Размещено на http://www.allbest.ru/

Адаптационные процессы в системе иммунитета человека при воздействии факторов космического полета

14.03.08 - авиационная, космическая и морская медицина

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Рыкова Марина Петровна

Москва 2013

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Государственном научном центре Российской Федерации - Институте медико-биологических проблем Российской академии наук.

Научные консультанты: доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАМН Моруков Борис Владимирович

доктор медицинских наук, профессор, член-корреспондент РАН Буравкова Людмила Борисовна

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор, академик РАЕН, заведующий поликлиническим отделением №1 ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России Лусс Людмила Васильевна

доктор медицинских наук, профессор кафедры гистологии, цитологии и эмбриологии ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова Минздравсоцразвития России Яцковский Александр Никодимович

доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом cанитарно-гигиенической безопасность человека в искусственной среде обитания ФГБУН ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН Ильин Вячеслав Константинович

Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение “Научно-исследовательский испытательный центр подготовки космонавтов имени Ю.А. Гагарина”

Защита диссертации состоится «____» декабря 2013 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01, созданного на базе Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе д.76а.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Государственного научного центра Российской Федерации - Института медико-биологических проблем Российской академии наук по адресу (123007, г. Москва, Хорошевское шоссе д.76а).

Автореферат разослан «____». сентября 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук М.А. Левинских

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Для жизнедеятельности организма, для его существования всеобъемлющее значение имеет постоянство внутренней среды. Живой организм является ультрастабильной системой, которая осуществляет активный поиск наиболее оптимального и наиболее устойчивого состояния (Горизонтов П.Д., 1981; Нефедов В.П., Ясайтис А.А., Новосельцев В.Н. и др. 1991; Наточин Ю.В., 2002). Этот поиск приводит к адаптации, т.е. к поддержанию некоторых важных переменных показателей организма в физиологических границах, несмотря на изменение обычных условий существования. Начало третьего тысячелетия отмечено ростом интереса мирового сообщества к межпланетным полетам. Об этом свидетельствует интенсивная разработка проектов, связанных с возможностью пилотируемых полетов на спутник Земли - Луну, и на одну из планет Солнечной системы - Марс, представляющих наибольший интерес для исследователей. Несомненно, для осуществления полета человека к Марсу необходимо решение комплекса проблем, в частности, выяснение закономерностей адаптации к длительному воздействию факторов космического полета (Григорьев А.И., 2007). Актуальность исследований процессов адаптации организма к различным неблагоприятным условиям существования на борту космического объекта (в частности, к невесомости) и последующей реадаптации к земным условиям связана, прежде всего, с тем, что изучение этих процессов позволяет глубже понять: что есть физиологическая адаптация, каковы ее пределы в различных системах организма, насколько стабильна эта адаптация и какой ценой для организма она достигается (Газенко О.Г., Григорьев А.И., Гюрджиан А.А., 1991).

Одним из факторов, которые могут лимитировать увеличение продолжительности пребывания человека в условиях космического полета, является снижение адаптивных возможностей одной из ключевых интегральных и регуляторных систем организма человека, направленной на сохранение и поддержание генетического гомеостаза организма, - иммунной системы. Практика полетов длительностью до одного года и более подтверждает, что человек может не только успешно приспосабливаться к существованию в условиях микрогравитации, но и эффективно осуществлять профессиональную деятельность, а после полетов сравнительно быстро реадаптироваться к земному уровню гравитации. В то же время за последние десятилетия накоплены данные, свидетельствующие о том, что под влиянием действия комплекса факторов космического полета у космонавтов и астронавтов, совершивших полеты различной продолжительности на кораблях типа «Салют», «Апполон», «Союз» и «Спейс Шаттл», а также на орбитальных станциях «Скайлэб», «Салют-6, 7» и «МИР», происходят изменения в функционировании системы иммунитета (Константинова И.В., 1988; Stowe R.P., Sams C.F. Mehta S.K. et al., 1999; Sonnenfeld G, Butel JS, Shearer WT., 2003; Gueguinou N., Huin-Schohn C., Bascove M. Et al., 2009).

За значительный отрезок времени, прошедший с начала исследований влияния условий космического полета на организм человека, в связи с быстрым и все ускоряющимся прогрессом естественных наук (в том числе в иммунологии, клеточной и молекулярной биологии) не только существенно изменились подходы к изучению иммунитета космонавтов, но и стало совершенно очевидно, что, поскольку иммунная система, как и всякая другая гомеостатическая система, не является конгломератом отдельных элементов, а представляет собой сложную систему, обладающую организацией и целостностью (Петров Р.В., 1987; Лозовой В.П., 1988; Хаитов Р.М., 2001; Сепиашвили Р.И., 2003), то для реального суждения о направленности и динамики развития адаптационных изменений иммунной системы при воздействии факторов космического полета необходима интегральная оценка всей системы иммунитета. Представляется, что такие исследования имеют и теоретический, и прикладной аспекты, так как только основываясь на понимании адаптационных реакций иммунной системы возможно разработать эффективные меры профилактики и коррекции неблагоприятного воздействия условий космического полета на организм человека.

Цель и задачи исследования

Целью данной работы является комплексное изучение адаптационных возможностей системы иммунитета человека к реальным и моделируемым факторам космического полета.

В ходе работы решались следующие задачи:

изучить особенности реакций иммунокомпетентных клеток при моделировании в наземных условиях различных факторов космического полета;

оценить количественное содержание и функциональную активность клеточных факторов врожденного и адаптивного иммунитета у космонавтов до и после космических полетов различной продолжительности;

исследовать механизмы адаптационной перестройки системы иммунитета в ответ на воздействие факторов космического полета;

разработать основные принципы оценки эффективности средств профилактики неблагоприятного воздействия факторов космического полета на систему иммунитета человека.

