Материалы и методы исследования. Для решения поставленных в настоящей работе задач нами проведены наблюдения и биохимические исследования 156 детей в возрасте от 3 до 11 лет I группы здоровья с различным исходным вегетативным тонусом (ИВТ): эйтонией (60 детей), симпатикотонией (72 ребёнка), ваготонией (24 ребёнка). При этом в группе детей с эйтонией в возрасте 3-4 года наблюдалось 22 ребёнка, в 5-7 лет - 24 и в 8-11 лет - 22 ребенка. В группе детей с ИВТ симпатикотонией в возрасте 3-4 года было 34 ребёнка, в 5-7 лет - 16 и в 8-11 лет - 14 детей. В группе детей с ИВТ ваготонией в возрасте 3-4 года наблюдалось 2 ребенка, в 5-7 лет - 10 детей и в 8-11 лет - 12 детей. Все дети посещали дошкольные учреждения или школы; большинство из них (86,7%) проживало в Западной Сибири с рождения. Биохимические исследования выполнены в биохимической лаборатории ЦНИЛа Тюменской медицинской академии (заведующая - старший научный сотрудник, к.б.н. Т.Д.Журавлева). Оценка полученных данных проводилась дифференцированно в зависимости от ИВТ - эйтонии, симпатикотонии, ваготонии. Для определения ИВТ использовались оценочные клинические таблицы Вейна А.М. (1981) в модификации Белоконь Н.А. (1987) и кардиоинтервалография (Баевский Р.М., 1979; Кубергер М.Г. и др., 1985). Принадлежность каждого ребенка к группе здоровья, лабораторные исследования осуществлялись в соответствии с приказами Минздрава РФ№ 60 от 14.03.95 г., № 81 от 15.03.02 г. и приложением № 1, 2 к приказу № 621 от 30.12.2003. Физическое развитие определялось с помощью центильных таблиц (Мазурин А.В., Воронцов И.М., 1999) и показателей физического развития, разработанных для Тюменского региона (Чимаров В.М., Сорогин В.П., Кретинина Л.Н., 1995). Для оценки физического развития были использованы также массо-ростовые индексы: Кетле, тучности и мышечного развития (Ямпольская Ю.А., 1999).

Биохимические методы исследования. Для определения характеристик кинетики интрацеллюлярного кальция в нейтрофилах и лимфоцитах проведено: исследование кинетики ионов кальция путем регистрации его с флуоресцентным хлортетрациклиновым (ХТЦ) зондом в лейковзвеси в физиологических условиях (Добрецов Г.Е., 1989); определение уровня общего интрацеллюлярного кальция в мембранах нейтрофилов и лимфоцитов (Kao E.A., 1971, в модификации Журавлевой Т.Д. 1989); исследование Са++-АТФазной активности по методу А.М. Казеннова, 1984, в модификации Т.Д. Журавлевой (1988).

Исследование общего холестерина, общих фосфолипидов и начальных этапов свободнорадикального окисления липидов включало: определение уровня общего холестерина с использованием пластин «Silufol» (Чехия) по методу Златкиса-Зака; количественное определение фосфолипидов по содержанию неорганического фосфора (Грибанов Г.А., 1976; Мельникова В.В., 1987); определение диеновых коньюгат полиненасыщенных жирных кислот (ДК ПНЖК) в мембранах нейтрофилов и лимфоцитов (Стальная И.Д. и др., 1977); определение гидроперекиси липидов (ГПЛ) спектрофотометрически (Писаревский Ю.А., 2000).

Особенности активности ферментов, регулирующих обмен реактивных оксигенных радикалов (РОР), выявлены: исследованием уровня перекиси водорода флуоресцентным методом (Тимошенко А.В. с сотр., 1998); исследованием активности ксантиноксидазы в плазме крови спектрофотометрически (Дьячина Н.И., 1973); определением активности супероксиддисмутазы (СОД) в мембранах нейтрофилов и лимфоцитов по методу Верболович В.Г., Подгорной А.М. (1987); определением активности каталазы по методу M. Karen, F. Toth et al. (1986).

Анализ полученных данных проводился с использованием статистического пакета «Statistiсa» на ПЭВМ Intel Inside Celeron. При создании базы данных использован редактор электронных таблиц программы «Microsoft-Excel 2000». Обработка результатов осуществлялась способом вариационной статистики по методу Фишера- Стьюдента. Наряду с этим, проведен многоплановый математический анализ парных корреляционных взаимосвязей изучаемых показателей с определением коэффициента корреляции Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Под наблюдением находились 156 здоровых детей в возрасте от 3 до 11 лет. Все дети имели гармоничное физическое и соответствующее возрасту нервно-психическое развитие, удовлетворительную резистентность к заболеваниям, у всех отмечено отсутствие пороков развития и хронической патологии.