Научная новизна

В проведенных исследованиях впервые был использован комплексный подход оценки врожденного и адаптивного иммунитета человека при анализе процессов адаптации системы иммунитета к воздействию факторов космического полета. При иммунологическом обследовании космонавтов до и после завершения космических полетов различной продолжительности и испытателей-добровольцев, находившихся в условиях наземного моделирования факторов космического полета, установлено, что процесс адаптации реализуется по мобилизационному типу компенсаторно-приспособительных реакций. При этом происходит перестройка уровня функционирования иммунной системы, проявляющаяся разнонаправленными сдвигами субпопуляционного состава клеточных факторов иммунной системы и их функциональной активности с преобладанием показателей активации. Отмеченное в ряде случаев угнетение функциональной активности иммунокомпетентных клеток может быть расценено не только как один из признаков истощения функциональных резервов иммунной системы, но и признаком состояния «риска» развития вторичного иммунодефицита.

Впервые показано, что адаптация системы иммунитета человека к условиям космического полета достигается ценой значительного повышения напряженности ее функционирования на уровне системных взаимоотношений иммунокомпетентных клеток. Выявлено, что кратковременное воздействие факторов космического полета ведет к интенсификации работы иммунной системы, проявляющейся в повышении связанности ее компонентов, тогда как длительное воздействие этих факторов приводит к перенапряжению, а в дальнейшем и к истощению функциональных резервов иммунной системы, проявляющемся в ослаблении связанности ее компонентов.

Установлено, что изменения в функционировании системы иммунного гомеостаза при действии комплекса факторов космического полета обеспечиваются различными механизмами. Впервые показано, что нарушение функций Т-звена иммунитета может быть связано как с изолированными, так и сочетанными изменениями главных этапов иммунного ответа, т.е. активации, пролиферации и регуляции. Выявлены основные типы реакции Т-звена иммунитета на условия длительного космического полета: снижение способности Т-лимфоцитов к пролиферации со снижением их способности к активации, свидетельствующее о нарушениях в системе иммунитета на уровне процессов активации; снижение способности Т-лимфоцитов к пролиферации с сохранением их способности к активации. Комплексное исследование показателей, характеризующих состояние иммунной и цитокиновой систем, впервые позволило оценить роль цитокинов в формирования сдвигов в системе иммунитета при действии на организм человека факторов космического полета. Показано, что, снижение функциональной активности Т-лимфоцитов космонавтов в периоде послеполетной реадаптации определяется не столько недостатком ИЛ-2, сколько повышением продукции ИЛ-10.

Теоретическая и практическая значимость работы

Результаты комплексного исследования показателей, характеризующих состояние иммунной системы, при действии факторов космического полета позволяют более полно представить механизмы адаптации физиологических систем организма человека.

Практическая значимость работы заключается в обосновании необходимости при отборе «устойчивых» к воздействию экстремальных факторов орбитального полета космонавтов, а также для прогноза адаптационных возможностей организма членов экипажей к условиям межпланетного космического полета включать в предполетный контроль методы оценки функциональных резервов системы иммунного гомеостаза.

Практическую значимость представляют также разработанные теоретические положения, которые могут быть использованы для обоснования, разработки и апробации новых, перспективных средств профилактики и коррекции неблагоприятных сдвигов в системе иммунитета в условиях длительных орбитальных и межпланетных полетов.

Положения, выносимые на защиту

1. Механизмы адаптационной перестройки системы иммунитета человека в ответ на комплексное воздействие факторов космического полета закономерно приводят к изменению параметров, характеризующих состояние врожденного и адаптивного иммунитета. Характер сдвигов на измененные условия среды обитания в начале однотипен и включает активацию иммунной системы. В свою очередь длительная активация может приводить к истощению резервных возможностей этой гомеостатической системы, что проявляется в снижении содержания функционально активных зрелых иммунокомпетентных клеток, обеспечивающих защиту организма. Выраженность этих изменений зависит от индивидуальных особенностей функционирования системы иммунитета.

2. Изменения в функционировании системы иммунного гомеостаза человека при адаптации к комплексу факторов космического полета происходят на различных уровнях иммунного процесса: активации, пролиферации, дифференцировки.

3. Адаптация системы иммунитета к факторам космического полета достигается ценой значительного повышения напряженности ее функционирования. Длительное пребывание в условиях орбитального космического полета может приводить к дисрегуляции иммунной системы космонавтов.

4. Использование функциональных тестов, характеризующих резервные возможности иммунной системы, позволяет оценить эффективность профилактических и коррегирующих мероприятий с учетом индивидуальных возможностей организма космонавтов.

Апробация работы

Основные результаты и положения диссертации были представлены и обсуждены на XI, XVII Международных симпозиумах «Человек в космосе» (Тулуза, 1995; Москва, 2009 г.); Международной конференции «Гипокинезия (Медицинские и психологические проблемы)» (Москва, 1997 г.), Международном симпозиуме «Международная научная кооперация на борту орбитальной станции Мир» (Лион, 2001), XIII Международной конференции «Космическая биология и авиакосмическая медицина» (Москва, 2006 г.), LX конгрессе Международной астронавтической федерации ( Тэджон, 2009), XXI съезде Физиологического общества им. И.П.Павлова (Калуга, 2010 г.), Международном симпозиуме по результатам экспериментов, моделирующих пилотируемый полет на Марс (Марс-500) (Москва, 2012 г.)

По теме диссертации опубликовано 58печатных работ, в том числе 17 статей в журналах из перечня ВАК РФ.

Диссертация апробирована на заседании секции «Космическая физиология и биология» Ученого совета ГНЦ РФ - ИМБП РАН «Космическая физиология и биология» 02.07. 2013 г.

Связь работы с научными программами

Работа выполнена при поддержке программ РАН и Роскосмоса, а также грантов президента РФ “Поддержка ведущих научных школ» и РФФИ.

Структура и объем диссертации

Диссертация изложена на 93 страницах и состоит из глав: «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы исследований», «Результаты и обсуждение», «Выводы» и «Список литературы». Текст диссертации изложен на 216 страницах, содержит 34 рисунков и 25 таблиц. Список литературы состоит из 289 цитируемых источников, из которых 163 - на русском и 126 - на иностранном языке.

иммунокомпетентный клетка космический полет

Основное СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объем и условия исследований

Содержание и общий объем проведенных исследований представлены в таблице 1.

Таблица 1

Объем и структура исследований

№№ п/п	Направления исследований	Продолжительность (сутки)	Количество обследованных
1.	Космические полеты на орбитальной станции Мир
1.1	Кратковременные космические полеты	8-31	18
1.2	Продолжительные космические полеты	115-428	52
2.	Космические полеты на МКС
2.1	Кратковременные космические полеты	8-10	20
2.2	Продолжительные космические полеты	125- 215	41
3.	Модельные эксперименты с «сухой» иммерсией без применения средств профилактики
3.1. 3.2.	Модельный эксперимент с «сухой» иммерсией Модельный эксперимент с «сухой» иммерсией	7 5	5 13
4.	Модельный эксперимент с антиортостатической (-5?) гипокинезией (АНОГ) без применения профилактических средств	120	6
5. 5.1. 5.2.	Модельные эксперименты с длительной изоляцией в гермообъеме: Модельный эксперимент с длительной изоляцией в гермообъекте (SFINCSS-99) Модельный эксперимент с 520-суточной изоляцией, моделирующем элементы межпланетной экспедиции к Марсу	110-240 520	11 6
6. 6.1. 6.2.	Эксперименты с физическими нагрузками: Эксперименты с силовыми тренировками по схеме классической силовой тренировки и по схеме низкоинтенсивной силовой тренировки без расслабления с нагрузкой 50% от максимальной произвольной силы Эксперименты с длительной аэробной нагрузкой по программе низкоскоростной эксцентрической тренировки, по программе высокоскоростной эксцентрической тренировки и по программе высокоскоростной концентрической тренировки.	56 56	37 22

Исследования влияния факторов реального космического полета на состояние системы иммунитета были выполнены до и после завершения кратковременных (8-31 суток) и длительных (115-438 суток) экспедиций на орбитальных космических станциях Мир и МКС с участием 131 космонавта.

Моделирование факторов космического полета в наземных условиях (5- и 7-суточная «сухая» иммерсия, 120-суточная АНОГ -5?, 110-520-суточная изоляция в гермообъеме) проводили на экспериментальных базах ГНЦ РФ ИМБП РАН. Общие условия проведения комплексных испытаний, циклограмма исследований, научно-практические цели экспериментов описаны Козловской И.Б. (2008), Лариной И.М. с соавт. (1999), Барановым В.М. (2001), Моруковым Б.В. (2011).

Эксперименты с физическими нагрузками включали эксперименты с силовыми тренировками по схеме классической силовой тренировки и по схеме низкоинтенсивной силовой тренировки без расслабления, а также эксперименты с длительной аэробной нагрузкой по программе низкоскоростной эксцентрической тренировки, по программе высокоскоростной эксцентрической тренировки и по программе высокоскоростной концентрической тренировки (Виноградова О.Л. и соавт, 2007).

Материалом для исследования являлась периферическая кровь космонавтов и испытателей-добровольцев, участвовавших в наземных модельных экспериментах. Взятие проб крови у космонавтов проводилось за 60 суток до старта и на 1-7-е сутки после приземления, у испытателей-добровольцев - в фоновом периоде, во время воздействия и после его завершения. Испытатели-добровольцы, принимавшие участие в наземных экспериментах, были допущены врачебно-экспертной комиссией ГНЦ РФ - ИМБП РАН к проведению испытаний. Предварительно процедуры и методики исследований были рассмотрены Комиссией по биомедицинской этике при ГНЦ РФ-ИМБП РАН, а от испытателей, принимавших участие в исследованиях, было получено добровольное информированное согласие.

Методы исследований

Иммунологическое обследование проводилось с использованием методов проточной цитофлюориметрии, иммуноферментного анализа, радиоиммунологического анализа, турбидиметрии и включало изучение следующих параметров:

содержание в периферической крови, лейкоцитов, лимфоцитов, моноцитов и нейтрофильных гранулоцитов;

система врожденного иммунитета: содержание в периферической крови моноцитов и гранулоцитов, экспрессирующих сигнальные и эндоцитозные образраспознающие рецепторы (TLR2, TLR 4, TLR6, CD36, CD206), молекулы межклеточной адгезии (CD24, CD54) и Fc-рецептор (CD16); фагоцитарная активность моноцитов и гранулоцитов периферической крови;

система естественной цитотоксичности: содержание в периферической крови ЕК (CD16⁺ и СD56⁺-лимфоциты); содержание ЕК, экспрессирующих активационный маркер CD69, в культурах клеток in vitro при стимуляции интерлейкином 2 (ИЛ2); цитотоксическая активность ЕК-клеток периферической крови;

Т-звено адаптивного иммунитета: содержание в периферической крови CD3⁺, CD3⁺CD4⁺, CD3⁺CD8⁺, CD3⁺CD25⁺, CD4⁺CD25^+Bright, CD3⁺HLA-DR⁺, CD3⁺CD71⁺, CD3⁺CD95⁺, CD4⁺CD45RА⁺, CD4⁺CD45RО⁺, CD4⁺38⁺- CD8⁺CD38⁺-лимфоцитов; содержание CD3⁺CD69⁺ лимфоцитов в нестимулированных и стимулированных митогеном (ФГА) 18-часовых культурах мононуклеарных клеток; содержание CD3⁺CD25⁺-лимфоцитов в нестимулированных и стимулированных митогеном (ФГА) 48-часовых культурах мононуклеарных клеток; функциональная активность Т-лимфоцитов по уровню спонтанного и индуцированного митогенного (ФГА-фитогемагглютинин) пролиферативного ответа в 48-часовых культурах мононуклеарных клеток;

В-звено адаптивного иммунитета: содержание в периферической крови CD19⁺, CD20⁺, CD19⁺CD23⁺-лимфоцитов; содержание CD19⁺CD69⁺ лимфоцитов в нестимулированных и стимулированных митогеном лаконоса (МЛ) 18-часовых культурах мононуклеарных клеток; функциональная активность В-лимфоцитов по уровню спонтанного и индуцированного МЛ пролиферативного ответа в 5-суточных культурах мононуклеарных клеток; количество IgA, IgM, IgG в нестимулированных и стимулированных МЛ 5-суточных культурах мононуклеарных клеток; уровень сывороточных иммуноглобулинов классов A, M, G (IgA, IgM, IgG);

апоптоз иммунокомпетентных клеток;

цитокиновый профиль: уровень цитокинов в сыворотке крови - ИЛ-1a, ИЛ-1b, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12р70, ИФНg, ФНОa и ФНОb; способность иммунокомпетентных клеток секретировать цитокины - ИЛ-1b, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-8, ИЛ-10, ИЛ-12р70, ИФНg, ФНОa и ФНОb, в системе in vitro при стимуляции ЛПС и ФГА.