Исследование семейного анамнеза показало отсутствие наследственной отягощенности, при этом ИВТ эйтония чаще отмечен у детей, родители которых менее всего были подвержены соматической патологии.

Физическое развитие характеризовалось увеличением индекса Кетле I и снижением индекса мышечного развития детей по мере увеличения их возраста. У детей с ИВТ эйтонией и ваготонией индекс тучности заметно снижался в периоде вытягивания. Однако у ваготоников индексы Кетле I и II были наиболее низкими, а индекс мышечного развития - наиболее высоким. Эти данные свидетельствуют, что характерной особенностью детей с ИВТ ваготонией является преобладание массы тела над ростовыми показателями во все анализируемые периоды онтогенетического развития.

В качестве объективного критерия диагностики здоровья определялось количество нейтрофилов и лимфоцитов в периферической крови как показателей иммунологической защиты организма в зависимости от возраста и ИВТ. Выявлено, что количество нейтрофилов при всех типах ИВТ увеличивается в возрасте 5-7 лет и вновь снижается к 8-11 годам, но при этом в возрасте 3-4 года и 5-7 лет отмечается некоторое уменьшение количества клеток у детей с ваготонией. При этом в 3-4 года наблюдается достоверное уменьшение и числа лимфоцитов. При ваготонии количество лимфоцитов оказалось более высоким в возрасте 5-7 лет, в сравнении с периодами набора массы, не имея существенных различий у детей с разным типом функционирования ВНС.

Результаты проведенных исследований дают основание детей с ИВТ эйтонией выделить в особую эталонную группу здоровья и использовать их показатели в качестве контрольных.

Структурно-функциональная организация нейтрофилов у детей с ИВТ эйтонией характеризуется низким содержанием Н2О2 в периоде вытягивания, сочетающимся, судя по кинетике зонда ХТЦ, с минимальным содержанием Ca++ в примембранном слое и низким уровнем интрацеллюлярного Са++ при накоплении общего кальция (таблица 1). В структуре нейтрофилов в этот период отмечается накопление ГПЛ при снижении общих фосфолипидов (ОФЛ) и увеличении коэффициента ОХС/ОФЛ в 1,5-2 раза. Эти изменения, судя по данным литературы (Маянский А.Н., 2003), направлены на дифференцировку нейтрофилов.

Таблица 1

Показатели структурно-функциональной организации нейтрофилов и лимфоцитов у детей с ИВТ эйтонией в изучаемые периоды онтогенеза

* -достоверность различий между группами детей 3-4 лет и 5-7 лет

# - достоверность различий между группами детей 5-7 лет и 8-11 лет

^ - достоверность различий между группами детей 3-4 лет и 8-11 лет

В возрасте детей 3-4 лет в структуре нейтрофилов являются характерными высокая концентрация Са++ в примембранном слое при снижении коэффициента ОХС/ОФЛ, низкая концентрация Н2О2 в сочетании с уменьшением активности СОД и каталазы, что свидетельствует о низкой их функциональной активности и превалированием их пролиферации.

Для II периода набора массы у детей с ИВТ эйтонией, судя по кинетике зонда ХТЦ, характерно наибольшее увеличение максимальной и стартовой концентрации Ca++ и содержания Н2О2 в нейтрофилах, что отражает процесс дифференцировки нейтрофилов. В лимфоцитах у детей-эйтоников 8-11 лет максимальный уровень Н2О2 сочетался с низкой активностью каталазы (Р<0,05), а в возрасте 3-4 года низкий уровень Н2О2 - с высокой активностью каталазы.

В лимфоцитах у детей с эйтонией в периоде вытягивания, судя по пику ФЛУ зонда ХТЦ, характерно, в сравнении с периодами набора массы, достоверное снижение интрацеллюлярного Са++ при увеличении почти в два раза свободного кальция и тенденции к увеличению активности Са++-АТФазы. Во II периоде набора массы, в сравнении с группой детей 3-4 лет, выявлено снижение концентрации Са++ в примембранном слое (P < 0,01) при одновременном увеличении его интрацеллюлярного уровня (P < 0,001). Эти показатели указывают на завершенность дифференцировки лимфоцитов в указанные возрастные периоды.