содержание белка теплового шока HSP70 в сыворотке крови.

Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием пакета прикладных программ «Statistica 6.0» для Windows. Достоверность уровня различия сравниваемых величин оценивали, используя непараметрический метод анализа повторных измерений Уилкоксона. Данные представлены в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего, медианы и интерквартильной широты (0,25-0,75).

Результаты исследований и их обсуждение

1. Исследования системы иммунитета человека в условиях наземного моделирования факторов космического полета

1.1. Эксперименты с «сухой» иммерсией. Показано, что при пребывании испытателей-добровольцев в течение 5-7 суток в условиях «сухой» иммерсии (СИ) наблюдалось изменение показателей, характеризующих состояние врожденного и адаптивного иммунитета. Отклонения изученных иммунных параметров были подвержены значительной индивидуальной вариабельности. Так, у 58% обследованных было отмечено повышение относительного содержания в периферической крови моноцитов (Мн) и нейтрофильных гранулоцитов (НГ), экспрессирующих на своей поверхности сигнальные образраспознающие рецепторы (pattern recognition receptors, PRR) - То11-подобных рецепторов (Toll-like receptors, TLR) 2, 4, и 6. В то же время у некоторых из обследованных пребывание в условиях СИ, напротив, привело к существенному снижению содержания в периферической крови Мн и НГ, экспрессирующих TLR. При этом в обследованной группе испытателей-добровольцев были установлены сильные прямые корреляционные связи между уровнем белка теплового шока с молекулярной массой 70 кДа (HSP70) в сыворотке крови и содержанием в периферической крови Мн, экспрессирующих TLR2 (r=0,88; р<0,001) и TLR4 (r=0,78; р<0,001).

Кроме того, на заключительном этапе СИ в 42% наблюдений отмечалось не только повышение содержания в периферической крови лимфоцитов-естественных киллеров (ЕК) - подклассов лимфоцитов, экспрессирующих мембранные молекулы CD56 (CD56^dim+- и CD56^bright+-клеток) и CD16, а также их субтипов, имеющих высокую, умеренную и низкую цитолитическую активность (CD56⁺CD16⁺, CD16^-CD56⁺ и CD16⁺CD56^-), но и повышение индуцированной ИЛ-2 способности CD56⁺-клеток экспрессировать ранний активационный маркер CD69.

Анализ такого показателя как соотношение числа отклонений абсолютного и относительного содержания в периферической крови субпопуляций клеточных факторов адаптивного иммунитета - Т- и В-лимфоцитов, в сторону повышения от фоновых значений к числу отклонений в сторону снижения показал, что у 54% обследованных испытателей было выявлено его уменьшение. При идентификации раннего активационного маркера CD69 на Т-лимфоцитах, стимулированных ФГА в культурах клеток in vitro, у части обследованных было также отмечено снижение количество CD3⁺-клеток, экспрессирующих этот маркер, что свидетельствует о недостаточном запасе функциональных резервов эффекторных клеток Т-звена адаптивного иммунитета.

Таким образом, совокупность выявленных изменений параметров врожденного и адаптивного иммунитета при воздействии на организм факторов снижения опоры, свидетельствует о том, что перенастройка на новый уровень функционирования в новых условиях происходит в зависимости от индивидуальных особенностей и функциональных резервов иммунной системы.

1.2. Эксперимент со 120-суточной антиортостатической гипокинезией (АНОГ). Показано, что при длительном воздействии на организм здоровых добровольцев условий пребывания в АНОГ индивидуальные показатели, характеризующие функциональное состояние и содержание в периферической крови клеточных факторов системы естественной цитотоксичности, характеризовались большой вариабельностью и разнонаправленностью изменений. На 110-е сутки АНОГ отмечено три типа реакций этой системы: снижение цитотоксической активности и количества ЕК-клеток c фенотипом CD16⁺; повышение цитотоксической активности и количества CD16⁺-клеток; угнетение цитотоксической активности при повышении количества CD16⁺-клеток. Таким образом, длительное пребывание в неблагоприятных для человека условиях АНОГ приводит к активной мобилизации резервов системы естественной цитотоксичности, признаком которой является повышение выхода в циркуляцию ЕК-клеток. А снижение функциональной активности эффекторных клеток являются следствием перенапряжения этой системы у лиц, «неустойчивых» к воздействию экстремальных факторов.

Изучение функциональной активности Т-лимфоцитов выявило на заключительном этапе АНОГ снижение пролиферативной активности Т-лимфоцитов в ответ на стимуляцию ФГА в 48-часовых культурах клеток (на 39,1±7,87%; р<0,05). Анализ фенотипа иммунокомпетентных клеток позволил установить, что в этот период наблюдалось значительное повышение экспрессии рецепторов CD25 на лимфоцитах периферической крови (рис. 1).



Рис. 1 ФГА-индуцированная пролиферативная активность Т-лимфоцитов в 48-часовых культурах клеток (% бластов) и процент CD25⁺-Т-лимфоцитов в периферической крови обследуемых в условиях 120-суточной АНОГ (индивидуальные данные)

По-видимому, усиление экспрессии рецепторов к интерлейкину-2 на Т-лимфоцитах периферической крови, отражающее состояние активации иммунной системы in vivo в результате эндогенной антигенной стимуляции, возможно опосредованной продуктами распада мышечной ткани, является важным фактором нарушения Т-звена иммунитета при длительном ограничении подвижности.

Таким образом, результаты исследований показали, что при длительном пребывании здоровых добровольцев в условиях АНОГ возникают негативные сдвиги в системе иммунитета, проявляющиеся на уровне процессов активации и способности иммуноцитов к дифференцировке.