Анализ структурно-функциональной организации исследуемых клеток крови у детей с ИВТ симпатикотонией позволил выявить их связь с вегетативной конституцией и установить различия закономерностей их становления. Анализируя динамику содержания перекиси водорода в онтогенезе, нами установлены различия его уровня в нейтрофилах и лимфоцитах (рис. 1, 2). Функциональная активность нейтрофилов у детей с симпатикотонией, в отличие от показателей у эйтоников, в периоде вытягивания характеризовалась более высоким содержанием Н2О2, сопряженным с накоплением Са++ в примембранном слое, снижением его трансмембранного транспорта, общего интрацеллюлярного кальция и активности СОД.

Рис. 1. Содержание перекиси водорода в нейтрофилах у здоровых детей в исследуемые периоды онтогенеза в зависимости от ИВТ (* - достоверность различий с симпатикотонией, ** - достоверность различий с ваготонией)

В периодах набора массы у детей этой группы, в сравнении с данными при эйтонии, на фоне идентичных величин Н2О2 отмечено снижение Са++ в примембранном слое и его внутриклеточного уровня. Эти изменения у детей 3-4 лет сочетались с увеличением Са++-АТФазы и каталазы, а в возрасте 8-11 лет - со снижением активности СОД и повышением уровня ОФЛ.

В лимфоцитах у наблюдаемых нами детей с ИВТ симпатикотонией, в сравнении с детьми эталонной группы здоровья, выявлены также существенные различия. Так, в I периоде набора массы, судя по кинетике зонда ХТЦ, в лимфоцитах выявлено снижение интрацеллюлярного Са++ при увеличении скорости его трансмембранного транспорта (Р<0,01) (рис. 3-4). Подобное состояние может быть сопряжено со структурно-функциональным преобразованием биомембран.

Рис. 2. Содержание перекиси водорода в лимфоцитах у здоровых детей в исследуемые периоды онтогенеза в зависимости от ИВТ (* - достоверность различий с симпатикотонией, ** - достоверность различий с ваготонией)

При этом уровень Н2О2 у детей данной группы, идентичный показателям при эйтонии, позволяет расценивать структурно-функциональные преобразования в лимфоцитах как адаптивный процесс, сопряженный с состоянием ВНС. По данным корреляционных взаимосвязей, синтез лимфоцитами Н2О2 обусловлен дефицитом холинэргических влияний: X - r = + 0,537, ОФЛ - r = - 0,541 и избытком адренэргических: ВПР - r = - 0,536 и ОФЛ - r = - 0,591, при которых продукция перекиси водорода предопределяется уровнем фосфолипидов (r = + 0,496). Следовательно, выявленный уровень Н2О2 в лимфоцитах у детей с симпатикотонией в возрасте 3-4 года обеспечивается спецификой обмена Са++, низкой активностью СОД и каталазы и предопределяется, в первую очередь, дефицитом в мембранах ОХС при относительном увеличении ОФЛ. В периоде вытягивания, судя по кинетике зонда ХТЦ, для детей с симпатикотонией в лимфоцитах, в сравнении с контрольной группой, характерно увеличение примембранной концентрации Са++, его внутриклеточной концентрации при снижении скорости трансмембранного транспорта.

При этом стабильность уровня перекиси водорода обусловлена снижением уровня каталазы (r=-0,838). Уменьшение скорости трансмембранного транспорта кальция, судя по увеличению коэффициентов ОХС/ОФЛ, ДК ПНЖК/ГПЛ и СОД/каталазы, может быть сопряжено с увеличением ОФЛ, накоплением ДК ПНЖК и ингибированием СОД. Это подтверждается взаимосвязями между активностью симпатического отдела ВНС: АМо и СОД (r = -0,735), ИВР и ОФЛ (r = +0,814) и ИН2-ОФЛ (r = +0,898). При этом уровень интрацеллюлярного кальция и скорость его транспорта определяется активностью Са++-АТФазы (r = + 0,822 и r = + 0,832 соответственно). В структуре лимфоцитов у детей этой группы не выявлено достоверных изменений, а в системе ферментов, регулирующих РОР, активность СОД была высокой (Р<0,05), что указывает на увеличение синтеза перекиси водорода. Эти изменения активности СОД могут быть сопряжены с повышением активности ксантиноксидазы в плазме крови, то есть, возможно, избыточным синтезом супероксида кислорода и его дисмутации с образованием Н2О2. Выявленные данные структурно-функциональных преобразований у детей с симпатикотонией указывают на более выраженную дифференцировку нейтрофилов в периоде вытягивания у детей с симпатикотонией.

Рис. 3. Показатели кинетики кальция в нейтрофилах у здоровых детей в зависимости от ИВТ в онтогенезе

(* - достоверность различий с ИВТ-симпатикотонией, ** - достоверность различий с ИВТ-ваготонией)