1.3. Эксперимент с 520-суточной изоляцией, моделирующей элементы межпланетной экспедиции к Марсу. В ходе эксперимента отрабатывались принципы, методы и аппаратура для автономного обеспечения марсианской экспедиции, включая новые методы и средства профилактики неблагоприятного действия факторов межпланетного полета (Григорьев А.И., Моруков Б.В., 2011). Результаты иммунологических исследований показали, что наиболее выраженными и закономерно наблюдающимися уже после 120 суток пребывания в условиях изоляции являются изменения в системе TLR. которые связаны со значительным снижением абсолютного содержания TLR2⁺-, TLR4⁺- и TLR6⁺CD14⁺-клеток в периферической крови (рис. 2А) и процентного содержания TLR2⁺-, TLR4⁺- и TLR6⁺-клеток среди CD14⁺-Мн, а также снижение абсолютного и процентного содержания в периферической крови НГ, экспрессирующих эти рецепторы. В то же время на протяжении всего периода экспериментального воздействия лиганд TLR4 ЛПС оказывал выраженное стимулирующее действие на выработку цитокинов (рис. 2Б), что свидетельствует о высокой функциональной активности системы TLR врожденного иммунитета. Следует отметить, что в условиях изоляции изменения количества Мн и НГ, экспрессирующих TLR, имели волнообразный характер. Учитывая тот факт, что TLR непосредственно и специфически взаимодействуют со стереотипными и консервативными в эволюции молекулами микроорганизмов, присущие одновременно большим систематическим группам микробов (pathogen-associated molecular patterns, PAMP) [Medzhitov R., 2007], можно с большой долей вероятности предположить, что отмеченные особенности изменений в системе TLR обусловлены волнообразным характером периодов активации и стагнации условно-патогенной микрофлоры.

Анализ фагоцитарной активности Мн выявил повышение на 10-15% этого показателя на 168 сутки изоляции. Однако, в дальнейшем, происходило её постепенное уменьшение. Динамика фагоцитарной активности НГ несколько отличалась от моноцитарной и имела статистически значимое повышение на 168, 248 и 360 сутки изоляции. Таким образом, исследование одной из эффекторных функций клеточных факторов естественной резистентности - поглотительной способности, позволило установить, что характерной чертой адаптационной перестройки системы врожденного иммунитета в условиях длительного пребывания в гермообъекте является высокая активность фагоцитирующих клеток.

Рис. 2 Динамика показателей врожденного и адаптивного иммунитета у добровольцев-испытателей в эксперименте с 520-суточной изоляцией в гермообъекте с искусственной средой обитания: А - процентное содержание клеток, экспрессирующих на своей мембране рецепторы TLR2⁺, TLR4⁺, TLR6⁺, среди CD14⁺-моноцитов; Б - продукция цитокинов мононулеарными клетками периферической крови в ответ на стимуляцию ЛПС в 24-часовых культурах клеток in vitro; В- содержание ЕК-лимфоцитов в периферической крови; Г - содержание ЕК - лимфоцитов, экспрессирующих ранний маркер активации CD69 в 18-часовых нестимулированных и стимулированных ИЛ-2 культурах клеток Д - содержание В - лимфоцитов, экспрессирующих ранний маркер активации CD69 в 18-часовых культурах клеток в присутствии МЛ; содержание Т - лимфоцитов, экспрессирующих ранний маркер активации CD69 в 18-часовых культурах клеток в присутствии ФГА; содержание Т - лимфоцитов, экспрессирующих маркер активации CD25 в 48-часовых культурах клеток в присутствии ФГА; Е - продукция цитокинов мононулеарными клетками периферической крови в ответ на стимуляцию ФГА в 48-часовых культурах клеток in vitro

* - Достоверное различие с исходным уровнем, р <0.05.

Анализ результатов, полученных при изучении состояния системы естественной цитотоксичности, показал, что, начиная с 12-ти месяцев пребывания в гермообъекте и заканчивая 7-ми сутками восстановительного периода, у испытателей-добровольцев наблюдалось значительное уменьшение не только относительного, но и абсолютного содержания в периферической крови зрелых циркулирующих CD3^-CD16⁺CD56⁺-лимфоцитов (рис. 2В). Исследование особенностей фенотипа ЕК позволило установить, что выявленные изменения были связаны со снижением уровня в периферической крови как подкласса ЕК-лимфоцитов, экспрессирующих мембранную молекулу CD16, так и подкласса ЕК-лимфоцитов, экспрессирующих мембранную молекулу CD56. На заключительном этапе экспериментального воздействия у большинства обследованных наблюдалось преимущественно уменьшение содержания лимфоцитов, относящихся к субтипу ЕК-лимфоцитов с высокой цитолитической активностью (CD56⁺CD16⁺ЕК- клеток), а не субтипов ЕК-лимфоцитов, имеющих умеренную и низкую цитолитическую активность (CD16^-CD56⁺ - и CD16⁺CD56^- -ЕК-клетки). Таким образом, перестройка системы естественной цитотоксичности в ответ на воздействие факторов пребывания в условиях гермообъекта, влияющих, в частности, на взаимоотношения организма с представителями, как экзогенной микрофлоры, так и аутомикрофлоры, потребовала определенного напряжения этой системы, о чем свидетельствует изменение уровня эффекторных клеток в периферической крови у большинства обследуемых.

При изучении экспрессии раннего активационного маркера CD69 на CD56⁺-лимфоцитах в нестимулированных и стимулированных ИЛ-2 18-часовых культурах клеток к 4-му месяцу пребывания в экспериментальных условиях наблюдалось снижение экспрессии СD69 на ЕК-лимфоцитах как в отсутствии стимуляции, так и при культивировании в присутствии ИЛ-2 (рис. 2Г). Такой феномен может отражать не только снижение функциональной потенции ЕК-клеток, но и свидетельствовать об истощении резервных возможностей системы естественной цитотоксичности.

Изучение количественных характеристик клеточных факторов адаптивного иммунитета показало, что после 8 месяцев пребывания в условиях экспериментального воздействия наблюдалось значительное увеличение доли CD4⁺- клеток в популяции Т-лимфоцитов, связанное, с увеличением уровня как «наивных» CD4⁺-Т-клеток (CD4⁺CD45RA⁺), так и CD4⁺-Т-клеток памяти (CD4⁺CD45RО⁺). Повышение относительного и абсолютного содержания CD3⁺CD4⁺-лимфоцитов в периферической крови, по-видимому, связано со сдвигом равновесия системы в сторону интенсификации образования факторов, стимулирующих иммунные реакции. В 50% наблюдений также в отдельные периоды пребывания в гермообъекте наблюдалось повышение относительного и/или абсолютного содержания CD4⁺CD25^+bright -лимфоцитов.

После года пребывания в гермообъекте и до окончания воздействия отмечалось повышение способности Т- и В-лимфоцитов экспрессировать на своей поверхности ранний активационный маркер CD69, а также повышение ФГА-индуцированной продукции цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови (рис 2Д, рис. 2Е). Отличительной особенностью цитокинового профиля на этапе, соответствующему по сценарию эксперимента возвращению экипажа на Землю, являлось развитие дисбаланса цитокинов в сторону Th2 гуморального иммунного ответа, о чем свидетельствует снижение соотношения ИФН?, являющегося маркером клеточно-опосредованных иммунных реакций Th1, к ИЛ-10, являющегося маркером гуморальных иммунных реакций Th2.

Таким образом, использование функционального подхода к оценке адаптивного иммунитета позволило установить, что для поддержания гомеостаза в условиях длительного воздействии на организм человека комплекса факторов изоляции в гермообъекте требуется высокая степень напряжения клеточных факторов этого звена иммунной системы. Выраженные признаки активной мобилизации механизмов адаптивного иммунитета наблюдались на заключительном этапе эксперимента. Такой характер сдвигов свидетельствует о том, что в этот период произошел переход функциональной активности иммунокомпетентных клеток на новый уровень, соответствующий условиям длительной изоляции в гермообъекте.

2. Исследование системы иммунитета человека при воздействии факторов космического полета

2.1. Влияние факторов космического полета на систему образраспознающих рецепторов врожденного иммунитета. Анализ результатов, полученных при оценке экспрессии TLR Мн и НГ периферической крови у членов экипажей экспедиций на МКС выявил высокую вариабельность и разнонаправленную динамику этих параметров (рис. 3). Так, у 5 космонавтов на 1-е сутки после возвращения на Землю было отмечено повышение относительного содержания в периферической крови Мн и НГ, экспрессирующих на своей поверхности TLR (рис. 3, группа А). В то же время у 9 космонавтов в раннем периоде реадаптации, напротив, наблюдалось снижение содержания в периферической крови клеточных факторов врожденного иммунитета, экспрессирующих эти рецепторы (рис. 3, группа Б).



Рис. 3 Показатели врожденного иммунитета у космонавтов на 1-е сутки после завершения длительных космических полетов (процент от предполетного уровня)

Исследование уровня HSP70 выявило на 1-е сутки после приземления значительное повышение концентрации HSP70 (р<0,05).

Анализ результатов, полученных при оценке уровня HSP70 и количества клеток врожденного иммунитета, экспрессирующих TLR, в периферической крови космонавтов, отчасти проливает свет на роль стресса в изменении функции иммунной системы космонавтов в раннем периоде реадаптации к земным условиям после завершения длительных космических полетов. Общеизвестно, что при воздействии на организм различных стрессовых факторов, включая физические и психологические, инфекционные, токсические, происходит массивная экспрессия и возрастание уровня HSP, в частности HSP70 ?Wendling U., Paul L., van der Zee R. et al., 2000], оказывающего протективное действие на клетки моноцитарно-гранулоцитарного ряда, и как следствие этого повышение количества Мн и НГ, экспрессирующих на своей поверхности TLR. Таким образом, возможно, что выявленное увеличение в периферической крови космонавтов количества Мн и НГ, экспрессирующих сигнальные образраспознающие рецепторы, является ответной реакцией системы врожденного иммунитета на стресс-факторы заключительного этапа полета. В то же время наиболее вероятной причиной отмеченного в раннем послеполетном периоде у части обследованных космонавтов уменьшения количества МН и НГ, экспрессирующих TLR2, TLR4 и TLR6 рецепторы, может быть истощение костномозгового пула.

Анализ одного из характеризующих функциональное состояние TLR показателей - продукции цитокинов клетками периферической крови в ответ на лиганд TLR4 ЛПС in vitro, показал, что в раннем периоде реадаптации к земным условиям после завершения длительных космических полетов, в супернатантах, полученных при 24-часовой инкубации мононуклеарных клеток, наблюдалась тенденция к снижению синтеза провоспалительных цитокинов (ИЛ-1в, ИЛ-6, ИЛ-8, ФНОб), причем глубина выявленных изменений не зависела от уровня в периферической крови моноцитов и гранулоцитов, экспрессирующих на своей поверхности CD14/TLR4 рецепторный комплекс (рис. 4). Такое снижение могло бы быть объяснено увеличением ЛПС-индуцированного синтеза ИЛ-10, однако, проведённые исследования наглядно продемонстрировали также снижение и этого показателя на первые сутки после завершения длительных космических полетов.



Рис. 4 Продукция цитокинов мононуклеарными клетками периферической крови космонавтов до и после длительных космических полетов на МКС: I - продукция цитокинов в 18-часовых нестимулированных культурах клеток; II - продукция цитокинов в 18-часовых ЛПС- стимулированных культурах клеток

Результаты, полученные при изучении содержания в периферической крови обследованных космонавтов Мн и НГ, экспрессирующих на своей мембране эндоцитозные (маннозный рецептор - CD206, скавенджер рецептор - CD36, интегрины - CD11b/CD18) PRR, а также рецептор цитотоксичности (CD16) и активационные молекулы (CD24 и CD54), свидетельствуют об индивидуальном характере изменений фенотипа этих популяций клеток в раннем послеполетном периоде (рис. 3).

Таким образом, процесс адаптации системы PRR врожденного иммунитета к комплексу факторов длительного космического полета реализуется через полиморфные изменения системы TLR клеточных факторов врожденного иммунитета. Активизацию работы системы врожденного иммунитета, осуществление ее на качественно ином уровне, по-видимому, следует считать признаком адаптационной перестройки организма в ответ на длительное комплексное воздействие неблагоприятных факторов, направленных на сохранение иммунного гомеостаза. Однако в ряде случаев выявленное снижение функциональной активности иммунокомпетентных клеток может быть расценено не только как один из признаков перенапряжения и истощения функциональных резервов системы врожденного иммунитета космонавта к условиям космического полета, но и признаком состояния «риска» развития вторичного иммунодефицита.

2.2. Влияние факторов космического полета на систему естественной цитотоксичности. Анализ изменений параметров, характеризующих систему естественной цитотоксичности, показал, что по усредненным данным на первые и седьмые сутки после возвращения на Землю наблюдалось существенное снижение индекса цитотоксичности (ИЦ) ЕК (рис. 5). Однако анализ динамики индивидуальных значений ИЦ выявил несколько типов реакции системы естественной цитотоксичности на условия длительных космических полетов: уменьшение цитотоксической активности на первый день после приземления с тенденцией к увеличению показателя до предполетного уровня на 7 сутки периода реадаптации; отсутствие снижения цитотоксической активности на первый день после приземления и значительное угнетение цитотоксической активности на 7 сутки периода реадаптации; уменьшение цитотоксической активности на 1-7 день после полета; увеличение цитотоксической активности на первый день после приземления с тенденцией возвращения значения показателя к предполетному уровню в более поздние сроки обследования. Важно отметить, что у некоторых членов экипажей даже после 12 или 15 месяцев полета, функциональная активность ЕК-лимфоцитов была высокой, по крайней мере, во все послеполетные периоды обследования. Эти результаты указывают на то, что при достаточном запасе функциональных резервов иммунная система (или некоторые ее компоненты) может адаптироваться к длительному влиянию микрогравитации. Однако следует отметить, что анализ индуцированной ИЛ-2 экспрессии поверхностного клеточного маркера CD69 на ЕК-клетках периферической крови 17 космонавтов показал, что после завершения длительных полетов на борту МКС у всех обследованных наблюдалось значительное уменьшение доли клеток, экспрессирующих этот ранний активационный маркер, свидетельствующее о снижении функциональных резервов клеточных факторов естественной цитотоксичности.

Рис. 5 Функциональная активность ЕК-лимфоцитов и экспрессия раннего маркера активации CD69 на CD69⁺-ЕК-лимфоцитах

У космонавтов, совершивших космические полеты на Международной космической станции (МКС), наряду с изучением функциональной активности исследовались и фенотипические особенности ЕК периферической крови космонавтов. Показано, что в значительной части наблюдений угнетение цитотоксической активности отмечалось на фоне уменьшения процента циркулирующих ЕК с фенотипом CD3^-CD56⁺CD16⁺. Однако снижение цитотоксической активности ЕК клеток после космического полета нельзя связывать только с изменением количества циркулирующих

Размещено на http://www.allbest.ru/

Таблица 2

Показатели системы естественной цитотоксичности у космонавтов до и после космических полетов на МКС (М±m; медиана; нижний - 25% и верхний -75%, квартили)

Показатели	Длительные полеты	Короткие полеты
	До полета	1 сут	7 сут	До полета	1 сут
CD3-CD16+CD56+,	отн., %	14,5±0,87; 15; 9-18	10,3±0,92*; 10; 7-12	11,5±0,72*; 11; 9-15	22,8±3,07; 24; 14-28	13,6±1,37*; 14; 9-17
	абс., х109/л	0,278±0,0234; 0,26; 0,16-0,37	0,251±0,0229; 0,22; 0,16-0,32	0,234±0,0187*; 0,23; 0,15-0,30	0,398±0,0287; 0,17; 0,32-0,48	0,273±0,0346*; 0,18; 0,19-0,35
CD16+,	отн., %	15,2±1,29; 15; 10-19	9,1±1,52*; 8; 4-12	11,6±1,43*; 10; 6-16	24,0±4,84; 23; 15-35	14,0±1,79; 15; 11-16
	абс., х109/л	0,302 0,0349; 0,30; 0,20-0,39	0,225 0,0344; 0,20; 0,08-0,34	0,243 0,0352*; 0,21; 0,13-0,35	0,397±0,0688; 0,39; 0,33-0,53	0,285±0,0490; 0,26; 0,25-0,35
CD16+CD56+,	отн., %	11,5±1,06; 12; 7-14	5,7±0,83*; 6; 2-9	8,4±1,15*; 7; 4-12	21,4±4,26; 21; 13-31	11,8±1,93*; 12; 8-15
	абс., х109/л	0,225±0,0254; 0,19; 0,13-0,30	0,143±0,0241*; 0,11; 0,05-0,23	0,169±0,0236*; 0,16; 0,07-0,24	0,354±0,0604; 0,36; 0,28-0,47	0,239±0,0162*; 0,24; 0,19-0,28
CD16-CD56+,	отн., %	9,0±1,01; 7; 5-11	8,0±0,82; 8; 5-12	8,4±1,01; 7; 5-12	5,6±1,57; 4; 4-7	4,6±0,68; 4; 4-5
	абс., х109/л	0,170±0,0219; 0,12; 0,09-0,22	0,189±0,0290; 0,17; 0,09-0,24	0,173±0,0284; 0,13; 0,09-0,22	0,093±0,0233; 0,09; 0,06-0,12	0,090±0,0108; 0,09; 0,07-0,11
CD16+CD56-,	отн., %	3,7±0,61; 2; 1-6	3,5±1,07; 2; 1-5	3,1±0,76; 2; 1-4	2,6±0,68; 2; 2-3	2,2±0,37; 2; 2-3
	абс., х109/л	0,077±0,0147; 0,05; 0,02-0,12	0,080±0,0193; 0,05; 0,02-0,12	0,073±0,0210; 0,03; 0,02-0,11	0,043±0,0099; 0,04; 0,03-0,05	0,046±0,0106; 0,05; 0,03-0,07
CD56+,	отн., %	20,5±1,28; 19; 17-25	13,4±1,03*; 12; 11-16	16,3±1,47*; 15; 11-21	26,8±3,25; 28; 22-33	16,4±1,36*; 16; 14-19
	абс., х109/л	0,395±0,0340; 0,41; 0,24-0,51	0,327±0,0425*; 0,29; 0,20-0,38	0,334±0,0113*; 0,30; 0,19-0,42	0,444±0,0398; 0,48; 0,37-0,50	0,328±0,0398*; 0,31; 0,30-0,37
CD8+CD56+,	отн., %	11,0±1,18; 8; 6-15	8,6±0,91*; 7; 6-12	9,4±1,25*; 8; 5-14	26,8±3,25; 28; 22-33	16,4±1,36*; 16; 14-19
	абс., х109/л	0,213±0,0270; 0,18; 0,13-0,27	0,219±0,0330; 0,17; 0,11-0,29	0,211±0,0376*; 0,14; 0,10-0,28	0,444±0,0398; 0,48; 0,37-0,50	0,328±0,0398*; 0,31; 0,30-0,37
	CD11b+CD56+,¨отн., %

13,9?0,96;

14; 10-18

9,3?0,93*;

Размещено на http://www.allbest.ru/

9; 6-12¨

Размещено на http://www.allbest.ru/

12,3?1,50;

Размещено на http://www.allbest.ru/

11; 7-16¨

26,8?3,25;

Размещено на http://www.allbest.ru/

28; 22-33¨

Размещено на http://www.allbest.ru/

16,4?1,36*;

Размещено на http://www.allbest.ru/

16; 14-19¨
	абс., х109/л	0,266±0,0248; 0,24; 0,18-0,35	0,236±0,0374; 0,19; 0,13-0,29	0,247±0,0442*; 0,17; 0,14-0,33	0,444±_,0398; 0,48; 0,37-0,50	0,328±0,0398*; 0,31; 0,30-0,37

* -Достоверное различие с фоном (р<0,05)

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЕК. В частности, отмечены два варианта изменений уровня ЕК в периферической крови. Первый - процент CD3^-CD56⁺CD16⁺-лимфоцитов не изменялся или даже увеличивался по сравнению с предполетными значениями, а функциональная активность ЕК была снижена. Второй - процент CD3^-CD56⁺CD16⁺-лимфоцитов значительно уменьшался, однако цитотоксическая активность этих клеток существенно превышала предполетный уровень. Анализ фенотипических особенностей ЕК показал, что в раннем периоде реадаптации наблюдалось снижение содержания в периферической крови CD56⁺- клеток (как CD56^+dim -, так и CD56^+bright -клеток) и CD16⁺-клеток, связанное преимущественно с уменьшением уровня лимфоцитов, относящихся к субтипу CD56⁺CD16⁺ЕК- клеток, а не к субтипам CD16^-CD56⁺ - и CD16⁺CD56^- - клеток (табл. 2).

До настоящего времени остается неясным вопрос - происходят ли изменения ЕК уже во время полета или эти изменения вызваны исключительно действием на организм человека факторов посадки. Сравнение данных, полученных после коротких и длительных полетов, может пролить свет на понимание различий и взаимодействие между мультифакторным стрессом, связанным непосредственно с космическим полетом и стрессом, связанным с этапом приземления. Результаты исследований, проводившихся в предполетном периоде и после завершения коротких полетов (8-10 суток), выявили в раннем периоде реадаптации к земным условиям у некоторых из обследованных космонавтов уменьшение функциональной активности ЕК, снижение содержания ЕК в периферической крови и подавление способности ЕК к активации в ответ на стимуляцию ИЛ-2 в раннем периоде реадаптации к земным условиям. Следует отметить, что американскими исследователями у астронавтов, совершивших космические полеты продолжительностью 4-16 суток, также было отмечено угнетение цитотоксической активности и содержания в периферической крови ЕК [Tipton C.M., Greenleaf J.E., Jackson C.G., 1996; Sonnenfeld G., Shearer W.T., 2002; Mehta S.K., Kaur I., Grimm E.A. et al., 2001; Mills P.J., Meck J.V., Waters W.W. et al., 2001; Borchers A.T., Keen C.L., Gershwin M.E., 2002; Crucian B.E., Stowe R.P., Pierson D.L., Sams C.F., 2008 ]. Эти данные подтверждают, что стресс, который испытывают космонавты во время приземления (т.е. острый ответ на возвращение и реадаптацию к условиям земной гравитации), может вносить существенный вклад в ослабление функции ЕК-клеток. По всей видимости, эти изменения являются результатом действия совокупности многих факторов, включая нейропептидные гормоны, катахоламины (в особенности глюкокортикоиды) и др. [Meehan R., Whitson P., Sams C., 1993; Stowe R.P., Sams C.F., Pierson D.L., 2003]. Однако только исследования, проведенные непосредственно на борту орбитальной станции, позволят составить представление о реакции системы естественной цитотоксичности на условия космического полета. Создание новой методологии слежения за иммунологической резистентностью во время космического полета невозможно без предварительного исследования эффектов микрогравитации на изолированные иммунокомпетентные клетки. Изучение цитотоксической активности изолированных лимфоцитов крови человека при совместном культивировании с суспензионной линией человеческих эритролейкемических лимфобластоидных клеток К-562 в условиях микрогравитации было проведено в рамках космического эксперимента «Межклеточное взаимодействие». Этот эксперимент, выполненный российскими членами основных экипажей МКС-7-12, является первым и пока единственным осуществленным экспериментом, направленным на изучение влияния микрогравитации на ЕК. Для проведения исследований на борту МКС в ГНЦ РФ ИМБП РАН разработана модификация технологии с использованием культуры лимфоцитов человека и суспензионной культуры клеток-мишеней применительно к условиям на борту орбитальной космической станции, а также специальная укладка «ФИБРОБЛАСТ-1», предназначенная для доставки на борт МКС биологического материала и оборудования, необходимого для выполнения космонавтами во время космического полета основных операций, предусмотренных программой эксперимента [Буравкова Л.Б. и соавт., 2004; 2005; 2006]. Полученные экспериментальные данные показали, что в условиях микрогравитации ЕК сохраняли способность оказывать in vitro цитотоксическое действие на клетки-мишени (табл. 3).

...